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会议推荐 2026第三届中国医药企业项目管理大会 2026第二届中国AI项目管理大会 2026第十五届中国PMO大会 2026第五届中国项目经理大会 本 文 目 录 1、扩展共价药物的""弹药库"" 2、共价药物典型药代动力学特征及案例分享 3、研究进展:综述-共价药物 | Nature Reviews Drug Discovery 4、共价药物新舞台瞄准赖氨酸的共价药物开发 一、扩展共价药物的""弹药库"" （原创 北纬55°  X-MOL资讯） 共价药物在2022年底抗击Covid-19疫情中扮演了中流砥柱的角色。辉瑞的抗SARS-CoV-2病毒药物Paxlovid对于抑制疫情起到了极为重要的作用。Paxlovid中有效成分之一nirmatrelvir就是一款共价药物，能够结合在SARS-CoV-2病毒增殖过程中发挥重要作用的蛋白3C样蛋白酶蛋白（3CLPRO，亦称Mpro）从而抑制病毒增殖。这个抑制过程并非传统药物的药物分子与靶标的非共价结合方式，nirmatrelvir分子上的亲电氰基与Mpro蛋白上Cys145残基的侧链巯基之间共价结合，产生硫代亚胺酸脂（thioimidate），从而结合靶标实现药效（图1）。由于是共价反应，该药选择性更高，药效更强。 图1. 抗SARS-CoV-2病毒药物nirmatrelvir，以及其共价结合机理。 其实共价药物并不是新生事物，在药物历史上具有里程碑意义的药物中，有一些就是共价药物，例如1899年问世的阿司匹林和1928年的盘尼西林。它们分别靠乙酰水杨酸酯和β-内酰胺四元环充当亲电“弹头”，与靶标上的亲核基团发生共价反应，抑制靶标的生物学功能（图2）。 图2. 阿司匹林作用机制。 共价药物发展史可谓英才辈出，涌现出的重要共价抑制剂药物参见图3。 图3. 共价药物发展史上重要的药物代表（红色结构为亲电弹头）。图片来源：Drug Discov. Today 共价抑制剂设计要点 共价抑制剂最重要的优势之一，在于它们比非共价抑制剂更高的选择性。药物的毒性也与选择性之间存在重要关联。共价药物的选择性和毒性主要由三个方面决定：弹头的亲电性、目标残基的亲核性以及药物配体-靶标之间的非共价作用。 弹头亲电性在共价抑制剂选择性方面起到极其重要的作用。高反应性亲电试剂通常表现出较低的选择性，这是因为它们也容易攻击除目标靶标之外的细胞其它部分。这可能导致有毒产物或加合物的形成，从而引发毒副作用。鉴于过高的亲电性可能导致脱靶效应，人们通常优选具有较低反应性的弹头。在与靶标初始非共价结合之后，目标的共价反应应该仅与目标靶标的亲核基团进行，从而降低脱靶效应和毒性。例如在一项研究中，科学家发现用富马酸叔丁酯取代丙烯酰胺弹头可减少 70% 的脱靶率。富马酸叔丁酯弹头较大的空间体积阻碍了不希望的反应，但保持了原始弹头的反应性。与靶标的非共价相互作用也赋予抑制剂选择性。为了实现高选择性，非共价结合应该足够强，以选择性地与其靶标结合，并且实现高停留时间。 共价抑制剂亲电弹头 如上文所述，共价抑制剂药物的弹头通常是亲电的，针对各种亲核蛋白质残基，最常见的是半胱氨酸和赖氨酸残基，也包括组氨酸的咪唑基团。图4显示了根据三个数据库（CovalentInDB、WHdb、CovPDB）中与共价抑制剂作用的氨基酸残基数量（其中包括了该氨基酸位于多肽N-端的情况，例如Val）。大多数弹头以半胱氨酸、丝氨酸和赖氨酸为目标。但靶标范围已显著扩大，21个氨基酸中有 16 个被共价靶向。