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不是“溶不进水”那么简单：难溶性药物究竟被卡在了哪里？ 本系列以2013、2023和2024年三篇综述为主线，依次拆解难溶性药物从问题诊断到技术选择的路径。本讲是系列起点，先建立溶解度、溶出、吸收和暴露的共同语言。药物很强，为什么到了动物身上却像“没吃进去”？ 一支候选药物在细胞实验里表现漂亮，放进 DMSO 储备液也清清亮亮。可一旦稀释到生理缓冲液中，活性忽高忽低；做成口服悬液后，动物血药浓度又低而且波动很大。团队很容易把它归结为一句话：药物太难溶了。 这句话可能没错，却还不足以指引下一步。因为“难溶”不是一个单独的故障：药物可能很难从晶体里出来，可能出来得太慢，可能刚进入水相就重新析出，也可能溶出来了却过不了肠壁。不同故障，解法并不相同。 药剂学里常把问题拆成几道连续关卡：药物先从固体制剂中释放，再进入胃肠液，保持可溶或可分散状态，接着穿过肠道屏障，最后逃过代谢并到达循环。前一关做得再好，也不能保证后一关自动通过。 图1｜口服药物要连续通过胃肠环境和吸收屏障图中从口腔、胃到小肠和大肠，列出不同部位的生理条件。读图时先看药物进入肠腔前后的pH与屏障变化：溶解只是其中一步，后面还要面对酶、黏液和上皮吸收。 来源：Rocha B et al., Expert Opinion on Drug Discovery, 2023，Figure 1。原图题（节译）：Main absorption sites and representative barriers for oral drugs。溶解度、溶出速度和吸收，是三个不同的问题 “溶解度”问的是：在一定条件下，液体里最多能容纳多少药物？它描述的是接近平衡时的上限。 “溶出速度”问的是：药片或颗粒中的药物，以多快的速度进入液体？就算最终能溶很多，如果释放太慢，药物也可能赶不上胃肠道转运的时间。 “吸收”则问的是：已经到达肠腔的药物，有多少能够穿过肠上皮，进入血液或淋巴？它还受到膜通透性、转运体、肠道代谢和肝脏首过代谢等影响。 因此，溶解度上升，并不必然意味着口服生物利用度同比上升。对溶解性差但渗透性好的药物，溶出可能是主要瓶颈；如果溶解性和渗透性都差，单纯把药“溶得更多”仍可能不够。 生物药剂学分类系统（BCS）把药物按溶解性和渗透性分成四类。第 II 类通常是低溶解性、高渗透性，研发注意力常放在溶出和胃肠道中的可用药物浓度；第 IV 类则两项都低，除了溶解问题，还得面对跨膜吸收不足。BCS 是帮助组织思路的框架，并不意味着同一类里的每个分子都用同一剂型就能解决。 图2｜BCS把溶解性和渗透性放在同一张图里横轴是溶解性，纵轴是渗透性。II类药物主要受溶解性限制；IV类两项都低，增溶未必足以带来吸收改善。分类用于组织问题，不能替代具体实验。 来源：Williams HD et al., Pharmacological Reviews, 2013，Figure 4。原图题（节译）：Biopharmaceutics Classification System (BCS)。水分子要“拉走”药物，先得把晶体拆开 药物从晶体进入水中，大体要经历两件事：先克服晶体里药物分子之间的吸引力，再由水分子与药物形成足够有利的相互作用。 如果晶体排列紧密、分子间作用强，药物就不容易离开固体；如果药物分子本身很难与水相容，离开晶体后也不容易在水中稳定存在。两股力量共同决定了药物的水中溶解行为。 图3｜药物进入水相前，先要离开固体并与水相处图中分三步展示溶解过程：分子先脱离晶格，再在液体中形成空间，最后与溶剂相互作用。晶格牢固或药物与水相容性差，都会让溶解变难。 来源：Williams HD et al., Pharmacological Reviews, 2013，Figure 5。原图题（节译）：Three steps required for a solute drug molecule to enter solution。 把分子做得更亲水，可能改善与水的相处；但若同时削弱了靶点结合所需的疏水相互作用，药效也可能受影响。这正是药物化学优化与制剂开发经常需要共同权衡的地方。 这也解释了为什么“脂溶”不等于“水溶”。一个分子可以很喜欢油相、容易进入细胞膜，却不愿意待在水相；它也可能因为晶格特别稳定而难以从晶体中释放。只看一个脂溶性指标，无法替代对晶型、熔点、离子化状态、剂量和溶出行为的判断。 2013 年综述用通量关系把这种多因素依赖表达得很清楚：药物穿过吸收膜的通量，取决于膜的渗透能力，也取决于膜表面附近能够维持的药物浓度。作者进一步提醒，剂量和肠道环境也要放进判断中。换句话说，同一个溶解度数值，对低剂量、高渗透分子和高剂量、低渗透分子，意义并不相同。 综述引用的一个对照很能说明剂量的重要性：地高辛单次剂量仅 0.5 mg，列出的溶解度为 0.024 mg/ml，作者给出的完全溶解体积约 21 ml，吸收表现仍可良好；灰黄霉素剂量为 500 mg，溶解度为 0.015 mg/ml，估算完全溶解需要约 33,333 ml，吸收则低且波动。这些是综述所引的历史例子，不是对所有制剂或患者的预测。它们说明，“难溶”必须放到剂量和吸收能力的背景里理解。 图4｜剂量会改变“难溶”对吸收的实际影响表中地高辛剂量低，按溶解度估算所需体积约21 ml，综述列为吸收良好；灰黄霉素剂量高，估算需约33,333 ml，列为低且可变。两例提醒我们把溶解度和剂量放在一起看。 