PF-04691502

点击蓝字 ↑ 关注药研视角 PharmaView JMC速览 2026.02.05 近日，中国科学院广州生物医药与健康研究院唐士兵/巫林平/Micky D. Tortorella团队在药物化学权威期刊Journal of Medicinal Chemistry上发表了一篇题为"Discovery and Optimization of 4-Aminopteridin-7(8H)-one Derivatives as Potent and Selective mTOR Inhibitors with Favorable Pharmacodynamic and Safety Characteristics"（4-氨基蝶啶-7(8H)-酮衍生物的发现与优化：兼具优异药效与安全性的高选择性mTOR抑制剂）的研究论文。广州健康院王丹阳、李庚武、刘建光为论文的共同第一作者，唐士兵、巫林平、Micky D. Tortorella（现单位为中国科学院香港创新研究院）为论文的共同通讯作者。 1 min速览 研究背景 mTOR信号通路与肿瘤治疗需求：mTOR（雷帕霉素靶蛋白）是PI3K/AKT/mTOR信号通路的核心节点，调控细胞生长、增殖、存活和代谢，在胃癌、肺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中异常激活。现有mTOR抑制剂分为三代：第一代雷帕霉素及其衍生物（rapalogs）存在水溶性差、生物利用度低及无法抑制mTORC2等缺陷；第二代ATP竞争性抑制剂（mTOR-KIs）虽能同时抑制mTORC1和mTORC2，但部分化合物因靶点选择性不足导致严重毒性——如PF-04691502因双重抑制PI3K/mTOR引发肺炎和肺毒性而终止临床试验，OSI-027则引起急性肾损伤。因此，开发结构新颖、高选择性、低毒性的mTOR抑制剂仍是该领域的迫切需求。 重点内容 1. 全新骨架设计与构效关系优化 通过分析PF-04691502、OSI-027、Torkinib和Sapanisertib等代表性mTOR抑制剂的共同药效团，采用生物电子等排替换和骨架跃迁策略，设计并构建了4-氨基蝶啶-7(8H)-酮全新母核 该骨架模拟ATP腺嘌呤部分，可与mTOR铰链区Val2240形成氢键，并与疏水残基Trp2239产生π-π堆积作用 系统优化N-8位和C-6位取代基：环己烷羧酸侧链（N-8位）通过氢键网络稳定结合；6-羟基苯并呋喃（C-6位，化合物51/T133）将活性从427 nM提升至0.34 nM，提升逾1200倍 2. 高选择性与广谱抗肿瘤活性 对473种激酶的筛选显示，T133（51）对mTOR具有卓越选择性，仅对PI3K亚型有轻微抑制（Ki：PI3Kα 47 nM、PI3Kβ 125 nM、PI3Kδ 1.8 nM、PI3Kγ 4.9 nM），对mTOR的Ki为0.17 nM，选择性倍数>10倍 在17种肿瘤细胞系中表现出广谱抗增殖活性，对HGC-27胃癌细胞的IC₅₀为0.82 μM 3. 双重抑制mTORC1/mTORC2及多重抗肿瘤机制 Western blot证实T133剂量依赖性抑制mTORC1下游底物（p-S6、p-4EBP1）和mTORC2下游靶点（p-AKT） 诱导细胞凋亡（PARP切割）、自噬（MDC染色）及G1期细胞周期阻滞 4. 优异的药代动力学与安全性 小鼠PK参数：口服生物利用度31.2%，半衰期1.88 h，Cmax 868 ng/mL 肝微粒体稳定性良好（人/小鼠t₁/₂分别为266 min和248 min） 安全性评价：CYP450抑制活性低（IC₅₀ >10 μM）、Ames试验阴性、hERG抑制率仅7.7%（30 μM） 5. 体内药效与安全性对比优势 HGC-27胃癌异种移植模型：30 mg/kg和60 mg/kg剂量下肿瘤生长抑制率分别为83%和92%，与PF-04691502（10 mg/kg，95%）疗效相当 关键差异化优势：PF-04691502组出现显著体重下降、ALT/AST升高、IL-6激增及肝/肺组织病理损伤（肝窦狭窄、肺泡结构破坏、间质纤维化）；而T133组体重稳定，肝肾功能正常，无炎症反应，组织形态正常 研究总结 本研究通过理性药物设计成功开发了一类4-氨基蝶啶-7(8H)-酮类高选择性mTOR抑制剂，代表化合物T133（51）具有以下核心优势： 亚纳摩尔级酶抑制活性（Ki = 0.17 nM）和>10倍的选择性 双重抑制mTORC1/mTORC2，阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路 广谱抗肿瘤活性覆盖胃癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤 显著改善的安全性特征，解决了现有mTOR抑制剂临床毒性瓶颈 良好的口服生物利用度和代谢稳定性 T133作为兼具高效力、高选择性、优异安全性的临床前候选化合物，为mTOR靶向抗肿瘤药物开发提供了新的化学骨架和优化方向，具有进一步开发用于治疗胃癌及其他恶性肿瘤的潜力。 