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在神经科学研究领域，获取高质量、功能成熟且具有人类生理相关性的神经元，是探索中枢神经系统疾病机制、进行药物筛选和毒性测试的关键一步。传统的动物模型或原代神经元培养，在实验周期、物种差异及可重复性方面面临着诸多挑战。 我们很荣幸地向您介绍 StemCell 革命性的新产品——STEMdiff™-TF 前脑兴奋性神经元诱导分化试剂盒（#100-1678）。这是首款商业化、基于非整合mRNA-LNP技术的试剂盒，能够在短短5-6天内，高效、稳定地将人诱导多能干细胞（hiPSCs）和人胚胎干细胞（hESCs）直接诱导为高纯度的兴奋性谷氨酸能前脑神经元。 01 产品介绍1. 技术创新：非整合mRNA-LNP 递送系统 STEMdiff™-TF 前脑诱导神经元分化试剂盒 采用创新的正向编程（Forward Programming）策略。与传统方法不同，该试剂盒通过脂质纳米颗粒（LNP） 递送编码关键转录因子Neurogenin-2 (NGN2) 的非整合型mRNA。 这一技术路径具备显著优势： 高效快速：LNP高效递送确保NGN2转录因子的瞬时高表达，驱动hPSCs快速定向分化为前脑神经元命运，将传统数月甚至数周的分化周期缩短至仅需5-6天。 安全无整合：mRNA无需进入细胞核，无基因组整合风险，规避了传统病毒方法（如慢病毒）带来的插入突变、基因表达沉默等不确定性，确保了遗传背景的原始性和实验的一致性。 高纯度与可重复性：试剂盒经过严格质控，可在多种hPSC细胞系中稳定产生高纯度（>90%）的兴奋性谷氨酸能神经元，简化了下游分析流程，提升了实验结果的可靠性。2. 构建功能成熟的人源神经元模型 由此试剂盒快速诱导产生的前脑神经元具备区域特异性。为进一步获得具有电生理活性的功能性神经元，研究人员可将其与 STEMdiff™ 前脑神经元成熟试剂盒（#08605） 配合使用。后者基于BrainPhys™ 神经元培养基，能够更好地模拟人脑生理环境，支持神经元的长期存活、突触形成和电生理功能的成熟，为MEA、钙成像、膜片钳等下游功能实验提供理想的细胞模型。 STEMdiff™-TF 前脑诱导神经元分化试剂盒以其灵活性、稳定性和人源相关性，精准服务于以下科研需求： 神经退行性疾病机制研究：为ALS、帕金森病、亨廷顿病、额颞叶痴呆等研究提供患者iPSC来源的神经元，用于模拟神经毒性、线粒体及溶酶体功能障碍等核心病理过程。 神经发育与突触疾病模型：助力Rett综合征、脆性X综合征、自闭症谱系障碍及各类离子通道病（如SCN, KCNT, KCNQ变异）的研究，为探究突触功能异常及电生理表型提供稳定、可重复的细胞平台。 神经精神疾病药物筛选：为精神分裂症、抑郁症等复杂疾病的功能基因组学、通路分析及药物筛选提供与患者遗传背景一致、且可大规模扩增的神经元模型，推动个性化医疗研究。 药物发现与神经毒性评价：面向生物医药企业和CRO团队，提供符合“新方法学”（NAMs）理念的人源细胞模型，用于中枢神经系统药物的高通量筛选、靶点验证及神经毒性早期评价，有望减少对动物模型的依赖。3. 产品核心优势 快速高效：5-6天完成从干细胞到前脑神经元的定向诱导。 安全稳定：采用非整合型mRNA-LNP递送技术，避免基因编辑，确保遗传背景的原始性和实验一致性。 灵活定制：兼容多种hPSC细胞系，包括患者来源的iPSC，为疾病建模提供无限可能。 功能成熟：可无缝衔接STEMdiff™ 前脑神经元成熟试剂盒，获得功能性神经元。 简化流程：标准化的试剂盒组分，显著降低DIY方法（如慢病毒系统或定向分化）的操作复杂性和批次间差异。 