来源：Williams HD et al., Pharmacological Reviews, 2013，Table 1。原图题（节译）：Examples of dose, solubility, and volume requirements。体外实验中的“浓度”，有时只是配出来的浓度 药物研发早期，常把溶于 DMSO 的储备液逐步稀释到含盐、蛋白或细胞的水相体系里。但有些疏水化合物遇水后会迅速超过自身可维持的溶解范围，形成肉眼看不见的微小沉淀。此时，实验者以为加入了某个浓度，真正留在溶液里的药可能已经少了很多。 另一种情况是药物粘在孔板、吸头、滤膜或管壁上。测得的上清药物减少，未必代表它被细胞吸收或被蛋白结合，也可能只是被实验器材“带走”。2013 年综述特别提醒，过滤、透析和离心等分离步骤本身也可能引入吸附损失。对难溶化合物来说，验证材料表面和质量平衡，常常不是细枝末节，而是正确解释实验的前提。 还要分清“总量”和“自由量”。胶束、环糊精或血清蛋白可以把更多药物暂时留在水相中，测定时总浓度看起来上升；但被结合或包合的药物，并不一定能立即扩散穿膜或结合靶点。自由药物浓度有时更接近能够参与这些过程的那部分药物。它仍然不是体内靶点暴露的完美替代指标，却能提醒我们：增溶后不能只盯着一个总浓度数字。 因此，体外活性曲线的异常也可能是“暴露问题”，不一定是靶点药理变了。若同一化合物在不同板型、不同稀释顺序或不同血清比例下给出明显不同的效价，先检查终点时刻实际溶解浓度、沉淀和吸附，再解释构效关系，会更稳妥。必要时可用定量分析确认孔中的实际浓度，并以适合该化合物的容器材料做回收率或质量平衡验证。否则，表观活性较弱的化合物可能只是没有以预期浓度留在体系里。药物进入胃肠道后，还要应对哪些变化？ 胃和小肠不是一杯静止的水。药物会经过不同的 pH 环境，遇到消化酶、胆盐和食物成分；它需要在有限的转运时间里完成溶解与吸收。弱酸、弱碱的电离状态可能随 pH 改变，先前溶解的药物因此可能在另一段肠道环境中重新析出。 即便药物维持在肠液里，也仍需穿过黏液层和肠上皮。上皮细胞上的外排转运体可能把药物送回肠腔，肠壁酶和肝脏代谢则可能在药物进入全身循环前降低有效暴露。2023 年综述把这些过程放在同一张口服吸收屏障图中，提醒制剂设计要针对真正的限制环节。 因此，动物体内暴露低，并不能单凭结果判断“溶解度改善失败”。可能是药物在胃肠道里析出，也可能是渗透不足、被外排、被代谢，或制剂的释放时机不合适。反过来，某个处方在体外提高了表观溶解度，也不等于它已经证明能提高人体吸收。选技术之前，先问五个问题 “难溶”是诊断起点，不是处方答案。面对一个新分子，至少要把下面几项放在一起看： 要弄清的问题 它帮助判断什么 分子在不同 pH 下的平衡溶解度是多少？ 是否可通过电离、调 pH 或成盐改善 溶出速度如何，晶型和熔点会不会限制释放？ 是否优先考虑粒径、晶体工程或无定形体系 最高临床剂量能否在胃肠道可用液体体积中溶解？ 当前溶解度对实际剂量是否构成限制 膜通透性如何，是否存在外排或明显首过代谢？ 单纯增溶是否足够，是否要考虑吸收/代谢问题 稀释、消化和储存后会不会析出或结晶？ 处方是否能在体内和货架期保持有效状态 还需要结合分子可电离性、脂溶性、剂量、目标给药途径和候选辅料安全性。2013 年综述的核心提醒至今仍实用：低溶解度何时会成为吸收瓶颈，不能脱离渗透性、剂量和胃肠道环境单独下结论；2023 与 2024 年综述则把问题继续推向体内屏障和具体制剂选择。 实验上，可以把这些问题组成一组互相校验的检查，而不是期待单个“溶解度值”回答全部问题：先测相关 pH 范围的平衡溶解度，再看剂型或原料药的溶出曲线；随后检查稀释或介质转换后是否析出，并测定关键时间点的实际溶解浓度；最后把溶出结果与渗透、稳定性和适当的体内暴露数据对应起来。每一项都回答一个不同的问题。对于早期化合物，未必一次做齐所有开发研究，但至少应知道目前的判断来自平衡测定、动力学测定还是计算预测。 数据解释也要避免两个常见跳步。第一，某一缓冲液里测到的高表观溶解度，不能自动代表胃到小肠的环境转换过程中仍保持稳定；第二，体外溶出变快，不能单独证明吸收增加，因为肠壁通透、外排和代谢并未因此自动改变。把每种实验的边界写清楚，反而更容易识别下一步真正需要补哪类证据。 下一篇，我们从最接近药物分子本身的几种办法开始：如果分子可以电离，是先做盐型筛选？若不适合成盐，共晶、共无定形或前药又各自改变了什么？ 本文主要依据 Williams HD, et al.Strategies to Address Low Drug Solubility in Discovery and Development. Pharmacological Reviews. 2013;65:315–499. 重点：Introduction、Section I、Section II。 Rocha B, et al.Promising strategies for improving oral bioavailability of poor water-soluble drugs. Expert Opinion on Drug Discovery. 2023;18(6):615–627. 重点：Section 2、Figure 1。 Xie B, et al.Solubilization techniques used for poorly water-soluble drugs. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2024;14(11):4683–4716. 重点：Introduction 与 Section 2 的BCS II/IV讨论。