图片来源：ACS 详细阅读 01 INTRODUCTION 研究背景 PI3K/AKT/mTOR信号通路调控细胞生长、增殖、存活和代谢，其异常激活与胃癌等多种恶性肿瘤相关。研究表明，磷酸化mTOR（p-mTOR）在超过60%的胃腺癌中高表达，且与肿瘤侵袭性、转移正相关，与患者五年生存率负相关，提示靶向mTOR是胃癌治疗的潜在策略。mTOR属于PI3K相关激酶家族，形成mTORC1和mTORC2两种功能不同的复合物。现有mTOR抑制剂分为三代：第一代rapalogs（如雷帕霉素）溶解性差、生物利用度低且无法抑制mTORC2；第二代ATP竞争性抑制剂（mTOR-KIs）可同时抑制mTORC1和mTORC2，但临床化合物存在毒性问题——PF-04691502因双重抑制PI3K/mTOR导致肺炎和肺毒性终止临床开发，OSI-027引起急性肾损伤，Sapanisertib因毒性需降低剂量；第三代RapaLinks为双价抑制剂，有望克服耐药。此外，mTOR/PI3K、mTOR/HDAC等双靶点抑制剂也在开发中。尽管取得进展，但选择性不足导致的毒性仍是mTOR抑制剂临床成功的主要障碍。因此，开发结构新颖、选择性更高、毒性更低的新型mTOR抑制剂仍是研究热点。本研究报道了一类4-氨基蝶啶-7(8H)-酮衍生物作为新型ATP竞争性mTOR抑制剂，通过优化获得先导化合物T133（51），兼具高效力、高选择性和良好的药效与安全性特征。 02 Drug Design ①药物设计 为克服第一、三代mTOR抑制剂选择性差、耐药及无法抑制mTORC2等局限，本研究以ATP竞争性抑制剂为结构模板，通过系统分析代表性第二代抑制剂（PF-04691502、OSI-027、Torkinib、Sapanisertib）发现其ATP结合口袋中双环含氮杂环的保守药效团特征，进而采用生物电子等排替换和骨架跃迁策略重新设计核心骨架。经Schrodinger Maestro和Discovery Studio软件进行分子对接和药效团匹配的计算机辅助迭代优化，成功设计了模拟ATP腺嘌呤部分的新型4-氨基蝶啶-7(8H)-酮骨架——该刚性稠合吡嗪酮-嘧啶系统可与mTOR铰链区Val2240形成强氢键，并与疏水残基Trp2239产生π-π堆积作用，7-羰基改善水溶性并降低clogP，4-氨基则提供进一步相互作用位点。 ②构效关系 为获得强效衍生物，研究首先考察N-8位结构修饰的构效关系：以IC₅₀为9.4 nM的化合物1为阳性对照，设计合成了N-8取代衍生物5-9，其中与化合物1取代基相同的衍生物5活性中等（IC₅₀=427 nM），证实该核心结构具有mTOR靶向潜力但需进一步优化；环己烷羧酸取代的衍生物6活性最高（IC₅₀=40 nM），分子对接显示其羧酸侧链与mTOR ATP结合位点的Gln2167和Lys2187形成稳定氢键网络，与选择性mTOR抑制剂2的结合策略一致，突显羧酸基团在靶点结合中的关键作用；相比之下，羟基取代衍生物9几乎无活性（IC₅₀>10,000 nM），线性烷基链衍生物8活性降低（IC₅₀=2153 nM），吡喃环衍生物7活性有限（IC₅₀=801 nM），表明N-8位对取代基极性和空间取向高度敏感，倾向于极性或特异性相互作用基团。鉴于化合物6的可修饰性，研究选择N-8位带环己烷羧酸的4-氨基蝶啶-7(8H)-酮作为核心结构，进一步开展C-6位取代基的构效关系研究，合成并系统分析了吡啶基、苯基、吲哚基及其他杂环取代类似物。 ③合成路线 4-氨基蝶啶-7(8H)-酮衍生物的合成路线如方案1所示，以化合物51的制备为例进行说明。总体策略涉及引入官能团和构建核心骨架以进行后续转化：化合物57a在酸性条件下经亚硝酸钠处理引入亚硝基得到57b，前体58a引入甲磺酰基作为离去基团得到中间体58b，该修饰有利于后续亲核取代反应；58b制备完成后开始构建4-氨基蝶啶-7(8H)-酮核心骨架，为引入不同R²基团，相应羧酸前体（如59a）经酯化反应，若前体含羟基需预先保护以防止副反应，酯化中间体随后与57b反应并重排生成核心中间体如51a；51a再与58b发生亲核取代反应引入R¹基团得到中间体51b，最后对51b进行脱保护和水解反应生成目标化合物51。