附注：*例如：Sudhof 等人，2013年 **例如：STEMdiff™ 前脑神经元分化试剂盒STEMdiff™ Forebrain Neuron Differentiation Kit #08600 02 实验准备1. 产品组分以下组分作为完整试剂盒（ #100-1678）销售，不单独提供。 注意：STEMdiff™-TF 前脑诱导神经元基础培养基随冰袋发货，而 STEMdiff™-TF 前脑诱导神经元添加补充物 A 和 STEMdiff™-TF 前脑诱导神经元补充物 B（50X）则随干冰发货。所有组分均需按照上文提供的说明进行储存。 2. 需要准备的试剂与耗材 * 仅当计划将培养物维持超过分化第5天时才需要这些组分。 3. 使用多聚-D-赖氨酸(PDL)和Corning® Matrigel® hESC-Qualified 基质包被培养板 使用无菌技术，用PDL和Corning® Matrigel® hESC-Qualified 基质包被经组织培养处理的培养板。 ——多聚-D-赖氨酸(PDL) 使用浓度为100 µg/mL的PDL。如有需要，可用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释PDL溶液，使其终浓度达到100 µg/mL。 通过反复颠倒瓶子数次，轻轻混匀PDL溶液，确保其均一性。避免剧烈摇晃以防止起泡。 将PDL溶液加入经组织培养处理的培养板中，使其覆盖整个生长表面。推荐包被溶液体积请参考表1。 将溶液均匀分布，并在37°C、5% CO₂条件下孵育3小时。 通过轻轻加入D-PBS（不含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺），然后倾斜培养板，将移液器吸头置于培养板角落处以吸除溶液，此洗涤步骤重复三次，注意避免损坏PDL包被层。 将PDL包被的培养板在生物安全柜中开盖，于室温(15 - 25°C)下孵育30分钟，使其完全干燥。为避免污染，干燥时间不要超过30分钟。 ——Corning® Matrigel® hESC-Qualified 基质Corning® Matrigel® 应分装后冷冻保存。请查阅Matrigel® 分析证书，了解推荐的分装体积（“稀释倍数”）以制备25 mL稀释后的基质。在解冻和处理Corning® Matrigel® 时，务必始终置于冰上，以防止其凝结成胶。7. 在冰上解冻一份Corning® Matrigel® 分装品。8. 量取24 mL冷的、含15 mM HEPES的DMEM/F-12培养基，置于50 mL锥形管中，并保持在冰上。9. 将解冻的Corning® Matrigel® 加入到含15 mM HEPES的冷DMEM/F-12培养基中（即在50 mL管中），并充分混匀。如有需要，可用冷的培养基冲洗原装小瓶。10. 立即使用稀释好的Corning® Matrigel® 溶液包被经组织培养处理的培养板。推荐包被体积请参考表1。11. 旋动培养板，使溶液均匀铺满整个表面。如果培养板表面未能被Corning® Matrigel® 溶液完全覆盖，则该培养板不应使用。12. 在室温(15 - 25°C)下孵育1小时。注意不要让Matrigel溶液蒸发。注意： 推荐使用新鲜包被的培养板。但是，如果不能立即使用，包被好的培养板必须密封（例如，用Parafilm® 封口膜），并可在2 - 8°C下储存长达一周。在进行步骤13之前，需将储存的已包被培养板恢复至室温。13. 在准备接种细胞前，立即吸去Corning® Matrigel® 溶液。确保包被表面未被划伤。不要让包被表面干燥。注意： 去除Corning® Matrigel® 溶液后，无需洗涤培养板。 