点击蓝字 关注我们 作者 王毅通1,2 王茹1 孙立彦3 刘玲1,2,* 1 中国科学院微生物研究所 微生物多样性与资源创新利用全国重点实验室，北京 100101； 2 沈阳药科大学中药学院，沈阳 110016； 3 山东第一医科大学药学院(药物研究所)，济南 250117 摘要 摘要：目的    研究黄精内生真菌Fusarium sp. HJY2的次级代谢产物及其抗细菌活性。方法    采用大米固体培养基发酵培养菌株，用乙酸乙酯提取获得粗提物，综合运用硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、半制备高效液相色谱等分离技术进行分离纯化；通过核磁共振波谱(NMR)和质谱(MS)分析并与文献数据对比鉴定其结构；采用杯碟法和微量稀释法对化合物进行体外抗菌活性评价。结果    从该菌发酵产物中分离得到了7个化合物，结构分别鉴定为3β-hydroxy-(22E, 24R)-ergosta-5,8,22-trien-7-one(1)、3β,5α-dihydroxy-(22E, 24R)-ergosta-7,22-dien-6-one(2)、dihydrolateropyrone(3)、7-hydroxy-3-(2-hydroxy-propyl)-5-methyl-isochromen-1-one(4)、(−)-citreoisocoumarinol(5)、镰刀菌素I(6)和9-oxo-10(E),12(E)-octadecadienoic acid(7)。其中化合物7对甘蓝黑腐病菌、耻垢分枝杆菌和枯草芽孢杆菌均具有抗菌活性，MIC值分别为32、32和64 μg/mL。结论    黄精内生真菌Fusarium sp.HJY2能产生结构多样的次级代谢产物，化合物7具有较好的抗细菌活性，为抗菌药物研发提供了候选分子。 关键词：内生真菌；镰刀菌属；结构鉴定；次级代谢产物；抗菌活性 Chemical constituents of endophytic fungus Fusarium sp. from Polygonatum sibiricum and their antibacterial activity Abstract    Objective    To investigate the secondary metabolites of the endophytic fungus Fusarium sp. HJY2 isolated from Polygonatum sibiricum and evaluate their antibacterial activities. Methods    The strain was fermented on a rice solid medium, and the crude extract was obtained by ethyl acetate extraction. The crude extract was then isolated and purified using silica gel column chromatography (CC), Sephadex LH-20 gel CC, and semi-preparative high-performance liquid chromatography. The structures of the isolated compounds were determined by the analysis of nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR), mass spectrometry (MS), and comparison to the literature.The in vitro antibacterial activities were evaluated by the cylinder plate method and the microdilution method.Results    Seven compounds were isolated from the crude extract of this strain, and their structures were identified as 3β-hydroxy-(22E, 24R)-ergosta-5,8,22-trien-7-one (1), 3β,5α-dihydroxy-(22E, 24R)-ergosta-7,22-dien-6-one (2),dihydrolateropyrone (3), 7-hydroxy-3-(2-hydroxy-propyl)-5-methyl-isochromen-1-one (4), (–)-citreoisocoumarinol (5), fusarin I (6) and 9-oxo-10(E),12(E)-octadecadienoic acid (7), respectively. Compound 7 displayed antibacterial activity against