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会议推荐 2026第三届中国医药企业项目管理大会 2026第二届中国AI项目管理大会 2026第十五届中国PMO大会 2026第五届中国项目经理大会 本 文 目 录 1、全球药物靶点发现、挖掘与探索:方法、技术及中外创新实例深度解析 2、独家原创|周虎博士:新技术/策略在难成药靶点药物发现中的作用 3、用 DrugDomain 查药物靶点与结合结构，全流程教程 4、JMC:靶向药物早期发现中靶标结合分析方法大全【完整指南】 一、全球药物靶点发现、挖掘与探索:方法、技术及中外创新实例深度解析 （原创 张江药哥 张江药哥） 1. 引言：药物靶点研究的战略意义 1.1 药物靶点定义与重要性 在生物医药领域，药物靶点被精准定义为疾病发生发展过程中特定的分子或细胞结构，其核心功能在于通过与药物分子的特异性相互作用，进而产生预期的治疗效果 。靶点发现是推动医药行业创新，特别是新药研发的基石。通过深入剖析疾病的分子机制和生物学特性，科学家能够识别并确立新的药物靶点，从而设计出更为精确且高效的治疗方案，以实现对疾病的干预和最大化的疗效 。   药物靶点在整个新药研发项目中扮演着决定性的角色。例如，截至2021年9月，美国食品药品监督管理局（FDA）批准的1619个药物中，共涉及893个独特的靶点，其中667个为人源靶点，其余为病原体靶点，这充分彰显了靶点在现代药物研发中的核心地位 。靶点发现，亦称靶点识别与验证，其过程在于为那些尚无有效治疗手段或现有疗法存在显著缺陷的疾病，寻找并确立潜在的治疗靶点。这些靶点可以是已知的、推定的，也可以是全新的生物分子 。从分子层面看，药物靶标是指人体内与特定疾病相关的、具有特定化学性质并能与药物进行特异性结合的生物分子，如蛋白质和核酸。尽管蛋白质是目前大多数药物最常见的靶标，因为它们是器官和组织的重要组成部分，并参与了所有关键的生物过程，但对其他分子类型的探索也日益深入 。  靶点发现的初始阶段在于精准定位特定的分子靶点，例如某种蛋白质或核酸。随后，靶点验证则是一个关键步骤，旨在确认该分子在疾病中的作用及其作为潜在药物靶点的可行性 。实践表明，在药物开发的早期阶段，如果药物靶点未能得到充分的验证，将可能导致后期临床试验的高昂失败，并降低新药的批准率。因此，高效的靶点验证和早期概念验证研究对于显著降低II期临床试验的失败率，从而减少新分子实体开发成本具有至关重要的作用 。   1.2 靶点“成药性”概念的演进 传统上，药物靶点主要集中于具有明确结合口袋的蛋白质，其“成药性”被定义为药物能够有效结合并调节其功能 。然而，随着生物医药技术的飞速发展，这一概念正经历深刻的变革。当前，研究人员正日益关注并深入探索核酸（如mRNA）、脂质和碳水化合物等非蛋白质分子作为药物靶点的潜力 。例如，许多核酸类药物通过精确结合DNA或RNA分子来抑制靶蛋白表达 。此外，人工智能（AI）技术的崛起，特别是其在预测和设计药物分子方面的强大能力，正在重新定义“不可成药靶点”的边界 。AI能够处理高度动态的结构、缺乏明确结合口袋或具有高度保守活性位点的靶点，甚至可以针对蛋白质-蛋白质相互作用进行设计 。这种发展趋势表明，药物发现的范畴正在从单纯基于结构的“成药性”向更广泛、更具功能性的“成药性”转变，极大地拓宽了潜在的药物研发空间。 2. 靶点发现：识别疾病核心驱动因素 靶点发现是指在药物研发的早期阶段，通过深入理解疾病的生物学机制，识别并确定与疾病发生发展密切相关的特定分子或细胞结构。这一过程旨在找到全新的、未被充分利用的，或已知但其在特定疾病中的关键作用尚未被完全阐明的潜在治疗靶点。它通常涉及基础科学研究、基因组学、蛋白质组学等“组学”技术，以及功能基因组学方法，以生成关于疾病驱动因素的初步假设。 2.1 靶点发现的方法 靶点发现的方法论涵盖了多种前沿技术和策略： 基础科学研究： 通过深入理解疾病的基本生物学机制，确定可能参与疾病发生发展的分子靶点，例如肿瘤细胞中的异常蛋白或炎症反应中的信号通路分子 。   基因组学： 识别与疾病相关的基因变异，并深入解析这些基因的功能及其调控网络，为靶点发现提供关键的分子层面线索 。例如，通过定量PCR（qPCR）等技术可以分析基因表达，确定拷贝数变异（CNV），并启动早期生物标志物的发现 。   蛋白质组学： 揭示蛋白质在疾病中的表达模式和相互作用方式，从而帮助科学家理解疾病的生物学特性 。通过流式细胞仪、自动化细胞分选仪和计数器以及细胞成像仪等工具，可以对蛋白质进行快速、可重复的评估，并进行蛋白定量和表达水平监测 。   生物信息学： 对大规模基因组和蛋白质组数据进行高效分析和挖掘，从而发现新的潜在靶点 。例如，通过基因本体（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析，可以共同识别差异基因主要参与的生物学过程和信号通路 。   高通量筛选： 快速筛选大量化合物，以寻找与靶点相互作用的潜在药物候选物 。 遗传学方法： 利用遗传相互作用（如增强子或抑制子）来生成潜在靶点的假设 。 化学蛋白质组学： 通过创建能够特异性结合目标蛋白的化学探针，进而检索和识别这些蛋白，从而在蛋白质组学层面识别药物靶点 。 全基因组关联研究（GWAS）： 分析大量个体的全基因组，识别与特定疾病风险显著相关的基因变异 。 2.2 靶点发现的主体 靶点发现的主体通常包括： 学术研究机构和大学： 它们是基础科学研究的摇篮，通过前沿研究揭示疾病的分子机制，并发现新的潜在靶点 。 大型制药公司： 它们拥有强大的研发能力和资源，通过内部研究和外部合作，系统性地进行靶点识别 。 新兴生物技术公司： 它们通常专注于特定疾病领域或前沿技术，通过创新方法发现首创（First-in-class）靶点 。  目前中国大部分创新药企，都是fast follow，非常少的公司在做全新靶点发现的工作，因为靶点发现是一个非常耗时，充满了不确定性的事情，而且新的靶点发现可能是诺贝尔奖级别的工作，对科学家的综合素质要求也非常高 ，另外也看运气。 2.3 中国靶点发现实例 1、鞍石生物科技 (Avistone Bio) 与首都医科大学附属北京天坛医院江涛院士团队：脑胶质瘤PTPRZ1-MET融合基因的发现  2014年，江涛院士团队在全球范围内首次发现并报道了PTPRZ1-MET融合基因，并确定其是脑胶质瘤从低级别向高级别进展的重要驱动基因之一 。这一发现为脑胶质瘤的分子病理学研究做出了突出贡献，并为后续的靶向治疗药物开发奠定了基础。 这一发现直接促成了中国首个获批用于脑胶质瘤MET靶向治疗的小分子靶向药物伯瑞替尼（Beritinib）的研发和上市，开启了脑胶质瘤精准靶向治疗的时代 。   2、中国科学院上海有机化学研究所：帕金森病潜在新靶点FAM171A2的发现  研究团队通过GWAS发现FAM171A2基因的多个突变与帕金森病风险增加显著相关 。随后，通过分析帕金森病患者脑组织和脑脊液中FAM171A2蛋白水平升高，并结合体内和体外研究，揭示了FAM171A2介导病理性α-突触核蛋白淀粉样纤维摄取和扩散的关键机制 。 这项研究为帕金森病提供了新的治疗靶点和干预策略，是基础研究向临床转化迈出的重要一步 。   2.4 外国靶点发现实例 1、阿斯利康 (AstraZeneca)：基因组学驱动的原创性靶点识别 主体： 阿斯利康（大型制药公司）及其合作机构，如英国癌症研究中心、Horizon Discovery和创新基因组学研究所 。旨在识别原创性的新型靶点，通过构建对疾病生物学机制的深刻理解来发现。通过大规模基因组测序（计划到2026年分析200万个基因组）、功能基因组学（大规模CRISPR筛选，包括基因敲除CRISPRn、基因上调CRISPRa和基因下调CRISPRi） 。 阿斯利康通过庞大的基因组数据收集和功能基因组学策略，旨在构建对疾病生物学机制的深刻理解，从而发现“更好”的原创性靶点 。这种策略旨在提高研发成功率，减少后期临床试验的失败 。   2、Ragon Institute：结核病抗体靶点发现 Ragon Institute（顶尖研究机构） 识别能够增强机体对抗结核分枝杆菌（Mtb）能力的抗体靶点。 通过单克隆抗体（mAbs）库筛选 。研究人员通过筛选大量的单克隆抗体库，这些抗体靶向Mtb的多种不同组分，以确定哪些抗体能有效减少感染小鼠体内的细菌生长 。这项研究揭示了抗体如何直接增强机体对抗Mtb的能力。 这项发现为开发新型结核病免疫疗法提供了重要基础 。 3、2023年FDA/EMA/PMDA批准的12个新颖作用机制靶点 主体： 全球范围内的制药公司和研究机构（通过多年基础研究和转化医学的结晶） 。 靶点/机制： 这些靶点是2023年首次被批准药物调控的靶点，代表了全新的作用机制。 发现方法： 涉及对疾病生物学机制的深入理解和创新性药物分子的设计，通常是多学科交叉研究的成果 。   实例： 神经激肽3受体 (NK3R)： 药物Fezolinetant，小分子抑制剂，用于治疗更年期血管舒缩症状 。 补体因子B (CFB)： 药物Iptacopan，小分子抑制剂，用于治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿症 。   γ-分泌酶 (PSEN1 和 PSEN2)： 药物Nirogacestat，小分子抑制剂，用于治疗硬纤维瘤 。   活化素受体1型 (ACVR1)： 药物Momelotinib，小分子抑制剂，用于治疗骨髓纤维化 。 RAC-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1, 2, 3 (AKT1, AKT2, AKT3)： 药物Capivasertib，小分子抑制剂，用于治疗乳腺癌 。   G蛋白偶联受体家族C组5成员D (GPRC5D)： 药物Talquetamab，双特异性抗体，用于治疗多发性骨髓瘤 。   组织因子途径抑制剂 (TFPI)： 药物Concizumab，单克隆抗体，用于治疗血友病A/B 。   超氧化物歧化酶1 mRNA (SOD1)： 药物Tofersen，反义寡核苷酸（ASO），用于治疗肌萎缩侧索硬化症（SOD1突变型） 。   l-乳酸脱氢酶A mRNA (LDHA)： 药物Nedosiran，小干扰RNA（siRNA），用于治疗原发性高草酸尿症1型 。   意义： 这些新靶点的发现和相应药物的批准，为此前无有效疗法或现有疗法效果不佳的疾病带来了新的治疗选择 。   3. 靶点挖掘：从大数据中发现潜在靶点 靶点挖掘是指利用计算生物学、生物信息学和人工智能（AI）等先进技术，从海量的生物医学数据（如基因组学、蛋白质组学、转录组学、临床数据、科学文献、专利信息等）中，系统性地识别、提取和优先排序潜在药物靶点的过程。这一过程旨在通过数据分析和模式识别，揭示传统方法可能难以发现的复杂生物学关联和“隐藏”的靶点。 3.1 靶点挖掘的方法 靶点挖掘主要依赖于数据驱动的计算方法： 生物信息学分析： 对大规模“组学”数据（基因组学、蛋白质组学、转录组学、代谢组学等）进行整合和分析，识别疾病相关的基因、蛋白质和通路 。例如，通过基因本体（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析，可以共同识别差异基因主要参与的生物学过程和信号通路 。   人工智能（AI）与机器学习（ML）： 自然语言处理（NLP）： 从海量科学文献、临床试验报告和公共数据库中提取并综合信息，识别新型生物分子靶点（比如智慧芽数据库）。 知识图谱： 构建基因、药物、疾病和分子通路之间的复杂关系网络，从中发现新的生物学洞察和潜在靶点 。 深度学习与模式识别： 自动从异构数据集中提取和识别复杂模式，预测药物与疾病、基因之间的关联 。 虚拟筛选： 快速评估大量化合物与靶点的潜在相互作用，筛选出高活性的化合物 。 生成式AI： 用于从头设计新型分子和靶点，甚至攻克传统上被认为是“不可成药”的靶点 。 遗传学与AI结合： 通过遗传学研究发现与疾病风险相关的基因变异，并结合AI平台在活体动物中直接评估基因靶点 。  可能真实的靶点挖掘，就是通过智慧芽等数据库，跟踪大公司处于临床前研究的靶点，在这些靶点基础上，结合领导层的眼光，去部署做大量的文献调研，基于公共数据的机制深入挖掘 3.2 靶点挖掘的主体 靶点挖掘的主体通常包括： AI驱动的药物发现公司： 它们专注于开发和应用AI平台来加速靶点识别和药物设计 。 大型制药公司： 它们通过与AI公司合作或建立内部AI团队，利用大数据和AI技术挖掘新靶点 。 学术研究机构： 它们利用生物信息学和计算生物学工具，从公开数据集中挖掘潜在靶点 。 3.3 中国靶点挖掘实例 1、英矽智能 (Insilico Medicine)：AI驱动的靶点和化合物发现  英矽智能（AI驱动的药物发现公司） 发现特发性肺纤维化（IPF）药物Rentosertib的靶点TNIK（TRAF2 and NCK-interacting kinase） 。  通过开发的Pharma.AI平台，包括PandaOmics模块（利用深度生成模型、强化学习、Transformer模型、自然语言处理NLP和机器学习）和Chemistry42模块 。PandaOmics模块分析海量生物学数据和文献（1.9万亿数据点、1000万生物样本的RNA测序和蛋白质组学数据，以及4000万份专利和临床试验文档），通过NLP和机器学习来发现和优先排序新型靶点 。 Rentosertib是全球首个靶点和化合物均由生成式AI发现的药物，将靶点识别到临床前候选药物筛选的平均时间缩短至12-18个月，远低于传统方法 。   2、望石智慧 (Drug Farm)：遗传学与AI结合的IDInVivo平台  望石智慧（生物技术公司）发现α-激酶1（ALPK1）抑制剂DF-003，靶向罕见遗传病ROSAH综合征和心肾疾病的根本原因 。通过IDInVivo平台，结合遗传学和人工智能技术，能够在活体动物中直接评估基因靶点 。这种结合活体动物评估和AI的挖掘方式，提高了靶点识别的效率和准确性，加速了创新免疫调节疗法的开发 。   3、中国医科大学 (CMU) 及其医疗系统：AI辅助药物发现 中国医科大学及其医疗系统（学术研究机构）发现异基因CAR-T疗法（用于实体瘤）、SOA101三特异性抗体、SOB100 HLA-G靶向外泌体 。通过AI驱动的药物发现平台，结合外泌体技术和AI，实现药物的精准递送 。 AI技术被广泛应用于医疗解决方案，包括儿童生长评估系统、远程ICU系统、智能健康排程和Tc-99mTRODAT-1平台辅助中枢神经系统运动障碍诊断等，这些都依赖于对大量医疗数据的挖掘和分析以识别潜在的干预点 。   4、Rgenta Therapeutics：口服小分子RNA靶向药物平台 Rgenta Therapeutics（生物技术公司）通过专有平台，挖掘基因组数据以识别可靶向的RNA加工事件 。 这为肿瘤治疗开辟了新的途径，通过靶向RNA加工事件来干预疾病 。   3.4 外国靶点挖掘实例 1、阿斯利康 (AstraZeneca) 与BenevolentAI：知识图谱AI驱动的靶点识别 阿斯利康（大型制药公司）与BenevolentAI（AI公司）发现慢性肾病（CKD）领域中肾小球足细胞功能相关的新型靶点 。通过 知识图谱AI、多组学表征（基因组、转录组、蛋白质组、代谢组、脂质组分析、多模态成像和临床数据） 。合作已在CKD领域识别出超越传统肾素-血管紧张素系统的全新靶点，并成功推动了一个基于此前未探索的肾小球足细胞功能靶点的药物发现项目 。 2、BenevolentAI：COVID-19药物再利用 BenevolentAI（AI公司）发现 巴瑞替尼（baricitinib）作为潜在COVID-19治疗药物。通过AI平台（知识图谱），对现有药物和疾病数据进行快速挖掘 。这个发型展现了AI在紧急情况下快速识别潜在治疗方案的强大能力，仅用三天就识别出巴瑞替尼 。 3、Recursion Pharmaceuticals：机器学习驱动的基因组筛选 Recursion Pharmaceuticals（生物技术公司）发现RBM39降解剂REC-1245，靶向生物标志物富集的实体瘤和淋巴瘤 。通过无偏倚的机器学习驱动的基因组筛选 。 将靶点识别到IND申报研究阶段的时间缩短至18个月内，比行业平均水平快一倍以上，显著加速了药物研发进程 。 4、Caris Life Sciences：肿瘤学新型靶点发现平台 Caris Life Sciences（生物技术公司）发现识别并验证肿瘤学领域中真正新颖的靶点 。 通过Caris Discovery®平台，包括专有的适体（aptamer）基蛋白质组学分析平台（ADAPT）、计算分析和机器学习预测AI 。该平台能够以系统级规模对任何实体瘤类型进行无偏倚的蛋白质组学分析 。 这一发现使得Caris能够发现并验证在传统方法中可能被忽视的新型肿瘤靶点，突破传统药物开发中靶点冗余和数量有限的瓶颈 。   4 靶点探索：深入理解与验证治疗潜力 靶点探索是指在潜在药物靶点被初步识别或挖掘出来之后，对其进行深入的生物学和药理学研究，以全面理解其在疾病发生发展中的具体作用、其“成药性”（是否能被药物有效调控），以及作为治疗干预点的可行性。这一阶段通常涉及功能基因组学（如CRISPR筛选以验证基因功能）、表型筛选、结构生物学、以及开发新型治疗模式（如核酸疗法、基因编辑）来验证和优化靶点。 4.1 靶点探索的方法 靶点探索主要通过以下方法进行： 功能基因组学： 通过系统性地操控基因表达（如基因敲除、上调、下调），观察模拟药物预期效果的表型结果，以深入理解基因型与表型之间的关系，构建疾病相关模型和检测方法 。 CRISPR基因编辑技术： 作为功能基因组学的重要工具，用于靶点验证，阐明作用机制和疾病中的生物学通路，并可用于寻找合成致死靶点 。同时，CRISPR本身也作为一种治疗模式，直接纠正或改变遗传指令 。 表型筛选： 通过观察化合物对细胞、组织或整个生物体产生的整体生物学效应来发现药物，尤其适用于疾病机制尚未完全阐明的复杂疾病 。现代表型筛选融合了高内涵成像、RNA谱分析等先进工具 。 结构生物学： 通过解析靶点分子的三维结构，理解其与药物分子的相互作用机制，指导药物设计和优化 。 蛋白质工程： 设计和构建具有特定功能的蛋白质分子，如融合蛋白、双特异性抗体、抗体偶联药物（ADC），以实现对靶点的精确调控 。 核酸靶向疗法： 开发直接结合或作用于DNA/RNA分子的药物（如反义寡核苷酸ASO、小干扰RNA siRNA、碱基编辑），调节基因表达或功能 。 4.2 靶点探索的主体 靶点探索的主体通常包括： 生物技术公司： 它们通常拥有特定的技术平台（如蛋白质工程、基因编辑平台），专注于将已识别的靶点转化为治疗候选药物 。 大型制药公司： 它们通过内部研发和外部合作，对潜在靶点进行全面的验证和优化，并将其推进到临床开发阶段 。 学术研究机构： 它们在基础研究的基础上，进一步探索靶点的功能和治疗潜力，并开发新的治疗模式 。 4.3 中国靶点探索实例 1、荣昌生物 (RemeGen)：泰它西普（Telitacicept）双靶点融合蛋白的探索与优化 荣昌生物发现BLyS（B淋巴细胞刺激因子）和APRIL（增殖诱导配体）双靶点 。