衍生物5-55的合成遵循类似总体策略，仅根据最终结构调整具体R¹和R²取代基前体，该模块化方法通过改变R¹和R²位官能团实现产物库的高效多样化。 03 RESULTS ①化合物51是选择性mTOR抑制剂并可抑制癌细胞增殖与迁移 为评估化合物51的激酶选择性，研究采用SelectScreen激酶分析服务，在1 μM浓度下对473种独特激酶和突变体进行了485项检测。激酶树图结果显示，51对绝大多数激酶几乎无影响，仅对mTOR和PI3K有抑制作用，表现出优异的选择性。为进一步确认51对mTOR的选择性，研究评估了其对I类PI3K四种亚型的抑制效力：51对mTOR的Ki值为0.17 nM，对PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kδ、PI3Kγ的Ki值分别为47 nM、125 nM、1.8 nM和4.9 nM，对mTOR的选择性超过PI3K亚型10倍以上。与PF-04691502相比，51增强的选择性可能归因于其空间构象——羧基与外部Glu2190和Lys2187形成盐桥相互作用，同时与mTOR形成稳定的氢键网络。研究进一步检测了51在多种人癌细胞系中的细胞抑制活性，包括胃癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、白血病、淋巴瘤和浆细胞瘤，IC₅₀值在亚微摩尔至低微摩尔范围，提示51具有广谱抗增殖效应。鉴于p-mTOR过表达与胃癌进展的正相关性，研究在携带PI3KCA突变和PTEN缺失的HGC-27胃癌细胞中系统评价了51的细胞活性：51以0.82 μM的IC₅₀值显著抑制HGC-27细胞增殖。此外，51在非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299和乳腺癌细胞系T-47D中也表现出强效抗增殖活性，IC₅₀值分别为1.22 μM和0.28 μM。 ②化合物51通过PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导细胞凋亡、细胞周期阻滞和自噬 研究通过Western blot分析考察了51对HGC-27细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响，处理时间为2小时和24小时，并通过三次独立实验的定量分析进行确认。作为竞争性mTOR抑制剂，51通过双重抑制mTORC1和mTORC2有效阻断该信号通路：具体而言，mTORC1调控的核糖体蛋白S6磷酸化及真核翻译起始因子4E结合蛋白1（4EBP1）磷酸化，以及作为mTORC2下游靶点的AKT磷酸化，均被51以剂量依赖性方式抑制，特别是在低于1 μM浓度下即显示出强效抑制活性，突显其治疗潜力。此外，Western blot检测了多聚ADP核糖聚合酶（PARP）及其切割形式，PARP切割为片段是caspase介导凋亡的关键生化事件，随着浓度增加，51触发PARP切割并诱导细胞凋亡。基于对PI3K/AKT/mTOR通路的抑制，51在HGC-27细胞中通过抑制细胞迁移、诱导自噬及阻滞细胞周期于G1期，以剂量依赖性方式发挥协同抗肿瘤活性。51在NCI-H1299非小细胞肺癌和T-47D乳腺癌细胞系中进一步评价，在这两种细胞系中均表现出强效抗增殖活性，Western blot显示51同样抑制这些细胞中的PI3K/AKT/mTOR通路，表现为下游底物p-AKT、p-S6和p-4EBP1的磷酸化水平降低，且处理也抑制细胞迁移、诱导自噬并阻滞细胞周期，支持其作为广谱抗肿瘤药物的潜力。 ③药代动力学特征分析 基于其良好的体外活性特征，研究在ICR小鼠中对51进行了体内药代动力学评价。静脉注射1 mg/kg剂量后，51表现出中等清除率（Cl = 1332 mL/h/kg）、可接受的分布容积（Vss = 0.642 L/kg）和1.25小时的半衰期。口服给药5 mg/kg后，51显示出良好的系统暴露量（AUC0-t = 1169 h·ng/mL）、中等半衰期（T1/2 = 1.88 h）和可接受的口服生物利用度（F = 31.2%），吸收迅速，在给药后0.5小时达到最大血浆浓度（Cmax）868 ng/mL。此外，51在人源和小鼠肝微粒体中均稳定。这些数据表明化合物51具有中等体内滞留时间和良好的口服吸收特性，支持其作为开发候选物的潜力。然而，鉴于其中等半衰期，需要进一步研究和优化以延长作用持续时间。值得注意的是，与化合物44相比，51表现出更优的口服生物利用度、更有利的清除率和改善的系统暴露量，这可能归因于羟基的存在增强了水溶性和分子极性，从而优化了其药代动力学性质。 ④体内抗肿瘤活性、药效学及安全性评价 研究在HGC-27细胞系来源的胃癌异种移植模型中进一步评估了51的体内疗效。每日口服给药一次，51以剂量依赖性方式显示出显著抗肿瘤效果，30 mg/kg和60 mg/kg剂量下的肿瘤生长抑制率分别为83%和92%。为考察广谱抗肿瘤潜力，研究还在NCI-H1299细胞系来源的异种移植模型中评价了51的疗效，与胃癌模型结果一致，51在该非小细胞肺癌模型中有效抑制肿瘤生长，证实了其对不同癌症类型的疗效。同时，51在HGC-27模型中表现出优异的安全性特征：小鼠体重维持稳定，肝功能和肾功能参数处于生理范围内，IL-6水平无显著变化，提示炎症反应极小。相比之下，PF-04691502在10 mg/kg剂量下虽显示出略高的肿瘤生长抑制率（95%），但伴随显著增加的毒性——治疗组小鼠体重低于所有其他组，ALT和AST水平升高提示潜在肝细胞损伤，尿素显著降低可能与肝损伤导致的蛋白质分解代谢减少有关，IL-6水平急剧升高证实存在强烈炎症反应。组织病理学分析显示PF-04691502处理组存在显著药物诱导毒性：肝脏损伤表现为肝窦狭窄、肝细胞空泡化及炎症介导的间质增生和脂肪变性或水样变性；肺部损伤严重，表现为肺泡间隔破坏、肺泡腔塌陷、明显间质纤维化伴胶原沉积、炎症细胞浸润、红细胞外渗、蛋白性肺泡渗出物伴局灶性透明膜形成，这些是严重药物诱导肺损伤的特征性表现，与临床II期研究中报道的不可接受的肺炎和肺膜炎一致；此外，PF-04691502临床研究中27%患者报告皮疹，动物实验中也观察到皮肤瘀点。在NCI-H1299模型中，PF-04691502同样表现出显著毒性：初始剂量10 mg/kg给药后小鼠体重迅速下降约15%，需立即暂停给药并进行营养补充和保温等支持治疗，待体重恢复至损失小于10%后谨慎以5 mg/kg减量给药，且所有5只小鼠均出现背部毛发稀疏，2只出现明显斑片状脱毛。重要的是，51未诱导肝脏、肾脏或肺组织的显著形态学改变和病理变化，免疫组织化学染色进一步显示51以剂量依赖性方式抑制mTOR信号通路，30 mg/kg和60 mg/kg剂量下p-AKT和p-S6水平均降低。此外，51还进行了初步安全性评估：对主要CYP450亚型（CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4）的抑制试验显示各亚型IC₅₀值均大于10 μM，药物-药物相互作用潜力低；Ames试验评价致突变潜力，结果显示在有无S9混合物条件下对所有测试浓度的鼠伤寒沙门氏菌菌株均未诱导回复突变；hERG抑制试验中，51在30 μM浓度下仅诱导7.7%的hERG通道抑制，显著低于50%抑制阈值，提示心脏毒性风险低。综合结果表明，化合物51具有有利的安全性特征，药物-药物相互作用、遗传毒性和心脏毒性风险低，支持其进一步开发潜力。 图片来源：ACS 总结与展望 本研究通过发现与优化4-氨基蝶啶-7(8H)-酮衍生物，获得了一类强效且高选择性的mTOR抑制剂。其中，化合物51凭借其独特结构与mTOR形成盐桥相互作用及氢键网络，成为高选择性mTOR抑制剂。该化合物表现出优异的选择性，对473种激酶和突变体 panel 的脱靶活性极小；在多种肿瘤细胞系中显示出广谱抗增殖活性；作为ATP竞争性抑制剂，通过降低下游靶点磷酸化水平实现对mTORC1和mTORC2的双重抑制；此外，还能诱导细胞凋亡、自噬及G1期细胞周期阻滞。体内研究表明，化合物51具有强效抗肿瘤疗效与良好药效学特征的平衡：在HGC-27异种移植模型中，口服给药实现剂量依赖性肿瘤生长抑制（30 mg/kg和60 mg/kg剂量下抑制率分别为83%和92%），同时维持正常体重和器官功能参数。值得注意的是，与PF-04691502诱导的严重器官损伤形成鲜明对比，51表现出极低的肝毒性、肾毒性和肺毒性。免疫组织化学分析证实其通过剂量依赖性降低p-AKT和p-S6水平实现双重mTORC1/mTORC2抑制。此外，化合物51还表现出良好的药代动力学性质（F = 31.2%，t₁/₂ = 1.88 h）、低hERG抑制活性（30 μM下7.7%）及Ames试验阴性结果，进一步支持其开发潜力。综上，这些结果表明化合物51作为治疗胃癌的临床前候选化合物的前景，值得在其他肿瘤适应症中进行深入研究。 文献详细全面信息请跳转原文阅读： https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.5c03503  声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