Xanthomonas campestris pv. campestris, Mycolicibacterium smegmatis, and Bacillus subtilis, with MIC values of 32, 32, and 64 μg/mL, respectively. Conclusion    The endophytic fungus Fusarium sp. HJY2 from Polygonatum sibiricum was rich in structurally diverse secondary metabolites, and compound 7 exhibited antibacterial activity. This study provided potential candidate molecules for the development of antibacterial drugs. Key words    Endophytic fungi; Fusarium sp.; Structure elucidation; Secondary metabolites; Antibacterial activity 植物内生真菌(endophytic fungi)是指定殖于健康植物组织内部而不引起明显植物病害的一类真菌[1]。多数内生真菌是对宿主植物有益的，部分内生真菌还可以参与寄主植物的生物合成途径[2]，二者间是互惠共生关系[3]。植物内生真菌能产生结构多样的次级代谢产物，包括萜类、生物碱、聚酮、肽类、皂苷等多种结构类型，这些化合物具有广泛的药理活性，已经成为新药研发的重要资源。最典型的例子是从红豆杉内生真菌Taxomyces andreanae中分离获得抗癌药物紫杉醇[4]，这一发现推动了植物内生真菌研究领域的发展。 黄精作为传统中草药，自古便有广泛应用，《名医别录》中记载：“黄精，味甘，平，无毒。主补中益气，除风湿，安五脏。”现代药理学研究也证实黄精具有抑菌抗炎、抗氧化及免疫调节等药理作用[5]。黄精内生真菌群落呈现显著的物种多样性特征，包括镰刀菌属、不产孢真菌、链格孢属等，潜藏着大量具有抑菌活性的内生真菌[6]，例如汪滢等[7]在黄精中发现一株内生真菌变灰青霉，并从中分离得到灰黄霉素等抗植物病原真菌活性良好的化合物。一方面，镰刀菌属在黄精内生真菌菌群丰度及生态位占比方面均表现出显著优势[6]。另一方面，镰刀菌能产生丰富的次级代谢物[8]，具有抗菌[9]、细胞毒[10]、抗氧化[11]及抗病原虫[12]等活性，例如，Zhou等[13]从中国海南岛正红树内生真菌F. solani HDN15-410代谢物中鉴定出两个新的γ-吡喃酮衍生物fusolanones A和B，其中fusolanones B对副溶血性弧菌具有较好活性，MIC(最低抑菌浓度)为6.25 μg/mL，阳性对照为制真菌素(MIC为1.03 μg/mL)。Ibrahim等[14]在长叶薄荷内生镰刀属真菌中分离了一个新的氨基苯甲酰胺衍生物，fusaribenzamide A，对白色念珠菌具有较强的抑制活性，MIC为11.9 μg/disc，抑制程度较低于阳性对照制真菌素(MIC为4.9 μg/disc)。然而，针对黄精宿主来源的镰刀菌次级代谢产物化学多样性研究仍存在明显空白，尤其缺乏系统性分离鉴定与活性评价相结合的深入探索，因此对黄精内生镰刀菌开展次级代谢产物研究具有一定的理论基础和潜在价值。 本研究以1株自黄精叶片中分离得到的内生真菌Fusarium sp. HJY2为研究对象，在大米固体培养基中进行扩大发酵，获得乙酸乙酯提取物，用杯碟法初步评估粗提物抗菌活性，对其进行次级代谢产物化学研究，分离得到7个化合物(图1)，并将它们的波谱数据与文献比对，鉴定为两个甾体类化合物：3β-hydroxy-(22E, 24R)-ergosta-5,8,22-trien-7-one(1)、3β,5α-dihydroxy-(22E,24R)-ergosta-7,22-dien-6-one(2)；3个聚酮类化合物：dihydrolateropyrone(3)、7-hydroxy-3-(2-hydroxy-propyl)-5-methyl-isochromen-1-one(4)、(−)-citreoisocoumarinol(5)；以及两个脂肪酸类化合物：镰刀菌素I(6)和9-oxo-10(E),12(E)-octadecadienoic acid(7)。最后，采用微量稀释法对化合物进行体外抗菌活性评价。 1 材料与方法 1.1 试剂与仪器 1.1.2 供试菌株 菌株HJY2分离自健康黄精叶片，现保存于中国科学院微生物研究所微生物多样性与资源创新利用全国重点实验室。刮取菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上生长的菌丝体，使用CTAB法[15]提取该菌株的基因组DNA。对提取的DNA使用ITS1和ITS4通用引物进行PCR扩增，以获得目标内部转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)基因序列的扩增产物，经过凝胶电泳分析验证了扩增产物的大小和纯度，而后送至中国北京擎科生物技术有限公司进行测序。测序结果经BLAST工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对，通过计算序列相似性确定最相近分类单元，并结合真菌形态确定菌株分类地位。 