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来源：新浪证券-红岸工作室 1月26日，悦康药业跌0.92%，成交额2.16亿元，换手率1.80%，总市值121.05亿元。 异动分析 细胞免疫治疗+创新药+仿制药一致性评价+幽门螺杆菌概念+人工智能 1、根据2025年3月15日公告：公司有自主研发的细胞与基因治疗药物开发平台，本平台具备先进的CAR设计技术，运用CRISPR/C as9基因编辑实现精准改造。通过实体瘤靶点筛选及双靶点CAR结构创新，开发双靶点CAR-T、CAR-NK 疗法。利用FASTCART平台技术降低成本、缩短制备周期，借助流式细胞术保证细胞筛选和质量。同时，结合mRNA-LNP 技术前瞻性布局in vivo细胞疗法。 2、根据2025年3月15日公告：各项创新药研发进程加速推进的同时，公司在研发领域也取得了重大突破性成果。如：重点研发项目——靶向PCSK9的siRNA 1.1类创新药YKYY015注射液，成功获得了发明专利授权。这一里程碑式的成就，不仅彰显了公司在创新药物研发方面的雄厚实力和卓越能力，也为后续的临床试验和市场推广奠定了坚实基础。 3、2024年2月6日互动易回复，截止2024年1月，公司共15项产品已通过仿制药一致性评价。 4、公司拟投资 10,000.00 万元建设新的原料药生产线。项目建成后，达产年生产能力为双氯芬酸钠年产 330 吨、兰索拉唑年产 10吨，来曲唑年产 0.30 吨。兰索拉唑为一种新型抑制胃酸分泌药物，对幽门螺杆菌的抑菌活性比奥美拉唑较高。 5、2023年年报：在人工智能药物开发方面，公司搭建了多个AI深度学习模型，可用于靶标发现、药物设计、药物筛选、化学合成、工艺开发及参数优化等全链条药物研发环节。用于多肽、阳离子脂质、肿瘤新抗原等药物的全新设计，以及药物活性和毒性筛选，并已向国家知识产权局提交4项AI药物算法专利。公司借助已开发的AI算法模型可以实现药物的从头设计，已设计出多个候选分子并正在系统地进行实验验证，这将高效地缩短药物设计和筛选进程，提升药物研发的效率。 (免责声明：分析内容来源于互联网，不构成投资建议，请投资者根据不同行情独立判断) 资金分析 今日主力净流入314.27万，占比0.01%，行业排名61/158，连续2日被主力资金增仓；所属行业主力净流入5.62亿，当前无连续增减仓现象，主力趋势不明显。 主力持仓 主力没有控盘，筹码分布非常分散，主力成交额7520.15万，占总成交额的8.66%。 技术面：筹码平均交易成本为26.02元 该股筹码平均交易成本为26.02元，近期筹码减仓，但减仓程度减缓；目前股价在压力位28.50和支撑位25.70之间，可以做区间波段。 公司简介 资料显示，悦康药业集团股份有限公司位于北京市北京经济技术开发区宏达中路6号,香港铜锣湾希慎道33号利园1期19楼1919室，成立日期2001年8月14日，上市日期2020年12月24日，公司主营业务涉及悦康药业定位于高端化学药的研发与生产,报告期内主营业务收入主要集中在心脑血管药物、消化系统药物、糖尿病用药以及抗感染药物等。银杏叶提取物注射液、天麻素注射液、注射用兰索拉唑、奥美拉唑肠溶胶囊、盐酸二甲双胍缓释片、注射用头孢呋辛钠、注射用头孢曲松钠对公司收入贡献占比较大或未来增长潜力较大,是公司的主要产品。主营业务收入构成为：心脑血管类55.67%，抗感染20.88%，原料药8.73%，消化系统类6.87%，降糖类4.85%，其他2.62%，其他(补充)0.36%，技术服务0.02%。 悦康药业所属申万行业为：医药生物-化学制药-化学制剂。