点击蓝字 ↑ 关注药研视角 PharmaView JMC速览 2026.02.05 近日，中国科学院广州生物医药与健康研究院唐士兵/巫林平/Micky D. Tortorella团队在药物化学权威期刊Journal of Medicinal Chemistry上发表了一篇题为"Discovery and Optimization of 4-Aminopteridin-7(8H)-one Derivatives as Potent and Selective mTOR Inhibitors with Favorable Pharmacodynamic and Safety Characteristics"（4-氨基蝶啶-7(8H)-酮衍生物的发现与优化：兼具优异药效与安全性的高选择性mTOR抑制剂）的研究论文。广州健康院王丹阳、李庚武、刘建光为论文的共同第一作者，唐士兵、巫林平、Micky D. Tortorella（现单位为中国科学院香港创新研究院）为论文的共同通讯作者。 1 min速览 研究背景 mTOR信号通路与肿瘤治疗需求：mTOR（雷帕霉素靶蛋白）是PI3K/AKT/mTOR信号通路的核心节点，调控细胞生长、增殖、存活和代谢，在胃癌、肺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中异常激活。现有mTOR抑制剂分为三代：第一代雷帕霉素及其衍生物（rapalogs）存在水溶性差、生物利用度低及无法抑制mTORC2等缺陷；第二代ATP竞争性抑制剂（mTOR-KIs）虽能同时抑制mTORC1和mTORC2，但部分化合物因靶点选择性不足导致严重毒性——如PF-04691502因双重抑制PI3K/mTOR引发肺炎和肺毒性而终止临床试验，OSI-027则引起急性肾损伤。因此，开发结构新颖、高选择性、低毒性的mTOR抑制剂仍是该领域的迫切需求。 重点内容 1. 全新骨架设计与构效关系优化 通过分析PF-04691502、OSI-027、Torkinib和Sapanisertib等代表性mTOR抑制剂的共同药效团，采用生物电子等排替换和骨架跃迁策略，设计并构建了4-氨基蝶啶-7(8H)-酮全新母核 该骨架模拟ATP腺嘌呤部分，可与mTOR铰链区Val2240形成氢键，并与疏水残基Trp2239产生π-π堆积作用 系统优化N-8位和C-6位取代基：环己烷羧酸侧链（N-8位）通过氢键网络稳定结合；6-羟基苯并呋喃（C-6位，化合物51/T133）将活性从427 nM提升至0.34 nM，提升逾1200倍 2. 高选择性与广谱抗肿瘤活性 对473种激酶的筛选显示，T133（51）对mTOR具有卓越选择性，仅对PI3K亚型有轻微抑制（Ki：PI3Kα 47 nM、PI3Kβ 125 nM、PI3Kδ 1.8 nM、PI3Kγ 4.9 nM），对mTOR的Ki为0.17 nM，选择性倍数>10倍 在17种肿瘤细胞系中表现出广谱抗增殖活性，对HGC-27胃癌细胞的IC₅₀为0.82 μM 3. 双重抑制mTORC1/mTORC2及多重抗肿瘤机制 Western blot证实T133剂量依赖性抑制mTORC1下游底物（p-S6、p-4EBP1）和mTORC2下游靶点（p-AKT） 诱导细胞凋亡（PARP切割）、自噬（MDC染色）及G1期细胞周期阻滞 4. 优异的药代动力学与安全性 小鼠PK参数：口服生物利用度31.2%，半衰期1.88 h，Cmax 868 ng/mL 肝微粒体稳定性良好（人/小鼠t₁/₂分别为266 min和248 min） 安全性评价：CYP450抑制活性低（IC₅₀ >10 μM）、Ames试验阴性、hERG抑制率仅7.7%（30 μM） 5. 体内药效与安全性对比优势 HGC-27胃癌异种移植模型：30 mg/kg和60 mg/kg剂量下肿瘤生长抑制率分别为83%和92%，与PF-04691502（10 mg/kg，95%）疗效相当 关键差异化优势：PF-04691502组出现显著体重下降、ALT/AST升高、IL-6激增及肝/肺组织病理损伤（肝窦狭窄、肺泡结构破坏、间质纤维化）；而T133组体重稳定，肝肾功能正常，无炎症反应，组织形态正常 研究总结 本研究通过理性药物设计成功开发了一类4-氨基蝶啶-7(8H)-酮类高选择性mTOR抑制剂，代表化合物T133（51）具有以下核心优势： 亚纳摩尔级酶抑制活性（Ki = 0.17 nM）和>10倍的选择性 双重抑制mTORC1/mTORC2，阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路 广谱抗肿瘤活性覆盖胃癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤 显著改善的安全性特征，解决了现有mTOR抑制剂临床毒性瓶颈 良好的口服生物利用度和代谢稳定性 T133作为兼具高效力、高选择性、优异安全性的临床前候选化合物，为mTOR靶向抗肿瘤药物开发提供了新的化学骨架和优化方向，具有进一步开发用于治疗胃癌及其他恶性肿瘤的潜力。 