1.2 方法 1.2.1 菌株发酵 将菌株接种于PDA培养基，倒置于28 ℃恒温霉菌培养箱中培养5~7 d，在边缘切取4~5块含菌丝的琼脂块(约0.5 cm2)接种至500 mL真菌2号液体培养基(麦芽提取物20 g、L-谷氨酸钠10 g、K2HPO4∙3H2O 0.5 g、MgSO4∙7H2O 0.3 g、葡萄糖10 g、酵母提取物3 g、玉米浆1 g、D-甘露醇20 g和蒸馏水1 L)。置于恒温振荡培养箱中，28 ℃、200 r/min培养3 d，获得种子液。在无菌操作台中将种子液接种至经高压蒸汽灭菌的大米培养基(大米100 g、蒸馏水110 mL、种子液10 mL，150×500 mL 锥形瓶)，进行固态放大发酵(共15 kg)，28 ℃避光静置发酵30 d。 1.2.2 提取与分离 对发酵产物进行萃取，选用12 L乙酸乙酯浸泡并反复超声3次，负压条件下旋蒸浓缩获得乙酸乙酯浸膏97.4 g。利用正相硅胶柱层析(CC)进行分离，流动相采用石油醚-乙酸乙酯(V/V，1:0，20:1，15:1，10:1，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，0:1)梯度洗脱，经薄层色谱(TLC)分析后用无水甲醇洗脱，根据分析结果将其合并得到10个馏分(Fr.1~Fr.10)。Fr.1(石油醚/乙酸乙酯，V/V，10:1；1.1 g)经过甲醇-水(V/V，2:8~1:0)梯度洗脱的ODS反相柱层析分离，分析后合并得9个亚馏分(Fr.1.1~Fr.1.9)，其中Fr.1.9(纯甲醇；18.4 mg)借助半制备反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分离，在设定条件(92%甲醇/酸水洗脱40 min，2 mL/min)下得到化合物1(1.2 mg，tR 36.4 min)和2(1.5 mg，tR 32.0 min)。利用正相柱层析对Fr.4(石油醚/乙酸乙酯，V/V，1:1；3.4 g)分离，以石油醚-二氯甲烷-甲醇体系为流动相梯度洗脱(V/V/V，10:1:0~0:0:1)，得到4个亚馏分(Fr.4.1~Fr.4.4)，对Fr.4.1(石油醚-二氯甲烷-甲醇，V/V/V，0:1:0；395.2 mg)使用Sephadex LH-20凝胶柱层析，采用甲醇分离，得到20个亚馏分(Fr.4.1.1~Fr.4.1.20)，Fr.4.1.15(31.0 mg)通过RP-HPLC系统，在酸水-甲醇梯度(10%~100%甲醇)条件下洗脱35 min(流速2.0 mL/min)，分离得到化合物3(5.2 mg，tR 33.4 min)。Fr.6(石油醚-乙酸乙酯，V/V，1:2；3.2 g)经ODS反相柱层析，甲醇-水(V/V，2:8~1:0)梯度洗脱，获得8个亚馏分(Fr.6.1~Fr.6.8)，其中Fr.6.4(甲醇-水，V/V，1:1；32.4 mg)经RP-HPLC(20%乙腈/酸水洗脱55 min，2 mL/min)分离得到化合物4(10.0 mg，tR 24.8 min)。Fr.10(石油醚-乙酸乙酯，V/V，4:1；4.8 g)经正相柱层析，以石油醚-二氯甲烷-甲醇梯度洗脱(V/V/V，10:1:0~0:0:1)，得到7个亚馏分(Fr.10.1~Fr.10.7)，其中Fr.10.2(石油醚-二氯甲烷-甲醇，V/V/V，8:1:0；36.7 mg)经RP-HPLC(40%~90%甲醇/酸水梯度洗脱20 min，2 mL/min)分离得到化合物5(1.2 mg，tR 16.1 min)；Fr.10.4(石油醚-二氯甲烷-甲醇，V/V/V，4:1:0；290.3 mg)经过RP-HPLC(40%~70%甲醇/酸水梯度洗脱25 min，70%~90%甲醇/酸水梯度洗脱15 min；2 mL/min)分离得到化合物6(2.4 mg，tR 36.7 min)；Fr.10.5(石油醚-二氯甲烷-甲醇，V/V/V，0:10:1；97.7 mg)经RP-HPLC(80%甲醇/酸水，2 mL/min)分离得到化合物7(1.9 mg，tR 42.1 min)。 1.2.3 体外抗病原细菌活性测试 5种供试植物病原细菌菌株如下，3种革兰阳性菌：耻垢分枝杆菌(Mycolicibacterium smegmatis ATCC 700084)，甘蓝黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris BLY013)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC 6633)；2种革兰阴性菌：青枯雷尔菌(Ralstonia solanacearum BXL015)，辣椒青枯病菌(Pseudomonas solanacearum BLY014)。 1.2.3.1 粗提物活性测试 采用杯碟法对真菌粗提物的抗菌活性初步检测[16]：使用DMSO配制20 mg/mL粗提物溶液和150 μg/mL万古霉素溶液。选用LB液体培养基(蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%，蒸馏水1 L)将细菌培养至对数生长期(37 ℃、180 r/min)。稀释菌液浓度为(3~5)×106CFU/mL，各吸取100 μL菌悬液与10 mL适宜温度且尚未凝固的LB Agar培养基(含2%琼脂)混合均匀，倾倒于9 cm培养皿。