重组融合蛋白技术、分子信息学优化（提升稳定性、半衰期、免疫耐受性、降低免疫原性）。通过泰它西普是全球首款、同类首创的注射用重组BLyS和APRIL双靶点新型融合蛋白产品 。其结构由人跨膜激活剂和钙调蛋白配体相互作用因子（TACI）受体的胞外域与人免疫球蛋白G（IgG）的Fc段融合而成，能够同时靶向BLyS和APRIL，有效抑制B细胞介导的自身免疫反应 。泰它西普已获批用于治疗系统性红斑狼疮（SLE），并在重症肌无力（gMG）、类风湿性关节炎、IgA肾病等多种B细胞介导的难治性自身免疫疾病的后期临床试验中展现出显著疗效和良好安全性 。 2、康方生物 (Akeso)：PD-1/VEGF-A双特异性抗体的创新探索  康方生物（生物技术公司）发现PD-1（程序性死亡受体-1）和VEGF-A（血管内皮生长因子A）双靶点 。通过双特异性抗体设计，实现配体结合的协同效应 。 康方生物的Ivonescimab（依沃西）是一款双特异性抗体，其创新之处在于将PD-1和VEGF-A这两个现有靶点以新颖的方式结合，实现了VEGF结合能够使PD-1结合增加10倍以上的协同效应 。这种独特的分子设计在非小细胞肺癌中显示出协同作用，为肿瘤治疗提供了新的策略 。 3、科伦博泰 (Kelun-Biotech)：First-in-class ADC药物的靶点特性探索 科伦博泰（生物技术公司）发现潜在First-in-class ADC靶点（具体未披露）。基于对靶点生物学特性的深入理解，并利用公司专有的“OptiDCTM”平台开发ADC药物 。SKB518已获得美国FDA和中国NMPA的IND（新药临床试验）批准，并在中国进行I期临床试验，主要关注实体瘤、自身免疫、炎症和代谢疾病等主要疾病领域，体现了对靶点特性和成药性的深入探索 。   4、礼新医药 (Lanovamedicines)：热门靶点竞争中的差异化探索 礼新医药（生物技术公司）通过药物筛选与优化，以在竞争激烈的热门靶点领域占据领先地位 。  其LM-302在胃癌及胰腺癌细胞模型中显示出优异的有效性，并在动物模型中展现出卓越的抗肿瘤活性，表明中国企业不仅在“首创”靶点上发力，也在热门靶点上通过深入探索和优化来巩固竞争优势 。   4.4 外国靶点探索实例 1、辉瑞 (Pfizer)：现代化表型筛选的回归 辉瑞公司（大型制药公司）恢复囊性纤维化（CF）患者肺细胞液膜 。通过现代化表型筛选，融合了高内涵成像、RNA谱分析和CRISPR等先进工具，主要在细胞模型中进行 。 辉瑞利用表型筛选方法来深入理解化合物如何影响“疾病相关”的细胞或组织 。例如，为CF创建的表型筛选成功找到了能够重建肺细胞表面液膜的化合物 。表型筛选在疾病机制尚未完全阐明的复杂疾病领域，如阿尔茨海默病和某些感染性疾病，已被证明是发现新颖作用机制药物的关键工具 。 2、Granite Bio (与Versant's Ridgeline Discovery Engine合作)：自身免疫疾病首创抗体的探索 Granite Bio（生物技术公司）与Versant的Ridgeline Discovery Engine（风险投资公司孵化器）发现 GRT-001（耗竭促炎单核细胞）、GRT-002（阻断白细胞介素-3, IL-3） 。通过 首创抗体疗法开发、Versant的发现引擎模式（多学科团队、先进实验室设施、与学术界合作） 。 这种模式通过提供强大的科学基础设施和运营支持，加速了学术突破向治疗候选药物的转化，尤其是在自身免疫疾病和肿瘤学等复杂领域 。 3、CRISPR基因编辑技术在靶点验证与治疗中的应用 主体： CRISPR Therapeutics、Vertex、Editas Medicine、Beam Therapeutics、Locus Biosciences、Intellia Therapeutics、PACT Pharma等生物技术公司和研究机构 。 靶点/机制： 镰状细胞病（SCD）和输血依赖型β地中海贫血（TDT）： 诱导胎儿血红蛋白（HbF）表达 。 遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性（hATTR）： 减少体内错误TTR蛋白的产生 。 尿路感染（UTI）： 靶向并破坏导致UTI的大肠杆菌菌株的基因组 。 家族性高胆固醇血症： 降低有害的低密度脂蛋白胆固醇水平 。 癌症： 针对多种转移性癌症 。 神经退行性疾病： 亨廷顿病（靶向Huntingtin基因）和帕金森病（靶向LRRK2基因） 。 探索方法： 大规模CRISPR筛选（基因敲除、上调、下调）、碱基编辑、体内/体外基因编辑、脂质纳米颗粒（LNP）递送 。 意义： CRISPR技术不仅通过精确的基因操作为靶点验证提供了前所未有的工具，极大地提高了对基因功能和疾病机制的理解；同时，CRISPR本身也作为一种革命性的治疗手段，直接纠正或改变遗传指令，为单基因疾病和传统上难以治疗的疾病提供了全新的解决方案 。 4、核酸作为药物靶点的新兴趋势 主体： Ionis Pharmaceuticals、Alnylam Pharmaceuticals、Novartis、Sanofi等制药公司和生物技术公司 。 靶点/机制： 信使RNA (mRNA)： 在癌症和神经退行性疾病等多种RNA相关疾病的治疗中变得越来越重要 。例如，Inotersen和Patisiran通过靶向转甲状腺素蛋白mRNA（Transthyretin mRNA）来治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性 。Lumasiran通过靶向羟基酸氧化酶1 mRNA（Hydroxyacid oxidase 1 mRNA）来治疗原发性高草酸尿症1型 。Mipomersen则靶向载脂蛋白B-100的mRNA（mRNA of ApoB-100）来治疗纯合子家族性高胆固醇血症 。 其他核酸靶点： Bevasiranib靶向血管内皮生长因子A长链，Fitusiran靶向抗凝血酶-III，Golodirsen靶向肌营养不良蛋白，Inclisiran靶向前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型（PCSK9），Oblimersen靶向凋亡调节因子Bcl-2 。 探索方法： 反义寡核苷酸（ASO）和小干扰RNA（siRNA）的设计与化学修饰（如硫代磷酸酯PS修饰、2'-O-甲基和2'-O-甲氧基乙基修饰、磷酰胺吗啉代寡核苷酸PMO、锁核酸LNA、乙烯桥接核酸ENA），以提高稳定性、靶向性和降低免疫原性 。 意义： 这种对核酸靶点的日益重视，标志着药物发现“可靶向空间”的显著扩展，为开发更具创新性和特异性的治疗方案提供了广阔前景 。 5. 中国与外国靶点研究比较 全球生物制药领域正经历一场显著的权力转移，中国作为新兴的创新力量，正在重塑原有的合作与竞争格局。 5.1 中国靶点研究的特色与优势 从“快速跟随者”到“首创”创新者的转变： 长期以来，中国生物制药行业被认为主要扮演“快速跟随者”的角色，即在西方创新靶点被发现后，迅速开发“me-too”或“fast follower”药物 。然而，近年来，中国正迅速向全球创新者转变。鞍石生物的伯瑞替尼和荣昌生物的泰它西普被明确描述为“First-in-class”或“全球首款”药物 。科伦博泰的SKB518也具备“潜在First-in-class”的特性 。康方生物的Ivonescimab则展示了在现有靶点基础上进行“组合创新”的强大能力 。   政府战略支持与监管优化： 中国政府自2006年以来一直将生物技术作为优先发展领域，实施了长期国家战略，并对监管生态系统进行了改革，使得药物测试在中国能够比美国更快、更经济地进行 。这为新兴的中国企业提供了竞争优势 。   人才回流与本土创新： 大量在西方受训的顶尖科学家回国，带来了先进的知识和经验，并将其转化为本土创新驱动的公司 。   AI驱动药物发现的全球领导力： 中国在AI驱动药物发现领域展现出独特的领导力和创新模式，尤其在利用生成式AI进行新靶点和新分子发现方面取得了世界级的突破 。英矽智能的Rentosertib是全球首个靶点和化合物均由生成式AI发现的药物 。中国拥有超过100家AI制药公司，并在2021年获得了超过12.6亿美元的投资 。   研发投入与科学产出： 中国在研发方面投入巨资，2023年公共研发资金可能超过200亿元人民币，并加强了知识产权框架 。中国在2023年是合成生物学、基因组测序与分析、新型抗生素和抗病毒药物等领域高被引论文数量最多的国家 。   “生物优化”药物（Biobetter）的战略： 中国企业在改进现有药物方面表现出色，通过优化分子结构以提高疗效或降低副作用，例如在抗体偶联药物（ADC）领域 。   5.2 外国靶点研究的特色与优势 传统创新领导者地位： 欧美国家长期以来是全球药物发现的领导者，拥有深厚的基础科学研究积累和完善的创新生态系统 。   多元化技术平台与方法： 大型制药公司和生物技术公司广泛采用基因组学、蛋白质组学、表型筛选、结构生物学、CRISPR基因编辑等多种技术，并不断探索新的方法 。 成熟的风险投资与孵化模式： 例如Versant Ventures的Discovery Engines模式，通过提供强大的科学基础设施和运营支持，加速学术突破向治疗候选药物的转化 。 全球合作网络： 顶尖研究机构（如Broad Institute、马萨诸塞州总医院、卡罗林斯卡学院、华盛顿大学）与全球伙伴合作，共同推动全球健康领域的靶点发现 。 核酸靶向疗法的先驱： 在核酸类药物（如ASO、siRNA）的开发和应用方面，欧美公司处于领先地位，并不断推动其技术成熟和靶点拓展 。 共同趋势与挑战 AI的深度融合： 无论是中国还是西方，AI在药物发现中的应用都正从辅助工具向核心驱动力转变，旨在加速研发进程、提高成功率并拓展“不可成药”靶点的空间 。 多组学数据整合： 双方都在向多组学数据（基因组、蛋白质组、转录组、代谢组、脂质组、多模态成像和临床数据）的深度整合转变，以构建更全面的疾病“表型指纹” 。 精准医疗的追求： 靶点发现的最终目标都是推动个性化和精准医疗的实现，通过针对特定靶点设计的药物，提高治疗效果并减少副作用 。 共性挑战： 药物研发的整体失败率依然居高不下（约90%的药物候选物在临床前或临床试验中失败），高昂的研发成本，以及AI模型结果的解释性和可重复性限制，都是全球面临的共同挑战 。 地缘政治影响： 地缘政治紧张局势对生物技术领域产生了影响，一些公司为降低风险，已将其运营进行多元化布局 。  6. 未来趋势与挑战6.1 靶点研究面临的共性挑战 尽管药物靶点研究领域取得了显著进步，但其固有挑战依然存在，并随着技术发展呈现出新的复杂性：特定靶点评估的时间和资源密集性 ：从发现到验证，每一个环节都需要大量的投入AI模型的解释性和可重复性 ：机器学习方法在靶点识别中虽然高效，但其结果的解释性和可重复性有时受到限制技术挑战 ：检测低丰度、弱结合或膜蛋白等具有挑战性的靶点仍然存在困难表型筛选中的"命中验证"和"靶点去卷积" ：如何准确地确定引起表型变化的具体分子靶点仍是重大难题高失败率与成本压力 ：药物研发的整体失败率依然居高不下，约90%的药物候选物在临床前或临床试验中失败，且整个过程可能耗时超过十年6.2 AI、基因编辑等前沿技术的发展趋势 AI的深度融合与拓展： AI在药物发现中的应用正从辅助工具向核心驱动力转变。未来的趋势是AI将更深入地整合多模态数据（包括基因组、蛋白质组、转录组、代谢组、脂质组、多模态成像和临床数据），以构建更全面的疾病"表型指纹"。生成式AI（如GANs、VAEs、GPTs）将进一步提升从头设计新型分子和靶点的能力，甚至攻克此前被认为是"不可成药"的靶点，例如内源性无序蛋白和蛋白质-蛋白质相互作用。 CRISPR基因编辑技术的双重深化： CRISPR技术将继续深化其在靶点验证和治疗应用中的双重角色。在靶点验证方面，大规模功能基因组学筛选将更加成熟，能够更精确地阐明基因功能、疾病机制和合成致死靶点。单细胞CRISPR筛选等高分辨率技术将提供更细致的细胞亚群特异性基因反应信息。在治疗应用方面，CRISPR将从治疗单基因疾病向更广泛的复杂疾病扩展，包括癌症和感染性疾病。同时，更精确的基因编辑工具（如碱基编辑）和体内递送策略的进步，将使其应用更安全、更便捷。 核酸靶向疗法的持续成熟： 核酸作为药物靶点和治疗药物的趋势将持续加强。反义寡核苷酸（ASO）和siRNA等核酸类药物的设计将更加精细化，通过更先进的化学修饰提高稳定性、靶向性和降低免疫原性。除了直接靶向mRNA，研究还将深入探索小分子药物如何结合和调节各种非编码RNA（如lncRNA、miRNA）的功能，从而开辟新的治疗途径。RNA疗法，包括mRNA疫苗和治疗性mRNA，也将继续发展，为多种疾病提供快速响应和高度特异性的解决方案。6.3 个性化与精准医疗的未来方向 药物靶点研究的最终目标之一是推动个性化和精准医疗的实现。精准医疗策略，如靶向治疗，正在逐步改变疾病治疗的格局。通过针对特定靶点设计的药物，靶向治疗能够更精确地干预疾病过程，最大限度地减少对健康组织的损伤，并提高治疗效果。 肿瘤新抗原驱动的个性化免疫治疗 肿瘤新抗原(neoantigens)是由肿瘤细胞特有的基因突变产生的蛋白质片段，可被免疫系统识别为"非己"，因此成为个性化肿瘤免疫治疗的理想靶点。这些新抗原完全特异于癌细胞，不存在于正常组织中，提供了前所未有的治疗选择性。随着新一代测序技术和生物信息学算法的进步，科学家现在能够从个体患者的肿瘤样本中鉴定出特异性的新抗原谱系：个性化癌症疫苗 ：基于患者特定的新抗原设计的疫苗(如Moderna和Merck的mRNA-4157/V940)已在临床试验中展现出与免疫检查点抑制剂联用时的显著疗效，特别是在黑色素瘤等高突变负荷肿瘤中新抗原特异性T细胞疗法 ：通过分离、扩增或工程化改造患者自身的T细胞，使其能够识别肿瘤特异性新抗原，创造真正个性化的细胞疗法预测算法的革新 ：AI和机器学习算法正在提高新抗原预测的准确性，能够更精确地识别哪些突变产生的肽段能够被HLA分子有效呈递并引发T细胞应答 此外，肿瘤新抗原研究也正在从单一新抗原扩展到新抗原"签名"概念，通过分析患者肿瘤的整体新抗原模式，更全面地预测免疫治疗反应和疾病进展。 多模态生物标志物整合 随着AI、多组学技术和基因编辑等前沿技术的不断发展，研究人员能够更深入地理解个体患者的疾病生物学特征和分子驱动因素。精准医疗正从单一生物标志物向多模态生物标志物整合方向发展： AI能够整合海量异构数据来识别和预测最适合特定患者群体的靶点，包括基因组变异、转录组表达、蛋白质组谱、代谢组特征、微生物组成分和影像学特征等 基因组学和蛋白质组学提供详细的分子图谱，揭示疾病的分子驱动机制和潜在治疗靶点 液体活检技术正在革新患者监测方式，通过检测循环肿瘤DNA、外泌体和循环肿瘤细胞，实现早期诊断和动态监测，为治疗决策提供实时信息 靶向干预的精确化 CRISPR等基因编辑工具为根据患者的基因组特征进行精确干预提供了可能。基因治疗领域正经历从罕见单基因疾病向复杂多基因疾病扩展的趋势： 体内基因编辑技术正在快速进步，例如碱基编辑器和prime编辑技术能够以更高精度修复特定基因突变 组织和细胞特异性递送系统的开发，使靶向治疗能够更精确地在需要的组织和细胞中发挥作用 RNA靶向治疗(如ASO和siRNA)提供了比传统小分子和抗体更高度特异性的干预选择 这种技术融合将使得药物开发能够从"一刀切"的模式转向为特定患者群体甚至个体量身定制的疗法，从而最大化疗效并最小化副作用。精准医疗将持续驱动对高度精细的生物学数据、先进诊断工具和创新治疗模式的需求，以期精确调节疾病驱动机制，最终实现更有效、更安全的临床治疗。 随着这些技术的成熟，我们正进入一个能够为每位患者提供真正个性化治疗方案的时代，其中药物靶点的精准识别和靶向干预将成为实现这一愿景的核心要素。 7. 结论 靶点发现、挖掘与探索的比较 维度 靶点发现 靶点挖掘 靶点探索核心目标 确认新的生物分子为潜在药物靶点 深入研究靶点功能与作用机制 拓展靶点在新适应症、新组合中的应用主要方法 人类遗传学、多组学分析、高通量筛选、AI预测 结构生物学、化学生物学、蛋白质组学、功能验证 药理学拓展、联合治疗策略、耐药机制研究主要主体 学术机构、独立Biotech、大型药企研发部门 专业靶点公司、AI驱动的生物技术公司、大型药企早期研发部门 生物技术公司、大型药企后期开发团队、临床研究联盟代表案例 药物牧场的ALPK1、英矽智能的TNIK BRD4分析平台、PROTAC技术平台、BenevolentAI的AI挖掘 BTK抑制剂从血液肿瘤到自身免疫疾病的拓展时间周期 5-10年 2-5年 3-8年成功关键 机制创新、可药性分析、临床转化潜力 深度机制解析、选择性工具开发、多维验证 转化医学证据、精准适应症定位、联合用药策略风险特点 高风险、高回报，成功率低但影响大 中等风险，与已有知识关联度高 风险相对可控，基于已验证靶点的拓展 药物靶点研究是生物医药创新的核心驱动力，其战略意义在于为未满足的医疗需求提供精准、高效的治疗方案。当前，全球药物靶点研究正经历一场深刻的范式变革，主要体现在以下几个方面： 方法论的多元化与融合：传统的基因组学、蛋白质组学和生物信息学方法持续深化，并与高通量筛选、功能基因组学（特别是CRISPR筛选）等技术深度融合，共同构建疾病的分子图谱。表型筛选在现代化工具的赋能下强势回归，尤其在疾病机制复杂或不明朗的领域，展现出发现首创药物的独特优势。 AI的颠覆性作用：人工智能已成为加速靶点发现、拓展"成药性"边界的关键力量。AI通过整合海量多组学数据、文献信息，实现新靶点的快速识别和优先级排序。生成式AI能够从头设计具有理想特性的新型分子，甚至攻克传统上"不可成药"的靶点。AI驱动的药物发现显著缩短了研发时间线，并提高了早期临床阶段的成功率。 靶点类型的拓展：药物靶点已不再局限于蛋白质，核酸（特别是mRNA）正日益成为重要的治疗靶点。核酸类药物的技术不断成熟，并展现出高度的靶向性和特异性。小分子化合物也开始被设计用于直接调节RNA通路，进一步拓宽了"可靶向空间"。 中国创新的崛起：中国在药物靶点研究领域正从"快速跟随者"向"首创"和"同类最佳"的创新者转变。本土企业在肿瘤和自身免疫疾病领域取得了全球首创或具有国际影响力的突破。中国在AI驱动药物发现方面表现尤为突出，英矽智能的Rentosertib是全球首个靶点和化合物均由生成式AI发现的药物。 全球格局的演变：中国生物制药的崛起正在重塑全球竞争格局，许可交易的增加和研发速度的提升，使得中国成为全球药物研发的重要力量。然而，高昂的研发成本、临床试验的高失败率、AI模型的可解释性问题以及地缘政治因素，仍然是药物发现面临的共性挑战。 展望未来，靶点研究将更加依赖于多学科的交叉融合和技术的协同作用。AI、基因编辑和多组学技术将共同推动精准医疗的深入发展，实现针对特定患者群体甚至个体的定制化治疗。全球合作与竞争将持续演进，创新能力将成为各国和企业在生物医药领域取得领先地位的关键。克服现有挑战，持续投资于基础研究和前沿技术，将是确保新药研发管线持续产出，最终惠及全球患者的关键。 中国创新的崛起：中国在药物靶点研究领域正从“快速跟随者”向“首创”和“同类最佳”的创新者转变。本土企业如鞍石生物科技（伯瑞替尼）、荣昌生物（泰它西普）、康方生物（Ivonescimab）等，在肿瘤和自身免疫疾病领域取得了全球首创或具有国际影响力的突破 。