图片来源：ACS 详细阅读 01 INTRODUCTION 研究背景 PI3K/AKT/mTOR信号通路调控细胞生长、增殖、存活和代谢，其异常激活与胃癌等多种恶性肿瘤相关。研究表明，磷酸化mTOR（p-mTOR）在超过60%的胃腺癌中高表达，且与肿瘤侵袭性、转移正相关，与患者五年生存率负相关，提示靶向mTOR是胃癌治疗的潜在策略。mTOR属于PI3K相关激酶家族，形成mTORC1和mTORC2两种功能不同的复合物。现有mTOR抑制剂分为三代：第一代rapalogs（如雷帕霉素）溶解性差、生物利用度低且无法抑制mTORC2；第二代ATP竞争性抑制剂（mTOR-KIs）可同时抑制mTORC1和mTORC2，但临床化合物存在毒性问题——PF-04691502因双重抑制PI3K/mTOR导致肺炎和肺毒性终止临床开发，OSI-027引起急性肾损伤，Sapanisertib因毒性需降低剂量；第三代RapaLinks为双价抑制剂，有望克服耐药。此外，mTOR/PI3K、mTOR/HDAC等双靶点抑制剂也在开发中。尽管取得进展，但选择性不足导致的毒性仍是mTOR抑制剂临床成功的主要障碍。因此，开发结构新颖、选择性更高、毒性更低的新型mTOR抑制剂仍是研究热点。本研究报道了一类4-氨基蝶啶-7(8H)-酮衍生物作为新型ATP竞争性mTOR抑制剂，通过优化获得先导化合物T133（51），兼具高效力、高选择性和良好的药效与安全性特征。 02 Drug Design ①药物设计 为克服第一、三代mTOR抑制剂选择性差、耐药及无法抑制mTORC2等局限，本研究以ATP竞争性抑制剂为结构模板，通过系统分析代表性第二代抑制剂（PF-04691502、OSI-027、Torkinib、Sapanisertib）发现其ATP结合口袋中双环含氮杂环的保守药效团特征，进而采用生物电子等排替换和骨架跃迁策略重新设计核心骨架。经Schrodinger Maestro和Discovery Studio软件进行分子对接和药效团匹配的计算机辅助迭代优化，成功设计了模拟ATP腺嘌呤部分的新型4-氨基蝶啶-7(8H)-酮骨架——该刚性稠合吡嗪酮-嘧啶系统可与mTOR铰链区Val2240形成强氢键，并与疏水残基Trp2239产生π-π堆积作用，7-羰基改善水溶性并降低clogP，4-氨基则提供进一步相互作用位点。 ②构效关系 为获得强效衍生物，研究首先考察N-8位结构修饰的构效关系：以IC₅₀为9.4 nM的化合物1为阳性对照，设计合成了N-8取代衍生物5-9，其中与化合物1取代基相同的衍生物5活性中等（IC₅₀=427 nM），证实该核心结构具有mTOR靶向潜力但需进一步优化；环己烷羧酸取代的衍生物6活性最高（IC₅₀=40 nM），分子对接显示其羧酸侧链与mTOR ATP结合位点的Gln2167和Lys2187形成稳定氢键网络，与选择性mTOR抑制剂2的结合策略一致，突显羧酸基团在靶点结合中的关键作用；相比之下，羟基取代衍生物9几乎无活性（IC₅₀>10,000 nM），线性烷基链衍生物8活性降低（IC₅₀=2153 nM），吡喃环衍生物7活性有限（IC₅₀=801 nM），表明N-8位对取代基极性和空间取向高度敏感，倾向于极性或特异性相互作用基团。鉴于化合物6的可修饰性，研究选择N-8位带环己烷羧酸的4-氨基蝶啶-7(8H)-酮作为核心结构，进一步开展C-6位取代基的构效关系研究，合成并系统分析了吡啶基、苯基、吲哚基及其他杂环取代类似物。 ③合成路线 4-氨基蝶啶-7(8H)-酮衍生物的合成路线如方案1所示，以化合物51的制备为例进行说明。总体策略涉及引入官能团和构建核心骨架以进行后续转化：化合物57a在酸性条件下经亚硝酸钠处理引入亚硝基得到57b，前体58a引入甲磺酰基作为离去基团得到中间体58b，该修饰有利于后续亲核取代反应；58b制备完成后开始构建4-氨基蝶啶-7(8H)-酮核心骨架，为引入不同R²基团，相应羧酸前体（如59a）经酯化反应，若前体含羟基需预先保护以防止副反应，酯化中间体随后与57b反应并重排生成核心中间体如51a；51a再与58b发生亲核取代反应引入R¹基团得到中间体51b，最后对51b进行脱保护和水解反应生成目标化合物51。衍生物5-55的合成遵循类似总体策略，仅根据最终结构调整具体R¹和R²取代基前体，该模块化方法通过改变R¹和R²位官能团实现产物库的高效多样化。 