所属概念板块包括：创新药、幽门螺杆概念、医药电商、人工智能、仿制药一致性评价等。 截至9月30日，悦康药业股东户数1.07万，较上期减少8.39%；人均流通股42095股，较上期增加9.16%。2025年1月-9月，悦康药业实现营业收入17.59亿元，同比减少41.20%；归母净利润-1.48亿元，同比减少170.56%。 分红方面，悦康药业A股上市后累计派现10.92亿元。近三年，累计派现5.84亿元。 机构持仓方面，截止2025年9月30日，悦康药业十大流通股东中，富国精准医疗灵活配置混合A（005176）位居第五大流通股东，持股1077.41万股，相比上期减少33.70万股。易方达医疗保健行业混合A（110023）位居第六大流通股东，持股976.65万股，相比上期增加291.14万股。富国医药创新股票A（019916）位居第九大流通股东，持股683.22万股，为新进股东。富国天博创新混合（519035）位居第十大流通股东，持股632.26万股，为新进股东。南方医药保健灵活配置混合A（000452）退出十大流通股东之列。 声明：市场有风险，投资需谨慎。 本文基于第三方数据库自动发布，任何在本文出现的信息（包括但不限于个股、评论、预测、图表、指标、理论、任何形式的表述等）均只作为参考，不构成个人投资建议。受限于第三方数据库质量等问题，我们无法对数据的真实性及完整性进行分辨或核验，因此本文内容可能出现不准确、不完整、误导性的内容或信息，具体以公司公告为准。如有疑问，请联系biz@staff.sina.com.cn。

人工智能确定蟾毒灵是雌激素受体α的天然分子胶降解剂 汇报人：硕士研究生二年级 张福荣 在天然产物中挖掘目标活性分子是创新药物研发的核心方向之一。蟾毒灵是从传统药物中提取的天然化合物，具有良好的抗癌活性，但其具体作用机制仍不明确。本研究整合人工智能、分子对接和分子动力学模拟等方法，系统解析蟾毒灵的作用机制。研究使用组合靶点筛选策略鉴定出蟾毒灵的潜在作用靶点；通过表面等离子体共振、pull-down实验及细胞热位移实验证实蟾毒灵可直接与雌激素受体α（ERα）相互作用。分子对接分析表明，蟾毒灵选择性作用于ERα的Arg394残基；分子动力学模拟进一步揭示，蟾毒灵以“分子胶”形式增强ERα与E3泛素连接酶STUB1相互作用，促进ERα降解。鉴于ERα降解对克服乳腺癌内分泌耐药的治疗潜力，研究团队在体外细胞模型、体内动物模型及乳腺癌他莫昔芬耐药患者来源类器官模型中，均证实蟾毒灵可有效逆转他莫昔芬耐药。综上，蟾毒灵作为降解ERα的分子胶，为逆转乳腺癌他莫昔芬耐药提供全新的潜在治疗策略，也为天然产物的创新药物开发提供理论支撑。 本文“Harnessing artificial intelligence to identify Bufalin as a molecular glue degrader of estrogen receptor alpha”由中南大学湘雅药学院曹东升、中南大学湘雅二医院程岩团队合作于2025年8月22日发表于Nature Communications杂志上，影响因子为15.7。 实验流程图 研究背景 天然产物是分子设计的理想起点，在药物发现中占据关键地位，明确其作用靶点是开发创新疗法的核心前提。蟾毒灵作为从蟾酥中提取的活性单体，已用于多种癌症临床治疗，对肺癌、肝癌、结直肠癌等均展现显著抗肿瘤活性，不仅能够抑制肿瘤生长、调控肿瘤转移，而且还通过促使浸润肿瘤的巨噬细胞向M1表型转化增强抗肿瘤免疫反应[1, 2]。然而，其抗肿瘤作用的具体分子机制仍有待进一步阐明。