中国科研院所，如中国科学院上海有机化学研究所和中国医科大学，也在帕金森病新靶点发现和异基因CAR-T疗法等前沿领域取得重要进展 。中国在AI驱动药物发现方面表现尤为突出，英矽智能的Rentosertib是全球首个靶点和化合物均由生成式AI发现的药物 。   全球格局的演变与挑战：中国生物制药的崛起正在重塑全球竞争格局，许可交易的增加和研发速度的提升，使得中国成为全球药物研发的重要力量 。然而，高昂的研发成本、临床试验的高失败率、AI模型的可解释性问题以及地缘政治因素，仍然是药物发现面临的共性挑战 。   展望未来，药物靶点研究将更加依赖于多学科的交叉融合和技术的协同作用。AI、基因编辑和多组学技术将共同推动精准医疗的深入发展，实现针对特定患者群体甚至个体的定制化治疗 。全球合作与竞争将持续演进，创新能力将成为各国和企业在生物医药领域取得领先地位的关键。克服现有挑战，持续投资于基础研究和前沿技术，将是确保新药研发管线持续产出，最终惠及全球患者的关键。 二、独家原创|周虎博士:新技术/策略在难成药靶点药物发现中的作用 （原创 药学进展 药学进展） 新技术/策略在难成药靶点药物发现中的作用 PPS  茹愫洁 1,2，黄蕙 2,3，孟乾 2，周虎 1,2,3* （1. 南京中医药大学新中药学院，江苏 南京 210023；2. 中国科学院上海药物研究所，上海 200120；3. 国科大杭州高等研究院，浙江 杭州 310024） [摘要] 药物靶标发现是现代医药研发的基石，对实现药物高选择性和有效治疗至关重要。作为一项新兴技术，化学蛋白质组学结合化学生物学与蛋白质组学，推动了药物靶标发现的进展。概述针对难成药靶点的突破性技术 / 策略，包括蛋白降解剂、共价抑制剂等，探讨基于化学蛋白质组学的靶标发现技术在难成药靶点药物发现中的作用，为攻克难成药靶点提供了新的思路和方向。 药物发现是现代生物医学研究中最具挑战性和关键性的领域之一。随着疾病机制研究的不断深入及技术手段的发展，药物靶点的识别与验证已成为新药研发过程中的核心环节。药物靶点通常指在体内与药物产生特异性结合并介导生物学效应的分子，主要包括蛋白质、核酸及其他大分子。通过调控这些靶点的功能，药物能够干预相关信号通路，从而达到治疗目的 [1-2]。当前药物研发主要依赖 2 种策略，分别是基于表型的药物发现（phenotypic-based drug discovery，PDD ）和基于靶点的药物发现（target-based drug discovery ，TDD ）。PDD 通过观察细胞、组织或整个有机体的表型变化来筛选和识别药物，依赖于对生物体整体的反应来评估药效，适用于机制复杂或多基因相关的疾病研究；TDD 则针对特定生物分子靶点设计化合物，针对性强，可直接作用于靶点分子进行特异性调控。然而，PDD 的局限性在于难以解析分子机制和确认核心靶点，导致后续优化困难；TDD 面临的关键挑战则是传统可成药靶点的数量有限，且对靶点结构特征有较高要求 [1-2]。 目前，传统药物靶点大多是具有明确结构特征、能够稳定结合小分子的蛋白质。然而，越来越多研究发现，许多在生理和病理过程中发挥关键作用的蛋白质并不具备典型的小分子结合口袋，这类难成药靶点通常具有结构无序、高度动态或依赖蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI ）维持功能等特征，使其难以通过常规药物设计策略进行有效干预，严重阻碍新药开发。随着基础研究和新技术/策略（如蛋白降解剂、共价抑制剂等）的不断发展，诸如 Kirsten 大鼠肉瘤病毒癌基因同源 物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog ， KRAS）编码蛋白等难成药靶点已不再是难以逾越的障碍。其中，化学蛋白质组学靶标发现技术的发展为 PDD 和 TDD 策略的互补融合提供了可能，能够高效地将药物、靶点和疾病联系起来，极大地促进了难成药靶点的药物发现。其将定量蛋白质组学技术与化学生物学方法或生物物理学原理相结合，从而实现小分子在细胞或组织体系中的全局靶点筛选，为药物靶标发现技术带来了重大突破 [3]。 1 难成药靶点蛋白的类型与靶向策略研究 在药物研发过程中，TDD 策略面临的挑战之一是针对已知靶标蛋白如何设计有效结合的小分子化合物。在药物发现与研究中有效的药物靶点至关重要，其不仅具备与药物特异性结合的能力，还需要在体内发挥明确的治疗效果 [4]。理想的可成药靶点通常具有清晰的结构和功能特征，能与配体形成高亲和力的结合，并通过传统药物设计策略进行有效干预。然而随着越来越多靶标蛋白被发现，难成药靶点蛋白逐渐受到关注。这类蛋白通常具有复杂的结构和多样的功能，因其表面平坦且缺乏可靶向的结合口袋而难以作为药物的靶点，为药物设计带来了重大挑战 [5-6]。 1.1  难成药靶点蛋白的分类 难成药靶点蛋白通常分为以下几类：1 ）小GTP 酶类（small GTPases）。如大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（rat sarcoma viral oncogene homolog， RAS）编码的 RAS 家族蛋白 [ 包括 KRAS 蛋 白、 Harvey 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog，HRAS） 编 码 的HRAS 蛋白、神经母细胞瘤大鼠肉瘤病毒癌基因同 源 物（neuroblastoma rat sarcoma viral oncogene homolog，NRAS）编码的 NRAS 蛋白]，因表面缺乏可靶向口袋而被认为是难成药蛋白 [6-7] 。2）磷酸酶类。与激酶的作用相反，磷酸酶是一种催化蛋白质[ 包括丝氨酸（serine，Ser）、苏氨酸和酪氨酸残基 ]去磷酸化的酶。根据结构特征，磷酸酶被分为碱性磷酸酶和酸性磷酸酶。由于磷酸酶的结构存在很多相似性，具有选择性低和副作用大等问题，因此被认为是难成药靶点蛋白 [8] 。3）转录因子类。转录因子在基因表达调控中发挥核心作用，其功能失调与多种疾病密切相关，如肿瘤相关转录因子 [p53 和髓细胞瘤病毒癌基因同源物（myelocytomatosis virus oncogene homolog，Myc）编码的 Myc 蛋白等 ] 在癌症发生发展中起重要作用。然而，转录因子通常缺乏典型的小分子结合口袋，由于其结构异质性和缺乏结合位点，无法被小分子药物靶向 [6, 9] 。4）表观遗传类靶点。该类靶点在基因表达调节中起关键作用，主要通过 DNA 甲基化、组蛋白修饰等过程改变基因表达模式，进而影响细胞分化、肿瘤发生及多种疾病的进程，例如组蛋白甲基转移酶 zeste 增强子同源物 2 在多种癌症中呈高表达，可抑制抑癌基因的表达。然而由于表观遗传修饰具有可逆性和复杂性，调控范围广泛且特异性差，易产生脱靶效应和毒性，因此其靶向干预面临较大挑战 [10] 。5 ）PPI及其网络。PPI 在生物过程和细胞周期调节中至关重要。而大多数 PPI 表面相对平坦，使得传统药物难以有效结合。例如，B 细胞淋巴瘤/白血病-2 家族的抗凋亡蛋白和本质无序蛋白，由于其高度动态的结构和缺乏稳定的结合位点而难以靶向。近年来蛋白降解靶向嵌合体（proteolysis-targeting chimera， PROTAC）等新型技术的出现，为 PPI靶点的成药性提供了新方案 [11-12]。 1.2  靶向难成药蛋白的药物设计策略与前沿技术 随着机制研究和多种新技术的快速发展，难成药靶点药物的研发已不再是难以攻克的难题。目前，一些新技术和药物设计策略被应用于靶向难成药蛋白，其中常用的技术/策略包括蛋白降解剂、共价抑制剂、变构调节剂、化学诱导邻近技术（chemically induced proximity ，CIP）、基因治疗和人工智能（artificial intelligence，AI）制药等 [13]。 1.2.1  蛋白降解剂蛋白降解剂是目前针对难成药靶点的重要研发策略之一，可通过细胞内蛋白降解途径靶向目标蛋白降解。蛋白降解剂包括多种类型， 如 PROTAC、分子胶降解剂（molecular glue degrader，MGD）、溶酶体靶向嵌合体（lysosome- targeting chimera，LYTAC）、自噬体偶联化合物（autophagosome-tethering compound，ATTEC）等，其中，PROTAC 和分子胶是研究最为广泛的 2 种类型 [8, 14]。 真核细胞中负责蛋白质降解的两大系统分别是泛素-蛋白酶体系统和自噬 - 溶酶体系统。PROTAC是通过泛素-蛋白酶体系统靶向蛋白降解的一种技术 [15] 。PROTAC 分子通常由 E3 泛素连接酶配体、靶蛋白配体，以及连接这两者的连接子（linker）组成。其中，E3 泛素连接酶配体负责特异性招募 E3泛素连接酶，靶蛋白配体则识别并结合目标蛋白 [16]。 PROTAC 分子可将 E3 泛素连接酶募集到靶蛋白附近，为其贴上泛素标签，并最终被蛋白酶体降解。 PROTAC 技术最早由 Crews 等人于 2001 年提出，其原理是利用机体内固有的蛋白降解系统降低靶标蛋白水平，从而实现治疗疾病的目的 [5, 17]。与传统小分子抑制剂或抗体药物相比，PROTAC 的优势在于其对靶标蛋白的抑制作用不依赖于药物直接结合，而是通过降解目标蛋白发挥作用。这一特性使其尤其适用于传统难以靶向的蛋白质，如无活性位点或无序结构蛋白等。目前，PROTAC 技术已成为难成药靶点研发领域的重要工具之一。 MGD 是一种能够诱导泛素 E3 连接酶复合体与靶标蛋白发生相互作用，从而促进蛋白降解的靶向降解策略。MGD 通过拉近目标蛋白与 E3 连接酶的空间距离，增强、稳定或诱导两者形成新的蛋白间相互作用，改变靶蛋白或 E3 连接酶的构象，从而促进目标蛋白的泛素化降解。与 PROTAC 相比， MGD 通常由单一小分子组成，不需要额外的靶蛋白配体和连接子，具有较高的通透性和更佳的药代动力学特性。临床上免疫调节剂沙利度胺、来那度胺、泊马度胺等就是典型的分子胶药物，它们通过介导淋巴细胞增殖关键转录因子（IKAROS 家族锌指蛋白 1/3）降解来发挥抗肿瘤作用 [18-19]。 此外，基于自噬-溶酶体系统的新型蛋白降解策略也逐渐受到关注，包括 LYTAC 和 ATTEC 等方法。通过溶酶体途径可降解难以通过泛素-蛋白酶体系统处理的靶标蛋白，有望与现有蛋白降解剂互补，拓展可降解靶标蛋白的范围 [20]。 1.2.2  共价抑制剂 共价抑制剂一般通过温和的反应性官能团与靶标蛋白的氨基酸残基结合形成共价键，在药物结合引起的非共价相互作用之外提供额外的亲和力。针对缺乏表面“口袋”的难成药蛋白质，共价抑制剂在药物研发中展现出极大潜力，为治疗复杂疾病提供了新的可能性。 针对 KRAS 的共价抑制剂是当前难成药靶点研究的热点之一。KRAS 是一种小 GTP 酶，在细胞生长调控信号通路中起着至关重要的作用 [21-22] 。然而，KRAS 蛋白结构近球形，缺乏明确的小分子结合位点，长期以来被认为是难成药靶点。这一难题在 2021 年取得突破：美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准了首个靶向 KRASG12C  突变的创新药 sotorasib，标志着“不可成药”靶点药物研发进入新阶段。Sotorasib 是通过共价结合突变位点 Cys12，将 KRAS 锁定在非活性的鸟苷二磷酸结合状态，从而阻断其信号传导功能，实现对肿瘤的特异性抑制。目前 sotorasib 可用于治疗携带 KRASG12C  突变的腺癌、转移性结直肠癌和非小细胞肺癌等多种疾病，为相关肿瘤患者带来治疗希望 [23-24]。 表 皮 生 长 因 子 受 体（epidermal growth factor receptor，EGFR）共价抑制剂通过特异性与酪氨酸激酶活性位点结合，抑制 EGFR 激酶活性，从而抑制肿瘤细胞增殖 [25-26]。例如，第 3 代 EGFR 抑制剂奥希替尼和阿美替尼已被广泛应用于治疗 EGFR 突变引起的非小细胞肺癌 [27] 。此外，p53 作为调控细胞周期和凋亡的关键肿瘤抑制蛋白，其功能往往受突变或失活影响，导致细胞增殖异常，因此通过共价抑制剂恢复 p53 功能成为癌症治疗的全新思路和重要策略之一 [28-29]。 1.2.3  变构调节剂 传统药物设计通常聚焦于靶标蛋白的正构位点，即直接作用于活性位点来调节蛋白质的功能。然而对于难成药靶点蛋白，变构调节剂作为一种创新的药物设计策略，引起越来越多的关注。与直接作用于活性位点的传统药物不同，变构调节剂通过结合靶标蛋白的变构位点，改变蛋白质的构象状态，从而影响其与底物的亲和力及结合能力 [30] 。变构调节剂可分为 2 类：变构激活剂（allosteric activator），通过结合变构位点使受体构象发生变化，从而改变活性位点构象，促进底物和受体的结合；变构抑制剂（allosteric inhibitor）， 结合于变构位点，从而阻止底物与活性位点的结合 [31-32]。近年来，基于共价抑制与变构调节的联合策略，为难成药靶点蛋白的干预提供了新的解决方案。例如，上述提到的 sotorasib，作为首个获得 FDA 批准的 KRAS 共价抑制剂，同时也具备变构抑制剂的特性。Sotorasib通过与变构位点残基共价结合，使 KRASG12C  突变体稳定在失活状态，从而发挥抑制作用 [21-22]。 1.2.4  CIP  CIP 是一种利用双功能小分子诱导，使难成药靶点蛋白与效应分子相互靠近而发生蛋白质相互作用，从而实现特定生物学效应的技术。该技术分为 2 个独立的结构域：靶蛋白结合域和效应蛋白募集域。研究表明，CIP 技术可促进伴侣蛋白和KRAS 接近，形成“伴侣蛋白-药物分子-KRASG12C”三元复合物，从而抑制 KRAS 活性，抑制癌细胞生长增殖，对非小细胞肺癌和结直肠癌有显著的治疗效果，为难成药靶点的药物研发提供了新思路 [33]。 1.2.5  基因治疗 沿中心法则上游出发，针对传统小分子难以靶向的难成药蛋白，可通过基因层面干预，实现对这些靶点的功能调控，从而拓展难成药靶点蛋白的药物发现策略。基因治疗通过靶向 DNA 或RNA 来调节基因表达，常见的策略包括运输正常基因以替代突变基因、导入新基因、激活或敲除突变基因等。例如正在开发的靶向 c-Myc mRNA 小分子，通过抑制 c-Myc 蛋白的表达来阻断其功能 [32]。此外，成簇的规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats ，CRISPR ）/ CRISPR 相关蛋白 9（CRISPR-associated protein 9 ， Cas9）技术能够直接靶向 DNA 进行基因敲除，相较于传统依赖转录后调控的方法，更具精确性和持久性，有望在难成药靶点药物研究中发挥优势 [34]。 1.2.6  AI 制药 近年来，随着 AI 和深度学习等技术不断发展，AI 制药作为一项新兴工具在难成药靶点药物开发中逐渐取得优势 [35] 。近期，新一代 AI 生物分子结构预测模型 AlphaFold 3 发布，实现了对蛋白质、核酸分子、配体小分子及离子等结构的预测。AI 制药可通过数据分析和 AI 算法实现难成药蛋白的结构预测以及药物设计，拓展初始蛋白结构库，推动难成药靶点的发现以及成药机制的深入探究 [36] 。目前，全球已有多个针对难成药靶点在研的AI 制药药物处于研发阶段，如 Relay Therapeutics开发的含 Src 同源 2 结构域蛋白酪氨酸磷酸酶 2（Src homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase 2，SHP2）抑制剂GDC-1971（RLY-1971 ），结合并稳定 SHP2 的非活性构象 [35] 。此外，AI 技术还可以应用于 RNA 研究，通过 AI 模型训练生成并分析大量 RNA 的结构和功能方面的数据，为难成药靶点药物的研发提供了新的可能性 [37]。 2 基于化学蛋白质组学的靶标发现技术 随着难成药靶点研究的不断深入，依赖于已知靶点的药物发现方法日益显现出局限性，难以有效覆盖结构不规则、功能尚不明确或缺乏典型配体结合口袋的难成药靶点。而基于化学蛋白质组学的药物靶标发现技术能够在无需先验靶点信息的条件下，系统解析小分子与蛋白质的相互作用，还能够高通量地识别难成药靶点的小分子配体，为靶标发现和机制解析提供了强有力的支持。该技术通过高分辨率质谱结合生物信息学分析，可系统筛选与小分子结合的蛋白质，进而识别潜在靶标。基于化学蛋白质组学的靶标发现技术主要分为基于化学探针的靶标发现方法和非标记的靶标发现方法（见表 1 ）。其中，基于化学探针的靶标发现方法依赖于特定化学探针捕获靶标蛋白，是化学蛋白质组学中的经典策略；相比之下，非标记的靶标发现方法主要是通过检测蛋白质稳定性或构象变化来识别靶标，随着高分辨率质谱和定量蛋白质组学的发展，近年来受到越来越多的关注。 2.1  基于化学探针的靶标发现方法 基于化学探针的靶标发现方法主要利用含特定报告基团或亲和基团的化学探针，在细胞裂解液或组织匀浆中孵育，识别和富集与探针结合的蛋白质，并借助定量蛋白质组学技术对潜在靶标蛋白进行分析和鉴定。这一过程通常被称为基于探针的化学蛋白质组学（probe-based chemical proteomics）[37-38] 。这种方法的核心优势在于可直接捕获靶标蛋白，极大提高了靶点鉴定的特异性和准确性。根据工作流程不同，基于化学探针的靶标发现方法通常分为以化合物为中心的化学蛋白质组学（compound-centric chemical proteomics ，CCCP）和基于活性的蛋白质分析（affinity-based protein profiling，ABPP ）[39]。 2.1.1  CCCP  CCCP 方法是基于小分子与靶标蛋白之间的强亲和力相互作用，进行靶标蛋白捕获和鉴定的一种方法。该方法将亲和纯化色谱与质谱技术相结合，在小分子化合物或特定药物上引入可衍生化的官能团，使其固定于固相基质（如琼脂糖珠或磁性颗粒）上。随后将修饰后的固相基质与细胞裂解物共孵育，使靶标蛋白与小分子结合，最终通过定量蛋白质组学技术对富集的靶标蛋白进行分析和鉴定 [40]。 CCCP 方法是化合物靶标发现中较为经典的方法，不仅可以精确捕获靶标蛋白，还能揭示小分子与蛋白质相互作用的竞争性结合信息 [41] 。例如，Wang 等 [42] 利用 CCCP 技术发现膜联蛋白 A2 （annexin A2，ANXA2）是抗肿瘤药物博来霉素的直接结合靶标蛋白。博来霉素与 ANXA2 的结合可阻碍转录因子 EB 诱导的自噬通量，从而导致肺纤维化的发生。这项研究不仅揭示了博来霉素致纤维化的分子机制，也突出了 CCCP 方法在靶标发现及作用机制解析中的价值。随着技术发展，CCCP 技术有望在难成药靶点发现中发挥作用，为药物安全性改进和机制导向的药物设计提供有力支持。 2.1.2  ABPP  ABPP 最早由美国 Cravatt 团队提出，在 CCCP 技术的基础上发展而来，是一种更为方便、适用范围更广的方法 [43] 。