待凝固后，使用灭菌镊子轻轻放入3个牛津杯，分别吸取100 μL粗提物溶液、万古霉素溶液、DMSO加入牛津杯，37 ℃静置培养24 h后观察抑菌圈大小。 1.2.3.2 化合物活性测试 使用微量稀释法(CLSI M07标准)对单体化合物1~7的体外抗细菌活性进行初步评价。同样选用LB液体培养基将细菌培养至对数生长期。使用DMSO配制6.4 mg/mL化合物母液，对其进行二倍倍比稀释。在96孔板内依次加入2 μL化合物，再加入188 μL LB培养基和10 μL调整浓度后的待测菌液(5×105~1×106 CFU/mL)混匀；使每孔的化合物终浓度为64、32、16、8、4、2、1、0.5 μg/mL。37 ℃恒温静置培养24 h后，观察浑浊度，使培养液清澈的最低浓度即为最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)。万古霉素为阳性对照，DMSO为阴性对照，LB液体培养基为空白对照，实验重复3次。 2 结果与分析 2.1 菌株鉴定结果 将菌株HJY2的ITS序列与GenBank中的序列进行同源性比较，发现菌株与Fusarium acuminatum CS5907(Genbank No.MT635295.1)亲缘关系最近，同源性为100.00%。结合形态特征分析(图3)，初步鉴定该菌株为镰刀菌属(Fusarium sp.)。ITS序列已上传至Genbank数据库(Genbank No.OR485909)。 2.2 化合物结构鉴定 3β-Hydroxy-(22E, 24R)-ergosta-5,8,22-trien-7-one(1)：白色粉末，[α]D25−153.97(c 0.1, CHCl3)。根据ESI-MS显示离子峰m/z 411.3[M+H]+，推测其分子式为C28H42O2，具有8个不饱和度。核磁数据如下，1HNMR (500 MHz, acetone-d6) δH: 5.92(1H, d, J=1.4 Hz,H-6), 5.28(1H, dd, J=15.4, 7.6 Hz, H-23), 5.24(1H, dd,J=15.4, 7.2 Hz, H-22), 3.56(1H, m, H-3), 1.37(3H, s, H3-19), 1.08(3H, d, J=6.6 Hz, H3-21), 0.94(3H, d, J=6.8 Hz, H3-28), 0.86(3H, d, J=6.8 Hz, H3-27), 0.84(3H, d, J=6.9 Hz, H3-26), 0.69(3H, s, H3-18); 13C NMR (125 MHz, acetone-d6) δC: 185.9(C-7), 163.4(C-5), 161.6(C-9), 136.7(C-22),134.1(C-8), 132.7(C-23), 126.7(C-6), 72.2(C-3), 54.2(C-17), 49.4(C-14), 43.8(C-24), 43.1(C-13), 42.8(C-10),42.7(C-4), 41.3(C-20), 36.4(C-12), 35.5(C-1), 33.9(C-25), 32.6(C-2), 31.6(C-16), 25.6(C-15), 25.0(C-11),24.1(C-19), 21.5(C-21), 20.3(C-27), 20.0(C-26), 18.1(C-28), 12.2(C-18)。NMR数据与文献进行比对后基本一致[17]，鉴定为3β-hydroxy-(22E, 24R)-ergosta-5,8,22-trien-7-one。 3β,5α-Dihydroxy-(22E, 24R)-ergosta-7,22-dien-6-one(2)：白色粉末，[α]D25−6.0(c 0.1, EtOH)，根据ESI-MS显示其分子离子峰为m/z 429.3[M+H]+，推测其分子式为C28H44O3，不饱和度为7。核磁数据如下，1H NMR (500 MHz, acetone-d6) δH: 5.47(1H,t, J=2.2 Hz, H-7), 5.29(1H, dd, J=15.3, 7.4 Hz, H-23),5.23(1H, dd, J=15.3, 8.1 Hz, H-22), 3.94(1H, m, H-3),1.07(3H, d, J=6.6 Hz, H3-21), 0.94(3H, d, J=6.8 Hz, H3-28), 0.91(3H, s, H3-19), 0.86(3H, d, J=6.8 Hz, H3-27),0.84(3H, d, J=7.0 Hz, H3-26), 0.65(3H, s, H3-18);13C NMR (125 MHz, acetone-d6) δC: 198.9(C-6), 163.9(C-8), 136.4(C-22), 133.0(C-23), 120.5(C-7), 77.7(C-5),67.3(C-3), 56.8(C-17), 56.2(C-14), 45.2(C-9), 44.7(C-13), 43.7(C-24), 41.3(C-20), 41.2(C-12), 39.7(C-4),37.2(C-10), 33.8(C-25), 31.5(C-2), 31.3(C-1), 28.7(C-16), 23.2(C-11), 22.5(C-15), 21.5(C-21), 20.3(C-26),20.0(C-27), 18.1(C-28), 16.6(C-19), 12.9(C-18)。