表1. 不同培养板的推荐体积和接种密度 培养板 近似表面积 包被体积 最终培养体积 细胞接种密度 STEMdiff™-TF Forebrain Induced Neuron Supplement A体积 96孔板 0.33 cm2/孔 50 µL/孔 0.1 mL/孔 1.5 - 2.5 x 10^4 cells/孔 0.8 µL/孔 24孔板 2 cm2/孔 250 µL/孔 0.4 mL/孔 1.25 - 1.5 x 10^5 cells/孔 1.5 µL/孔 12孔板 4 cm2/孔 500 µL/孔 1 mL/孔 2.5 - 3 x 10^5 cells/孔 3 µL/孔 6孔板 10 cm2/孔 1.5 mL/孔 2 mL/孔 6.25 - 7.5 x 10^5 cells /孔 5.5 µL/孔 4. 接种培养基 使用无菌技术制备接种培养基（mTeSR™ Plus [#100-0276] + 10 µM Y-27632 [二盐酸盐]）。制备适当体积的接种培养基，使Y-27632（二盐酸盐）的终浓度达到10 µM。彻底混匀。使用前恢复至室温。 5. 完全 STEMdiff™-TF 前脑诱导神经元分化培养基 B（完全培养基 B） 使用无菌技术制备完全 STEMdiff™-TF 前脑诱导神经元分化培养基 B（完全培养基 B；STEMdiff™-TF 前脑诱导神经元基础培养基 + STEMdiff™-TF 前脑诱导神经元补充物 B [50X]）。以下示例为制备50 mL完全培养基B。如需制备其他体积，请按比例调整。 在室温(15 - 25°C)下解冻STEMdiff™-TF 前脑诱导神经元补充物 B（50X），或在2 - 8°C下解冻过夜。通过轻轻颠倒混匀。不要涡旋。注意： 如果不能立即使用，请分装并在-20°C下储存。不要超过补充物的有效期。一旦解冻，应立即使用分装品。请勿重新冷冻。 将1 mL STEMdiff™-TF 前脑诱导神经元补充物 B（50X）加入到49 mL STEMdiff™-TF 前脑诱导神经元基础培养基中。通过旋动或轻轻颠倒彻底混匀。避免剧烈摇晃。注意： 完全培养基B在2 - 8°C下可稳定保存长达2周。使用前将完全培养基B恢复至室温。请勿冷冻。请勿过滤完全培养基B。 6. 完全 STEMdiff™-TF 前脑诱导神经元分化培养基 AB（完全培养基 AB） 使用无菌技术制备完全 STEMdiff™-TF 前脑诱导神经元分化培养基 AB（完全培养基 AB；完全培养基 B + STEMdiff™-TF 前脑诱导神经元补充物 A）。本方案用于制备24孔板单孔所需的完全培养基AB。如果使用其他培养器皿，请相应调整体积。其他规格培养板的推荐体积请参考表1。 在2 - 8°C下解冻STEMdiff™-TF 前脑诱导神经元补充物 A过夜。通过轻轻吹打彻底混匀。不要涡旋。注意： 如果不能立即使用，可在2 - 8°C下储存长达3周。请勿重新冷冻。不要超过补充物的有效期。如需长期储存，请将STEMdiff™-TF 前脑诱导神经元补充物 A分装到试管中。将试管置于预冷的慢速冷冻容器（例如Corning® CoolCell® LX 细胞冷冻容器#200-0642）中，并将容器存放在-80°C。 对于24孔板中将要培养的每个孔，将1.5 μL STEMdiff™-TF 前脑诱导神经元补充物 A加入到400 μL完全培养基B中。通过上下吹打彻底混匀。不要涡旋。请勿过滤完全培养基AB。注意： 完全培养基AB在2 - 8°C下可稳定保存长达2周。使用前将完全培养基AB恢复至室温(15 - 25°C)。通过上下吹打彻底混匀。请勿冷冻。请勿过滤。 