ABPP 的核心原理是利用基于活性位点导向的化学探针，通过共价或非共价方式特异性结合蛋白质的活性位点，从而实现功能状态酶和药物靶标等蛋白质的识别 [44] 。相较于CCCP，ABPP 可检测识别蛋白质的活化状态，在机制研究及先导化合物筛选中显示出极大的优势。其中，ABPP 的关键步骤在于活性化学探针的设计与合成。探针通常由反应基团和化学标签 2 个主要部分组成，反应基团负责与蛋白质活性位点结合或共价修饰，化学标签（如生物素、荧光素等标记分子）负责富集靶标蛋白。近年来研究表明，ABPP 技术能够利用特异性化学探针靶向蛋白质中具有高反应活性的氨基酸 [ 如半胱氨酸（cysteine ，Cys）、赖氨酸（lysine，Lys）和 Ser 等 ] 残基，在活细胞体系中直接监测小分子与蛋白质的相互作用，从而拓展了可靶向蛋白的范围，为共价抑制剂的新靶标发现提供了重要线索。以北京大学王初教授团队开发的基于数据非依赖采集（data-independent acquisition ， DIA）的 ABPP 方法为例，该方法面向含有共价弹头（warhead，如丙烯酰胺或氯乙酰胺）的小分子片段库，通过竞争性结合实验，在活细胞中识别小分子与靶蛋白中 Cys 残基的共价相互作用。这种方法在一次筛选中可覆盖 20 000 余个 Cys 位点，既保留了先导化合物在活细胞内的真实结合特性，又突破了难成药靶点的技术瓶颈，为那些缺乏传统结合口袋的蛋白质提供了潜在的共价靶点 [45]。 2.2  非标记的药物靶标发现方法 目前，基于化学探针的靶标发现方法已得到广泛应用，但仍存在一定的局限性，例如化学探针可能会导致非特异性结合影响靶标的准确性，化学修饰过程费时费力，可能改变靶蛋白的构象或活性从而使其失去生物功能。为克服这些局限性，近年来非标记的药物靶标发现方法得到广泛的研究与快速发展。其中主要的非标记靶标发现方法包括细胞热转移分析（cellular thermal shift assay，CETSA）、热蛋白质组分析（thermal proteome profiling，TPP）、药物亲和反应靶点稳定性方法（drug affinity responsive target stability，DARTS）、限制性蛋白水解-质谱分析（limited proteolysis-mass spectrometry，LiP-MS）、以肽段为中心的蛋白质局部稳定性探测方法（peptide-centric local stability assay，PELSA）、基于氧化速率的蛋白稳定性方法（stability of proteins from rates of oxidation， SPROX）以及基于化学变性的蛋白沉淀法（chemical denaturation and protein precipitation ，CPP）等。这些方法的核心原理相似：当蛋白质与配体药物结合后，其稳定性通常会增加，进而增强对热变性、蛋白酶水解和氧化变性等外界因素的抵抗力。相比于基于化学探针的靶标发现方法，非标记靶标发现方法能够减少因化学修饰带来的干扰，提高靶标鉴定的可靠性，因此在药物发现及难成药靶点研究中具有广阔的应用前景。 2.2.1  CETSA  CETSA 最早由瑞典 Karolinska 研究所于 2013 年开发，其原理是通过温度变化观察蛋白质在药物存在下的稳定性变化。当蛋白质与药物结合时，其热稳定性通常会变化，导致蛋白质的热熔曲线改变，从而检测潜在的靶点 [46]。 CETSA 可适用于细胞裂解液、完整细胞或组织样本，然而该方法的局限性在于短时间内只能检测少量蛋白质。近年来，研究者开发了一种新技术——TPP，恰好弥补了这一缺点 [47] 。TPP 技术将CETSA 与定量蛋白质组学技术结合，通过质谱对不同温度下未变性的可溶性蛋白质进行定量分析，系统性识别潜在的靶标蛋白。目前广泛应用于抗肿瘤药物靶标发现及蛋白质相互作用研究，为非标记靶标发现提供了更高效、全面的解决方案 [46]。例如，  Walters 等 [48]  利用 TPP 技术发现小分子 Ro-08-2750可显著改变 RNA 结合蛋白（RNA-binding proteins ， RBPs）的热稳定性， 特别是含 RNA 识别基序（RNA recognition motif，RRM）结构域的 RBPs。其中， RBPs 因表面缺乏明显的小分子结合口袋，且功能高度依赖RNA介导的复合物结构，被视为难成药靶点。这一发现提示 Ro-08-2750 可广谱干扰多个 RBP- RNA 复合物，而非单一靶点抑制，为RNA 结合蛋白等难成药靶点的药物发现提供了新的思路。 2.2.2  DARTS  DARTS 是经典的非标记靶标发现方法之一。该技术由 Lomenick 等 [49] 于 2009 年开发，其核心原理是基于药物与靶标蛋白结合后可增强靶标蛋白结构稳定性，从而抗蛋白酶水解。如图 1 所示，在生理条件下，蛋白质构象处于动态变化状态，能够被各种蛋白酶降解，而当药物结合时，靶标蛋白的构象更加稳定，对蛋白酶水解的抵抗能力显著增强。目前 DARTS 方法广泛应用于小分子靶标的初步筛选和验证，在老药新用研究中也发挥重要作用，有研究通过 DARTS 方法发现传统抗过敏药物地氯雷他定可直接靶向 N-肉豆蔻酰转移酶 1，抑制其介导的蛋白质肉豆蔻酰化从而发挥抗肝癌作用 [50]。 然而，DARTS 技术存在一定的局限性，其不适用于药物与靶标蛋白结合亲和力较弱的情况，同时受限于不同蛋白质对蛋白酶降解的固有差异，从而导致靶标检测的灵敏度不足。近年来，在 DARTS的基础上发展了一种新技术——LiP-MS[51] 。其原理是当药物与小分子结合后，蛋白构象发生变化，遮盖了原有的广谱性蛋白酶酶切位点，从而产生不同的酶切片段。LiP-MS 通常采用蛋白酶 K 进行有限水解，切割蛋白质暴露在外的未折叠部分。随后将蛋白变性后用胰酶进行二次酶切，仅酶切 Lys 或精氨酸位点的肽段，而其他氨基酸位点肽段由蛋白酶K 酶切产生，最终通过液相色谱-串联质谱分析比较药物处理组和对照组的肽段分布及蛋白丰度差异，从而实现靶标筛选（见图 1 ）[52] 。这一方法在高通量筛选与高灵敏度检测方面表现出色，广泛应用于小分子药物靶标鉴定，有研究表明利用 LiP-MS 技术鉴定到蛋白磷酸酶 2A 作为抗癌药物洛米替定的直接靶点，为难成药靶点药物研究和作用机制解析提供了有力工具 [53]。 2.2.3  PELSA  PELSA 是最新发展的一种基于肽段水平检测蛋白质局部稳定性的技术，应用于药物靶标筛选和蛋白质相互作用研究 [54] 。其原理是根据药物与靶标蛋白结合后会改变蛋白质结合区域的稳定性，从而影响蛋白的酶切效率。在实验过程中，利用大量胰蛋白酶（酶与底物质量比为 1/2），将蛋白质酶切成小肽段，并与未被酶切的蛋白大片段分离开来，最终利用定量蛋白质组学技术检测肽段丰度发生变化的蛋白质，从而有效筛选并鉴定潜在的靶标蛋白和结合区域（见图 1 ）。相较于 LiP-MS，PELSA大大降低了样品的复杂度，具有更高的靶标蛋白鉴定灵敏度，能够在蛋白质组水平精准识别多种配体的靶标蛋白及其结合区域，在检测蛋白质翻译后修饰、抗体表位以及弱蛋白-配体相互作用等方面发挥重要作用 [54] 。因此，PELSA 技术在药物靶标筛选、药物辅助设计及蛋白功能状态研究等方面具有广泛的应用前景，未来有望助力解析复杂蛋白功能，推动难成药靶点药物的开发与应用。 2.2.4  SPROX  通常情况下，与药物结合的蛋白质相对不容易被化学变性剂诱导发生变性，靶标蛋白的抗氧化能力增强。SPROX 就是根据这一原理，通过检测靶标蛋白中甲硫氨酸（methionine，Met）的氧化水平，从而测定并识别靶标蛋白。目前 SPROX技术成功应用于酵母系统中，并鉴定出白藜芦醇的多个靶点，包括与胞质醛脱氢酶和翻译相关的蛋白质，进一步揭示了白藜芦醇的作用机制 [55] 。然而， SPROX 技术的局限性在于其对 Met 残基的依赖性，而蛋白质中 Met 含量较低，限制了可检测的蛋白质范围。此外，SPROX 仅适用于细胞裂解液的分析，因此在一定程度上限制了该技术的进一步应用。 2.2.5   CPP   CPP 是一种新型的非修饰目标分子靶标发现策略，用于大规模检测靶标蛋白和定量蛋白质 - 药物相互作用。该方法结合 SPROX 技术与TPP 技术原理，利用化学变性剂诱导蛋白质沉淀，比较给药组和对照组样品中的蛋白质沉淀情况从而筛选靶标蛋白并量化蛋白质- 药物结合亲和力。 CPP 方法操作简单，适用于高通量筛选，能减少背景噪音，有效提高蛋白质组学覆盖率。然而对化学变性剂的选择需谨慎，以免影响靶标蛋白的稳定性和活性 [56]。 3 结语与展望 药物发现是现代生物医学研究中至关重要的领域，随着科学技术的不断进步，难成药靶点蛋白的研究逐渐成为药物发现领域的热点和挑战。难成药靶点蛋白因其结构复杂、缺乏传统结合口袋等特性，难以通过常规药物设计策略进行有效干预。靶向这类蛋白虽具挑战性，但也为疾病治疗提供了新机遇。目前针对难成药靶点蛋白，已经开发了多种直接或间接靶向的技术 / 策略，包括蛋白降解剂、共价抑制剂、变构调节剂和基因治疗等，在靶向设计和技术开发等方面取得了显著进展。然而这些技术 / 策略也面临着分子复杂性、成药性瓶颈以及潜在脱靶风险等多重挑战，有待进一步通过多维度技术整合，实现对难成药靶标蛋白更精准的识别与表征。 近年来，基于化学蛋白质组学的靶标发现技术取得了重要突破，为难成药靶点药物发现与先导化合物筛选提供了有力工具，加速了其向成药靶点的转化进程 [57] 。基于化学蛋白质组学的靶标发现技术与其他技术相比有着显著优势。目前， BridGene Biosciences 公司开发创建的化学蛋白质组 学 平 台 IMTACTM（Isobaric Mass Tagged Affinity Characterization）可在活细胞中对全蛋白质组，特别是难以成药且与疾病密切相关的靶点，筛选小分子药物，为难成药靶点的药物开发带来了前所未有的机遇 [58]。此外，AI 和机器学习技术的快速发展也为药物发现不断注入新活力。整合计算模拟和大数据分析，不仅能够加速药物分子结构的优化，还能精准预测靶标蛋白的动态变化与配体结合模式。这些技术的发展将进一步提高药物的靶向性与亲和力，为难治疾病的临床治疗开辟新的方向，为药物研发带来革命性突破。 参考文献： [1] Ha J, Park H, Park J, et al. 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BridGene Biosciences’ IMTAC™ Small Molecule Discovery Platform Featured in Multiple Presentations at 2021 AACR-NCI-EORTC Virtual International Conference on Molecular Targets and Cancer Therapeutics[EB/OL].(2021-10-07)[2025-03-28]. https://www.prnewswire.com/news-releases/bridgene  biosciences-imtac--small-molecule-discovery-platform-featured-in multiple-presentations-at-2021-aacr-nci-eortc-virtual-international conference-on-molecular-targets-and-cancer-therapeutics-301395183.html. 周虎 博士，中国科学院上海药物研究所质谱中心负责人/ 研究员/ 博士生导师/ 课题组长，国家自然科学基金青年科学基金项目（A 类）获得者，中国生物化学与分子生物学会蛋白质组学专委会委员，中国生物化学与分子生物学会分子系统生物学专委会委员。2001 年于南开大学获生物学学士学位，2007 年于中科院上海生物化学与细胞生物学研究所获生物化学与分子生物学博士学位。2008—2012 年在渥太华大学系统生物学研究所进行博士后研究，其间担任质谱实验室主管，2012 年 3 月担任中国科学院上海药物研究所研究员和课题组长。研究方向为基于质谱的药物蛋白质组学研究：1 ）有机小分子和生物大分子相互作用的质谱方法学研究；2 ）转化蛋白质组学研究；3）药物蛋白质组学研究，以寻找药物小分子的作用靶点及其作用机制。已在 Cell, Cancer Cell 等 SCI 期刊上发表论文 100 余篇。 三、用 DrugDomain 查药物靶点与结合结构，全流程教程 （原创 药研猿 药研猿） 无论是寻找药物靶点，还是探索蛋白的结合分子，我们都希望有一个工具能快速给出答案。DrugDomain 数据库正好满足这一需求：输入一个药物或蛋白，就能立刻看到它的“关系网”和结构机制。下面就带大家分步骤学会使用。 01 进入数据库 首页上方就能看到搜索框，支持蛋白和小分子两种入口。 02 选择搜索方式 你可以根据研究需要选择不同的搜索模式： 以蛋白为导向的搜索（适合从目标蛋白出发，想知道它有哪些药物靶向） 比如在搜索框输入 UniProt ID（如 P15056） 以药物为导向的搜索（适合从某个分子出发，反推它作用在哪些蛋白上） 比如输入DrugBank ID（如 DB00398）、PDB 配体 ID 或 SMILES。 03 检索结果解读 以蛋白搜索为例，页面会显示： 基本信息：基因名、蛋白名、UniProt 编号 相关药物列表：DrugBank、PubChem、ChEMBL 等数据库的链接 作用机制：比如抑制剂/激动剂等说明 亲和力数据：来自 BindingDB 的实验数据 如果是药物搜索，则会反向展示所有靶点蛋白，信息同样全面。如下图： 04 进入结构详情页查看 点击某个“DrugDomain Data”列中对应项，就能进入 DrugDomain 的详细页面： 当有实验结构时： (1) 显示 PDB 号，点击即可直达 RCSB 数据库； (2) 提供 PyMOL 脚本：自动加载结构 → 给 ECOD domains 上色 → 标注药物结合位点;  (ECOD domains = 蛋白质的“功能模块”，并且这些模块已经按进化关系分好类) (3) 可查看 2D 相互作用图（LigPlot），直观显示药物与蛋白的结合氨基酸残基。 当没有实验结构时： (1) 调用 AlphaFold 等预测模型; (2) 生成可视化结果并标注“预测”性质。 05 查看 PTM 修饰信息（如果有的话...） 有些药物结合会受翻译后修饰（PTMs） 影响，此时DrugDomain会提供： ① 特定PTM修饰模型 (由AlphaFold3、RoseTTAFold All-Atom或 Chai-1 生成)； ② PyMOL 脚本，能同时显示 ECOD domains、修饰位点和药物结合情况。 06 总结应用场景 从蛋白找药物：定位靶点的潜在治疗分子； 从药物找蛋白：探索药物的多重作用通路； 结合结构分析：理解结合机制，辅助药物设计； 考虑 PTM 影响：评估翻译后修饰在调控中的角色。 四、JMC:靶向药物早期发现中靶标结合分析方法大全【完整指南】 （原创 安玉龙 早研早聊） 侃侃而言  学以致用 在基于靶标的药物发现中，需要对靶标结合情况进行量化，以建立构效关系，并开发出有效的临床候选药物；靶标结合情况也能为药物的作用机制（MoA）提供证据，虽然这并非获批所必需的，但能够增加临床试验成功的机率。 因此，已经开发了大量的检测方法来提供有关分离蛋白、和基于细胞的蛋白靶标结合的信息。 这些技术监测蛋白质与其配体复合物之间在稳定性、结构、光学性质、或质量差异等方面的变化。它们还通过热力学、动力学、和结构结合参数对化合物进行表征。这些不同方法体现了在给不同蛋白质类别“用药”时所面临的挑战，每种方法都有其优点、权衡之处、以及特定的靶向性。 近日（Jun. 4），英国癌症研究所癌症药物发现中心在 J. Med. Chem. 上分析讨论了在早期药物发现中（Hit 识别、Hit鉴定、Hit-to-Lead），关于靶标-结合物结合分析方法的汇总和完整应用指南。 共包括八大类别监测方法： （1）热技术：ITC、DSC、DSF、CETSA； （2）生物传感技术：SPR、GCI、BLI； （3）质谱技术：nMS、AS-MS、HDX-MS； （4）核磁共振技术：LO-NMR、PO-NMR; （5）结构生物学技术：X-射线晶体学、Cryo-EM、SAXS； （6）共振能力转移技术：FRET、BRET； （7）其它结合监测方法：FP、SS、FIDA、放射性配体结合； （8）化学蛋白质组学技术：ABPP、TPP、DARTS。 一、靶标结合测定 01 基于靶标的药物发现中的靶标结合 基于靶标的药物发现（TBDD）是近几十年来制药行业的主流方法。该策略首先要选择和验证与疾病相关的生物靶标，随后设计化合物，使其特异性地与靶蛋白结合，以产生治疗效果。 理想的情况下，设计的化合物应具有最小的脱靶相互作用，以及无毒副作用。 为了促进这一目标，需要： （1）开发检测方法，以监测蛋白质-配体之间的结合； （2）量化结合强度，以便迭代改进分子与靶标的结合，并建立构效关系（SAR）； （3）提供药物的作用机制（MoA）证据，增加临床成功可能性。 02 多样性检测方法 直接法：生物物理法 配体结合到靶蛋白上，通常会导致物理化学变化，且与蛋白质-配体相互作用的程度成正比。因此，可以开发多种生物物理技术，量化这种变化，直接确定靶标结合及结合强度。 间接法：生化活性分析法 此外，靶标结合也可以通过生化活性分析进行间接测量。如，酶促反应产物浓度变化、配体结合受体的下游效应等。这类功能性检测不仅可以确保药物结合，还可以产生所需的药理作用，然而，蛋白质具有高特异性，需要针对性开发。 比较功能性分析结果与直接检测结合的结果，可以确定观察到的效果确实是由于药物-靶蛋白相互作用，以及相互作用的效率。 当前，已经开发了大量测定方法，可提供分离靶蛋白、和细胞中靶标结合信息。这篇文中主要探讨了在早期药物发现阶段（Hit 识别、Hit 鉴定、Hit-to-Lead 阶段）量化靶标结合的方法，涵盖 3 类环境下的靶蛋白： （1）分离蛋白结合：利用分离纯化的靶蛋白，有利于小分子迭代改进，然而不能很好地代表靶蛋白在体内的行为； （2）细胞裂解物靶蛋白结合：一种介于分离靶标蛋白与活性靶标蛋白的中间模型，提供多种蛋白存在环境，但不能提供有关膜通透性或配体结合的下游效应信息。 （3）活细胞中靶蛋白结合：有利于建立药物分子特异性地与细胞中目标靶标结合信息；鉴于药物需要透过细胞膜（被动或主动运输）进入细胞，并有可能受细胞环境中其它生物分子相互作用干扰，因此，这种分析提供了一种生理学上相关的测量靶标结合的系统。 这些技术通过监测稳定性、结构、光学性质或蛋白质与其配体复合物之间的质量差异来实现，此外，还能通过热力学、动力学和结构结合参数对化合物进行表征。 （1）药物-靶标热力学 蛋白质-药物配体之间的相互作用可通过下图 a 中的简单结合平衡来描述，涉及两个平衡常数，如下图 b。 结合常数（KA）和解离常数（KD）互为倒数，其中 KD 的单位为摩尔（M)，常用于描述蛋白质-配体相互作用。 KD 值描述了配体对蛋白质的亲和力，可通过配体对蛋白质的滴定获得，确保每个浓度都达到平衡，如下图 c。