经比对，文献中的NMR数据与以上数据相符[18]，证实其为3β,5α-dihydroxy-(22E, 24R)-ergosta-7,22-dien-6-one。 Dihydrolateropyrone(3)：黄色固体，[α]D25−110.0(c 0.1, EtOH)，根据ESI-MS显示其分子离子峰为m/z: 321.1[M+H]+，推测其分子式为C15H12O8，具有10个不饱和度。核磁数据如下，1H NMR (500 MHz,CDCl3) δH: 13.20(1H, s, OH-5), 7.40(1H, s, H-10),6.20(1H, s, H-3), 5.97(1H, d, J=2.1 Hz, H-8), 4.93(1H,m, H-9), 3.82(3H, s, H3-13), 3.02(1H, d, J=5.6 Hz, OH-9), 2.46(3H, s, H3-11);13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC: 183.9(C-4), 170.8(C-2), 169.5(C-12), 168.3(C-6), 157.6(C-10a), 156.1(C-5), 133.4(C-5a), 124.5(C-9a), 113.0(C-4a), 109.7(C-3), 104.1(C-10), 81.2(C-8),70.35(C-9), 53.5(C-13), 20.9(C-11)。以上数据与参考文献基本一致[19]，鉴定为dihydrolateropyrone。 7-Hydroxy-3-(2-hydroxy-propyl)-5-methyl-isochromen-1-one(4)：白色粉末，[α]+42.99(c 0.1,MeOH)，根据ESI-MS显示其分子离子峰为m/z:235.1[M+H]+，推测其分子式为C13H14O4，具有7个不饱和度。核磁数据如下。1H NMR (500 MHz,DMSO-d6) δH: 6.61(1H, d, J=2.2 Hz, H-8), 6.60(1H,d, J=2.1 Hz, H-6), 5.96(1H, s, H-4), 4.82(1H, br s, 10-OH), 4.02(1H, m, H-10), 2.65(3H, s, H3-12), 2.59(1H,dd, J=14.2, 5.2 Hz, Ha-9), 2.54(1H, dd, J=14.2, 7.7 Hz,Hb-9), 1.14(3H, d, J=6.2 Hz, H3-11);13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC: 178.3(C-1), 164.8(C-3), 161.0(C-7), 159.2(C-8a), 141.4(C-5), 116.5(C-6), 114.4(C-4a),111.5(C-4), 100.6(C-8), 64.1(C-10), 42.9(C-9), 23.4(C-11), 22.4(C-12)。其1H NMR和13C NMR数据与参考文献对比后基本一致[20]，鉴定为7-hydroxy-3-(2-hydroxy-propyl)-5-methyl-isochromen-1-one。 (-)-Citreoisocoumarinol( 5 )：黄色固体，[α]D25−23.99(c 0.1, MeOH)，根据ESI-MS显示其分子离子峰为m/z: 281.1[M+H]+，推测其分子式为C14H16O6，具有7个不饱和度。核磁数据如下。1H NMR (500 MHz, acetone-d6) δH: 6.45(1H, s, H-5),6.33(1H, d, J=1.8 Hz, H-7), 6.27(1H, d, J=1.9 Hz, H-4),4.84(1H, s, 4′-OH), 4.52(1H, s, 2′-OH), 3.94(1H, m,H-4′), 3.80(1H, m, H-2′), 2.60(1H, dd, J=14.4, 4.3 Hz,Ha-1′), 2.44(1H, dd, J=14.4, 8.3 Hz, Hb-1′), 1.57(1H,dt, J=13.7, 7.9 Hz, Ha-3′), 1.43(1H, dt, J=13.6, 5.1 Hz,Hb-3′), 1.06(3H, d, J=6.1 Hz, H3-5′);13C NMR (125MHz, acetone-d6) δC: 166.4(C-1), 165.7(C-6), 162.6(C-8), 155.1(C-3), 139.6(C-10), 105.6(C-4), 102.7(C-5), 101.5(C-7), 97.8(C-9), 66.2(C-4′), 64.1(C-2′),46.0(C-3′), 41.2(C-1′), 23.6(C-5′)。该化合物NMR数据与文献中的报道基本一致[21]，鉴定化合物为(-)-citreoisocoumarinol。 镰刀菌素I(6)：黄色固体，根据ESI-MS显示其分子离子峰为m/z: 277.1[M+H]+，推测其分子式为C16H20O4，具有7个不饱和度。核磁数据如下。