7. STEMDIFF™ 前脑神经元成熟培养基 注意： 仅当计划将培养物维持超过第5天时才需要STEMdiff™ 前脑神经元成熟培养基。使用无菌技术制备STEMdiff™ 前脑神经元成熟培养基（ #08605；BrainPhys™ 神经元培养基 + STEMdiff™ 前脑神经元成熟补充物）。 03 实验流程 图1. STEMdiff™-TF 前脑诱导神经元分化试剂盒操作流程示意图 使用说明开始操作前请阅读整个方案。执行以下方案时请使用无菌技术：A. 收获和接种hESCs/hiPSCs为单细胞（第-1天）B. hESCs/hiPSCs向神经元的分化（第0-5天）C. 神经元成熟（第5-21天） A. 收获和接种hESCs/hiPSCs为单细胞（第-1天）本方案用于从6孔板的单孔中收获hESCs/hiPSCs，并将其接种到24孔板中进行分化。如果使用其他培养器皿，请相应调整体积。使用前将培养器皿、培养基和试剂恢复至室温(15 - 25°C)。 细胞可以预先在mTeSR™ Plus或eTeSR™中维持培养。 重要提示： 细胞密度是本试剂盒成功的关键参数。由于不同用户和细胞系的培养物外观可能存在差异，我们建议通过在24孔板中以5 x 10^4 - 1.5 x 10^5 细胞/孔（即 ~2.5 - 7.5 x 10^4 细胞/cm²）的密度接种hPSCs来确定最佳接种密度。例如，分别接种5 x 10^4、7.5 x 10^4、1 x 10^5、1.25 x 10^5 和 1.5 x 10^5 细胞/孔。在第0天，将培养物的形态和融合度与图2中显示的参考图像进行比较。仅当培养物外观与参考图像高度吻合时，才继续进行分化。 注意： 图2中显示的细胞密度是使用健康对照人iPSC细胞系，女性，SCTi003-A，产品目录号 #200-0511，以6.25 - 7.5 x 10^4 细胞/cm²的密度接种建立的。如果使用的细胞系生长速率不同（例如疾病模型hiPSCs、CRISPR编辑的hPSCs，或异常快速或缓慢生长的细胞），请在推荐范围内进行梯度测试，并根据需要调整，以重现图2中所示的第0天融合度。 注意： 推荐的细胞密度适用于在mTeSR™ Plus中维持的细胞。如果使用不同的培养基，请调整接种密度以匹配图2中所示的外观。例如，当使用eTeSR™时，建议使用较低的密度（例如2 - 2.25 x 10^4 细胞/cm²），因为eTeSR™中培养的细胞通常在接种当天表现出更高的贴壁率。 图2. 第0天的推荐细胞密度A - C 展示了第0天的推荐细胞密度。如果培养物外观明显比A - C更密或更稀疏，请丢弃该培养物，调整您的接种密度，然后重新开始。维持适当的细胞密度对于确保使用本试剂盒获得一致且可靠的结果至关重要。 按照“试剂和材料准备”部分A中所述，用PDL和Corning® Matrigel® 包被培养器皿。如果是预先准备好的培养器皿，需将其恢复至室温。 制备适当体积的接种培养基（见“试剂和材料准备”部分B）。 使用显微镜目视识别hESC/hiPSC培养物中的分化区域。用毡尖笔或镜头标记笔在培养板底部标记这些区域。通过用移液器吸头刮除或吸除的方式去除分化区域。避免将培养板一次性置于培养箱外超过15分钟。 用2 mL室温的D-PBS（不含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺）洗涤孔。弃去洗涤液。 加入0.5 mL TrypLE™ Express 酶 (1X)，含酚红 或 ACCUTASETM。 在37°C和5% CO₂条件下孵育4 - 8分钟。注意： 使用不同的细胞系和基质时，孵育时间可能会有所不同。