KD 值越小（相应结合常数 KA 就会越大），平衡进一步向蛋白质-配体复合物转移，配体与蛋白质结合就越强。 KD 值可以直接从结合曲线中估计出来，下图 c 中 y 轴代表蛋白质结合分数（θ），最大值为 1，代表所有蛋白质结合位点都被占用；而所有结合位点的一半被结合的配体的浓度为 KD 值。 因此，KD 值可以通过任何结合试验来确定，只要在每个浓度下达到平衡，结合与反应成正比。 配体对蛋白质的热力学稳定性可以通过量化焓的变化来确定，如结合焓变可以直接使用等温滴定量热法（ITC）或通过测量 KD 的温度依赖性和应用范霍夫方法来测量。 (2）药物-靶标动力学 药物-靶标动力学由药物结合（kon）和解离（koff）的微观速率常数决定。 药物停留时间（τ），由解离速率常数的倒数计算，可以用来预测体内疗效，因为具有较大停留时间的药物可以具有较长的作用时间。 对于共价药物，由于其与靶标不可逆地结合，因此理论上它们的停留时间是无限的；然而，靶标抑制的效果取决于蛋白质再合成速率，这使得共价药物能够获得更持久的治疗效果。 结合动力学会影响选择性，即使 KD 值相同的同一家族的多种受体，若其中一种受体解离速度较慢，则该药物对该蛋白质的选择性更强。 这表明，早期研发阶段，不仅需要热力学数据来预测体内的表现，还需要确保动力学参数，以最大限度地提高成功率。 微观速率常数值需要时间分辨数据（即观察到的事件响应曲线）通常通过诸如表面等离子共振（SPR）等生物传感技术来实现。 (3）结构参数 化学计量（N）指的是蛋白质与配体的比率，即有多少药物分子与蛋白质分子结合。 多数情况下，预期是1：1。因此，实验中测量化学计量可以识别出非特异性结合的化合物，如上图 d，聚集剂和结合多个蛋白质残基的混杂共价化合物。 药物分子可以与蛋白质的多种结合口袋相互作用，如上图 e：正构结合，即占据天然底物结合位点；变构结合，即与蛋白质的替代位点结合。 为了确定配体结合位点，X-射线晶体学研究是“黄金标准”法，而低温电子显微镜（Cryo-EM）在通量和分辨率方面有替代X-射线晶体学的趋势；其它如 NMR 和 HDX-MS 等技术也提供了结合位点信息。 竞争性试验在分析未知结合口袋中的结合的配体发生位置方面可提供证据。 二、靶标结合测定技术及 目前可用于确定药物-靶标直接结合的技术，分为以下八类：热技术、生物传感、质谱（MS）、核磁共振（NMR）、结构生物学、共振能量转移（RET）、其它结合试验、和化学蛋白质组学。 01 热技术 基本原理：通过温度变化引起蛋白质物理性质改变来监测靶标-配体结合。 监测方法包括： 量热法：ITC、DSC； 蛋白质熔融温度（TM）观察法：DSC、DSF、CETSA、cell Pulse、DLS、CD 热泳迁移率变化法：MST 不同温度下染料荧光变化：TRIC 热技术基于溶液检测，不需要将靶蛋白固定，因此易于设置并适用于多种体系。 （1.1）等温滴定量热法（ITC） ITC 测量配体与靶标结合时的焓变，是直接结合测量的黄金标准。 优势：不需要靶标固定或标记，不需要分析开发，操作简单，可相对快速地给出配体结合的结果。 输出数据类型：可测定 KD、N、ΔH （焓变）、ΔS（熵变）等参数； 局限性：需要较多蛋白质（毫克级）和高化合物溶解度，尚未用于基于细胞的筛选；且通量低，不能用于筛选工作。 适用性：适用于二次 Hit 确认和详细表征；主要用于纯化的重组蛋白（TC）、以及三元复合物形式（TC）蛋白的结合测试。 （1.2）差示扫描量热法（DSC） DSC法记录温度梯度下，蛋白质样品熔化温度时的放热效应；当配体存在时，可以测定熔融温度和焓变，更稳定的配体会使熔点温度 TM 增加更大。 优势：同 ITC，不需要靶标固定，不需要分析开发，检测快速。 输出数据类型：可测定 ΔTM，ΔH 等参数； 局限性：需要较多蛋白质；不能用于确定 KD值，且通量低，不能用于筛选工作。 适用性：适用重组蛋白（RP）的结合分析。 （1.3）差示扫描荧光法（DSF） DSF 通过监测蛋白质在加热过程中的荧光变化来确定熔点温度（TM），可使用天然荧光法（nano-DSF）或添加荧光染料（热位移分析法 TSA）来增强信号。 优势：确定蛋白质稳定性变化方非常有用，可用于筛选大范围亲和的化合物，具有一定的高通量（中等程度），其中 TSA 法不需要荧光标记和靶标固定。 输出数据类型：可测定ΔTM 等参数； 局限性：不能用于 KD 值确定 适用性：适用于纯化重组蛋白的大范围亲和筛选。 （1.4）细胞热位移分析法（CETSA） CETSA 在细胞水平测量药物-靶标相互作用，通过加热后完整蛋白量确定结合。 优势：可用于体内/体内形式的分析、细胞分析，具有中等通量，可用于筛选。 输出数据类型：ΔTM 局限性：不能用于 KD值测定，依赖于蛋白检测的方法，不适用于 FBDD（亲和检测范围低，不适用于低亲和力作用）。 适用性：适用于细胞裂解物、活细胞、以及活细胞-膜蛋白等形式的结合分析，可用于文库筛选。 （1.5）InCell Pulse、InCell Hunter 类似于 CETSA，InCELL Pulse 测定热冲击后完整蛋白质的数量，在稳定配体存在时，蛋白质数量增加；InCELL Hunter 观察正常蛋白质合成、聚集、降解状态的稳定周转； 两种分析方法均是使用酶片段互补（EFC）技术的化学发光来进行定量。 优势：可用于中等通量文库筛选； 输出数据：ΔTM 局限性：靶蛋白需用酶片段标记，不适用于 FBDD（亲和检测范围低，不适用于低亲和力作用）； 适用性：可用于活细胞、活细胞-膜蛋白的筛选 （1.6）动态光散射法（DLS） DLS 利用激光通过蛋白质溶液散射，并记录散射光随时间的强度，处理后可获得样品颗粒大小的分布；加热样品，可检测光散射的变化。 优势：无需标记、直接观测聚集、适用于复杂体系，可快速筛选（中等通量），并有利于排除假阳性信号（可识别由化合物聚集或蛋白质聚集导致的假阳性，如对于高脂溶性分子）。 输出参数：ΔTM、Agr.（聚集）； 局限性：灵敏度不如 TSA，检测范围窄；不适用于 FBDD（不适用于低亲和力检测）；设备依赖于 DLS 系统联用实时 PCR仪。 适用性：适用于纯化重组蛋白的中等通量的热稳定性初步筛选，作为辅助技术排除假阳性、评估纯化后蛋白质单分散性。 （1.7）圆二色谱法（CD） CD 法测量蛋白质对左旋/右旋圆偏振光的吸收差异，关联构象，即天然折叠蛋白具有强 CD 信号，变性后信号减弱。 通过分析散射光的波动情况，得到蛋白质颗粒的流体力学半径，进而推断其聚集程度或构象变化。 优势：无需标记、兼容溶液状态更贴近生理环境，构象敏感，可直接反映二级结构变化，如 α螺旋与β折叠比例。 输出参数：ΔTM、Agr.（聚集）； 局限性：通量低无法用于化合物库筛选、灵敏度低不适用于 FBDD，信息局限无法获得 KD值或结合位点信息。 适用性：作为补充技术，用于纯化蛋白的稳定性研究、构象变化验证、学术性小规模化合物作用机制表征（非筛选）。 （1.8）微尺度热电泳法（MST） MST 利用分子在温度梯度下的热泳动性（受大小、电荷、水合层影响），通过红外激光加热局部区域，监测蛋白质或复合物的荧光变化。 配体结合会改变蛋白质的热泳动性，从而定量分析结合亲和力 (KD）。 优势：低样品消耗、兼容性强（可用于复杂体系）、灵敏度高适用于 FBDD（弱结合检测） 输出参数：KD、N、Agr. 等参数。 局限性：需要荧光标记（天然荧光蛋白除外），不适用于初级筛选（需通过竞争实验排除假阳性）、通量有限（中等）、依赖 MST 专用仪器； 适用性：适用于纯化蛋白、细胞裂解物的 FBDD 筛选与小分子表征，评估蛋白质样品稳定性和纯度、研究 PPI 动力学和热力学参数；与荧光光谱、 SPR 等互补。 （1.9）温度相关强度变化法（TRIC） TRIC 通过检测荧光基团在温度梯度场中化学微环境对荧光信号的影响，来检测生物分子间相互作用。 优势：微量样品需求、检测速度快、灵敏度高 输出参数：KD 值； 局限性：需要荧光标记、荧光信号可能会受干扰导致数据解释复杂； 适用性：适用于纯化重组蛋白的高通量筛选（中等）、FBDD 筛选，并可用于蛋白质-配体、蛋白质-蛋白质相互作用研究。 02 生物传感技术 基本原理：基于生物分子（如蛋白质、核酸、抗体等）与目标分子之间的特异性相互作用，通过物理、化学或电化学信号的变化，利用生物传感元件来检测化学或生物分子的存在，实时监测结合动力学。 优势：可进行实时监测、具有高灵敏度、以及多样化格式（多种技术如 SPR、BLI、GCI 等）适用于不同的研究需求、无需标记、适合高通量筛选。 局限性：需要专业设备、操作复杂、成本较高。 适用性：可用于药物筛选、靶点验证、药物动力学研究等。 主流技术包括 SPR、BLI、GCI 等，辅助技术有 SwitchSense、MFS、dISA等。 （2.1）表面等离子共振法（SPR） SPR 利用表面等离子体共振现象，通过监测激光反射时的共振角度变化，实时检测蛋白质-配体结合引起的界面折射率（质量）变化。 蛋白质固定在金表面的羧甲基葡聚糖基质上，配体流经时若结合，会导致共振角度偏移，形成实时响应曲线，用于分析结合动力学（kon/koff）和亲和力（KD）。 优势：不需标记、实时监测、高灵敏度（可用于FBDD），应用范围广泛，可用于早期筛选、Hit 鉴定与优化等各个阶段。 输出参数：KD，Kon/Koff， N 等参数。 局限性：需固定蛋白，可能影响部分功能；操作复杂，具有设备依赖性； 适用性：适用于纯化重组蛋白、三元复合物、活细胞-膜蛋白等靶蛋白的结合分析，用于药物筛选、动力学优化、结构验证。 （2.2）光栅耦合干涉测试（GCI） GCI 是一种基于光学的生物传感技术，通过检测光波在生物层表面的相位变化来监测分子间的相互作用。 光束通过光栅耦合进入波导，与生物层相互作用后产生干涉信号，结合参考光束形成干涉图样，解调后的信号用于分析分子相互作用。 优势：高灵敏度、高通量、无需标记、实时监测、数据丰富。 输出参数：KD，Kon/Koff， N 等参数。 局限性：需固载靶标样品，设备依赖性、成本高。 适用性：用于纯化重组蛋白的化合物库筛选、先导化合物优化、药物与靶标结合评估。 （2.3）生物层干涉测量（BLI） BLI 技术基于光学干涉原理，通过检测光纤尖端生物层的厚度变化来监测分子间的相互作用。 当生物分子与固定在光纤尖端的靶分子结合时，会改变光纤表面的光反射路径，产生可检测的干涉信号。 优势：无需标记、高灵敏度可用于 FBDD、实时监测、可用于多样性复杂样品、高通量、操作简便。 输出参数：KD，Kon/Koff， N 等参数。 局限性：设备依赖性且成本高、需要靶标固定、BLI 信号受多种因素影响，可能对数据解释带来问题； 适用性：用于纯化重组蛋白、三元复合物的化合物库筛选、先导化合物优化、药物与靶标结合评估。 （2.4）可点切换纳米管（SwitchSense） SwitchSense 是一种基于 DNA 纳米杆的生物物理研究技术，用于研究分子间相互作用。 输出参数：KD，Kon/Koff， Arg. Rh 等参数 局限性：需要体外偶联和纯化，增加了复杂性，并限制了配体的自由性； 适用性：纯化重组靶蛋白的结合分析。 （2.5）磁力谱（MFS） MFS 技术利用磁力光谱学原理，通过磁力作用于磁性纳米颗粒，测量其与生物分子之间的相互作用力。 这种技术可以在单分子水平上测量结合力、构象变化和动力学，能够并行处理数千个相互作用。 输出参数：KD，Kon/Koff 等参数 局限性：设备依赖性且成本高、操作复杂； 适用性：纯化重组蛋白、三元复合物结合分析。 （2.6）全内反射荧光显微镜（TIRF） TIRF 使用一种动态抑制溶液测定（dISA）技术，用于监测膜结合蛋白和配体的相互作用。其通过将感兴趣的蛋白质和荧光团嵌入泡囊中来实现。 当蛋白质与生物传感器表面的工具化合物结合时，荧光团被激发。竞争性结合配体的存在导致蛋白质与表面之间的相互作用减少，因此荧光减少。监测有配体和无配体随时间的结合事件的数量 输出参数：KD，Kon/Koff 等参数 局限性：需要工具分子、固载靶标； 适用性：膜蛋白的结合分析。 03 质谱技术 基本原理：通过分析分子的质荷比来鉴定和定量蛋白质 - 配体复合物。 其中主要方法有： 3.1 天然质谱（Native MS） 分析完整蛋白及其非共价复合物，测定 KD、N，无需标记，适用于片段筛选和共价药物发现。 3.2 基于亲和力选择的质谱（AS-MS） 如尺寸排阻色谱-质谱（SEC-MS）、脉冲超滤-质谱（PUF-MS）等，用于筛选和鉴定结合配体。 3.3 氢-氘交换质谱（HDX-MS） 通过氢氘交换分析结合位点，提供结构信息，适用于表征。 应用场景：在高通量筛选和结合位点分析中具有重要作用，尤其适用于复杂混合物。 04 核磁共振技术 基本原理：利用原子核在磁场中的共振特性分析蛋白质 - 配体相互作用。 主要方法： 4.1 配体观测 NMR（LO-NMR） 如弛豫法、WaterLOGSY、STD-NMR 等，监测配体 NMR 参数变化，适用于片段筛选和弱结合检测。 4.2 蛋白质观测 NMR（PO-NMR） 如 1H-15N HSQC，通过化学位移扰动测定 KD 和结合位点，需要同位素标记，用于结构和亲和力分析。 应用场景：适合检测弱结合，在片段筛选和结构分析中应用广泛。 05 结构生物学 基本原理：提供蛋白质- 配体复合物的三维结构信息。 主要方法 5.1 X 射线晶体学 解析原子分辨率结构，指导药物设计，是金标准，但需要晶体，适用于表征。 5.2 冷冻电镜（Cryo-EM） 解析大蛋白和难结晶蛋白结构，分辨率不断提高，适用于结构分析。 5.3 小角 X 射线散射（SAXS） 分析溶液中蛋白质结构变化，适用于难结晶蛋白，测定 KD 和结构变化。 应用场景：为药物设计提供结构基础，在先导化合物优化中至关重要 06 共振能量转移（RET）技术 基本原理：通过供体-受体之间的能量转移监测分子邻近。 主要方法 6.1 荧光共振能量转移（FRET） 如 TR-FRET，通过荧光能量转移测定 KD，适用于高通量筛选。 6.2 生物发光共振能量转移（BRET） 如 nanoBRET，避免光漂白，适用于活细胞和高通量筛选，测定 KD 和驻留时间。 6.3 AlphaScreen 通过能量转移产生化学发光，适用于高通量筛选和 PPI 抑制剂分析。 应用场景：在高通量筛选和细胞水平分析中常用。 07 标其它监测方法 7.1 荧光偏振（FP） 通过荧光偏振变化测定 KD，适用于高通量筛选，但需要标记。 7.2 光谱位移（SS） 监测荧光光谱位移，测定 KD，适用于筛选。 7.3 流式诱导分散分析（FIDA） 通过扩散特性测定 KD 和动力学参数，无需固定化。 7.4 放射性配体结合测定 测定 KD 和受体密度，适用于细胞表面受体筛选。 7.5 荧光显微镜（FM) 实时成像监测活细胞靶蛋白结合。 08 化学蛋白质组学技术 基本原理：在全蛋白质组水平分析药物 - 靶标相互作用。 主要方法 8.1 基于亲和力的蛋白质组谱分析（ABPP） 利用报告基团标记配体，鉴定结合蛋白和位点，适用于活细胞和片段筛选。 8.2 热蛋白质组谱分析（TPP） 通过温度变化分析全蛋白质组稳定性，鉴定靶标，适用于活细胞和无标记分析。同CETSA。 8.3 药物亲和力响应靶标稳定性（DARTS） 通过蛋白酶消化抗性鉴定结合蛋白，适用于细胞裂解液。 应用场景：用于靶标发现和验证，尤其适用于 “不可成药” 靶点 三、靶标结合分析方法选择 影响靶标结合分析方法选择的因素有多种，归纳起来主要有以下几个方面： （1）靶点类型 不同靶点如酶、GPCR、膜蛋白、“不可成药” 靶点等，需选择不同方法。例如酶可采用 HTS，GPCR 常用细胞 - based 方法，“不可成药” 靶点适合片段筛选和化学蛋白质组学。 （2）开发阶段 Hit 识别阶段可采用高通量方法如 FP、AlphaScreen； Hit 确认需正交方法如 ITC、SPR； 先导优化阶段（Hit-to-Lead），需更详细的参数测定如 HDX-MS、X 射线晶体学。 （3）设备和试剂 考虑设备可用性、蛋白质消耗、标记需求等。如 SPR 需要特定仪器，ITC 消耗较多蛋白质。 （4）其他因素 如是否需要细胞水平分析、是否关注动力学或结构参数等。 四、总结& 靶标结合分析贯穿药物早期研发阶段：从 Hit 识别、到 Hit 验证、再到先导化合物优化（Hit to Lead）。 这篇文章为靶标结合物分析提供了选择方案框架，解决了临床前药物发现的关键决策点。策略上，结合靶标特点、研发阶段、技术优势，整合多学科技术进行分析方法选择；利用适当的靶标结合分析方法，以实现合理、快速、公正的分析，帮助早期药物研发做出理性、高效决策。 如，细胞相关性的结合数据对临床转化至关重要；结合热力学、动力学、结构数据的互补参数，可以更快速、合理地优化化合物。 未来发展方向： （1）化学蛋白质组学在全蛋白质组分析中的作用日益重要，新兴技术如 GCI、MMS 等不断发展，将推动靶点去卷积发展； （2）人工智能的发展，使得虚拟筛选和生成式 AI 在数据分析中的应用将提升药物发现效率，加速 Hit 发现； （3）冷冻电镜断层扫描（Cryo-ET）、细胞内NMR等原位技术发展，将为药物发现提供系统化技术框架，推动理性、高效决策 随着技术进步，靶标结合测定将在药物开发中发挥更关键作用。 end 本公众号声明： 1、如您转载本公众号原创内容必须注明出处。 2、本公众号转载的内容是出于传递更多信息之目的，若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请作者或发布单位与我们联系，我们将及时进行修改或删除处理。 3、本公众号文中部分图片来源于网络，版权归原作者所有，如果侵犯到您的权益，请联系我们删除。 4、本公众号发布的所有内容，并不意味着本公众号赞同其观点或证实其描述。其原创性以及文中陈述文字和内容未经本公众号证实，对本文全部或者部分内容的真实性、完整性、及时性我们不作任何保证或承诺，请浏览者仅作参考，并请自行核实。

