Verteporfin

前言溶酶体是细胞内执行消化作用的主要细胞器，也是代谢信号的传递中枢，参与调控了细胞内的多种生理代谢过程。研究表明，多种非化疗药物（如抗疟疾药氯喹、抗抑郁药丙咪嗪、止咳药右美沙芬等）和抗癌药物（如阿霉素、尼达尼布、索拉菲尼等）分子均对溶酶体具有高亲和力。此类药物分子通常具有碱性或弱碱性，容易在溶酶体中发生大量滞留，导致治疗效果不佳，且长期服用也易于引发耐药性和一些不良反应。药物在溶酶体内蓄积会影响其药代动力学特性、有效性和安全性，因此，在药物研发的早期阶段，尽早明确候选药物是否会被溶酶体捕获，能够更好地预测药物在组织和亚细胞内的分布情况，为新药研发过程中的吸收（absorption）、分布（distribution）、代谢（metabolism）及排泄（excretion）性质预测以及早期安全性评估提供参考。本文将从溶酶体的结构与功能出发，综合阐述溶酶体捕获的机理与应用，并提供相应的体外研究策略。溶酶体的结构与功能1溶酶体的结构溶酶体是一种具有单层膜结构的囊泡状、异质化的细胞器（图1），广泛地存在于除成熟红细胞之外的所有动物细胞中。溶酶体膜上存在一种关键蛋白——H+‑ATPase质子泵（V-type ATPase），它能够利用ATP水解释放的能量，驱动H+进入溶酶体腔（pH值大致为4.5~5.0），从而形成溶酶体-细胞质的pH梯度差。V-type ATPase质子泵与膜上其它离子通道蛋白（如Cl-通道蛋白、Na+/K+通道蛋白等）协同作用，以维持腔体内环境的动态平衡。图1. 溶酶体的生理结构[1]2溶酶体的功能溶酶体主要执行消化作用。溶酶体内部含有丰富的酸性水解酶，包括蛋白酶、脂肪酶、磷酸酶等，这些酸性水解酶能够帮助溶酶体消化经自噬或内吞作用运输的多种内源性或外源性大分子物质，也可以消化衰老或损伤的其它细胞器。除了基础的消化功能外，溶酶体还可以通过自噬作用参与细胞的免疫反应。溶酶体膜上的mTOR（雷帕霉素靶蛋白复合体）能够帮助溶酶体感知细胞内营养物质的富集情况，从而调节细胞的能量代谢和信号转导过程[2]。溶酶体捕获的机理及对ADME的影响基于溶酶体内的酸性环境，药物在溶酶体中发生质子化电离，并大量滞留在溶酶体内的过程被称为“溶酶体捕获”。溶酶体捕获的发生需要两个前提条件：（1）药物具有一定的跨膜能力（脂溶性）；（2）药物具有碱性基团，在酸性环境中容易发生质子化。1溶酶体捕获的机理一般而言，油水分配系数ClogP＞2.0，且pKa在6.5~11的化合物极易发生溶酶体捕获。亲脂性的碱性药物在生理pH条件下，主要以非解离型的形式存在，能够自由地穿透生物膜，进入细胞质。当其进入溶酶体后，溶酶体腔的酸性环境会促进药物结构中的碱性基团发生质子化电离。离子型药物的跨膜能力差，从而被滞留在溶酶体中，由此形成了“溶酶体捕获”现象（图2）。图2. 溶酶体捕获的机理2溶酶体捕获与药物ADME药物在人体内的ADME过程会受到诸如给药途径（如口服给药、注射给药、呼吸道吸入给药等）、生理因素（如组织器官血流量、体液pH值、细胞膜转运蛋白表达量等）、药物的固有性质（如脂溶性、酸碱性、血浆蛋白结合率等）和组织成分等多重因素的共同调控。亲溶酶体药物一方面由于其具有良好的脂溶性，药物分子更倾向于分布在脂肪丰富的组织，如脂肪、肝脏、肾脏等；另一方面因其易被溶酶体、高尔基体等酸性细胞器捕获，因此亲溶酶体药物容易在溶酶体丰富的组织器官（如肺、肾脏、肝脏、脾脏、脑和肠道等）中表现出极高的组织分布。药物的表观分布容积越大，相应的药物消除半衰期延长，在体内的存留时间越长。此外，对于口服制剂药物，溶酶体捕获作用可能会降低药物的吸收程度和吸收速率，从而影响药效。例如，右美沙芬在生物药剂学分类系统（Biopharmaceutics Classification System，BCS）中属于BCS I类化合物，在胃肠道中具有高溶解性和高渗透性，但是由于肠细胞的溶酶体捕获作用，使得其口服制剂中药物成分的达峰时间（约2.5小时）明显晚于其他典型的BCS I类药物（如普伐他汀的达峰时间为1~1.5小时）[3]。溶酶体捕获的应用溶酶体通透化介导的肿瘤细胞死亡正常情况下，溶酶体膜高度糖基化，溶酶体内的酸性水解酶被充分隔绝在溶酶体腔中。当溶酶体膜的通透性（Lysosomal membrane permeabilization，LMP）发生改变时，可溶性溶酶体内容物（如组织蛋白酶B、组织蛋白酶D等）释放到细胞质中，会激活细胞内的级联反应和炎症小体，促进细胞凋亡或坏死，这一过程被称为“溶酶体膜通透化介导的细胞死亡”。