CovalentInDB 还提供了有关针对辅助因子的共价弹头详细信息，这可能代表了一种新颖的靶向策略。最常见的亲电弹头包括丙烯酰胺、氯乙酰胺和腈，它们已经出现在很多上市共价药物之中，例如nirmatrelvir中的氰基。 图4. CovalentInDB，WHdb 和 CovPDB数据库中，与共价抑制剂作用的氨基酸残基分布图。图片来源：Drug Discov. Today 靶向半胱氨酸的共价弹头 半胱氨酸是共价抑制最常见的氨基酸靶标，其巯基pKa 8.4，接近生理pH，因此半胱氨酸的部分巯基是以去质子的thiolate状态存在的，这大大增强了它的亲核性和与亲电试剂的反应活性。在介电常数较高的极性环境中更倾向于发生半胱氨酸的亲核加成，因为反应基团上的电荷在更大程度上局域化，利于稳定thiolate并有利于它的亲核反应。然而在疏水口袋中，半胱氨酸不易极化，因此不易发生亲核反应。蛋白质表面半胱氨酸能够实现更大的极化，并且提供更大的空间来容纳各种亲电试剂，因此是最优选的。除了环境的极性和 pH 值之外，位置还控制着半胱氨酸的反应程度。靶向半胱氨酸的共价抑制剂亲电弹头包括迈克尔受体、腈、环氧化物、醛、卤代乙酰胺。其反应机理如表1-4所示。分别对应亲核取代、亲核加成、加成-消除和氧化反应机制。 表1. 通过亲核取代机制操作的半胱氨酸靶向弹头 1. 亲核取代机制 弹头3（β-杂芳基巯基乙酰胺）和弹头4（苯硫酚酮）分别针对常见共价弹头丙烯酰胺和酮的性质而开发。3是丙烯酰胺的生物电子等排体，其杂芳基取代基介导的可控反应性，能够实现更持久的抑制，还表现出较高的生理稳定性。相比之下，4是酮类不可逆共价抑制的首个例子，其中苯硫酚结构可以实现可逆抑制过程，因为它可以稳定硫代缩酮中间体。与传统的α-卤代甲基弹头相比，弹头4具有较高的特异性。溴代环丁烯胺酮5具有高水稳定性和生物利用度，其二甲基降低了母环的亲核性，使得只有溴被裂解，而氨基通过给电子来调节反应性并降低双键的亲电活性（迈克尔加成反应受体），从而降低 5 的整体反应性。 磺酰吡啶弹头 6a 和 亚砜吡啶弹头6b 通过吡啶上的砜/亚砜取代实现可调节的反应性，吸电子磺基团激活吡啶以进行 SNAr 反应。在硝基呋喃弹头7中，改变C4位置的取代基会改变弹头的反应性。SNAr弹头6和7都表现出高半胱氨酸选择性。硫醇取代的1,2,4-三唑基可以作为氯甲基弹头8的激活基团。用吸电子基团对 R1 基团进行修饰可增加反应活性，为弹头提供了调节空间。二卤乙酰胺 9 的开发是为了提高常规单卤乙酰胺弹头的选择性。由于氯氟乙酰胺 9a 中氟的吸电子性质，在C原子上感应出正电荷，从而减少了碳-氯键长度，导致弹头的亲电性降低。9a 的作用是可逆的，而二氯乙酰胺 9b 可以通过不可逆的机制起作用。羟胺弹头 10的安全性仍有待研究。硫代甲基四嗪 11 最近被鉴定为三合一共价抑制剂：（1）可逆共价半胱氨酸弹头；（2）与反式环辛烯（TCO）发生双正交反应，形成稳定的加合物，转化为不可逆共价弹头；（3）可通过与 TCO 的双正交反应用于荧光标记。 2. 亲核加成机制 表2. 通过亲核加成机制作用的半胱氨酸靶向弹头 以迈尔克加成反应为代表的亲核加成反应，是传统的丙烯酰胺类共价抑制剂与半胱氨酸产生共价结合的机制。随着人们对可逆共价抑制剂认识的不断加深，新型的亲核加成弹头也不断涌现出来。芳香族三氟甲基酮 15与 FGFR4 受体的 Cys552 表现出可逆共价结合，并且对硫醇表现出选择性。苯并噻唑基酮弹头 16曾用于开发抗 SARS-CoV-2 药物，可与3CL 蛋白酶的 Cys145 可逆结合。在被并入多肽骨架后，该抑制剂表现出优异的安全性，中度 CYP 抑制作用，无心脏毒性，也无致突变性。