目前研究认为，蟾毒灵可能通过抑制Hippo-YAP、Wnt/β-Catenin、JNK、SRC3/MIF、mTOR以及MAPK等多种信号通路发挥抗肿瘤作用，诱导肿瘤细胞凋亡、坏死或自噬[3, 4]。因此，明确蟾毒灵的具体抗肿瘤作用靶点对于优化其临床应用具有重要意义。 药物靶点的识别与验证耗时且极具挑战性，人工智能技术（融合机器学习、深度学习及网络算法）可高效预测化合物药效、毒性及作用机制，为靶点发现提速[5]。尽管多尺度系统药理学方法、组合靶点筛选策略等不断涌现，但精准识别靶点仍面临挑战。雌激素受体ERα和ERβ属于核激素受体，通过信号转导及转录因子调节影响基因转录，从而发挥雌激素的作用。在乳腺癌中，约有70%至80%为ER+亚型[6]，活跃的ER信号通路会促进癌细胞的增殖与存活，且其致癌作用主要由ERα介导，因此ERα是核心治疗靶点[7]。 内分泌疗法是ER+乳腺癌的一线治疗方案，包括他莫昔芬等选择性雌激素受体调节剂、氟维司汀等选择性雌激素受体降解剂，以及来曲唑等芳香化酶抑制剂[8]。其中，他莫昔芬通过竞争性抑制雌激素与ERα结合，显著改善ER+乳腺癌患者预后，但大约30%的患者会出现新发或获得性耐药[9]，导致肿瘤病情恶化。因此，探索有效逆转他莫昔芬耐药的策略迫在眉睫。 本研究利用人工智能技术预测蟾毒灵作用靶点，证实其可与ERα结合并促进其降解。机制上，蟾毒灵以“分子胶”形式增强ERα与E3泛素连接酶STUB1相互作用，诱导ERα降解。进一步验证表明，蟾毒灵在体外、体内及患者来源类器官模型中均能有效克服ER+乳腺癌他莫昔芬耐药，为这类患者提供新的治疗方法，也为天然产物的靶向药物开发提供实验支撑。 实验内容 Result 1 基于组合靶点筛选策略，探索蟾毒灵的药理作用机制 整合靶点预测方法、KEGG分析以及基于神经网络的多任务QSAR建模技术，确定蟾毒灵的潜在作用靶点（图1a）。采用FMBS方法，并结合Swiss Target Prediction、SEA、PPB2和ChEMBL33四种靶点预测工具，生成全面且互补的预测数据。为确保初步预测结果的可靠性，通过交集筛选标准将候选靶点精简至53个（图1b）。为进一步优化靶点列表、提高筛选精度，研究团队对这53个候选靶点进行KEGG富集分析（图1c），重点关注统计学显著且与癌症发生直接相关的信号通路，并利用弦图对这些通路及相关靶点进行可视化展示，最终确定11个关键靶点（图1d）。随后基于这11个靶点构建Chemprop模型25，并利用该模型对蟾毒灵的作用机制进行系统评估（图1e）。设定筛选阈值为0.8，最终确定CYP17A1、ESR1、mTOR、AR和PRKCD为蟾毒灵的潜在作用靶点。 图1 基于组合靶点筛选策略，探究蟾毒灵的药理作用机制。（a）蟾毒灵靶点预测流程图；（b）四种网络服务器以及FMBS方法预测靶点的维恩图；（c）53个候选靶点的KEGG富集分析气泡图；（d）KEGG分析中p值具有统计学意义的癌症相关通路与对应靶标的弦图，筛选出11个关键靶标；（e）基于11个关键靶标的多任务神经网络模型分析结果，识别出5个置信度较高的靶标：CYP17A1、ESR1、mTOR、AR和PRKCD。 Result 2 蟾毒灵直接与ERα相互作用 筛选出潜在作用靶点后，研究团队进一步通过实验验证蟾毒灵与这些靶点的相互作用。鉴于已有研究证实蟾毒灵与mTOR、AR存在关联，本研究采用表面等离子体共振（SPR）技术评估蟾毒灵与重组人ESR1、PRKCD及CYP17A1蛋白的结合能力。如图2a–c所示，SPR实验结果显示，蟾毒灵与ESR1的结合亲和力最强（KD值为5.42E−06M），而其与PRKCD（PKC delta）及CYP17A1的结合亲和力相对较弱，分别为1.29E−02M和2.94E−02M。