一般而言，与正常细胞相比，肿瘤细胞中的溶酶体数量增多，体腔变大，且溶酶体内水解酶的水平升高。因此，肿瘤细胞对亲溶酶体药物的毒性作用更敏感。当阳离子两亲性药物（cationic amphiphilic drugs，CADs）在溶酶体中大量蓄积时，会促进酸性鞘磷脂酶从溶酶体膜上分离，溶酶体膜通透化，组织蛋白酶释放增加，从而引起肿瘤细胞死亡（图3）。例如，抗组胺药特非那定（Terfenadine）可诱导前列腺癌细胞死亡；阿司咪唑（Astemizole）可抑制乳腺癌细胞和淋巴癌细胞的增殖[4]。图3. 溶酶体膜通透化介导的细胞死亡基于溶酶体内药物相互作用的联合用药多种抗肿瘤、抗疟疾、抗心律失常以及抗抑郁等中枢神经系统类药物均存在溶酶体捕获现象。当药物的作用靶点位于细胞核/质时，溶酶体捕获会降低靶位点的药物浓度，因此亲溶酶体药物作为单一药物进行治疗时，往往治疗效果有限，可以通过联合用药的方式来改善治疗效果。以索拉菲尼（Sorafenib，SF）和维替泊芬（Verteporfin，VP）的合用为例（图4），索拉菲尼是肝癌治疗的一线用药，但其容易发生溶酶体捕获，无法充分发挥药效。维替泊芬是一种亲溶酶体的自噬抑制剂，采用维替泊芬处理肝癌细胞会导致溶酶体pH值升高，溶酶体膜的通透性发生改变，当二者联合用药时，能够有效地抑制肝癌细胞的生长和增殖[5]。图4. 索拉菲尼联合维替泊芬治疗肝癌的示意图药物性诱导的磷脂沉积研究表明，亲溶酶体药物在细胞内的大量蓄积，容易诱导磷脂沉积症的发生。可能的机制有两种：第一种：药物与溶酶体内的脂质结合，形成难以被脂肪酶降解的药物-脂质复合物；第二种：药物抑制溶酶体脂肪酶的活性，导致磷脂大量蓄积。2021年，Science期刊发表的一篇关于SARS-CoV-2和其它病毒的药物再利用筛选报告指出[6]，近34%的抗病毒“老”药均为CAD药物，此类药物具有亲溶酶体性，而药物的抗病毒活性则与药物性磷脂沉积密切相关，提示溶酶体捕获诱导的药物性磷脂沉积在药物的抗病毒活性中可能发挥一定的作用。尽管如此，更多的研究证据表明药物和磷脂的大量蓄积会损伤溶酶体正常的生理功能，导致巨噬细胞和多种实质细胞出现空泡化，同时引起包括神经系统、心血管系统在内的肝脏、肾脏等多器官功能损伤[7]。因此，提前对药物进行早期磷脂沉积安全性风险评估，能够为先导化合物的筛选和结构优化提供参考，并增加候选药物进入临床试验的可行性。溶酶体捕获的体外研究策略目前，有关溶酶体捕获的体外研究方法主要有两种（表1）：第一种是基于液相色谱‑联质谱（LC-MS/MS）技术的生物分析；第二种是溶酶体特异性荧光探针的细胞蓄积实验。01基于LC-MS/MS技术的直接检测法V-type ATPase抑制剂能够抑制溶酶体酸化，进而降低药物在溶酶体内的蓄积。通过对比加与不加抑制剂处理后，药物在细胞/溶酶体内的浓度差异，可反映出药物在细胞/溶酶体内的蓄积情况。目前，科学家们采用MDCK II细胞、大鼠心肌细胞H9C2和人肝癌细胞Hep G2等多种细胞模型已经成功构建出一套快捷、准确、高通量的溶酶体捕获体外筛选体系[8, 9]。02溶酶体荧光探针蓄积实验（间接检测法）亲溶酶体药物在溶酶体中蓄积，会导致溶酶体腔内的pH值升高，从而降低pH依赖性的溶酶体特异性荧光探针的摄入。加与不加药物处理后，采用高内涵荧光显微镜进行成像，通过对比荧光探针在溶酶体内的荧光强度，能够预测化合物是否存在溶酶体捕获[10]。表1. 溶酶体捕获的体外研究方法溶酶体捕获评估模型的建立由于直接检测法能够更直接、准确地反映药物在溶酶体内的蓄积程度，同时对化合物的测试浓度要求较低，因此，药明康德DMPK团队采用直接检测法，基于MDCK II细胞模型成功建立了评估溶酶体捕获的两种筛选模型：Transwell模型和孔板模型。Transwell模型将MDCK II细胞接种至Transwell板，待细胞形成完整的单层膜结构后开始渗透性实验。化合物在含有或不含抑制剂的条件下，顶端到基底端（A‑B）方向给药。采用LC-MS/MS技术，检测化合物在未知样品中的浓度，通过对比加与不加抑制剂时，化合物在A-B方向的溶液回收率的改变，从而评估其是否被溶酶体捕获。药明康德DMPK挑选了6种性质已知的模型药物（表2）开展验证实验。