这表明有可能将这种弹头纳入进一步的共价药物发现活动中。在研究黄酮类化合物抑制Mpro的过程中，研究人员发现连苯三酚 17也是一种共价弹头。在氧化条件下，连苯三酚被氧化为邻苯醌形式，这是一种迈克尔加成反应受体，可与半胱氨酸靶标发生反应。连苯三分弹头与半胱氨酸的共价反应有很高的目标选择性，其反应性由氧化环境控制。与 α,β-不饱和羰基体系类似，炔烃也会发生迈克尔加成。炔烃通常连接在缺电子杂环上，因为它们有助于稳定负电荷并增加反应性。新开发的炔基弹头的分子实体包括18-21，它们具有高选择性。在炔基嘧啶 19 中，吸电子的嘧啶降低了炔基的亲电性，使其能够与不耐受高极性丙烯酰胺弹头的靶标相互作用。炔基噻唑20可调节炔基弹头的反应性，2-位的取代降低了电子密度，从而增加了弹头的亲电性。通过改变炔烃亲电性，杂环或环稠合也有助于调整反应性。尽管膦酰胺衍生物 21a 和 21b 仅应用于生物缀合和装订肽，但由于其高半胱氨酸选择性、易于合成和高化学稳定性，它们也有望用于共价抑制应用。这些弹头中 R1 位置的吸电子基团有助于调控弹头反应活性。 3. 加成-消除机制 表3. 通过加成-消除机制作用的半胱氨酸靶向弹头 研究人员发现，α-取代甲基酮与靶标之间的不可逆反应与离去基团的pKa有关。这个发现催生了α-酰氧基甲基酮亲电弹头22的产生。22具有可调节的 pKa 和反应活性，其中的杂芳酯基团增加了极性表面积（PSA, polar suface area），有助于优化药物分子的物理化学性质。弹头23在共价接合后释放完整的糖精，可应用于果糖 1,6-二磷酸酶 (FBPase) 的共价抑制。而在加成-消除过程中释放的糖精，本身也是一个共价抑制剂，可用于碳酸酐酶抑制。23的应用因此可以达到双重靶向目的。通过共价靶向释放糖精是一个新概念，可用于将糖精这样本身的共价抑制剂整合到大的共价抑制剂中，通过与靶标的共价反应将其释放，进一步引发位点特异性的共价抑制反应。碳酸酯 24 和氨基甲酸酯 25均表现出可逆共价结合、高半胱氨酸选择性和低反应性。二芳基碳酸酯24可以酰化去泛素酶靶标，形成动力学稳定的硫代碳酸酯中间体，该中间体经历缓慢的二酰化，从而表现出持续的抑制作用。二硫代氨基甲酸酯 25 对硫醇（例如谷胱甘肽）表现出低反应性。三卤乙酰胺弹头 26 具有更大的空间位阻，半胱氨酸硫醇攻击羰基（而不是直接进攻 β-碳）产生硫代半缩酮中间体，然后进行1,2-位移以取代一个溴化物。 4. 氧化机制 表4. 通过氧化反应机制作用的半胱氨酸靶向弹头 二硫烷基苯甲酰胺 27 有一个二硫键，可以与半胱氨酸的巯基发生thiol-disulfide交换反应，从而进行共价结合。硫代磺酸盐28通过独特的氢键激活机制，它与附近的组氨酸残基形成氢键会导致 S-S 键极化，从而更容易与半胱氨酸反应。这种机制增强了28选择性，使其倾向于半胱氨酸蛋白酶 (CP) 而不是丝氨酸蛋白酶 (SP) 结合。在CP中，组氨酸以质子化形式存在，因此很容易与28形成氢键（组氨酸作为氢键供体）。1,2,4-噻二唑 29可以通过可逆结合的方式抑制SARS-CoV-2病毒Mpro 蛋白酶的Cys145。R1、R2 和 R3基团调控弹头的反应活性。29本身显示出高反应性，通过R2和R3位置的对位卤素取代增强了反应性。值得注意的是，29 还表现出高细胞渗透性。硫氰酸盐30用于共价靶向CC 趋化因子受体 2 (CCR2) 和 SARS-CoV-2病毒的Mpro 蛋白酶。研究证明30是一种不可逆的半胱氨酸选择性弹头，反应性低，安全性高。 