为进一步验证该结果，研究人员合成生物素-蟾毒灵结合物，生物素亲和捕获实验结果显示，该结合物能够特异性结合ERα蛋白（图2d、e）。进一步实验证实，蟾毒灵与ERα的结合具有剂量依赖性（图2f），且在细胞中添加游离形式的蟾毒灵会显著抑制二者结合（图2g）。同时，蟾毒灵能提高ERα的热稳定性（图2h），免疫荧光实验也观察到生物素-蟾毒灵与ERα在MCF-7细胞中共定位（图2i）。综上，蟾毒灵与ERα蛋白存在特异性且直接的结合关系。 图2 蟾毒灵直接与雌激素受体α（ERα）相互作用。（a-c）SPRi图分别展示蟾毒灵与ESR1、PKCdelta以及CYP17A1重组蛋白的相互作用；（d）293T细胞转染ERα质粒48 h后，细胞裂解液与D-生物素或生物素-蟾毒灵4℃孵育过夜，经链霉亲和素磁珠沉淀、SDS-PAGE分离后，通过ERα抗体进行Western blot检测；（e）MCF-7细胞裂解液按（d）中方法孵育、沉淀及检测，验证内源性ERα结合情况；（f）293T细胞转染ERα质粒后，裂解液与不同浓度生物素-蟾毒灵孵育，通过上述沉淀、检测方法验证结合的剂量依赖性；（g）293T细胞转染Flag-ERα质粒后先与蟾毒灵孵育，裂解液再与生物素-蟾毒灵孵育沉淀，经Flag抗体Western blot检测游离蟾毒灵对结合的抑制作用；（h）热位移测定（CETSA）验证蟾毒灵与ERα结合；（i）免疫荧光染色显示ERα与生物素-蟾毒灵在MCF-7细胞内共定位（比例尺：5 μm）。 Result 3 蟾毒灵能够诱导ERα蛋白降解，并抑制其转录活性 为研究蟾毒灵对ERα的影响，研究人员用不同浓度的蟾毒灵处理ER+型乳腺癌细胞。Western blot结果显示，ERα蛋白表达水平随蟾毒灵浓度升高、处理时间延长呈显著下降趋势，具有剂量依赖性和时间依赖性（图3a、b）。值得注意的是，蟾毒灵处理后细胞内ERα的mRNA水平无明显变化，提示ERα蛋白表达下降并非源于基因转录抑制。 为进一步证实蟾毒灵的ERα蛋白降解作用，研究团队开展环己亚胺处理实验，结果表明蟾毒灵与环己亚胺联合使用能够显著加速ERα蛋白降解（图3c）。后续机制验证实验表明，蛋白酶体抑制剂MG-132可有效逆转蟾毒灵诱导的ERα蛋白水平下降（图3d）；E1泛素活化酶抑制剂MLN4924同样能够逆转蟾毒灵导致的ERα蛋白降解（图3e），而溶酶体抑制剂羟氯喹无法恢复ERα蛋白水平（图3f）。此外，免疫共沉淀实验证实，蟾毒灵可显著增加ERα蛋白的泛素化水平（图3g、h），进一步证明蟾毒灵主要通过蛋白酶体途径诱导ERα蛋白降解。 配体与ERα结合后，会促使ERα二聚化并结合至雌激素响应基因启动子区域的雌激素响应元件上，进而促进靶基因转录。基于蟾毒灵的ERα降解作用，研究进一步检测其对ERα转录活性的影响，结果显示蟾毒灵确实会减弱ERα的转录活性（图3i）；同时，ERα下游靶基因AGR2、CCND1、GREB1、NRIP1、PGR及SIAH2的表达水平均显著下调，进一步验证该结论（图3j）。 氟维司特是目前获FDA批准的选择性雌激素受体降解剂，其通过诱导ERα蛋白酶体降解，用于ER+乳腺癌治疗。鉴于蟾毒灵与氟维司特作用机制相似，研究对比蟾毒灵与氟维司特的活性差异，结果显示蟾毒灵促进ERα降解的效果优于氟维司特，且抗癌活性更强。综上，蟾毒灵兼具高效降解ERα与强抗癌活性的双重优势，是极具潜力的ER+乳腺癌治疗候选药物。 图3 蟾毒灵能够诱导ERα蛋白降解，并抑制其转录活性。