在测试条件下，加入抑制剂能够显著提高亲溶酶体药物（氯丙嗪、洛哌丁胺、伊马替尼、普萘洛尔和右美沙芬）在A-B方向的溶液回收率（p<0.05），而酸性化合物双氯芬酸的溶液回收率则无明显差异（p>0.05）（图5），这一结果充分证明了该MDCK II细胞Transwell实验模型体系的可行性。表 2. 溶酶体捕获的模型药物信息图5. MDCK II细胞模型药物验证（Transwell模型）（*p<0.05，即有显著性差异）随后，采用MDCK II细胞Transwell实验模型探究化合物A与化合物B是否受溶酶体捕获，如图6所示，加入抑制剂后，化合物A在MDCK II细胞中A-B方向的溶液回收率显著提高，而化合物B的溶液回收率则无明显差异。提示化合物A极可能被MDCK II细胞内的溶酶体捕获，而化合物B不易发生溶酶体捕获。图6. MDCK II细胞测试化合物验证（Transwell模型）（*p<0.05，即有显著性差异）孔板模型将MDCK II细胞接种至96孔板中，培养过夜且达到80-90%融合度后，先将细胞置于含有或不含抑制剂的预孵育液中进行预孵育，随后与测试化合物进行共孵育。孵育结束后，采用LC-MS/MS技术，检测细胞裂解样品中化合物的浓度。最后，通过对比加与不加抑制剂时，化合物在细胞内蓄积量的差异，以评估化合物被溶酶体捕获的程度。为了验证模型的可靠性，采用与Transwell模型相同的模型药物进行验证实验。在测试条件下，加入抑制剂能够明显降低亲溶酶体药物（氯丙嗪、洛哌丁胺、伊马替尼、普萘洛尔和右美沙芬）在胞内的蓄积，而酸性化合物双氯芬酸在胞内的蓄积量则无明显差异（图7），这一结果也充分证明了MDCK II细胞孔板模型实验体系的可行性。图7. MDCK II细胞模型药物验证（孔板模型）随后，采用MDCK II细胞孔板模型同时探究化合物A与化合物B是否受溶酶体捕获，如图8所示，在测试条件下，加入抑制剂后，化合物A在MDCK II细胞内的蓄积量明显降低，而化合物B在胞内的蓄积则无明显差异。表明化合物A极可能被MDCK II细胞内的溶酶体捕获，而化合物B不易发生溶酶体捕获，这与MDCK II细胞Transwell实验模型的结论一致。图8. MDCK II细胞测试化合物验证（孔板模型）两种模型的差异MDCK II细胞Transwell模型与MDCK II细胞孔板模型均可用于体外溶酶体捕获评估的高通量分析。其中，MDCK II细胞Transwell模型可在评估测试化合物被溶酶体捕获程度的同时，对化合物进行渗透性的预测，并可探究溶酶体捕获效应对该测试化合物渗透性的影响。相对于MDCK II细胞Transwell模型而言，MDCK II细胞孔板模型实验周期短、通量高且成本低，更适用于药物研发早期阶段的高通量筛选。结语溶酶体的捕获效应存在于多种已知的上市药物以及在研的候选药物中。药物在溶酶体内蓄积会影响药物的药代动力学特征、有效性和安全性。亲溶酶体药物还可以通过改变溶酶体腔内的pH值、稳态体积以及酶结合位点，从而引起药物相互作用，进一步影响药效或产生毒副作用。因此，尽早明确候选药物是否会被溶酶体捕获，能够为药物的早期研发提供更全面的指导与帮助。参考文献：[1] Trivedi PC, Bartlett JJ, Pulinilkunnil T. Cells. 2020 May 4;9(5):1131.[2] Zhang Z, Yue P, Lu T, Wang Y, Wei Y, Wei X. Role of lysosomes in physiological activities, diseases, and therapy. J Hematol Oncol. 2021 May 14;14(1):79.[3] Bolger MB, Macwan JS, Sarfraz M, Almukainzi M, Löbenberg R. The Irrelevance of In Vitro Dissolution in Setting Product Specifications for Drugs Like Dextromethorphan That are Subject to Lysosomal Trapping. J Pharm Sci. 2019 Jan;108(1):268-278.[4] Serrano-Puebla, A., and Boya, P. (2018). 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