二、共价药物典型药代动力学特征及案例分享 （原创 药明康德DMPK 药明康德DMPK） 前 言 共价药物（covalent drug）是一类通过与靶标（通常是酶或受体）形成共价结合，从而抑制其生物功能的一类化合物。许多早期的共价药物是偶然发现的，它们通过结合活性位点来抑制酶的活性[1]。这些药物往往都含有丙烯酰胺、β-内酰胺等官能团，能与靶蛋白中特定的氨基酸残基形成共价键，发生不可逆或可逆的化学反应。因其特殊的作用机制，共价药物在某些方面表现出与传统小分子药物不同的药效学和药代动力学特征。 共价药物因能与靶蛋白发生非平衡的共价结合，从而克服内源性底物的竞争，能够靶向不可成药靶点，延长药物的作用时间等多方面的优点而倍受关注，并已取得了巨大成功。如表1不完全统计，自2011年来，至少已有30款共价药物已被批准用于治疗癌症、胃肠道疾病、心血管疾病、感染等不同的疾病，引领了小分子药物研发的前沿。已上市及在研的共价药物主要靶向EGFR、BTK、FGFR2、KRAS及JAK3蛋白等。由于共价作用特殊的机制，其在药代动力学方面也表现出了与其他常规小分子药物不一样的特点，本文总结了共价药物这些特殊的药代特征，供研发人员参考。 表1. 2011-2024年已上市共价药物  （下滑查看更多） *于2024年4月退市 注：共价弹头以红色标出。 共价药物与蛋白发生共价结合 共价药物与靶蛋白共价结合是发生药效的关键。除了与靶蛋白，共价药物还可能与其他蛋白发生共价结合，包括血液系统中的蛋白和组织蛋白如肝脏蛋白等。从而影响药物在体内的分布、代谢及可能产生的毒性。 1 共价药物与血清白蛋白（HSA） 发生共价结合 共价药物进入体内血液循环系统后，可能与血清白蛋白（HSA）发生共价结合。Wang等人[2]使用液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术分析了来那替尼（neratinib，HKI-272）与HSA的结合产物并确定了结合位点。研究表明HSA的Lys190残基与来那替尼共价结合，发生迈克尔加成形成了来那替尼-HSA加合物。此外，当来那替尼-HSA加合物在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中重新孵育18小时，来那替尼会逐渐游离出来，证明了来那替尼与HSA的共价结合具有缓慢的可逆性。 图1. 来那替尼与血清白蛋白发生可逆的共价结合 Paul A. Dickinson等人[3]发现奥希替尼（osimertinib）会与HSA发生不可逆的共价结合。不同浓度的奥希替尼（0.1、1、10和100 μM）分别与不同种属的血浆在37℃下孵育6小时以评价奥希替尼的稳定性。实验发现，与小鼠血浆、大鼠血浆、犬血浆、人血浆、HSA以及人源α1-酸性糖蛋白（AGP）相比，奥希替尼在人血浆和HSA的中的剩余百分比非常低（分别小于1%和15%，表2）。10 μM 14C标记的奥希替尼在37℃下与雄性大鼠血浆、人类（男性，n=3）血浆、磷酸盐缓冲液中的HSA（40 mg/mL）中进行孵育。在所有样品中，初始时间点测得的共价结合量≤1 pmol eq/mg蛋白质。随着时间的推移，蛋白共价结合物逐渐增加，在6小时孵育后，大鼠血浆、人类血浆和HSA的共价结合物的量分别达到159、196和158 pmol eq/mg蛋白，并且这些共价结合具有不可逆性，不同种属的血清白蛋白由于结构差异，形成共价结合物的程度不一样。 表2. 