（a）MCF-7、T47D细胞经不同浓度蟾毒灵处理48小时后，Western blot检测ERα表达；（b）MCF-7、T47D细胞经50 nM的蟾毒灵处理不同时间后，Western blot检测ERα表达；（c）MCF-7细胞经蟾毒灵处理后，指定时间点加入10 μg/ml环己亚胺进一步处理，Western blot检测其ERα表达；MCF-7、T47D细胞经蟾毒灵处理48h，分别在有无MG-132（d）、MLN4924（e）存在下，Western blot检测ERα表达；（f）MCF-7、T47D细胞经蟾毒灵处理，在有无羟氯喹存在下，Western blot检测ERα、LC3表达；（g）293T细胞转染ERα质粒和HA-Ub质粒，经蟾毒灵处理48 h后加入10 μM MG-132处理10 h，细胞裂解物经ERα抗体免疫沉淀后，HA抗体进行Western blot检测；（h）293T细胞转染Flag-ERα质粒，按（g）中方法处理后，裂解物经Flag抗体免疫沉淀，Ub抗体进行Western blot检测；（i）ERE-luciferase法检测蟾毒灵处理后ERα转录活性。（j）MCF-7细胞经不同浓度蟾毒灵处理48 h（部分加E2），qPCR检测ERα靶基因AGR2、CCND1、GREB1、NRIP1、PGR及SIAH2的mRNA水平。 Result 4 蟾毒灵能够选择性地与ERα蛋白的Arg394位点结合 为明确蟾毒灵与ERα蛋白的结合位点，研究团队首先使用Glide SP算法将蟾毒灵对接到ESR1的结合口袋（图4a），随后利用Amber 22软件对ESR1-蟾毒灵复合物的对接结构进行100 ns的分子动力学模拟，之后进行MM-GBSA能量计算及残基能量分析，确定能量贡献排名前10的关键残基（图4b）。进一步通过丙氨酸扫描突变实验对这些残基进行深入研究（图4c），能量贡献值大于-1千卡/摩尔的残基Leu354、Leu387、Arg394、Met528和Ala350是蟾毒灵与ERα结合所必需的关键残基。 为验证该结果，研究人员构建多种ERα突变质粒，将上述关键残基分别替换为丙氨酸或谷氨酰胺，将野生型ERα质粒及突变质粒转染到293T细胞。细胞裂解液与生物素-蟾毒灵孵育后，经链霉亲和素磁珠进行pull-down实验，结果表明，只有ERα Arg394A突变体丧失了与生物素-蟾毒灵结合的能力，而其他突变体与野生型ERα的结合亲和力无明显差异（图4d）。此外，蟾毒灵对ERα Arg394A突变体的降解作用也显著减弱（图4e）。免疫共沉淀实验显示，在蟾毒灵存在的情况下，ERα Arg394A突变体的泛素化水平低于野生型蛋白（图4f）。综上，ERα蛋白的Arg394残基是ERα与蟾毒灵特异性结合的关键位点，且该残基在蟾毒灵介导的ERα降解中起关键作用。 图4 蟾毒灵选择性地与ERα蛋白的Arg394位点结合。（a）蟾毒灵与ESR1分子对接图；（b-c）Amber软件对ESR1-蟾毒灵复合物进行100 ns分子动力学模拟，MM-GBSA能量计算及残基能量分析结果（筛选前10位关键残基用于丙氨酸扫描突变实验，误差值基于模拟轨迹最后100 ns均匀提取的100个数据点计算）；（d）293T细胞转染ERα野生型或突变型质粒48 h后，裂解液与生物素-蟾毒灵4℃孵育过夜，经链霉亲和素磁珠捕获、SDS-PAGE分离，ERα抗体进行Western blot检测；（e）293T细胞转染ERα野生型或突变型质粒后，经蟾毒灵处理48 h，Western blot检测ERα表达；（f）293T细胞转染Flag-ERα野生型或R394A突变型质粒以及HA-Ub质粒，经蟾毒灵处理48 h后加10 μM MG-132处理10 h，裂解液经Flag抗体免疫沉淀，HA抗体进行Western blot检测。 