对于在Corning® Matrigel® 上维持的培养物，4 - 5分钟通常是解离的最佳时间。 向孔中加入1 mL接种培养基。 小心倾斜培养板，并用1 mL移液器轻轻上下吹打以收获细胞，使其脱壁。将单细胞悬液转移至15 mL锥形管中。注意： 避免过度或剧烈的吹打，这可能对细胞活力产生不利影响。如果细胞不易脱壁，可能需要延长孵育时间。 将细胞悬液在300 x g条件下离心5分钟。 小心吸去上清液，并轻轻弹击试管3 - 5次以重悬细胞沉淀。 向细胞沉淀中加入1 - 2 mL接种培养基。通过轻轻吹打混匀。 使用台盼蓝和血球计数板或自动细胞计数方法进行细胞计数。 从步骤1中准备好的培养板中移除剩余的Corning® Matrigel® 溶液。如果使用24孔板，立即向每个孔中加入0.4 mL接种培养基。对于其他规格的培养器皿，推荐体积请参考表1。 以6.25 - 7.5 x 10^4 细胞/cm²（即对于24孔板为1.25 - 1.5 x 10^5 细胞/孔）的密度，或按照您确定的接种密度，将细胞加入每个孔中。对于其他规格的培养器皿，推荐细胞数量请参考表1。 将培养板进行几次快速、短促的前后、左右移动，使细胞均匀分布在孔表面。 在37°C和5% CO₂条件下孵育。24小时内请勿扰动培养板。 B. 分化（第0-5天） 本方案适用于在24孔板中分化hESCs/hiPSCs。如果使用其他培养器皿，推荐体积请参考表1。使用前将培养基和试剂恢复至室温(15 - 25°C)。 第0-2天制备完全培养基B（见"试剂和材料准备"部分C）和完全培养基AB（见"试剂和材料准备"部分D）。分化第0-2天需要完全培养基AB，分化第3-5天需要完全培养基B。 在第0天，使用1 mL移液器吸头轻轻移除并弃去每个孔中的培养基。如果使用吸引器，请倾斜培养器皿，将吸头置于培养器皿角落处以吸除溶液，避免接触细胞和包被基质。 使用血清学移液管或1 mL移液器吸头，向每个孔中加入0.4 mL完全培养基AB。避免扰动细胞和包被基质。 在37°C和5% CO₂条件下孵育24小时。 在第1天和第2天，重复步骤1-3。注意： 在第0天，需将每个孔的接种培养基完全移除并替换为完全培养基AB。在第1天和第2天，避免移除所有培养基；相反，应留下一小部分体积，以防止细胞暴露在空气中，因为细胞在此阶段更为敏感。 第3天将适当体积的完全培养基B恢复至室温。向完全培养基B中加入PluriSin-1，终浓度为20 μM。彻底混匀。注意： 要制备10 mM的PluriSin-1（213.2 g/mol）储备液，请将1 mg溶解于469 µL新鲜DMSO中，分装并在-20°C下储存，避免反复冻融；注意避免长时间光照。 使用1 mL移液器吸头，轻轻移除并弃去每个孔中的培养基。如果使用吸引器，请倾斜培养器皿，将吸头置于培养器皿角落处，以防止接触细胞和包被基质。务必在孔中留下一小部分体积的培养基，以防止细胞暴露在空气中。轻轻向每个孔中加入0.4 mL含PluriSin-1的完全培养基B。 在37°C和5% CO₂条件下孵育24小时。 第4-5天将完全培养基B恢复至室温。 在第4天，使用1 mL移液器吸头轻轻移除并弃去每个孔中的培养基。如果使用吸引器，请倾斜培养器皿，将吸头置于培养器皿角落处，以防止接触细胞和包被基质。务必在孔中留下一小部分体积的培养基，以防止细胞暴露在空气中。 轻轻向每个孔中加入0.4 mL完全培养基B。 在37°C和5% CO₂条件下孵育24小时。 在第5天，准备细胞用于神经元分化评估或其他预期实验。如果在此之后继续培养，请继续执行C部分进行神经元成熟。 C. 神经元成熟（第5-21天） 前脑神经元可在STEMdiff™ 前脑神经元成熟培养基中培养16天或更长时间，以使细胞进一步成熟。