摘要 成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）技术已彻底改变分子生物学领域，并为基因靶向治疗的未来奠定基础。CRISPR系统由CRISPR相关（Cas）核酸内切酶和向导RNA（gRNA）组成，可通过编程实现互补DNA或RNA的序列特异性结合、切割或修饰。然而，CRISPR基疗法的应用面临诸多挑战，如分子大小、原核或噬菌体起源以及必需的gRNA辅因子需求等，这些因素均会影响疗效、递送效率和安全性。本综述聚焦于gRNA的化学修饰和工程化方法，旨在增强或实现CRISPR基疗法的应用，重点以Cas9和Cas12a作为治疗范式进行探讨。文章还讨论了化学修饰gRNA旨在解决的问题（包括药物递送、生理稳定性、编辑效率和脱靶效应）以及仍存在的挑战。 引言 随心所欲改变基因的能力，极大地提升了我们理解生物学和治疗遗传性疾病的能力。成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关（Cas）核酸内切酶，凭借其简便的可编程性，成为基因编辑技术的前沿。 CRISPR-Cas效应酶（如化脓链球菌的Cas9（SpCas9））最初被发现是原核生物抵御病毒感染的防御机制。然而，其在基因编辑中的广泛应用潜力迅速显现——2020年获得诺贝尔奖认可，如今CRISPR基疗法已获批用于临床。相比锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）等传统技术（针对每个新基因都需精心设计新蛋白），CRISPR-Cas系统可遵循高度可预测的核酸碱基配对规则，通过改变gRNA序列，快速针对几乎任何基因进行编程。 当靶向双链DNA的Cas酶被引导至靶标时，会解开DNA双链并切割两条链的磷酸二酯键。DNA双链断裂（DSBs）随后通过细胞机制修复，如非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR），进而实现基因编辑。NHEJ通路修复不精确，会导致插入缺失（indel）突变，但高效适用于基因“敲除”——因为indel通常会引入提前终止密码子或错义突变，最终产生无功能蛋白。HDR通路需要“供体”DNA模板（通常其末端与DSB侧翼序列具有同源性），这种重组机制因靶标同源性而具有更高精确性，但效率较低。理论上，可利用HDR通路，通过供体DNA插入任何感兴趣的序列。尽管Cas9基系统应用最为广泛，但CRISPR的发现已涵盖两类、六型和近四十种亚型。II类系统具有单一多结构域效应蛋白（即Cas9和Cas12a酶），是生物技术和治疗领域研究最深入的类型。 开发CRISPR基药物（尤其是全身性治疗药物）需要进行常规药物学优化，包括递送效率、半衰期、疗效、特异性和作用持续时间。此外，还需对CRISPR-Cas系统进行特殊考量，例如减少脱靶编辑（即对错误基因的非预期编辑）——与传统药物不同，脱靶编辑难以逆转或修正。由于CRISPR-Cas系统由蛋白质和RNA组成，因此优化这两种组件对于治疗开发至关重要。核酸疗法的成败经验，为gRNA的化学探索提供了指导。反义寡核苷酸（ASOs）和小干扰RNA（siRNAs）等寡核苷酸疗法处于现代医学前沿，目前已有约二十余种获批用于临床。这一成就得益于两项关键化学创新：一是对磷酸骨架、核糖或脱氧核糖以及核苷酸碱基进行化学修饰，以增强递送效率和核酸酶稳定性，并减少免疫刺激；二是近期发现的高效递送方法。本综述聚焦gRNA化学工程在CRISPR-Cas系统中的作用，探讨该技术治疗转化的最新进展、潜在应用和关键问题。 CRISPR-Cas系统概述 药物设计和开发面临诸多挑战，包括递送、安全性和代谢稳定性。对于生物制剂和基因靶向药物而言，由于生物聚合物（如蛋白质和核酸）的复杂构效关系（包括折叠和分子相互作用），挑战更为复杂。为全面了解CRISPR-Cas gRNA化学工程面临的挑战、解决方案以及CRISPR疗法的广泛发展，本部分将讨论CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a酶的结构和机制——这两种酶是目前正在开发的典型治疗用系统。 Cas蛋白、向导RNA和核糖核蛋白结构 Cas9是II类II型CRISPR效应酶，具有双叶结构，包裹着gRNA:靶标DNA异源双链体。识别（REC）叶负责与异源双链体相互作用；核酸酶（NUC）叶包含原间隔区相邻基序（PAM）相互作用（PI）结构域以及HNH和RuvC催化结构域——PI结构域与靶标DNA的PAM序列相互作用，HNH和RuvC结构域的活性位点分别负责Mg²⁺依赖的靶标链和非靶标链DNA磷酸二酯键的核酸内切酶切割。最后，桥螺旋连接两个叶。 图1 天然CRISPR–Cas9和CRISPR–Cas12a复合物的结构组织 （A）化脓链球菌Cas9（SpCas9）结构域的示意图及其在核酸酶（NUC） lobe和识别（REC） lobe中的排列。右侧为SpCas9与向导RNA及靶标DNA形成复合物的晶体结构（PDB ID: 4OO8），标注了NUC lobe和REC lobe的位置，结构域颜色与左侧示意图一致。SpCas9天然双向导RNA的示意图显示了CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA），靶标DNA双链中，非靶标链为紫色，靶标链为蓝色，非靶标链上的原间隔区相邻基序（PAM）序列（NGG；N=A、C、G、T）用橙色框突出显示，红色箭头标注切割位点。 （B）嗜酸乳球菌Cas12a（AsCas12a）结构域的示意图及其在NUC lobe和REC lobe中的排列。右侧为AsCas12a与向导RNA及靶标DNA形成复合物的晶体结构（PDB ID: 5B43），标注了NUC lobe和REC lobe的位置，结构域颜色与左侧示意图一致。AsCas12a crRNA的示意图显示了向导（间隔区）和5'柄（重复序列）区域，靶标DNA双链中，非靶标链为紫色，靶标链为蓝色，非靶标链上的PAM序列（TTTV；V=A、C、G）用橙色框突出显示，红色箭头标注切割位点。 注：BH=桥螺旋；PDB=蛋白质数据库；PI=PAM相互作用结构域；WED=楔形结构域。（A）部分经Elsevier许可改编自参考文献34；（B）部分经Elsevier许可改编自参考文献33。 天然CRISPR-Cas9是双RNA引导系统，需要CRISPR RNA（crRNA）和反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）共同实现靶标识别和切割。crRNA有两个不同区域：一个是源自CRISPR阵列间隔区的向导区域（与靶标序列互补），另一个是源自CRISPR阵列重复序列的tracrRNA配对区域（与tracrRNA的5'端互补）。tracrRNA通过折叠的茎环结构将gRNA锚定在Cas9上。在含有Cas9效应物的细菌（如化脓链球菌）中，前体crRNA在CRISPR阵列内的加工由RNase III核酸内切酶介导——与tracrRNA杂交后，产生成熟的crRNA:tracrRNA复合物。这种双向导系统通常可简化为单向导RNA（sgRNA）——通过GAAA四环将crRNA和tracrRNA连接，长度约100个核苷酸。 Cas12a（前称为Prevotella和Francisella 1的CRISPR（Cpf1））是II类V型效应酶。尽管存在多种V型亚型，但Cas12a是研究最深入的亚型，其来自不同物种的同源物在长度和基因编辑效率上存在差异。来自嗜酸胺球菌（AsCas12a）、新凶手弗朗西丝菌（FnCas12a）和毛螺菌科细菌（LbCas12a）的Cas12a常用于人类基因编辑应用。Cas12a的结构域根据与Cas9中已鉴定结构域的功能相似性命名，但二者无结构相似性。Cas12a还具有一个楔形结构域，负责与其crRNA相互作用。此外，Cas12a包含一个单一的RuvC活性位点，负责切割靶标链和非靶标链。其辅助Nuc结构域此前被认为与Cas9中的HNH结构域类似，但实际上不含活性位点，而是参与将靶标链定向到RuvC结构域中进行切割。 Cas12a具有crRNA自加工机制——通过位于楔形结构域中的额外独立活性位点，分离CRISPR阵列内的crRNA序列，产生长度约39-43个核苷酸的成熟crRNA。这种独特的核糖核酸内切酶活性已用于Cas12a基编辑系统的多重编辑。此外，与Cas9不同，Cas12a不需要tracrRNA，是天然紧凑的单RNA引导系统。这一特性对于临床应用可能具有重要价值——因为单一、较短的crRNA可通过标准固相寡核苷酸合成轻松制备。Cas12a的crRNA包含一个源自重复序列的区域（通常称为5'柄）和一个源自间隔区的向导区域——5'柄折叠成假结结构，其序列在Cas12a同源物中高度保守（这与其折叠需求和结合Cas12a的作用相关）。 gRNA通过多种弱相互作用与Cas蛋白结合，包括带负电的磷酸骨架与带正电的氨基酸之间的电荷-电荷相互作用、碱基与脂肪族侧链的疏水堆积以及氢键网络。核糖2'-羟基（2'-OH）基团与Cas蛋白之间的极性接触（通常是与肽骨架形成氢键），似乎与gRNA的化学修饰尤为相关——研究已证实，这些残基位置的2'-OH基团缺失，会对Cas蛋白功能产生显著影响。gRNA与Cas蛋白的结合会导致蛋白质结构发生构象变化，进而组装成活性核糖核蛋白（RNP）复合物。 图2 向导RNA与Cas蛋白之间代表性的2'-羟基（2'-OH）相互作用与Cas蛋白形成2'-OH相互作用的核苷酸用红色标注。 （A）Cas9单一向导RNA向导区域中的2'-OH基团，与化脓链球菌Cas9（SpCas9）蛋白中Y450的羰基氧形成氢键（PDB ID: 4OO8）。 （B）Cas12a CRISPR RNA 5'柄中的2'-OH基团，与嗜酸乳球菌AsCas12a蛋白中D966的羰基氧形成氢键（PDB ID: 5B43），键长为2.8 Å。 靶标DNA结合和切割机制 CRISPR-Cas系统切割靶标DNA的机制可概括为三个关键步骤：（1）PAM识别；（2）异源双链体“R环”形成；（3）DNA切割。Cas RNP对PAM的识别，似乎是通过与DNA分子的快速碰撞而非沿DNA滑动实现的——这也解释了为何DNA非PAM区域的结合持续时间较短。当靶标DNA与RNP复合物相互作用时，其定位方式使得带负电的DNA骨架通过与REC叶的静电相互作用，被固定在带正电的中央通道中，而PAM序列的小沟则位于PI结构域中。该结构域中的氨基酸通过碱基和形状读出机制，采样碱基相互作用以确定是否完全匹配。 图3 天然CRISPR–Cas9和CRISPR–Cas12a系统切割双链DNA及修复的通用机制 （A）左侧：Cas9蛋白（SpCas9）通过识别非靶标链（NTS）上的NGG（N=A、C、G、T）原间隔区相邻基序（PAM）序列定位靶位点，crRNA间隔区序列与PAM序列上游的靶标链（TS）杂交形成R环结构，Cas9蛋白在靶标DNA的PAM近端区域诱导双链断裂（DSB），产生平末端切割位点。crRNA间隔区衍生的向导区域为黄色，重复序列衍生的tracrRNA配对区域为橙色，tracrRNA为红色，靶标链为深蓝色，非靶标链为浅蓝色，PAM序列为黑色。右侧：Cas12a蛋白（AsCas12a）通过识别非靶标链上的TTTV（V=A、C、G）PAM序列定位靶位点，crRNA间隔区序列与该位点下游的靶标链杂交形成R环结构，Cas12a蛋白在PAM远端区域诱导双链断裂，产生粘性末端切割位点。 （B）左侧：非同源末端连接（NHEJ）DNA修复机制通过随机插入核苷酸形成插入缺失（indel），导致多种突变（沉默突变、错义突变、无义突变或移码突变）。右侧：同源定向修复（HDR）DNA修复机制利用两端与切割位点同源的供体模板，通过插入模板实现受控的基因校正或改造。 Cas9识别富含G的PAM（对于SpCas9，具体为NGG（N=A、C、G、T）），位于非靶标链上靶标结合区域的下游。相反，Cas12a识别富含T的PAM（对于AsCas12a，具体为TTTV（V=A、C、G）），位于非靶标链上靶标结合区域的上游。如果PAM序列完全匹配，一个氨基酸残基将插入双链DNA中，破坏双链杂交并导致靶标链上的+1磷酸基团远离非靶标链——这促进了双链DNA的局部解旋，并允许crRNA向导区域开始与靶标链进行碱基配对采样。DNA中的错误碱基序列会导致空间位阻排斥，阻碍与PI结构域的有利相互作用以及+1磷酸基团的旋转。然而，Cas12a蛋白的该结构域比Cas9的对应结构域具有更大灵活性，使其能够识别含胞嘧啶（C）残基的非经典PAM序列，尽管相互作用较弱。 第二步涉及crRNA向导区域与互补DNA靶标链形成异源双链体（也称为“R环”）。满足PAM要求后，与靶标链的碱基配对启动——非靶标链对齐到RuvC活性位点，分离的DNA双链通过NUC叶上的氢键和范德华接触得以稳定。crRNA间隔区中靠近PAM的前5-10个核苷酸（称为种子区），通过与Cas9或Cas12a的各种相互作用进行结构预排序，这种预排序有助于异源双链体碱基配对的成核。因此，这些crRNA核苷酸对错配碱基高度敏感，且Cas氨基酸高度保守。不适当或形成不良的R环不稳定，会导致Cas RNP与DNA解离。远离种子序列的错配或凸起，会导致更易耐受的结构扰动，通常允许DNA切割活性降低。两个系统中均形成20个碱基对的R环后，疏水氨基酸与异源双链体形成破坏性相互作用，阻止进一步的碱基配对。 最后一步是DNA切割。当形成满意的R环结构时，Cas蛋白内部会发生构象变化，解锁活性位点。对于Cas9，REC结构域和HNH结构域两侧的接头氨基酸会感知正确的R环形成，这一“守门”步骤被称为REC结构域构象检查点。随后，DNA链的易断裂磷酸基团被拉到活性位点中，以正确的方向和距离靠近催化残基，促进水解。HNH结构域的激活会触发额外的构象变化，激活RuvC结构域以切割非靶标链。对于Cas9，这一系列事件通常在PAM上游的第3和第4个核苷酸之间产生“平末端”DSB。 对于Cas12a，RuvC结构域中PAM序列下游第18和第19个核苷酸之间的非靶标链切割，会导致R环PAM远端的DNA双链解开。Nuc结构域与靶标链协同作用，将其折回RuvC活性位点（与非靶标链具有相同极性），在约第23和第24个核苷酸之间切割，产生“粘性末端”DSB。非靶标链可通过活性位点中的修剪进一步加工，产生更长的突出端——这可能有利于促进HDR。由于靶标链在PAM远端区域参与碱基配对的核苷酸下游被切割，因此该链在异源双链体受影响前可经历多轮切割，导致靶标序列大量缺失，可能增加indel突变导致基因敲除的概率。 CRISPR-Cas系统的化学工程 CRISPR-Cas gRNA的化学工程旨在实现多个目标，包括提高对核酸酶的稳定性、调节Cas蛋白活性和特异性、便于合成和控制，以及实现治疗递送。已有多项研究通过各种策略应对这些挑战。本部分重点介绍gRNA的化学修饰——这些修饰能够实现治疗应用，并与Cas酶活性或预期治疗结果兼容。关于所讨论的化学修饰，读者可参考专栏1和专栏2，了解已纳入gRNA的化学修饰特性的更深入描述。本综述不推测gRNA的最佳化学修饰模式——因为制定广泛的设计规则可能为时尚早。迄今为止开展的许多研究具有多样性，难以轻松、系统地相互比较以找出最佳修饰模式。研究之间的差异包括体外生化分析与基于细胞的分析、不同细胞系、递送方法、靶标序列以及每项研究特有的化学性质。此外，许多修饰尚未在每个位置单独测试，且通常在多重修饰的背景下进行。 将天然Cas9双向导RNA融合为单向导RNA 已发表的gRNA首批改造之一，是通过截短crRNA和tracrRNA，并通过GAAA四环将其融合，将SpCas9的天然双向导系统转化为sgRNA。与双RNA引导系统相比，sgRNA简化了载体表达，并已被证明可增强小鼠肝脏中的编辑活性。化学工程研究表明，四环可通过“点击化学”及相关反应引入的三唑键或其他化学基团替代。 点击化学已成功应用于多种应用中，用于连接两个分子。其具有生物正交性，且通常是快速、高产率的反应。产生三唑键的两种最常见点击反应是铜（I）催化的炔烃-叠氮化物环加成和应变促进的炔烃-叠氮化物环加成。铜（I）催化的炔烃-叠氮化物环加成可使用任何非应变炔烃基团，但依赖铜催化剂——铜对细胞有毒性，且在核酸纯化过程中难以去除，因此不太可能轻易用于治疗应用。在应变促进的炔烃-叠氮化物环加成中，应变炔烃（如环辛炔和二苯并环辛炔）无需金属催化剂即可提高对叠氮化物的反应性。三唑键用于替代整个四环或其磷酸基团时，表现出高度兼容性，甚至与未修饰的sgRNA相比，编辑效率略有提高。由于Cas9蛋白不与sgRNA四环相互作用，因此它应该能够耐受多种修饰和化学性质。连接crRNA和tracrRNA的另一种方法是利用基于四嗪的逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应——该反应具有与炔烃-叠氮化物点击反应相似的有利条件。 延长半衰期、提高编辑效率和规避免疫反应 RNA的核酸酶稳定性差且易激活免疫反应，使其不适合作为治疗药物候选物。因此，gRNA的化学修饰旨在解决这些缺点。应对这些挑战的一种最简单方法，是对gRNA的5'和3'末端进行最小修饰，以抑制核酸外切酶降解并延长细胞半衰期。首个报道gRNA化学修饰的研究，将三个末端核苷酸替换为2'-O-甲基（2'-OMe）、带有硫代磷酸酯（PS）键的2'-OMe或带有硫代膦酰乙酸酯键的2'-OMe，后两种修饰在引入原代人类细胞（通常难以转染和编辑）时，显著提高了编辑活性。随后，其他研究小组证明了末端修饰对提高Cas9和Cas12a编辑效率的效用，包括带有和不带有PS键的2'-脱氧（DNA）和2'-氟RNA（2'F-RNA）。如今，在生物医学CRISPR应用中，使用修饰核苷酸和骨架键对合成gRNA的末端进行封端已成为标准做法。其他已使用的键包括酰胺键（在PAM远端区域耐受）和刺激响应性硫代磷酸酯（可响应光或过氧化氢等刺激激活编辑）。刺激响应性方法也已应用于核糖。 核苷酸碱基修饰是生物系统调控的基础，可在DNA（表观遗传学）或mRNA（表观转录组学）水平调节基因和蛋白质表达。例如5-甲基胞嘧啶（m⁵C）、5-羟甲基胞嘧啶和N⁶-甲基腺苷。转运RNA（tRNA）中存在许多天然核苷酸碱基修饰，它们在tRNA折叠、稳定性和相互作用中发挥关键作用。对其他核酸疗法的核苷酸碱基进行修饰，可减少免疫反应、增强核酸酶稳定性，并改变热稳定性和与靶标的亲和力。2023年诺贝尔生理学或医学奖基于鉴定和纳入天然核苷酸碱基修饰（如假尿苷（Ψ）），将mRNA转化为可行疫苗的价值——Ψ可减少先天免疫系统检测并增加蛋白质表达。尽管已对核苷酸碱基修饰进行了大量研究，但目前仅有三种获批用于临床（m⁵C、Ψ和N¹-甲基假尿苷）。 已有多项研究探索了核苷酸碱基修饰对gRNA的潜力。体外或无细胞Cas9切割分析表明，m⁵C、Ψ、5-甲基尿苷（m⁵U）和其他碱基修饰在tracrRNA和crRNA中均具有良好耐受性，且可提高特异性。在细胞中，这些修饰的gRNA可减少免疫识别和细胞毒性，但同时也会降低编辑活性。这项研究强调了gRNA修饰的体外和基于细胞的分析之间的差异——这在其他碱基修饰（如N⁶-甲基腺苷、2-硫尿苷、4-硫尿苷和N¹-甲基假尿苷）中也观察到。有趣的是，利用尿苷耗竭增加核苷酸碱基修饰（m⁵C和Ψ）在Cas9 mRNA中的掺入，可增强编辑效率并降低免疫原性。对于Cas12a，N⁶-甲基腺苷在体外和细胞中均会降低切割效率，且这种作用依赖于细胞脱甲基酶活性。Cas蛋白与核苷酸碱基发生相互作用，而某些修饰的存在可能会破坏这种相互作用。例如，N¹-甲基假尿苷的碱基呈顺式构象，导致RNA:DNA R环杂合体不稳定。 专栏1 常用于治疗性核酸的核糖和磷酸二酯修饰特性 化学修饰在现代治疗性核酸中发挥关键作用。核酸酶抗性、热亲和力和螺旋结构等化学性质，深刻影响其生物活性。糖环的构象决定每种修饰的螺旋结构。修饰大致分为两类：形成A型螺旋结构（与RNA相似）的修饰和形成B型螺旋结构（与DNA相似）的修饰。 2'-脱氧（DNA） DNA缺乏2'-羟基（2'-OH），这增加了核糖的灵活性，允许各种糖折叠构象。因此，DNA可根据其局部环境呈现A型或B型螺旋几何结构。例如，当DNA位于相邻RNA核苷酸的环境中时，会容易获得RNA首选的A型样螺旋结构。与RNA核苷酸相比，DNA具有增强的核酸酶稳定性，但无法形成氢键相互作用。 2'-O-甲基（2'-OMe） 对于寡核苷酸疗法而言，添加2'-OMe不仅可提高靶标结合亲和力和核酸酶稳定性，还有助于降低免疫反应。这种突破性修饰在临床应用中取得了显著成功，是小干扰RNA药物帕替拉尼、吉沃西兰和英克西兰疗效的关键组成部分。