Result 5 蟾毒灵通过增强ERα与E3泛素连接酶STUB1相互作用促进ERα降解。 为深入阐明蟾毒灵诱导ERα降解的分子机制，研究团队聚焦泛素连接酶在ERα降解通路中的核心作用，通过分子动力学模拟探讨蟾毒灵对ERα与TRIM56、RNF181、RNF2和STUB1等泛素连接酶相互作用的影响。已有研究表明，TRIM56、RNF181和RNF2可稳定ERα表达；而STUB1则通过泛素–蛋白酶体系统降低ERα表达水平。研究表明，蟾毒灵显著降低ERα与STUB1的结合自由能，从-4.9455 kcal/mol变为-58.1918 kcal/mol，与实验结果一致。STUB1含有的TPR结构域特异性识别并结合分子伴侣蛋白HSP70/HSP90，而ERα正是这种伴侣系统的关键成分。此外，STUB1表达水平与乳腺癌预后密切相关，且STUB1已被证实为ERα降解的关键介质。 对200 ns模拟轨迹的详细结构分析表明，蟾毒灵会重新定位，深入嵌入ERα结合口袋，并与Erα Arg394位点形成氢键（图5b），这种重新定位引发ERα构象微小变化，增强其与STUB1的结合能力。RMSD分析结果显示，在蟾毒灵存在的情况下，ERα-STUB1复合物在200 ns的模拟过程中构象始终保持稳定（图5c）。结合表面面积分析进一步证实，在蟾毒灵的作用下ERα与STUB1相互作用强度增加（图5d）。此外，ESR1和STUB1的RMSF分析显示，配体与这些蛋白质的结合会降低它们在蛋白质-蛋白质界面处的灵活性。具体来说，ESR1的335–343、417–425和515–538位点，以及STUB1的25–49、61–69和121–136位点的残基的波动幅度减小（图5e）。随着模拟过程的进行，蟾毒灵会增加STUB1与ESR1之间的氢键数量，进一步稳定二者相互作用（图5f）。沉默STUB1会导致ERα水平升高（图5g）。免疫共沉淀实验证实蟾毒灵显著增强ERα与STUB1结合能力（图5h），而敲低STUB1会减弱蟾毒灵诱导的ERα降解（图5i），表明STUB1是蟾毒灵介导的ERα泛素化降解的必需介质。综上，蟾毒灵作为分子胶，促进ERα与STUB1相互作用，诱导ERα降解。 图5 蟾毒灵通过增强ERα与泛素E3连接酶STUB相互作用，促进ERα降解。（a）ERα与STUB1在有无蟾毒灵存在下的结合构象（洋红色：蛋白质-蛋白质对接结果；绿色：在蟾毒灵存在下进行200 ns分子动力学模拟后形成的聚集构象，蓝色：无蟾毒灵时同条件模拟聚集构象；蟾毒灵以黄色条状结构显示）；（b）ERα-蟾毒灵-STUB1复合物在200 ns内的构象变化情况；（c）在有无蟾毒灵情况下，ERα-STUB1复合物200 ns分子动力学模拟的RMSD变化曲线；（d）在有无蟾毒灵情况下，ERα与STUB1的结合表面积分析结果；（e）在有无蟾毒灵情况下，ERα与STUB1的RMSF变化曲线；（f）模拟过程中，ERα与STUB1间氢键数量变化情况；（g）MCF-7、T47D细胞分别转染非靶向siRNA或STUB1 siRNA，Western blot检测Erα、STUB1表达；（h）293T细胞转染Flag-ERα和HA-STUB1质粒并经蟾毒灵处理，Flag抗体进行免疫沉淀实验，对应抗体检测结合蛋白；（i）MCF-7、T47D细胞分别转染非靶向siRNA或STUB1 siRNA，经蟾毒灵处理48 h，Western blot检测ERα、STUB1蛋白表达。 Result 6 蟾毒灵在ER+细胞中的抗癌作用依赖于ERα 克隆形成及CCK-8实验结果表明，蟾毒灵显著抑制MCF-7、T47D细胞生长（图6a、b）。