在37℃孵育6小时后，不同浓度的奥希替尼在小鼠血浆、大鼠血浆、犬血浆、人血浆、HSA和人α1-酸性糖蛋白（AGP）中剩余百分比（%） 索托拉西布（sotorasib）是一种首创的靶向KRASG12C的共价抑制剂，Upendra P. Dahal等人[4]通过与大鼠血液或血浆与索托拉西布体外共孵育实验，利用蛋白质组学技术证明了索托拉西布会与大鼠的血清白蛋白或大鼠血红蛋白发生共价结合形成共价结合物。Irene Vuu等人[5]对索托拉西布给药后的人体内血浆样品进行了蛋白质组学分析。结果表明，索托拉西布的会与HSA的137位的赖氨酸残基（lysine-137）发生共价结合。而布鲁替尼、来那替尼和奥希替尼与HAS的共价结合为190位的赖氨酸（lysine-190）残基。 与血浆蛋白发生共价结合的直接影响是使用常规平衡透析实验测试血浆蛋白结合率的时候，获得低的回收率，进而导致游离分数fu值的可靠性低。除此以外，与血浆蛋白共价结合，很可能是某些共价药物的在体内的消除途径之一，具体在本文的2.2部分讨论。 2 共价药物与肝脏蛋白发生共价结合 用3H标记的奥希替尼与人肝细胞共孵育，0和4小时与肝细胞蛋白形成共价结合物的量分别为16.7和693 pmol eq/mg蛋白[6]。3H标记的奥希替尼与大鼠肝细胞共孵育后，0和4小时与肝细胞蛋白形成共价结合物的量分别为10.9和228 pmol eq/mg蛋白（表3）。3H标记的奥希替尼与人肝细胞和大鼠肝细胞共同孵育后，共价结合分数分别为0.29和0.02。肝脏作为人体的主要代谢和解毒器官，与肝脏蛋白的共价结合可能导致肝脏毒性或免疫毒性。但迄今为止，在临床或临床前研究中没有发现表明奥希替尼或其代谢物与蛋白的共价结合与任何毒性相关，包括特异性肝脏毒性或免疫介导的毒性。 表3. 奥希替尼在体外与人肝细胞和大鼠肝细胞形成共价结合物的情况 共价药物的代谢和消除 共价药物的代谢和消除与常规小分子药物有很多相似之处，比如都会发生CYP450介导的一相代谢。带有丙烯酰胺弹头的共价药物会与谷胱甘肽（GSH）或半胱氨酸形成共价结合物。会随着血清白蛋白共价加合物的新陈代谢而发生体内消除。 01 与谷胱甘肽/半胱氨酸形成加合物作为 体内重要消除途径 福巴替尼（futibatinib）是一种选择性、不可逆的成纤维细胞生长因子受体1-4（FGFR1-4）抑制剂，最近已获批用于治疗FGFR2重排阳性的胆管癌。I期临床研究评估了14C-福巴替尼在健康参与者（n=6）中单次口服20毫克剂量的物质平衡和代谢特征[7]。研究显示，血浆中最主要的代谢物是与半胱氨酸甘氨酸形成的结合物，占循环放射活性（CRA）的13%。在人体肝细胞的体外孵育实验中，14C-福巴替尼的代谢物包括去甲基福巴替尼的葡萄糖苷酸结合物和硫酸盐结合物，同时也包括与谷胱甘肽和半胱氨酸形成的结合物。这些数据表明，福巴替尼的主要代谢途径为O-去甲基化和谷胱甘肽结合。 索托拉西布（sotorasib）的人体内代谢涉及非酶促的谷胱甘肽结合、γ谷氨酰转移酶（GGT）介导的谷胱甘肽加合物的水解，以及CYP450介导的氧化反应。健康男性受试者在服用单次口服720 mg剂量（含约1 μCi的[14C]-索托拉西布）后，检测器血浆中的代谢物[8]。研究表明，在血浆提取物中，半胱氨酸加合物和药物原型分别占总放射性的31.6%和22.2%。在血浆中检测到的索托拉西布-白蛋白加合物作为一种次要成分。另外，在人肝S9体外研究中表明，谷胱甘肽加合物的形成主要是通过非酶促迈克尔加成进行的。使用人肾S9并结合GGT酶特异性抑制剂的体外研究表明，GGT酶是将谷胱甘肽加合物转化为半胱氨酸加合物的主要酶。具体代谢途径如图2所示。 图2. 