由于甲基取代氢，新引入的基团不能作为氢键供体，但可以作为受体。有趣的是，RNA可被天然修饰为2'-OMe，例如通过位点特异性RNA引导的box C/D小核仁RNP复合物。 2'-氟RNA（2'F-RNA） 这种修饰通过氟原子取代2'-OH基团，是最早研究的合成RNA模拟物之一，已用于多种FDA批准的寡核苷酸疗法，包括哌加他尼和帕替拉尼。由于电负性极强的氟增强了碱基对中核苷酸碱基之间的氢键强度，2'F-RNA可提高互补核酸的热亲和力（每次修饰的ΔTm=+2-3°C；Tm为解链温度）。氟原子可作为氢键受体，但不能作为供体。值得注意的是，尽管这种修饰增强了核酸内切酶稳定性（尤其是嘧啶核苷酸），但2'F-RNA修饰的寡核苷酸仍易被核酸外切酶降解。 桥接核酸（BNAs） 研究表明，BNAs还可增强细胞摄取、结合亲和力和核酸酶稳定性。其中最简单的锁核酸（LNA），显著提高了与RNA的热亲和力（每次修饰的ΔTm=+5-9°C）。糖的预组织形成RNA样构象，以及2'-O,4'-C亚甲基桥增强的疏水相互作用，可解释结合亲和力的提高。在CRISPR-Cas9系统中测试的其他双环类似物包括受限2'-O-乙基（cEt）和N-甲基取代的BNAs（BNA NC）。 硫代磷酸酯（PS） PS键是研究最广泛的磷酸修饰之一——其中一个非桥接氧原子被硫原子取代。这种细微变化略微降低了与互补RNA的结合亲和力（每次修饰的ΔTm=-0.5°C），但增强了与血清蛋白（如白蛋白）的结合，有助于循环。由于核苷酸间PS键具有手性，长度为n个核苷酸的完全PS修饰寡核苷酸的合成，会产生2ⁿ⁻¹种可能的非对映异构体。具有Rp立体化学的PS键更易被核酸酶降解，而具有Sp立体化学的PS键对结合亲和力的损害较小。因此，差向异构体（Rp+Sp）混合物在结合亲和力和核酸酶抗性之间取得了良好平衡。 探索构效关系和扩展治疗效用 化学改变核酸结构，会对其生物物理性质（如杂交亲和力和螺旋结构）和药理性质（如疏水性、核酸酶抗性、免疫原性、药代动力学和药效学，以及在组织中的积累或半衰期）产生深远影响。这些变化可能成为临床转化的关键决定因素。化学修饰对于核酸疗法的成功至关重要——美国食品药品监督管理局（FDA）批准的每项疗法均具有至少一种必需的化学修饰。这包括PS修饰（已用于早期反义药物，如福米韦生）、2'-OMe和2'F-RNA修饰（有助于小干扰RNA疗法，如吉沃西兰和卢马西兰的疗效）、2'-O-甲氧基乙基修饰（存在于ASO中，如米泊美生、英托森和沃拉诺森，可提高靶标结合和稳定性）。吗啉代磷酸二酰胺寡核苷酸具有抗核酸酶的中性骨架，用于剪接转换寡核苷酸（如依特立生和戈洛迪生），治疗杜氏肌营养不良症。从基础科学角度而言，核酸的化学修饰还可作为探针，更好地理解与辅因子（即Cas9）或分子靶标（即DNA或RNA）相互作用时的构效关系和作用机制。 对RNA核苷酸碱基的核糖部分进行修饰，可通过减少免疫识别、增加半衰期和稳定性，以及调节靶标杂交亲和力，增强治疗性质。最直接的修饰之一是将2'-OH基团替换为氢（H），形成2'-脱氧核糖（即DNA）。已有多个研究小组探索了Cas9和Cas12a crRNA中的DNA取代——既作为探索构效关系的探针，也作为提高潜在治疗效用的方法。完全转化为DNA会使crRNA失活，可能是由于失去了足够的A型结构和氢键网络。然而，部分DNA修饰（尤其是在与Cas蛋白相互作用不显著的位置，如环区域、末端以及远离预测的2'-OH接触点）具有良好耐受性，甚至可增强酶活性和特异性。 图4 CRISPR–Cas9系统中连接crRNA和tracrRNA形成单一向导RNA（sgRNA）的化学修饰此类化学修饰包括非张力（A部分）和张力（B部分）三唑基连接体，以及短链（C部分）和长链（D部分）四嗪基连接体。注：crRNA=CRISPR RNA；tracrRNA=反式激活crRNA。 DNA是天然存在的核苷酸，仍易受酶降解，并会被参与先天免疫传感的细胞因子识别。因此，已对其他具有明确特性且在核酸疗法中取得成功记录的核糖修饰进行了更深入的研究。这些修饰包括2'-OMe、2'F-RNA和2'-4'桥接核酸（BNAs）——它们更能模拟RNA核苷酸结构，要么阻断RNase识别，要么阻止2'氧对相邻3'磷酸的通常分子内攻击。 2'位置的甲基化（生成天然存在的2'-OMe），已用于替换Cas9 crRNAs、tracrRNAs和sgRNAs以及Cas12a crRNAs末端的5'和3'核苷酸。据报道，这种修饰可提高稳定性、活性和特异性——尽管更高的活性可能源于细胞中更长的半衰期。在内部特定位置（略微庞大的甲基不会造成空间限制或破坏由2'-OH基团介导的预测极性接触），2'-OMe的内部放置也具有良好耐受性。 2'F-RNA修饰已被纳入Cas9的双向导系统（即crRNA和tracrRNA）和sgRNA，以及Cas12a的crRNA。当放置在高度2'-OMe修饰的Cas9 sgRNA的向导区域时，可提高体内编辑活性并减少脱靶编辑事件。在双向导背景下，完全2'F-RNA修饰的crRNA在体外保持编辑活性，但在细胞中几乎完全丧失活性。向导区域中交替的2'F-RNA/2'-OMe模式，完全消除了体外编辑活性。在种子区域3'端放置2'F-RNA，在主要为全DNA修饰或未修饰的crRNA背景下，在体外具有耐受性。然而，当这些crRNA用于细胞时，基因编辑显著降低。2'F-RNA最有效的位置之一是在gRNA间隔区的5'端（种子区域外）。在Cas9的tracrRNA中，2'F-RNA可有效提高细胞编辑效率，尤其是与2'-OMe等其他修饰结合时。 当2'F-RNA被纳入Cas12a的crRNA时，内部2'F-RNA取代比2'-OMe具有更好的耐受性，允许纳入更多修饰。此外，在3'端替换多达五个连续的2'F-RNAs，相对于未修饰的crRNA，可提高活性。这可能是由于氟的原子半径小，对整体结构的影响最小，并保护RNA链免受核酸内切酶稳定性影响（尤其是在嘧啶位点）。这种修饰模式广泛适用于不同的靶标基因，并可用于增强低产量同源物（如LbCas12a）的编辑活性。然而，用2'F-RNA或其他核苷酸类似物对crRNA进行更广泛的修饰，需要考虑对这种取代敏感的2'-OH接触。 在Cas9的间隔区种子区域放置BNAs（如LNA、cEt和BNA NC），可提高细胞中的PAM特异性，但降低体外切割动力学和活性。这归因于BNA修饰有助于诱导强A型螺旋特征，从而更好地与靶标DNA结合。由于其空间位阻较大，在gRNA间隔区的特定位点纳入BNA NC，与锁核酸相比，可提高靶标特异性。尽管BNA类似物在构象上“锁定”，但增强寡核苷酸灵活性的修饰，在靶向复杂二级结构时非常有用。当在双向导系统中使用时，经解锁核酸（UNA）修饰的Cas9 crRNA，在体外表现出最低的基因编辑活性。然而，仅在间隔区3'端的单个位置（与其他化学修饰结合）测试了UNA。增强灵活性的另一类是非核苷酸连接体（如丁二醇）——当在与UNA相同的位置和化学修饰背景下使用时，也表现出最低的编辑活性。因此，需要开展更多研究，以确定UNA和丁二醇等柔性修饰是否可在其他位置增强gRNA特性。 不符合典型RNA模拟物特性但已被研究的修饰，是2'-阿拉伯核酸和2'-氟-阿拉伯核酸。鉴于它们倾向于DNA样糖构象，已用于研究先前研究中涉及的A型螺旋结构、灵活性和2'-OH要求。当用于Cas9和Cas12a crRNAs时，这些修饰通常降低体外编辑活性。然而，当用于Cas9 crRNA的tracrRNA配对区域时，体外切割活性得以维持。 2'-羟基屏障 目前，文献中评估的所有核糖修饰，均未能令人满意地替换gRNA与Cas9或Cas12a蛋白形成2'-OH极性接触的大多数残基。我们通俗地将这一瓶颈（有效阻止gRNA的完全化学调节）称为“2'-羟基屏障”。围绕2'-羟基屏障的一个令人困惑的现象是，一些修饰在这些位置在体外具有良好耐受性——即使使用完全化学修饰的gRNA，也能提供强大的酶促切割，但当引入细胞时，这些相同的gRNA通常不支持高效的基因编辑。这些结果表明，细胞环境或染色质底物的独特特征，赋予CRISPR-Cas酶对2'-OH接触的关键敏感性。细胞环境中固有的几个因素可能导致这种差异。一个关键考虑因素是活性RNP复合物的浓度——体外分析通常使用更高浓度的RNP和靶标DNA，且不受细胞摄取、区室化、定位和分子拥挤的限制。此外，基因组DNA的染色质可及性，使其比纯化DNA更难结合和切割。因此，2'-OH接触的细微变化及其在Cas活性中的作用，在体外可能无关紧要，但会影响细胞环境中的基因编辑。 当试图替换关键2'-OH位置的天然RNA残基时，观察到体积较大的修饰（如Cas9 crRNA中的2'F-4'OMe和2'4'-diOMe修饰，以及Cas12a crRNA中的七元环氧杂环核酸）兼容性较差。相反，结构干扰较小的修饰（如2'F-RNA和DNA）在某些位置具有更好的耐受性。不幸的是，DNA不具备氢键形成能力，且2'F-RNA仅能提供一些氢键受体特性，而不能提供氢键供体特性。2'-阿拉伯核酸是RNA的立体异构体，但2'-OH指向相反方向，在少数关键2'-OH残基处的替换，尽管表现出体外切割活性，但未能支持Cas12a的基因编辑。为了在2'位置替换氢键供体和氢键受体特性，在Cas12a crRNA的5'柄中的单个残基处纳入了2'-氨基（2'-NH₂）。对两个关键残基进行2'-NH₂和2'F-RNA的逐步替换，发现无法替换大多数接触位置的2'-OH，尽管观察到每种修饰都具有一定的位置依赖性和序列依赖性。 尽管关键2'-OH残基必须在很大程度上保持为天然RNA核苷酸，但仍可通过相邻磷酸二酯键的修饰（如PS键）对其进行部分保护，尽管编辑活性通常会降低。鉴于PS键改变了微妙的蛋白质相互作用，并略微降低了杂交亲和力，这些观察结果表明，2'-OH基团除了简单的氢键外，还发挥着其他功能（如支持酶动力学）。除硫代膦酰乙酸酯外，还在Cas9 crRNA的间隔区探索了膦酰乙酸酯（PACE）骨架修饰。在特定位置纳入PACE，可显著降低脱靶效应。尽管未在特定2'-OH接触的背景下进行PACE纳入，但这些结果表明，关键2'-OH接触可能有助于控制特异性和活性，并主张对连接修饰进行更多研究。还探索了Cas9 crRNA中的2',5'-RNA——这种连接在保持糖上的羟基的同时，提供了增强的核酸酶抗性。然而，在整个Cas9 crRNA中多次连续插入这种非经典连接，会导致编辑活性降低或丧失。最后，磷酰胍是一种电荷中性骨架修饰——当策略性地纳入Cas9 crRNA的PAM远端间隔区的特定位置（远离2'-OH接触）时，发现在不显著影响编辑活性的情况下，可提高靶标特异性。 为解决2'-羟基屏障问题，应进一步探索能够维持2'-OH接触但赋予核酸酶抗性的新型化学物质（如4'核糖修饰）。然而，它们对核糖环构象、碱基配对效率和空间位阻的影响可能会影响功能，需要加以考虑。其他工程替代方案可能提供解决方案，例如最近展示的使用化学修饰的寡核苷酸，与不稳定RNA核苷酸上的sgRNA杂交，从而实现sgRNA在体内的“裸”未配方递送。同样，共价缀合物的探索较少，但它们可以掩盖gRNA或有效地将其导向特定组织。例如，与SpCas9a蛋白融合的细胞穿透肽，已被证明可增强向纹状体的递送。单个Cas酶的蛋白质工程，也可能为某些治疗应用提供解决方法。尽管已投入大量精力进行Cas蛋白工程，但在将CRISPR gRNA的化学工程与Cas蛋白工程相结合方面，仍存在巨大差距。 Cas9和Cas12a系统均观察到2'-羟基屏障，这表明RNA引导的CRISPR酶可能共享更广泛的特征。一种假设是，对2'-OH接触的依赖，源于RNA向导与其蛋白质对应物的密切协同进化——有助于调节酶活性（如许多辅因子所做的那样），或确保DNA不能被替代用于促进切割活性。值得注意的是，对于Cas9和Cas12a，2'-OH接触主要发生在gRNA和肽骨架之间，而非氨基酸侧链之间。这些接触可能通过构象动力学在调节酶活性中发挥作用。然而，在Cas酶催化所经历的许多构象状态转变过程中，它们的状态仍不清楚。尽管gRNA的完全修饰对于许多应用可能并非必需，但深入理解修饰耐受性的规则，对于精确调整CRISPR-Cas系统以满足临床疗效标准并解锁更广泛的治疗用途至关重要。重要的是，类似的2'-羟基屏障可能适用于其他RNA引导的酶。因此，理解2'-羟基屏障可能不仅加速CRISPR基疗法的发展，还将影响CRISPR之外的其他RNA引导系统（这些系统最终可能找到治疗应用，如最近发现的桥RNA引导的IS110基重组系统）。 图5 CRISPR–Cas系统中使用的化学修饰 这些修饰分为三类：核苷酸碱基修饰（黄色）、糖基修饰（红色）和磷酸基团修饰（蓝色），涵盖核碱基（如m⁵C、Ψ）、糖环（如2'-OMe、2'F-RNA、LNA、UNA）及磷酸骨架（如PS、PACE、PG）等多种修饰类型。 专栏2 纳入CRISPR RNA的其他多种化学修饰 4'-O-甲基（4'-OMe）与2'-F和2'-OMe结合 2'F-4'OMe和2'4'-diOMe修饰被证明采用RNA样构象。这两种修饰均增强核酸酶稳定性，提高热亲和力，并在小干扰RNA中具有耐受性。 解锁核酸（UNA）和非核苷酸连接体 UNA得名于核糖中缺乏C2'-C3'键，显著降低RNA双链体中的结合亲和力（每次修饰的ΔTm=-10°C；Tm为解链温度），但增加了寡核苷酸靶向二级结构的灵活性。尽管降低了结合亲和力，但与天然RNA相比，它确实增强了错配识别和核酸酶抗性。 丁二醇（C4）连接体等非核苷酸结构已被证明可破坏双链体结构，但增强其灵活性。这种修饰维持了磷酸距离，并已被证明可破坏双链体（每次修饰的ΔTm=-5至-8°C），但当纳入DNA:RNA双链体的反义链时，可将RNase H切割速率提高3.5倍——这与反义寡核苷酸应用相关。相比之下，UNA修饰未显示出这种增强。 阿拉伯核酸（ANA）和2'-氟-阿拉伯核酸（2'F-ANA） ANA是RNA的立体异构体，由于2'-OH位于核糖的相反面，构象与DNA相似。ANA可与RNA结合，但不能与DNA互补，并且比DNA和RNA对3'核酸外切酶具有更高的抗性。 2'F-ANA修饰是2'F-RNA的差向异构体，采用DNA样糖构象。2'F-ANA:RNA杂合体的一个特殊特征是在嘌呤:嘧啶步骤（如TG和TA）形成核苷酸间氟-氢键（2'F-H8）。有证据表明，这些相互作用也发生在嘧啶和嘌呤核苷的分子内。2'F-ANA寡核苷酸有许多应用，包括反义寡核苷酸、小干扰RNA和适配体。与ANA类似，2'F-ANA也赋予增强的3'核酸外切酶抗性。 2',5'-RNA 2',5'核苷酸间连接是核酸中最常见的经典3',5'连接的替代方案。尽管这种连接破坏了RNA双链体（每次修饰的ΔTm=-2.5至-4.3°C），但糖折叠适应其构象的能力（尤其是当在其他3',5'-RNA链中使用单个或最小插入时），允许分子的结构灵活性。 2'-氨基（2'-NH₂） 2'-NH₂包含胺基而非2'-OH基团，可同时作为氢受体和氢供体。在生理pH下，由于2'-NH₂基团的pKa约为6.2，2'-NH₂的主要形式是非质子化的。这增加了形成氢键相互作用的可能性。这种修饰采用与DNA相似的构象。 氧杂环核酸 氧杂环核酸（OxNA）具有扩展的环结构，带有七元环。随着环大小的增加，它可以在多个位置拥有羟基，原则上能够形成多个氢键相互作用。OxNA的扩展环结构，使其能够将核苷酸间连接放置在糖环的各个位置。 膦酰乙酸酯和硫代膦酰乙酸酯 骨架修饰膦酰乙酸酯（PACE）和硫代膦酰乙酸酯（thioPACE）具有磷-碳键，分别带有非桥接氧或硫原子。研究表明，当用于DNA时，它们会募集RNase H，并且对核酸酶具有抗性。 磷酰胍 磷酰胍（PG）连接是一种骨架修饰，用磷酰胍基团取代其中一个非桥接氧原子，使骨架呈电荷中性。这种修饰增强了细胞摄取和核酸酶抗性。此外，与其他骨架修饰不同，这种连接增强了与DNA和RNA靶标的杂交亲和力，并在细胞中具有低毒性。 递送难题 与许多核酸疗法类似，靶向且安全的递送，是CRISPR-Cas系统在临床应用中有效使用的重大挑战。该系统组件的大尺寸、负电荷和可变稳定性，带来了诸多困难。 图6 CRISPR–Cas系统的递送方式 （A）临床试验中使用的CRISPR组件（mRNA和向导RNA）及递送系统（脂质纳米颗粒）：脂质纳米颗粒（LNP）包裹编码Cas蛋白的mRNA和化学稳定的向导RNA（gRNA），mRNA 5'端带有帽子结构（5'GPPPAAA-3'），通过LNP实现体内递送。 （B）临床前开发阶段的组件及递送系统：包括DNA质粒（编码Cas蛋白和gRNA）、核糖核蛋白（RNP），以及类病毒颗粒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、细胞穿透肽和外泌体等递送载体，可实现不同CRISPR组件的靶向递送。 正在进行的临床试验主要利用腺相关病毒表达或脂质纳米颗粒（LNP）制剂进行递送。病毒载体（尤其是腺相关病毒）已被广泛探索用于基因编辑应用——因其尺寸小、递送效率高且具有组织特异性嗜性。然而，其包装容量限制在约4.7 kb，这限制了更大CRISPR系统的递送。这一障碍可通过使用不同的病毒递送载体（如慢病毒和腺病毒颗粒）来克服——这些载体在负载容量、封装的遗传物质类型、免疫原性和组织嗜性方面存在差异。或者，可将CRISPR组件分为两个病毒载体，并使用更小的Cas酶（如金黄色葡萄球菌Cas9（SaCas9）和丹毒丝菌科的Cas12a（EbCas12a））或内含肽分裂Cas9，以减少总体负载。类病毒颗粒已成为一种有前途的方法，兼具病毒和非病毒递送的优点。类病毒颗粒源自逆转录病毒（如HIV-1和莫洛尼小鼠白血病病毒），能够直接递送mRNA、蛋白质或RNPs，而非工程化病毒基因组。DNA表达载体可与细胞穿透肽组装成纳米结构，作为病毒载体或类病毒颗粒的替代方案。这些短肽带正电，通过静电相互作用与载体DNA结合。它们还可与核定位序列缀合，以促进核转运，或与适配体缀合以实现细胞靶向能力。 除了递送编码基因编辑系统的DNA外，还可将CRISPR组件作为单独的RNA分子递送至细胞，具体为编码Cas蛋白的mRNA和化学稳定的gRNA。Cas蛋白必须从mRNA翻译而来，这在RNP组装前造成时间滞后，因此gRNA的化学稳定尤为重要。基于RNA的递送最常见的方法是使用LNPs——如先前经临床批准的小干扰RNA疗法和mRNA疫苗所证明的。此外，由于其瞬时和非病毒特性，以及无法永久整合到患者细胞的基因组中，使用LNPs进行基于RNA的CRISPR-Cas系统递送，可减轻DNA表达的风险。LNPs能够在全身给药或直接给药至所需组织后，靶向多种组织（基于其大小和脂质组成）。它们还可共同配制，将Cas mRNA和gRNA封装在同一个颗粒中，确保递送至确切位置。LNPs可通过靶向配体进一步功能化，以提高特异性。例如，N-乙酰半乳糖胺功能化的LNPs优先靶向肝脏，并且在临床批准的小干扰RNA和ASO递送中安全且稳健。LNPs在血清中与载脂蛋白E（ApoE）复合后，主要被肝细胞内吞。内吞作用遵循N-乙酰半乳糖胺与脱唾液酸糖蛋白受体（ASGPRs）的结合——ASGPRs在肝细胞中的表达浓度显著高于其他细胞类型，从而实现靶向摄取。 在基于RNP的递送方法中，预先组装的RNP复合物直接递送至细胞，可精确控制Cas蛋白和gRNA的组成和浓度。