Trehalose

❓ 为什么要让AAV"冻干"？想象一下，你有一个非常珍贵的救命药，但它必须存放在-60°C以下的超低温冰箱里，运输时还需要专门的冷链车辆，这不仅成本高昂，还限制了药物能够到达的地区。这就是目前大多数基因治疗产品面临的现实挑战。腺相关病毒（AAV）作为基因治疗的明星载体，已经成功应用于多种疾病的治疗，包括FDA已批准的Zolgensma（治疗脊髓性肌萎缩症）、Elevidys(治疗杜氏肌肉营养不良)和ROCTAVIAN（治疗重度血友病A）等。但是，这些"救命药"都需要在超低温条件下储存和运输，这无疑增加了治疗成本，也限制了全球患者的可及性。冻干技术（也叫冷冻干燥）就像是给药物做"脱水保鲜"——通过特殊工艺将水分去除，让药物在常规冷藏温度（2-8°C）甚至室温下保持稳定。如果能成功开发出AAV的冻干制剂，就能大大降低储存运输成本，让更多患者受益。💡 AAV冻干技术的挑战AAV病毒颗粒就像一个装有珍贵货物的"微型集装箱"——病毒外壳包裹着治疗基因。冻干过程中最大的挑战是：保持"集装箱"完整：防止病毒外壳破损；防止"货物丢失"：避免内部基因泄露；维持颗粒大小：保证重新溶解后性能不变。2025年，来自BioMarin制药公司和堪萨斯大学的研究团队，首次系统性地探讨了通过冻干技术来提高AAV5基因治疗药物的稳定性和保质期的可能性，并评估了不同辅料对AAV5在冻干过程和储存稳定性中的影响。研究结果表明，冻干是一种可行的替代冷冻配方的方法，可以稳定AAV5药物产品。💥 技术突破首次成功开发AAV5冻干制剂；发现羟基依克多因的卓越保护效果；建立了系统的AAV冻干制剂评价方法；证明柠檬酸钠可替代氯化钠作为渗透压调节剂。🧪创新的配方设计：三个方向，六个配方，F3配方最优研究团队重点关注了以下成分：1.海藻糖（Trehalose）：传统的冷冻保护剂，可通过氢键作用稳定蛋白质结构，也可以通过提供玻璃态基质来限制降解反应。2.羟基依克多因（Hydroxyectoine）⭐：本研究的最大亮点！来自嗜盐微生物的天然保护剂，能通过与蛋白表面直接相互作用，替代结合水的氢键，从而维持蛋白结构稳定。3.重组人血清白蛋白（rHA）：可增加溶液黏度，通过优先排斥机制提供保护。在某些配方中显示出一定的稳定效果，尤其是在与海藻糖共同使用时。4. 柠檬酸钠vs氯化钠：用柠檬酸钠替代传统的氯化钠可以提高玻璃化转变温度（Tg'），减少结晶倾向。围绕三个方向设计了基础处方：F1组：甘露醇+海藻糖+氯化钠，追求冻干成型外观；F2组：海藻糖+柠檬酸钠，提升玻璃化转变温度Tg'；F3组：海藻糖+羟基依克多因+柠檬酸钠，引入生物保护机制。这三组基础配方又各自设了是否加入重组人白蛋白（rHA）的对照，最终组成六组样品：F1、F2、F3（不加rHA）；F1-A、F2-A、F3-A（加了rHA）核心发现：F3配方表现最优🏆 最佳配方（F3）5%海藻糖+5%羟基依克多因20mM Tris缓冲液（pH7.4）20mM柠檬酸钠 0.1% P188📊 优异的表现数据冻干后立即检测：外泄DNA仅7.5%（对照组100%）；空壳病毒颗粒仅5.0%；病毒颗粒大小保持稳定（27-28nm）。4周稳定性测试：5°C储存：外泄DNA维持在7.5%，几乎无变化；25°C储存：外泄DNA增加到约15%，仍在可接受范围（图1）。图1. 在5°C（A-B）和25°C（C-D）条件下，通过SG-DSF测量的外部DNA（%）随时间的变化。🔍创新的检测方法研究团队首次将透射电子显微镜（TEM）应用于冻干AAV的表征：（1）直接观察病毒颗粒完整性；（2）区分完整、空壳和破损的病毒颗粒；（3）验证了其他分析方法的结果。⚠️仍需解决的挑战法规问题：羟基依克多因尚未获得FDA批准作为药用辅料；生产规模：目前仅有实验室规模生产，成本较高；质量控制：不同批次羟基依克多因存在颜色差异；工艺优化：需要进一步改善冻干制品的外观。💰 对基因治疗行业的影响1. 