索托拉西布在人体内的代谢途径[8] 02 共价药物随着白蛋白结合物的 新陈代谢而清除 在一项健康志愿者单次口服20 mg（0.037 MBq） [14C]-奥希替尼的临床试验中[6]，给药84天后，放射性总回收率占给药剂量的82%，粪和尿的回收率分别是67.8%和14.2%，表明奥希替尼主要通过粪便途径排泄。血浆中奥希替尼消除半衰期为61.2小时，而血浆总放射性半衰期是474小时，如图3所示。血浆总放射性的消除延迟是由于奥希替尼与人血浆蛋白发生共价结合所致。此外，从血浆中提取的放射性物质（8%）远低于粪便（70%），考虑到粪便样本中约有30%的放射性物质未被提取，推测这30%来自于血浆中奥西替尼与白蛋白的结合物或其代谢物，因此通过形成蛋白加合物排泄到粪便中是奥希替尼在体内的主要清除途径之一。 图3. 健康男性志愿者单次口服[14C]-奥希替尼20mg后，血浆中奥希替尼的浓度-时间曲线图和血浆放射性-时间曲线图[6] 表4总结了几个共价药物的体内主要代谢和清除途径[9]。来那替尼、吡咯替尼、达克替尼、依鲁替尼与常规小分子一样，其体内的主要清除途径是经过CYP450酶的代谢，阿法替尼与奥希替尼类似，其体内主要清除途径也是与血浆蛋白发生共价结合而消除。 表4. 6个共价药物在人体内的主要清除途径[9] NR: 未报道。 共价药物对CYP450酶的时间依赖性抑制 据报道，大多数共价药物至少是一种人CYP酶的时间依赖性抑制剂[10]。Moghaddam MF等人对10个共价药物（阿比特龙、阿法替尼、波塞普韦、卡奈替尼、卡非佐米、达可替尼、来那替尼、依鲁替尼、特拉匹韦以及氨己烯酸）在5 μM浓度下对7种CYP酶（包括CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4/5）的可逆抑制和时间依赖性抑制（TDI）进行测试。实验结果显示，大多数共价药物对至少一种CYP酶亚型表现出时间依赖性抑制的潜力。 根据已上市药物的申报资料披露情况，表5列出了近年获批的共价药物的TDI情况，9个共价药物均至少对某一亚型有TDI效应。药明康德DMPK已发表的公众号文章：共价药物体外时间依赖性抑制（TDI）数据分析和解读 中详细分析了29个已上市的共价药物对CYP酶的TDI研究结果，并对体外TDI风险评估方法和数据解读提供了相关建议，欢迎参阅。对于具有潜在TDI效应的共价药物，在研发早期通过体外研究明确药物主要抑制的CYP450酶并获得相应的动力学参数，并结合人体PK数据可有效预测临床TDI的风险。 表5. 近年上市的共价药物对人CYP酶的时间依赖性结果 “Y”表示体外实验显示有TDI。“-”表示体外实验未显示TDI。 共价药物的PK/PD关系 对于传统小分子药物而言，需要将血药浓度维持在一定水平以维持药效作用。而共价药物与靶蛋白共价结合后，持续占据靶标活性位点而发挥药效，靶标活性的恢复周期取决于新的靶标蛋白合成所需的时间，而与血浆中药物的半衰期关联不大。 如下以一款不可逆BTK抑制剂CC-292的PK/PD关系为例阐述其与常规小分子的不同[11]。在一项临床研究中，六名健康成年受试者接受了一次口服2.0 mg/kg剂量的CC-292并在一段时间内连续收集血样，以确定CC-292的血浆浓度与BTK靶点蛋白占位之间（PK-PD）的关系。所有受试者均在给药后24小时内，血浆浓度下降至接近或低于检测下限（0.1 ng/mL），终末消除半衰期为1.9小时。在CC-292给药后8至24小时内，所有六名受试者均维持了完全或接近完全的BTK靶点占有率，而此时血浆中药物浓度已降低至低水平或接近定量下限。在给药后48至72小时BTK靶点占有率接近50%。而这一数值与BTK靶点蛋白的再生半衰期48至72小时相吻合（图4）。