03 RESULTS ①化合物51是选择性mTOR抑制剂并可抑制癌细胞增殖与迁移 为评估化合物51的激酶选择性，研究采用SelectScreen激酶分析服务，在1 μM浓度下对473种独特激酶和突变体进行了485项检测。激酶树图结果显示，51对绝大多数激酶几乎无影响，仅对mTOR和PI3K有抑制作用，表现出优异的选择性。为进一步确认51对mTOR的选择性，研究评估了其对I类PI3K四种亚型的抑制效力：51对mTOR的Ki值为0.17 nM，对PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kδ、PI3Kγ的Ki值分别为47 nM、125 nM、1.8 nM和4.9 nM，对mTOR的选择性超过PI3K亚型10倍以上。与PF-04691502相比，51增强的选择性可能归因于其空间构象——羧基与外部Glu2190和Lys2187形成盐桥相互作用，同时与mTOR形成稳定的氢键网络。研究进一步检测了51在多种人癌细胞系中的细胞抑制活性，包括胃癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、白血病、淋巴瘤和浆细胞瘤，IC₅₀值在亚微摩尔至低微摩尔范围，提示51具有广谱抗增殖效应。鉴于p-mTOR过表达与胃癌进展的正相关性，研究在携带PI3KCA突变和PTEN缺失的HGC-27胃癌细胞中系统评价了51的细胞活性：51以0.82 μM的IC₅₀值显著抑制HGC-27细胞增殖。此外，51在非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299和乳腺癌细胞系T-47D中也表现出强效抗增殖活性，IC₅₀值分别为1.22 μM和0.28 μM。 ②化合物51通过PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导细胞凋亡、细胞周期阻滞和自噬 研究通过Western blot分析考察了51对HGC-27细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响，处理时间为2小时和24小时，并通过三次独立实验的定量分析进行确认。作为竞争性mTOR抑制剂，51通过双重抑制mTORC1和mTORC2有效阻断该信号通路：具体而言，mTORC1调控的核糖体蛋白S6磷酸化及真核翻译起始因子4E结合蛋白1（4EBP1）磷酸化，以及作为mTORC2下游靶点的AKT磷酸化，均被51以剂量依赖性方式抑制，特别是在低于1 μM浓度下即显示出强效抑制活性，突显其治疗潜力。此外，Western blot检测了多聚ADP核糖聚合酶（PARP）及其切割形式，PARP切割为片段是caspase介导凋亡的关键生化事件，随着浓度增加，51触发PARP切割并诱导细胞凋亡。基于对PI3K/AKT/mTOR通路的抑制，51在HGC-27细胞中通过抑制细胞迁移、诱导自噬及阻滞细胞周期于G1期，以剂量依赖性方式发挥协同抗肿瘤活性。51在NCI-H1299非小细胞肺癌和T-47D乳腺癌细胞系中进一步评价，在这两种细胞系中均表现出强效抗增殖活性，Western blot显示51同样抑制这些细胞中的PI3K/AKT/mTOR通路，表现为下游底物p-AKT、p-S6和p-4EBP1的磷酸化水平降低，且处理也抑制细胞迁移、诱导自噬并阻滞细胞周期，支持其作为广谱抗肿瘤药物的潜力。 ③药代动力学特征分析 基于其良好的体外活性特征，研究在ICR小鼠中对51进行了体内药代动力学评价。静脉注射1 mg/kg剂量后，51表现出中等清除率（Cl = 1332 mL/h/kg）、可接受的分布容积（Vss = 0.642 L/kg）和1.25小时的半衰期。口服给药5 mg/kg后，51显示出良好的系统暴露量（AUC0-t = 1169 h·ng/mL）、中等半衰期（T1/2 = 1.88 h）和可接受的口服生物利用度（F = 31.2%），吸收迅速，在给药后0.5小时达到最大血浆浓度（Cmax）868 ng/mL。此外，51在人源和小鼠肝微粒体中均稳定。这些数据表明化合物51具有中等体内滞留时间和良好的口服吸收特性，支持其作为开发候选物的潜力。然而，鉴于其中等半衰期，需要进一步研究和优化以延长作用持续时间。值得注意的是，与化合物44相比，51表现出更优的口服生物利用度、更有利的清除率和改善的系统暴露量，这可能归因于羟基的存在增强了水溶性和分子极性，从而优化了其药代动力学性质。 ④体内抗肿瘤活性、药效学及安全性评价 研究在HGC-27细胞系来源的胃癌异种移植模型中进一步评估了51的体内疗效。