此外，蟾毒灵还能诱导细胞凋亡（见图6c）。为确定蟾毒灵抗肿瘤作用是否与ERα有关，研究人员构建ERα敲除模型，Annexin V染色结果显示蟾毒灵治疗效果因此减弱（图6d、e）。此外，ERα表达抑制还会减弱蟾毒灵诱导的细胞凋亡，具体表现为cleaved PARP表达水平降低（图6f）。当ERα表达被抑制时，蟾毒灵对乳腺癌细胞的抗肿瘤作用也会减弱（图6g），而那些ERα过表达的细胞对蟾毒灵更敏感（图6h）。克隆形成实验也进一步佐证，与对照组细胞相比，ERα表达受抑细胞对蟾毒灵的治疗反应更为迟钝（图6i）。综上，蟾毒灵的抗肿瘤作用在机制上依赖于ERα降解，ERα是蟾毒灵发挥抗癌活性的的关键治疗靶点。 图6 蟾毒灵在ER+细胞中的抗癌作用依赖于ERα受体。（a）克隆形成实验检测MCF-7、T47D细胞经蟾毒灵处理后的增殖能力；（b）MCF-7、T47D细胞经不同浓度蟾毒灵处理后，CCK-8实验检测其存活情况；（c）MCF-7细胞经20或50 nM蟾毒灵处理48 h后，Annexin V染色分析其凋亡情况；（d、e）MCF-7细胞转染非靶向siRNA或ESR1 siRNA，经蟾毒灵处理48h，Annexin V染色分析其凋亡情况；（f）MCF-7细胞转染非靶向siRNA或ESR1 siRNA，经蟾毒灵处理48 h，Western blot检测ERα、PARP蛋白表达；（g）T47D细胞转染非靶向siRNA或ESR1 siRNA，经蟾毒灵处理后，CCK-8实验检测细胞存活情况；（h）293T细胞转染Flag-ERα质粒，经蟾毒灵处理后，CCK-8实验检测细胞存活情况；（i）MCF-7细胞转染非靶向siRNA或ESR1 siRNA，经蟾毒灵处理后，克隆形成实验检测细胞增殖能力。 Result 7 蟾毒灵在体外及体内均能有效克服肿瘤对他莫昔芬的耐药性 已有研究表明，他莫昔芬治疗后ERα持续表达促进诸如氟维司汀等选择性雌激素受体拮抗剂的发展，这类药物可在其他内分泌疗法无效时提升临床疗效。鉴于蟾毒灵具有降解ERα的能力，本研究进一步探究其对抗乳腺癌内分泌耐药的效果。临床样本分析显示，内分泌治疗复发患者的肿瘤组织中仍存在ERα表达（图7a），提示ERα降解或可成为逆转耐药的有效策略。蟾毒灵可有效促进他莫昔芬耐药LCC2细胞中ERα降解（图7b），表明他莫昔芬复发患者或可从蟾毒灵治疗中获益。图7c进一步表明，蟾毒灵的治疗效果呈剂量依赖性：随着剂量增加，LCC2细胞的存活率下降；而克隆形成实验和EdU检测也进一步证实蟾毒灵对细胞增殖的抑制作用（图7d、e）。此外，蟾毒灵还能够诱导LCC2细胞凋亡，具体表现为Annexin V染色阳性率升高、PARP蛋白切割增强及Bcl-2蛋白表达下调（见图7f、g）。更重要的是，蟾毒灵对LCC2耐药细胞的抗癌活性显著优于氟维司特（图7h、i），进一步凸显其在逆转他莫昔芬耐药中的优势。 图7 蟾毒灵在体外及体内均能有效克服肿瘤对他莫昔芬的耐药。（a）他莫昔芬治疗复发的乳腺癌细胞的ERα免疫组化染色结果（比例尺：20 μm）；他莫昔芬耐药的LCC2细胞施加蟾毒灵处理，（b）Western blot检测ERα表达，（c）CCK-8实验检测细胞存活率；（d）克隆形成实验检测增殖能力，（e）EdU检测增殖情况（比例尺：100 μm）；LCC2细胞经50或100nM的蟾毒灵处理48h后，（f）Western blot检测PARP、Bcl-2表达，（g）Annexin V染色分析细胞凋亡；（h）克隆形成实验检测蟾毒灵或氟维司汀对LCC2细胞的增殖抑制作用；（i）蟾毒灵和氟维司汀联合处理LCC2细胞，CCK-8实验检测细胞存活率。 