按照"试剂和材料准备"部分E所述制备STEMdiff™ 前脑神经元成熟培养基。本方案适用于在24孔板中使神经元成熟。如果使用其他培养器皿，推荐体积请参考表1。 使用1 mL移液器吸头，轻轻移除每个孔中的培养基并弃去。如果使用吸引器，请倾斜培养器皿，将吸头置于培养器皿角落处以吸除溶液，避免接触细胞和包被基质。务必在孔中留下一小部分体积的培养基，以防止细胞暴露在空气中。 轻轻向每个孔中加入0.4 mL STEMdiff™ 前脑神经元成熟培养基。 在37°C和5% CO₂条件下孵育。注意： 每隔2-3天，使用STEMdiff™ 前脑神经元成熟培养基进行一次全量换液。避免移除所有培养基；留下一小部分体积以防止细胞暴露在空气中，因为细胞在此阶段更为敏感。注意： 为避免细胞脱落，应缓慢进行换液（例如逐滴加入），将移液器吸头指向培养器皿壁。如果观察到细胞脱落，可改为每隔一天进行半量换液。 到第5天时，可能仍有5-10%的增殖细胞存在。为在此时间点后维持培养物纯度，可在转换为成熟培养基48小时后（即第7天），开始在STEMdiff™ 前脑神经元成熟培养基中补充2-3 µM的5-氟-2'-脱氧尿苷和尿苷(Fdu/U)，之后每隔48小时至少再进行两次补充换液（即第9天和第11天）。如果在此之后仍有增殖细胞存在，可根据需要继续在培养基中补充Fdu/U。注意： 继续使前脑神经元成熟16天或更长时间。 04 实验结果 神经元分化评估 为评估神经元分化和成熟效率，请在分化第5天使用以下抗体通过免疫细胞化学方法评估Beta-Tubulin III的表达，并在成熟16天后评估MAP2和synapsin的表达： 抗Beta-Tubulin III抗体，克隆TUJ1（ #60052） 抗人MAP2抗体，多克隆（ #100-1342 或 abcam  #ab5392） 抗人synapsin抗体，多克隆（MilliporeSigma  #AB1543） 抗人FOXG1抗体，多克隆（abcam  #ab18259） 预期在成熟培养基中维持16天后，细胞中Beta III Tubulin阳性细胞 > 90%，MAP2阳性细胞 > 90%，Synapsin I阳性细胞 > 80%。结果可能因使用的细胞系而异。 图3. 使用STEMdiff™-TF前脑诱导神经元分化试剂盒生成高纯度神经元培养物 (A) 使用STEMdiff™-TF前脑诱导神经元试剂盒进行神经元分化，在第5天，从H9 hESC和健康对照人iPSC细胞系（女性，SCTi003-A，#200-0511）分化得到的神经元的代表性ICC图像显示了广泛的神经元诱导，细胞经TUBB3（绿色）、MAP2（品红色）、SYN1（红色）染色，细胞核经DAPI（蓝色）标记。比例尺 = 100 µm。(B) 第5天和第21天泛神经元标志物的ICC数据量化图。使用STEMdiff™-TF前脑诱导神经元试剂盒生成的神经元在第5天展现出TUBB3的高表达，并且到第21天，中间/成熟标志物(MAP2)和突触前标志物(SYN1)的表达增加，这与神经元逐步成熟的过程相符。数据收集自四个hPSC细胞系，每个细胞系设置4-8个重复样本。柱状图显示平均值 ± 标准差。ICC = 免疫细胞化学；hPSC = 人多能干细胞。 图4. 使用STEMdiff™-TF前脑诱导神经元分化试剂盒生成的神经元可与星形胶质细胞共培养，以模拟细胞间相互作用并增强体外神经元活性 (A) 使用STEMdiff™-TF前脑诱导神经元分化试剂盒从健康对照人iPSC细胞系（女性，SCTi003-A， #200-0511）分化得到的神经元，与人iPSC来源的星形胶质细胞（#200-0980）共培养，并使用STEMdiff™ 前脑神经元成熟试剂盒（ #08605）维持培养的代表性ICC图像。