1H NMR (500 MHz, acetone-d6) δH: 7.28(1H, d, J=9.6 Hz,H-10), 6.92(1H, m, H-2), 6.74(1H, m, H-8), 6.72(1H,m, H-6), 6.65(1H, d, J=15.5 Hz, H-9), 6.58(1H, dd,J=15.0, 9.5 Hz, H-7), 6.21(1H, s, H-4), 3.69(3H, s, H3-14), 1.95(3H, d, J=1.5 Hz, H3-16), 1.75(3H, dd, J=7.2,1.2 Hz, H3-1), 1.71(3H, m, H3-15);13C NMR (125 MHz,acetone-d6) δC: 169.4(C-12), 167.6(C-13), 140.6(C-10), 140.5(C-6), 140.4(C-8), 139.0(C-2), 138.8(C-5), 131.4(C-3), 129.8(C-7), 129.1(C-9), 127.7(C-4),127.5(C-11), 52.0(C-14), 16.0(C-1), 14.5(C-15), 12.9(C-16)。其1H NMR和13C NMR数据与文献对比后基本一致[22]，鉴定为镰刀菌素I。 9-oxo-10(E),12(E)-octadecadienoic acid(7)：黄色油状，根据ESI-MS显示其分子离子峰为m/z: 295.2[M+H]+，推测其分子式为C18H30O3，具有4个不饱和度。核磁数据如下。1H NMR (500 MHz,CDCl3) δH: 7.13(1H, m, H-11), 6.18(2H, m, H-12, H-13),6.07(1H, d, J=15.5 Hz, H-10), 2.53(2H, t, J=7.4 Hz,H2-8), 2.34(2H, t, J=7.4 Hz, H2-2), 2.18(2H, m, H2-14), 1.62 (4H, m, H2-3, H2-7), 1.43(2H, m, H2-15), 1.30(10H, overlap, H2-4, H2-5, H2-6, H2-16, H2-17), 0.89(3H,t, J=6.8 Hz, H3-18);13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC:201.3(C-9), 146.0(C-13), 143.2(C-11), 129.0(C-12),128.0(C-10), 40.6(C-8), 34.0(C-2), 33.2(C-14), 31.5(C-16), 29.2(C-5/6), 29.0(C-4), 28.5(C-15), 24.8(C-3),24.5(C-7), 22.6(C-17), 14.1(C-18)。其1H NMR和13C NMR数据与文献对比后基本一致[23]，鉴定为9-oxo-10(E),12(E)-octadecadienoic acid。 2.3 抗菌活性结果 采用杯碟法评估了HJY2粗提物对5种病原细菌的抑菌活性，结果显示在20 mg/mL下，粗提物对3种革兰阳性菌表现出显著抑制作用(图4)，对2种革兰阴性菌未表现出抑制活性。 采用微量稀释法评估了化合物4~7对5种病原细菌的体外抑菌活性。结果如表2所示，化合物7对耻垢分枝杆菌(MIC=32 μg/mL)和甘蓝黑腐病(MIC=32 μg/mL)表现出中等抗菌活性，对枯草芽孢杆菌的抑制活性较弱(MIC=64 μg/mL)；其余化合物(1~6)在测试浓度下对供试菌株均未表现出明显的抗菌活性(MIC>64 μg/mL)。 3 讨论与结论 本文对黄精内生真菌Fusarium sp. HJY2的次级代谢产物进行研究，分离纯化获得7个化合物。据文献报道，化合物1对P388、HL-60细胞株具有显著细胞毒活性[24]，同时是一种植物生长调节剂，可促进生菜生长[25]；化合物2在体外对HIV-1病毒具有显著的抑制效果，其半数抑制浓度(IC50)为12.4 μmol/L，表明它可能具有作为抗HIV药物开发的潜力[26]；化合物4对白色念珠菌SC5314具有中等抑制活性(IC50=(193±2.08) μmol/L)，提示其作为抗真菌先导化合物的潜力[20]；化合物6对脂多糖LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中NO的产生具有显著的抑制效果，表现出抗炎活性，IC50值为(13.1±6.8) µmol/L[22]。本研究首次在镰刀菌属中分离得到化合物4和7；首次报道了化合物7对于甘蓝黑腐病菌、耻垢分枝杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活性。结合粗提物的抑菌圈实验结果，说明了Fusarium sp. HJY2的次级代谢产物对革兰阳性的植物病原细菌具有一定抑菌活性，在宿主植物抵御外界侵害中发挥协同作用。研究结果进一步丰富了黄精内生镰刀菌次级代谢产物的多样性，为研发新型农用抗生素提供了一定基础。 利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突 参考文献（略） 引用格式：王毅通, 王茹, 孙立彦, 等. 黄精内生真菌Fusarium sp.的化学成分及其抗细菌活性[J]. 中国抗生素杂志, 2026, 51(8): 1058-1065. 长按并识别下方二维码查看2026年第8期全文 ▼ 点击下方“阅读原文”下载全文 ↓↓↓