为验证蟾毒灵抗他莫昔芬耐药的有效性，研究团队建立了他莫昔芬耐药LCC2移植瘤模型通过腹腔注射给药评估其体内抗肿瘤活性。结果显示，蟾毒灵处理组肿瘤体积与重量均显著下降，且抗肿瘤效果优于氟维司特（图8a–c）。免疫组化结果显示，经过蟾毒灵治疗的肿瘤中Ki67表达水平明显降低（图8d）。H&E染色进一步显示，蟾毒灵治疗的移植瘤细胞排列较为松散，细胞核体积较对照组缩小（图8e）。此外，经过蟾毒灵治疗后，肿瘤中ERα蛋白表达水平降低，与体外实验结果一致（图8f、g）。治疗剂量的蟾毒灵并未出现任何药物相关性毒性反应（图8h、i），说明蟾毒灵具有良好的生物安全性。综上，蟾毒灵作为可靶向破坏ERα结构的分子抑制剂，在临床前实验模型中可有效克服他莫昔芬耐药，兼具疗效与安全性。 图8蟾毒灵在体内可有效克服他莫昔芬耐药。4周龄雌性裸鼠接种LCC2细胞建立耐药模型，分组给药治疗（每组7只鼠），Buf指蟾毒灵，Ful指氟维司特。（a）实验终点裸鼠皮下肿瘤；（b）裸鼠肿瘤体积变化曲线；（c）肿瘤重量；（d）裸鼠肿瘤标本Ki67免疫组化结果（比例尺：20 μm）；（e）肿瘤标本H&E染色组织学分析（比例尺：20μm）；（f）肿瘤标本ERα免疫组化结果（比例尺：20 μm）；（g）肿瘤组织ERα蛋白表达情况；（h、i）裸鼠肝肾功能相关指标检测结果。 Result 8 蟾毒灵在他莫昔芬耐药患者来源的类器官中表现出显著抗癌作用 为进一步评估蟾毒灵的临床转化潜力，研究团队利用他莫西芬治疗复发乳腺癌患者样本建立他莫西芬耐药类器官模型。蟾毒灵治疗显著缩小类器官体积，表明蟾毒灵显著抑制他莫西芬耐药肿瘤生长（图9a、b）。此外，经蟾毒灵治疗后，他莫西芬耐药类器官的细胞存活率显著下降（图9c）。Calcein-AM/PI荧光染色实验证实，蟾毒灵治疗组类器官中大量细胞死亡（图9d）。综上，蟾毒灵作为治疗ER+型乳腺癌他莫西芬耐药的候选药物具有巨大潜力。 图9 蟾毒灵在他莫昔芬耐药患者来源的类器官中表现出显著抗癌作用。（a）蟾毒灵治疗后，他莫昔芬耐药患者来源类器官的代表性图像（比例尺：50 μm）；（b）蟾毒灵治疗后类器官大小；（c）蟾毒灵处理后类器官增殖情况；（d）Calcein-AM/PI荧光染色验证蟾毒灵的肿瘤抑制作用，比例尺：50 μm；（e）蟾毒灵在ER+乳腺癌中的作用机制示意图：结合人工智能技术与分子对接分析，发现蟾毒灵通过与ERα结合，增强ERα与E3泛素连接酶STUB1相互作用，诱导ERα降解；同时，蟾毒灵在体外和体内实验中均能克服他莫昔芬耐药。 总结与讨论 蟾毒灵是具有临床潜力的天然化合物，其抗肿瘤活性依赖癌症类型特异性靶点。本研究通过组合靶点预测策略，确定CYP17A1、ESR1（ERα）、mTOR、AR及PRKCD为蟾毒灵潜在作用靶点，且在ER⁺乳腺癌中ERα是其主要作用靶点。机制上，蟾毒灵以“分子胶”形式特异性结合ERα的R394位点，稳定ERα与泛素E3连接酶STUB1相互作用，促进ERα降解，进而抑制ERα转录活性，同时通过调控mTOR、Akt等多条通路诱导癌细胞死亡，对表达ERα的肿瘤具有选择性细胞毒性。 本研究为分子胶作用机制提供新见解，也为蟾毒灵衍生药物开发奠定基础。针对ER⁺乳腺癌他莫昔芬治疗后获得性耐药的临床痛点，研究发现内分泌治疗复发患者ERα表达升高，而蟾毒灵在体外、体内及耐药患者来源类器官模型中均展现强效抗肿瘤活性，有效逆转他莫西芬耐药，为耐药患者治疗提供新策略，同时也拓展天然产物在靶向蛋白降解领域的应用前景。 参考文献： [1] Yu Z, Li Y, Li Y, et al. 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