细胞经MAP2（品红色；神经元树突标志物）、GFAP（绿色，星形胶质细胞标志物）和DAPI（蓝色，细胞核）染色。GFAP阳性的星形胶质细胞展现出均匀分布和特征性形态，遍布于神经元网络中。MAP2阳性的神经元与GFAP阳性的星形胶质细胞共同证明了成功建立共培养。(B) MEA记录显示，使用STEMdiff™-TF前脑诱导神经元分化试剂盒生成的神经元，在转换为STEMdiff™ 前脑神经元成熟培养基一周后展现出自发锋电位活动。在五周的记录期内，活动指标——包括平均发放率、活跃电极数量、网络爆发和同步指数——稳步增加。与人iPSC来源的星形胶质细胞共培养（品红色）显著增强了神经元功能，与单独培养的神经元（灰色）相比，表现出更高的锋电位频率和更同步化的爆发活动。这些结果表明，在星形胶质细胞存在下，神经元成熟过程加速且更为稳健。数据以平均值 ± 标准差表示（每组 n = 6 个孔）。(C) 代表性MEA光栅图，比较了在STEMdiff™ 前脑神经元成熟培养基中第2、3和5周时，纯神经元培养与神经元-星形胶质细胞共培养的情况。神经元-星形胶质细胞共培养展现出更早 onset 和更强强度的网络活动，更显著且同步化的爆发最早在第1周出现，并在第5周达到高峰。这些模式表明，神经元-星形胶质细胞共培养支持了增强的网络形成和功能性突触发育。光栅图显示了检测到的锋电位（黑线）、单通道爆发（蓝线；至少5个锋电位的集合，每个锋电位间隔不超过100毫秒）和网络爆发（粉红色框；来自至少35%参与电极的至少50个锋电位的集合，每个锋电位间隔不超过100毫秒）。hPSCs = 人多能干细胞；ICC = 免疫细胞化学；MEA = 多电极阵列；ISI = 锋电位间隔。 图5. 使用STEMdiff™-TF前脑诱导神经元分化试剂盒生成的神经元可与星形胶质细胞和小胶质细胞进行三维共培养，以模拟体外细胞间相互作用 代表性ICC图像显示，使用STEMdiff™-TF前脑诱导神经元分化试剂盒从健康对照人iPSC细胞系（女性，SCTi003-A， #200-0511）分化得到的神经元，与人iPSC来源的星形胶质细胞（ #200-0980）以及使用STEMdiff™ 小胶质细胞分化试剂盒（#100-0019）生成的小胶质细胞进行了三维共培养。细胞经GFAP（绿色，星形胶质细胞标志物）、MAP2（品红色，神经元树突标志物）、IBA1（青色，小胶质细胞标志物）和DAPI（灰色，细胞核）染色。MAP2阳性神经元、GFAP阳性星形胶质细胞和IBA1阳性小胶质细胞的存在，证实了三维共培养体系的成功建立，证明了所有三种细胞类型在共享的体外环境中的兼容性和整合性。比例尺 = 100 μm；ICC = 免疫细胞化学；iPSC = 诱导性多能干细胞；hPSC = 人多能干细胞。 图6. 使用MEA进行的功能性药理学评估揭示，在STEMdiff™-TF前脑诱导神经元分化试剂盒与星形胶质细胞共培养体系中，4-AP和GABA对神经元活性的可逆性调节 使用STEMdiff™-TF前脑诱导神经元分化试剂盒从H9 hPSCs（黑色）或健康对照人iPSC细胞系（女性，SCTi003-A， #200-0511）分化得到的神经元，与人iPSC来源的星形胶质细胞（ #200-0980）共培养，并使用STEMdiff™ 前脑神经元成熟试剂盒（ #08605）维持，通过Maestro MEA™系统（ #200-0887）评估其神经元活性的定量分析。培养物分别用50或100 µM 4-AP（钾通道阻滞剂），或DMSO溶媒对照，或3或30 µM GABA（抑制性神经递质）或水溶媒对照进行处理。