扩大治疗可及性降低储运成本：从超低温(-60°C)储存改为冷藏(2-8°C)；简化冷链要求：减少对专业冷链设备的依赖；扩大覆盖范围：让偏远地区患者也能获得治疗。 2. 经济效益减少基础设施投入：医院和药房无需超低温设备；降低运输损失：减少因温度偏移导致的药物报废；提高市场竞争力：为AAV药物商业化提供新选择。3. 推动技术进步为其他AAV血清型提供参考：研究方法可推广应用；促进新辅料开发：推动羟基依克多因等新辅料的产业化；完善质量评价体系：建立更全面的AAV制剂质量评估标准。总结与展望这项研究为AAV基因治疗产品的制剂开发开辟了新路径。虽然羟基依克多因等新辅料还需要通过监管审批，但其卓越的保护效果让我们看到了希望。随着技术的不断完善和法规的逐步完善，冻干AAV制剂有望成为基因治疗领域的重要技术选择，让更多患者能够负担得起、用得上这些救命的基因治疗产品。关于派真生物：作为专业的腺相关病毒包装服务提供商，我们始终关注行业前沿技术发展，致力于为客户提供最优质的AAV产品和服务。如果您对AAV冻干制剂技术或我们的服务有任何问题，欢迎随时联系我们！点击文末“阅读原文”，了解更多实验细节。参考资料：Vargas, S.K., et al. Formulation development and feasibility of AAV5 as a lyophilized drug product. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2025, 114: 1214-1223.https://doi.org/10.1016/j.xphs.2025.01.004

抗体多特异性(polyspecificity)，也称为 CDR 特异性脱靶结合，是抗体药物安全的主要隐患。在临床中，脱靶结合可能导致不良事件和药物失败。潜意识里会认为抗体药物都非常特异，其实不然抗体脱靶是非常常见的，不过大部分都将死在临床研究中。最典型案例即是某药企的PD-1单抗，疗效对比不是很突出，血管瘤副作用倒是非常常见。相对来说，对于靶向杀伤细胞的疗法，例如 CAR-T 细胞疗法、双特异性抗体和抗体-药物偶联物（ADC），它尤其危险。 抗体多特异性是药物开发中的难题？去年mAbs 杂志的一篇文章详细分析了有关临床前和临床中抗体的多特异性，以及对基于细胞的多特异性脱靶结合蛋白芯片的回顾，以及 TCR 的局限性（参考1）。在使用膜蛋白芯片 (MPA) 进行特异性筛选时，研究人员发现多达 33% 的抗体候选药物具有多特异性。但这个问题还并不仅限于临床前先导候选药物。在对 83 种临床获批单抗（包括目前已获批和上市的药物）的分析中，18% 的单抗也存在脱靶结合。 目前 FDA 要求对基于抗体的疗法进行特异性测试 ，那么为什么临床单抗的脱靶结合率如此之高？这可能是因为依赖于一项已有 40 年历史的技术——组织交叉反应（TCR）研究，而该技术无法检测到脱靶结合。TCR 的局限性众所周知，它缺乏 MPA 等新型细胞蛋白芯片平台的灵敏度和其他优势。多特异性与多反应性多特异性（polyspecificity）脱靶结合不同于多反应性（Polyreactivity）。多特异性通过抗体的互补决定区 (CDR) 发生。它是指“与一定数量的蛋白质发生特异性相互作用，这些蛋白质在序列或结构基序方面可能相关，也可能不相关”。由于许多脱靶相互作用未被发现，包括基于细胞的蛋白质芯片在内的改进技术正在兴起，用于检测多特异性并识别脱靶，以便进行后续研究。 相比之下，多反应性是指抗体通过低亲和力、非特异性的跨组织相互作用而产生的普遍“粘性”。多反应性是一种众所周知的可显影性风险，其检测方法也已明确。 CDR 介导抗体多特异性的一种机制，如表位图所示。尽管靶蛋白和脱靶蛋白的序列同一性仅为 7%，但这两种蛋白共用一个 LGXXGP 表位。