每日口服给药一次，51以剂量依赖性方式显示出显著抗肿瘤效果，30 mg/kg和60 mg/kg剂量下的肿瘤生长抑制率分别为83%和92%。为考察广谱抗肿瘤潜力，研究还在NCI-H1299细胞系来源的异种移植模型中评价了51的疗效，与胃癌模型结果一致，51在该非小细胞肺癌模型中有效抑制肿瘤生长，证实了其对不同癌症类型的疗效。同时，51在HGC-27模型中表现出优异的安全性特征：小鼠体重维持稳定，肝功能和肾功能参数处于生理范围内，IL-6水平无显著变化，提示炎症反应极小。相比之下，PF-04691502在10 mg/kg剂量下虽显示出略高的肿瘤生长抑制率（95%），但伴随显著增加的毒性——治疗组小鼠体重低于所有其他组，ALT和AST水平升高提示潜在肝细胞损伤，尿素显著降低可能与肝损伤导致的蛋白质分解代谢减少有关，IL-6水平急剧升高证实存在强烈炎症反应。组织病理学分析显示PF-04691502处理组存在显著药物诱导毒性：肝脏损伤表现为肝窦狭窄、肝细胞空泡化及炎症介导的间质增生和脂肪变性或水样变性；肺部损伤严重，表现为肺泡间隔破坏、肺泡腔塌陷、明显间质纤维化伴胶原沉积、炎症细胞浸润、红细胞外渗、蛋白性肺泡渗出物伴局灶性透明膜形成，这些是严重药物诱导肺损伤的特征性表现，与临床II期研究中报道的不可接受的肺炎和肺膜炎一致；此外，PF-04691502临床研究中27%患者报告皮疹，动物实验中也观察到皮肤瘀点。在NCI-H1299模型中，PF-04691502同样表现出显著毒性：初始剂量10 mg/kg给药后小鼠体重迅速下降约15%，需立即暂停给药并进行营养补充和保温等支持治疗，待体重恢复至损失小于10%后谨慎以5 mg/kg减量给药，且所有5只小鼠均出现背部毛发稀疏，2只出现明显斑片状脱毛。重要的是，51未诱导肝脏、肾脏或肺组织的显著形态学改变和病理变化，免疫组织化学染色进一步显示51以剂量依赖性方式抑制mTOR信号通路，30 mg/kg和60 mg/kg剂量下p-AKT和p-S6水平均降低。此外，51还进行了初步安全性评估：对主要CYP450亚型（CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4）的抑制试验显示各亚型IC₅₀值均大于10 μM，药物-药物相互作用潜力低；Ames试验评价致突变潜力，结果显示在有无S9混合物条件下对所有测试浓度的鼠伤寒沙门氏菌菌株均未诱导回复突变；hERG抑制试验中，51在30 μM浓度下仅诱导7.7%的hERG通道抑制，显著低于50%抑制阈值，提示心脏毒性风险低。综合结果表明，化合物51具有有利的安全性特征，药物-药物相互作用、遗传毒性和心脏毒性风险低，支持其进一步开发潜力。 图片来源：ACS 总结与展望 本研究通过发现与优化4-氨基蝶啶-7(8H)-酮衍生物，获得了一类强效且高选择性的mTOR抑制剂。其中，化合物51凭借其独特结构与mTOR形成盐桥相互作用及氢键网络，成为高选择性mTOR抑制剂。该化合物表现出优异的选择性，对473种激酶和突变体 panel 的脱靶活性极小；在多种肿瘤细胞系中显示出广谱抗增殖活性；作为ATP竞争性抑制剂，通过降低下游靶点磷酸化水平实现对mTORC1和mTORC2的双重抑制；此外，还能诱导细胞凋亡、自噬及G1期细胞周期阻滞。体内研究表明，化合物51具有强效抗肿瘤疗效与良好药效学特征的平衡：在HGC-27异种移植模型中，口服给药实现剂量依赖性肿瘤生长抑制（30 mg/kg和60 mg/kg剂量下抑制率分别为83%和92%），同时维持正常体重和器官功能参数。值得注意的是，与PF-04691502诱导的严重器官损伤形成鲜明对比，51表现出极低的肝毒性、肾毒性和肺毒性。免疫组织化学分析证实其通过剂量依赖性降低p-AKT和p-S6水平实现双重mTORC1/mTORC2抑制。此外，化合物51还表现出良好的药代动力学性质（F = 31.2%，t₁/₂ = 1.88 h）、低hERG抑制活性（30 μM下7.7%）及Ames试验阴性结果，进一步支持其开发潜力。综上，这些结果表明化合物51作为治疗胃癌的临床前候选化合物的前景，值得在其他肿瘤适应症中进行深入研究。 文献详细全面信息请跳转原文阅读： https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.5c03503  说    明 公众号以个人学习和分享最新科研成果为目的，本文内容为阅读文献提炼总结的内容，因学识有限，难免有所疏漏和谬误，恳请批评指正。标记【原创】指原创编译，是出于便于传播目的，著作权归出版社与作者所有。投稿，合作，交流请后台联系。欢迎课题组投稿，可刊载研究成果宣传，人才招聘信息。欢迎合理转载，请写明来源于【药研视角】 PharmaView