培养物与化合物孵育1小时，之后记录神经元活性（处理；灰色条）。处理后，洗涤培养物并加入新鲜成熟培养基，24小时后记录自发活性（恢复；蓝绿色条）。(A) 4-AP处理显著增加了平均发放率和网络爆发，两者在洗脱后均恢复。(B) GABA处理显著降低了平均发放率、网络爆发和同步指数，所有这些指标在洗脱后均恢复。数据已归一化至每个培养物的基线活性，基线活性定义为处理前立即记录的自发活性。点代表技术重复样本。n = 1 – 2个细胞系。MEA = 多电极阵列；4-AP = 4-氨基吡啶。 图7. 使用STEMdiff™-TF前脑诱导神经元分化试剂盒生成的神经元的时间基因表达谱揭示多能性丧失以及神经元特性和成熟度的逐步获得 (A) 使用STEMdiff™-TF前脑诱导神经元分化试剂盒分化过程中，从三个hPSC细胞系（SCTi003-A、H9和SCTi004-A）在六个时间点（第0-5天和第21天）采集的大量RNA测序数据的PCA图，突出了从多能性到成熟神经元特性的显著转录组转变。符号表示细胞系（圆形：SCTi003-A，方形：H9，菱形：SCTi004-A）。所有细胞系在每个时间点的样本紧密聚类，表明神经元编程具有可重复性和一致性。(B) 热图显示了使用STEMdiff™-TF前脑诱导神经元分化试剂盒在不同分化阶段（第0-5天和第21天）选定基因的转录水平。多能性相关基因（POU5F1/OCT4、NANOG、SOX2）在诱导后迅速下调，确认了干细胞特性的丧失。NGN2靶基因（NEUROG2、NEUROD1、DCX）在早期编程阶段（第1-3天）上调，反映了神经元谱系特化的激活。泛神经元标志物（TUBB3、MAP2、POU3F2）和突触基因（SYN1、VAMP2、DLG4）逐步增加，在第21天表达达到峰值，表明神经元定型。第21天突触后基因（GRIN1、GRIA1/3）和谷氨酸能神经元标志物（SLC17A7、SATB2、CAMK2A、TBR1、SYT1）的晚期上调，突显了高级成熟和前脑谷氨酸能特性。表达值已归一化，并以从低（蓝色）到高（红色）的颜色编码，捕捉了构成神经元分化和成熟基础的动态转录变化。PCA = 主成分分析；hPSC = 人多能干细胞；NGN2 = Neurogenin 2。 图8. 单细胞转录组学证实使用STEMdiff™-TF前脑诱导神经元分化试剂盒从多能性向兴奋性谷氨酸能神经元的分化 (A) 使用STEMdiff™-TF前脑诱导神经元分化试剂盒生成的hPSCs（第0天）以及第5天和第21天神经元的单细胞RNA测序数据的UMAP可视化。不同的聚类显示了从多能状态到神经元状态的逐步转录转变。UMAP图突出了到第5天时多能性标志物（OCT4/POU5F1、NANOG）表达的降低，同时伴随着神经元谱系标志物（TUBB3、MAP2、SYP）的诱导，这些标志物到第21天时变得均匀表达。(B) 第21天神经元的小提琴图和UMAP投影图证实了兴奋性谷氨酸能谱系的富集，这些神经元主要表达标志物SLC17A6 (vGLUT2) 和 GLS。相比之下，其他神经元亚型的标志物表达量极低或不表达：GABA能（GAD1、DLX2、PVALB）、多巴胺能（TH、NR4A2、SLC6A3）和血清素能（TPH2、SLC6A4、FEV）。检测到低水平的胆碱能标志物（CHAT、PHOX2B、ACHE）表达。hPSCs = 人多能干细胞。 - END - 如果您需要咨询或订购，欢迎联系我们。我们的联系方式： 邮箱: support@luobio.com   电话: 136 0173 1759 地址:上海市徐汇区古美路 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