TCR 在检测抗体脱靶方面表现不佳组织交叉反应 (TCR) 研究于 1983 年首次由 FDA 推荐，至今仍被广泛用于特异性测试——尽管毒理学家表示，TCR 结果对 95% 分子的开发策略没有影响 。TCR 研究的局限性包括成本高昂、耗时长且难以解释。最重要的是，TCR 研究实际上并不能很好地预测药物安全性。基于细胞的蛋白质芯片是一种比 TCR 更灵敏、更一致、更准确的替代方案。正如以下三个案例研究所示，膜蛋白质组芯片可以检测出 TCR 研究遗漏的脱靶交叉反应。而且它成本更低、时间更短，并且能够提供定量结果。 对临床研究中单抗的分析表明，脱靶结合是临床药物失败的主要原因——部分原因是 TCR（主流筛选方法）在药物开发早期忽略了脱靶相互作用。虽然脱靶结合并不总是会产生不良事件，例如当药物无法接近脱靶位点时，但分析表明，没有脱靶的单抗在临床上更成功。基于细胞蛋白质芯片的脱靶识别、与安全性预测基于组织的研究最大的局限性在于它们无法识别特定的分子脱靶，只能识别其表达的组织。 相比之下， 基于细胞的蛋白质阵列（ 包括 MPA） 可以精确识别蛋白质脱靶。 了解脱靶的身份为后续研究潜在的安全问题提供了机会。 IND 申请中DL的 MPA 特异性数据特异性测试是所有基于抗体的疗法安全性评估的关键组成部分 （请参阅下面的 FDA 指导文件部分）。目前，向 FDA 提交的 100 多份 IND 申请已经包含 MPA 特异性数据，在几种情况下没有 TCR 数据。如， Cabaletta Bio 提交 IND 申请，并推动 DSG3-CAART 细胞疗法的临床开发。  膜蛋白质组芯片已在约 100 多个 IND 申请中使用，有望成为合格药物开发工具 (DDT) 的细胞蛋白质芯片 。 FDA 抗体特异性检测指南文件FDA、ICH 和其他监管机构提供了评估生物治疗药物特异性的指导文件。相关 FDA 文件如下:《人用单克隆抗体产品生产和检测注意事项》 （1997 年 2 月）。 第 30 页：“应采用合适的、已验证的新技术。” 第 31 页：提及 TCR。第 46 页：应检测的组织(参考2)。S6(R1) 生物技术衍生药物的临床前安全性评估 (2012 年 5 月)。S6 附录，第 10 页，注释 1：“可采用其他技术替代[免疫组织化学]技术来展示靶标/结合位点的分布。”(参考3)。嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞产品开发考量 (2024 年 1 月)。 第 21 页：“非预期靶向健康/正常组织中表达的其他抗原存在安全隐患，可通过体外和/或体内研究进行评估。” 文中以蛋白质芯片为例进行了说明(参考4)。1. mAbs Volume 16, 2024 - Issue 1, 10.1080/19420862.2024.23937852. https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/points-consider-manufacture-and-testing-monoclonal-antibody-products-human-use3. https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/s6r1-preclinical-safety-evaluation-biotechnology-derived-pharmaceuticals4. https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/considerations-development-chimeric-antigen-receptor-car-t-cell-products声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