这种方法有助于最大限度地减少对gRNA的化学修饰要求，并消除RNP组装作为限制因素，通常可实现高编辑效率。然而，与质粒和mRNA类似，RNP复合物必须受到保护，且无法轻易穿过细胞膜。电穿孔有利于合子和干细胞的体外基因编辑。然而，这种方法对于体内基因编辑既不安全也不实用。大脑有多种直接注射途径，如鞘内注射、纹状体内注射和脑室内注射。然而，研究人员主要利用静脉内或皮下给药，在肝外组织中递送RNP复合物。LNP制剂和外泌体可全身封装并向细胞递送RNP复合物。外泌体是由脂质双层组成的天然细胞外囊泡。该双层在循环过程中保护RNP复合物，并防止其被免疫细胞识别和破坏。外泌体可源自靶细胞类型，或通过肽人工功能化以实现靶向递送。 下一代CRISPR-Cas系统 CRISPR-Cas系统进化为原核生物抵御噬菌体和自私遗传元件的防御机制，而非用于临床应用中的精确遗传操作。将其引入哺乳动物细胞以产生DSBs，通常会导致除偶尔脱靶编辑外的不良副作用，如诱导遗传毒性、大缺失、染色体易位和染色体重排。控制DNA修复结果的难度，促使开发不产生DSBs的替代CRISPR-Cas效应物。这些系统利用催化失活的“失活”（即dCas9）或切口酶（即nCas9）版本，与其他酶或因子融合以产生预期效果。例如DNA核苷酸碱基转换（碱基编辑）、通过逆转录引入新的短模板序列（引导编辑），以及瞬时表观基因组编辑技术（如转录激活（CRISPRa）或转录干扰（CRISPRi））。此外，使用Cas13等CRISPR-Cas系统靶向RNA，为基因靶向治疗创造了新机会。重要的是，化学crRNA工程的许多优势和挑战将扩展到这些下一代系统——因为它们仍然依赖RNA向导。有关表观基因组编辑的更深入讨论，读者可参考Villiger等人的综述。 图7 无双链断裂的工程化CRISPR–Cas介导编辑 （A）碱基编辑：将Cas9切口酶（nCas9）与脱氨酶融合，无需产生双链DNA断裂即可实现单碱基替换（C→T或A→G）。 （B）引导编辑：由nCas9和逆转录酶（RT）组成，利用引导编辑向导RNA（pegRNA）进行精确DNA编辑，pegRNA包含单一向导RNA、RT模板和引物结合位点。 （C）转录激活（CRISPRa）：将催化失活的Cas9（dCas9）与转录激活结构域（如VP64、VPR、SunTag）融合，工程化单一向导RNA通过MS2适配体募集与MS2外壳蛋白连接的转录激活因子P65和HSF1，靶向基因启动子区域以提高靶基因表达。 （D）转录干扰（CRISPRi）：将dCas9与转录抑制结构域（如KRAB）融合，复合物靶向基因靶位点以抑制转录。 碱基编辑器和引导编辑器 碱基编辑器（BEs）可将核苷酸碱基对从C·G转换为T·A，或从A·T转换为G·C，无需产生DSBs或需要供体模板。它们由gRNA和dCas9（在某些情况下为nCas9）与胞苷或腺苷脱氨酶融合组成。RNA引导系统引导脱氨酶催化靶标碱基的化学转换，从而改变DNA序列。胞嘧啶碱基编辑器将C转换为U，随后在DNA复制或修复过程中被校正为T。同样，腺嘌呤碱基编辑器将A转换为肌苷（I），进一步被校正为G。 编码BE蛋白的mRNA和sgRNA的化学修饰，已被证明可增强碱基编辑效率。在非人灵长类动物中，基于LNP的体内递送利用了带有末端2'-OMe和PS修饰的合成gRNA。用5-甲氧基尿苷替换mRNA中的所有尿苷残基，以及sgRNA的末端2'-OMe和PS修饰，可增加蛋白质表达并显著提高A-to-G转换率。此外，将修饰的sgRNA（带有PACE的2'-OMe）与BE4 mRNA结合使用，与2'-OMe-PS修饰相比，胞苷碱基编辑效率提高了40%，残留sgRNA水平增加了250倍。 与BEs（仅限于特定类型的核苷酸碱基转换）不同，引导编辑器允许更广泛的高精度编辑，包括小插入、缺失和所有12种可能的碱基到碱基转换，无需诱导DSBs。这些系统依赖于与逆转录酶（RT）融合的nCas9，以及称为引导编辑向导RNA（pegRNA）的工程化gRNA。pegRNA由靶向基因组位点的间隔区序列、作为RT介导合成起始序列的引物结合位点，以及编码预期编辑的RT模板序列组成。 pegRNA的稳定性极大地影响引导编辑的功效。核酸外切酶降解导致截短的pegRNAs与全长RNAs竞争，从而降低效率。已使用pegRNA 3'端的结构化基序来解决稳定性问题。例如，3'假结（evopreQ1或mpknot）在各种基因组背景和细胞类型中，使引导编辑效率提高了3-4倍。其他基序包括寨卡病毒核糖核酸外切酶抗性RNA基序（xr-pegRNA）和G-四链体结构，可使引导编辑效率提高4.5倍。 pegRNAs的化学修饰也提高了编辑效率。三个末端2'-OMe和PS键被证明可在人类细胞中提高编辑效率高达3.1倍。体内研究还表明，pegRNA中带有三个末端PS键的全2'-OMe引物结合位点，使编辑效率提高了2.8倍。相反，RT模板的全2'-OMe替换导致活性显著降低。在使用DNA聚合酶而非逆转录酶的分裂引导编辑器中，引物结合位点的全2'-OMe修饰也具有良好耐受性。与带有逆转录酶和pegRNAs的传统引导编辑器不同，这些系统利用DNA聚合酶和未连接的sgRNA（称为线性RNA引导编辑模板或DNA聚合酶模板）。值得注意的是，将DNA修饰引入RT模板，增强了该系统的活性。 转录激活（CRISPRa）或干扰（CRISPRi） CRISPRa和CRISPRi等系统利用dCas9进行靶标DNA结合，而不进行切割。当被引导至基因启动子时，dCas9可与各种转录因子或表观遗传酶融合，以上调或下调基因表达。CRISPRa将dCas9与多个拷贝的VP16反式激活因子结构域或其他激活结构域（如三方激活模块VP64-p65-Rta（VPR））融合。这些结构域与细胞的转录机制相互作用，导致转录上调。或者，SunTag利用重复肽阵列，每个dCas9融合多个VP64激活结构域。协同激活介质（SAM）利用dCas9-VP64，带有包含两个MS2适配体的工程化sgRNA支架——这些适配体结合与HSF1和p65激活结构域融合的MS2外壳蛋白。与VPR和SunTag相比，这种方法导致更高水平的基因激活。第一代CRISPRi使用与dCas9融合的KRAB阻遏物结构域。该结构域通过其锌指基序与DNA结合，并募集TRIM28以诱导异染色质扩散，从而导致基因表达。向KRAB添加MeCP2等效应物，进一步增强了转录抑制，且据报道，SALL1-SDS3等其他结构域表现异常出色。很少有研究探索CRISPRa或CRISPRi的化学修饰向导。仅报道CRISPRi通过纳入两个相对标准的末端2'-OMe-PS键，利用化学修饰的gRNAs。 靶向RNA 天然靶向RNA而非DNA的CRISPR-Cas系统（如CRISPR效应物Cas13家族），是治疗开发的新兴工具。RNA靶向Cas酶的核酸内切酶活性，是RNAi或基于ASO的基因靶向治疗的替代方案。然而，非靶向RNA的非特异性附带切割是一个持续存在的挑战，限制了安全性。化学修饰的crRNAs是否有助于控制Cas13系统的附带切割或脱靶/在靶编辑，目前尚不清楚。迄今为止，仅有一项研究专门调查了Cas13d crRNA的化学修饰，得出结论：RNA敲低活性和持续时间的最显著提升，来自用2'-OMe或PS替换三个3'末端核苷酸，但不同时使用两者。用2'-OMe替换更大部分或整个crRNA，导致活性大幅丧失。然而，RfxCas13d（前称为CasRx）的高分辨率分子结构尚未获得，因此无法研究crRNA与Cas13d之间潜在的2'-OH接触。RNA靶向治疗应用可能转向催化失活（dCas13）版本。这些包括最近改进转剪接技术的尝试——可在pre-mRNA剪接过程中替换整个外显子，或dCas13与其他效应酶融合（如用于位点特异性和靶向A-to-I RNA编辑的ADAR催化结构域）。 CRISPR基疗法 用于血液疾病的Exa-cel/CTX001和Reni-cel/EDIT-301 首个获得临床批准的CRISPR基疗法是exagamglogene autotemcel（exa-cel，前称为CTX001），由Vertex Pharmaceuticals和CRISPR Therapeutics联合开发，用于治疗输血依赖性β-地中海贫血（TDT）或镰状细胞贫血（SCD）患者。由于血红蛋白疾病的单基因性质和孟德尔遗传模式（简化了靶向并导致其在不同人群中的高患病率），这些疾病成为CRISPR基药物干预的有希望候选者。 这两种疾病均由编码成人血红蛋白（HbA）β-珠蛋白亚基的HBB基因突变引起，导致红细胞缺陷或畸形。尽管TDT和SCD影响HbA的正确形成，但胎儿血红蛋白（HbF）不受影响。HbF的产生由转录因子BCL11A调控，BCL11A抑制γ-珠蛋白表达。通常，HbF在出生前后被HbA取代；然而，具有HbF遗传性持续性的个体，其BCL11A变体失活，允许出生后γ-珠蛋白表达，且无临床后果。HbF的遗传性持续性可预防疾病的临床表现。 Exa-cel利用CRISPR-Cas9进行编辑，模拟天然存在的BCL11A变体，以恢复TDT和SCD患者的红细胞功能。该疗法涉及CRISPR编辑的自体CD34+造血干祖细胞（HPSCs）——收集患者细胞，体外编辑，然后通过静脉输注返回患者体内。编辑使用与带有三个末端2'-OMe-PS修饰的sgRNAs组装的Cas9 RNPs。sgRNA靶向红细胞特异性增强子区域的BCL11A基因，从而降低其表达。这种优化策略导致最低的细胞毒性、高水平的基因编辑和检测不到的脱靶编辑。 Exa-cel的初步I期临床试验显示，一名TDT患者和一名SCD患者反应良好。该方法导致两名患者的等位基因编辑频率分别为68.9-82.7%。在第15个月时，TDT患者100%的外周红细胞表达HbF（F细胞），SCD患者98.1%的外周F细胞表达HbF。随后，共有97名患者纳入该研究，绝大多数患者达到了输血独立性和无血管闭塞危象的终点。2023年11月，exa-cel获得英国药品和医疗产品监管局的有条件批准，成为首个获得监管机构批准的CRISPR基疗法。FDA随后于2023年12月和2024年1月，分别批准exa-cel用于治疗TDT患者和伴有血管闭塞危象的SCD患者。 与exa-cel类似，另一种用于TDT和SCD的体外CRISPR基疗法是renizgamglogene autogedtemcel（reni-cel，前称为EDIT-301），由Editas Medicine开发。Reni-cel也由CRISPR编辑的自体CD34+ HPSCs组成；然而，使用的是CRISPR-Cas12a系统，靶标是HBG1/2基因。编码γ-珠蛋白亚基的HBG1/2基因，与HBB基因一起包含在β-珠蛋白基因座中。HBG1/2启动子区域包含靠近激活因子NF-Y结合位点的近端CCAAT盒基序，以及靠近BCL11A阻遏物结合位点的远端CCAAT盒基序。在成人阶段的红细胞中，BCL11A及其辅阻遏物在空间上阻断NF-Y结合，导致NF-Y及其辅激活因子结合到HBB启动子上。远端CCAAT盒基序内的多个单核苷酸多态性（SNPs）可阻止BCL11A结合，这些SNPs通常在具有HbF遗传性持续性的患者中发现。Reni-cel通过使用CRISPR-Cas12a，模拟BCL11A结合区域中的破坏性SNPs。与Cas9系统相比，专有Cas12a系统的使用导致更高的特异性和编辑效率、更大的缺失和更多的indel形成。 在临床前研究中，供体CD34+ HPSCs中观察到约90%的编辑效率，这在小鼠中赋予40-50%的HbF表达。鉴于总血红蛋白中约30%的HbF与两种疾病的症状消失相关，这些水平被认为具有治疗相关性。在一项有限的I/II期临床试验中，两名重度TDT患者和七名重度SCD患者接受了reni-cel治疗。治疗导致HbF和总血红蛋白均增加，4个月后观察到超过40%的HbF，并在整个随访期间保持稳定，从而达到目标水平。治疗还使TDT患者实现输血独立性，SCD患者无血管闭塞危象。 用于遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性的NTLA-2001 尽管血液疾病易于通过体外方法靶向，但靶向组织更具挑战性。一种利用体内递送的CRISPR基疗法是NTLA-2001，由Intellia Therapeutics和Regeneron Pharmaceuticals开发，用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白（hATTR）淀粉样变性患者。这种进行性和致命性疾病，由TTR蛋白的错误折叠和聚集引起，导致多发性神经病和心肌病等临床表现。NTLA-2001旨在靶向并敲除TTR基因，从而减少TTR蛋白并改善患者预后。鉴于该疾病是单基因疾病且TTR主要在肝脏中表达，hATTR淀粉样变性是RNA疗法的常见靶标，包括首个FDA批准的小干扰RNA疗法帕替拉尼。NTLA-2001由靶向TTR基因的sgRNA和编码SpCas9蛋白的mRNA组成，共同配制在具有脂质嗜性的LNP中。由于RNP复合物在进入细胞前未组装，因此sgRNA需要更广泛的化学修饰。基于早期发表的研究，Intellia展示了末端带有2'-OMe-PS且内部茎环带有2'-OMe修饰的sgRNA的体内活性。 转基因小鼠的临床前研究表明，单次给药后，NTLA-2001可敲低TTR表达。此外，在原代人类肝细胞中，即使在预期治疗暴露量的倍数下，在七个预测的顶级位点均未观察到脱靶编辑事件。使用替代sgRNA在食蟹猴中进行编辑，发现该基因通过NHEJ机制修复，在98.8%的序列中产生'A'的单核苷酸插入，导致移码突变。在一项涉及六名患有多发性神经病的hATTR淀粉样变性患者的有限I期临床试验中，单次静脉输注0.3 mg/kg剂量，在第28天使基线血清TTR蛋白水平平均降低87%。接受1 mg/kg更高剂量的队列，在第28天使基线血清TTR平均降低93%。在这些积极结果之后，I期临床试验扩展至72名患者，其中部分患者纳入心肌病组。NTLA-2001（现称为nexiguran ziclumeran或nex-z）已推进至针对多发性神经病和心肌病的关键临床试验。 用于遗传性血管性水肿的NTLA-2002 继NTLA-2001研究成功后，Intellia Therapeutics开发了NTLA-2002，用于治疗遗传性血管性水肿患者。这种疾病主要由SERPING1基因的多个突变引起，导致C1酯酶抑制剂（C1-INH）缺乏（1型）或功能障碍（2型）。C1-INH调节接触激活途径，包括血浆激肽释放酶对高分子量激肽原的切割和释放。缓激肽通过增加血管通透性，在血管性水肿发作中观察到的炎症和肿胀中发挥作用。在罕见的弗莱彻因子缺乏症患者中，血浆前激肽释放酶的减少除了活化部分凝血活酶时间延长外，无重大临床后果。因此，有人认为，敲除编码血浆激肽释放酶B1的KLKB1基因，应是通过降低总血浆激肽释放酶水平，治疗遗传性血管性水肿患者的有效方法。 鉴于血浆激肽释放酶主要在肝脏中表达，NTLA-2002采用与NTLA-2001相同的设计，将sgRNA向导区域的序列重新编程以靶向KLKB1基因，展示了该平台的模块性。在一项涉及十名1型或2型遗传性血管性水肿患者的I期临床试验中，单次给药NTLA-2002，导致总血浆激肽释放酶水平持续降低。与基线相比，接受25 mg、50 mg或75 mg剂量的患者，分别降低了67%、84%和95%。基于先前的研究，已确定总血浆激肽释放酶降低>60%与发作的几乎完全控制相关。该研究中的数据进一步支持了这一点——尽管允许患者继续使用长期预防药物，但所有服用这些药物的患者在NTLA-2002治疗后均停止使用。此外，允许患者在发作期间继续使用按需治疗药物；然而，每位患者的每月发作次数要么减少，要么完全停止，因此不再需要频繁使用按需治疗药物。与NTLA-2001一样，所有不良事件均为轻度至中度。基于这些积极数据，该研究推进至II期临床试验，测试两个最低剂量以及在NTLA-2002给药前停止预防治疗的要求。 用于杂合子家族性高胆固醇血症的VERVE-101和VERVE-102 LNP递送的肝脏疗法的其他例子是VERVE-101和VERVE-102，由Verve Therapeutics开发。这些疗法利用ABE8.8-m碱基编辑技术，以及带有2'-OMe和PS修饰的gRNA，设计用于治疗杂合子家族性高胆固醇血症（HeFH）。HeFH是一种常染色体共显性疾病，其特征是低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平高，导致早发性动脉粥样硬化性心血管疾病。HeFH由负责胆固醇代谢的多个基因突变引起，包括PCSK9、LDLR和APOB，导致LDL-C水平升高。前蛋白转化酶枯草溶菌素9型（PCSK9）在肝脏中产生并释放到血液中，与肝细胞表面的LDL受体（LDLRs）结合并将其靶向降解。PCSK9减少了肝脏表面的LDLR数量，从而限制了肝脏从血液中清除LDL-C的能力。值得注意的是，已证明PCSK9中的功能丧失突变可降低血液中的LDL-C水平。PCSK9基因具有功能丧失突变的个体，冠心病的发生率降低了88%。因此，降低PCSK9水平，可作为降低HeFH患者LDL-C的有效策略，从而减少冠心病事件。 VERVE-101和VERVE-102均利用相同的有效载荷；然而，VERVE-102使用N-乙酰半乳糖胺-LNP递送系统，以增强肝脏递送。这些系统靶向主要在肝细胞中表达的PCSK9基因。在PCSK9基因中引入A-to-G碱基编辑，可有效破坏PCSK9的产生，从而降低血液中的LDL-C。非人灵长类动物的临床前研究表明，PCSK9蛋白血清水平和LDL-C血液水平均显著降低。具体而言，单次给药0.75和1.5 mg/kg的VERVE-101，分别导致LDL-C降低45%和69%。在HeFH患者的临床试验中，单次输注0.45 mg/kg剂量的VERVE-101，使LDL-C胆固醇降低了39-48%。接受0.6 mg/kg更高剂量的患者，LDL-C水平降低了55%，并维持长达180天。然而，由于一名患者出现血清丙氨酸转氨酶水平严重升高，Verve Therapeutics暂停了VERVE-101临床试验的招募。幸运的是，不良事件在几天内完全解决。该公司已将重点转向VERVE-102试验。 结论 CRISPR技术已彻底改变分子生物学、生物医学研究和医学领域。它允许研究人员敲除基因、添加新基因和序列元件、开启或关闭转录，以及向生物体基因组添加表观遗传标记。最近，它还实现了RNA序列水平的编辑，有可能在基因治疗中获得类似的收益，同时降低风险。使用CRISPR进行人类基因编辑，已在临床上展示了治疗先前无法治愈的疾病的能力，包括TDT、SCD和hATTR淀粉样变性——通过有意改变患者细胞内的DNA。 gRNA的化学修饰为其作为治疗剂的成功做出了贡献。常用修饰包括PS键、2'F-RNA和2'-OMe——这些修饰在Cas9和Cas12a gRNAs的末端和选定内部位置具有良好耐受性。然而，这些化学修饰（甚至是在CRISPR-Cas研究中广泛使用的修饰），仅代表先前为核酸疗法探索的化学物质的一小部分。因此，仍有许多其他化学物质可能适用于CRISPR-Cas系统。这些包括核苷酸碱基修饰、防止核酸内切酶降解的内部修饰，以及理解和克服2'-羟基屏障的核糖修饰。尽管仍有进步空间，但CRISPR基疗法的未来前景极为光明——已取得临床成功，且许多令人兴奋的应用即将出现。