这些数据表明共价药物的药代动力学（PK）与药效（PD）之间的脱钩。因此，共价药物不需要像常规小分子一样优化血浆消除半衰期或血浆暴露量。共价药物在短时间内达到与靶标结合的浓度后，靶点蛋白的再生速率将决定药物作用的持续时间。 图4. CC-292在健康人群血浆中药物浓度—时间曲线图与靶点占有率—时间曲线图[11] 结 语 本文主要总结了共价药物区别于传统小分子药物的典型药代动力学特征，包括与体内蛋白发生的共价结合影响药物在体内的分布和代谢、与谷胱甘肽/半胱氨酸共价结合、可能对CYP450酶的时间依赖性抑制以及PK/PD关系的特殊性。这些复杂的药代特征也为药物的研究和开发带来了新的挑战。通过了解共价药物这些独特的药代动力学特征，可以协助研发人员拨开迷雾。 三、研究进展:综述-共价药物 | Nature Reviews Drug Discovery （原创 今日新材料 今日新材料） 共价药物Covalent drugs，用于治疗疾病，已有一个多世纪的历史，但促进共价药物合理设计的工具，最近才出现。 正如用于治疗各种癌症的共价表皮生长因子受体 covalent epidermal growth factor receptor，EGFR和Bruton酪氨酸激酶Bruton’s tyrosine kinase，BTK抑制剂所证明的那样，有目的地向现有配体添加反应性官能团，可以实现对靶蛋白的有效和选择性抑制。 此外，通过“亲电优先electrophile-first”方法鉴定共价配体，也产生了共价药物的发现，如KRAS(G12C) 和 SARS-CoV-2主要蛋白酶的共价抑制剂。特别是，KRAS(G12C)抑制剂的发现，验证了共价筛选技术的使用，该技术，在过去十年中，变得更加强大和广泛。化学蛋白质组学平台的出现是，对共价配体筛选的有力补充，并有助于配体发现、选择性分析和靶标鉴定。 近日，美国 加利福尼亚大学伯克利分校（University of California, Berkeley）Lydia Boike，Nathaniel J. Henning，Daniel K. Nomura，在Nature Reviews Drug Discovery上发表综述文章，系统展示了共价药物发现的里程碑，重点是，从这些项目中吸取的经验教训，以及不断发展的共价药物发现技术工具箱，如何促进该领域的成功。 Advances in covalent drug discovery.  共价药物发现的进展。 图1：主要共价药物开发的时间表。 图2：表皮生长因子受体epidermal growth factor receptor，EGFR抑制剂结构进展。 图3：KRAS(G12C) 与adagrasib (MRTX849)和sotorasib (AMG-510)共结晶的排列结构。 图4：Nirmatrelvir与SARS-CoV-2主要蛋白酶的复合物。 文献链接：https://www.nature.com/articles/s41573-022-00542-z https://www.nature.com/articles/s41573-022-00542-z.pdf DOI: https://doi.org/10.1038/s41573-022-00542-z 本文译自Nature。 四、共价药物新舞台瞄准赖氨酸的共价药物开发 （原创  北纬55°  X-MOL资讯） 共价药物一百多年前就已出现，例如大名鼎鼎的阿司匹林与青霉素，它们的乙酰水杨酸基团以及β-内酰胺四元环，可以与靶标蛋白上的亲核基团产生共价反应，从而以更牢固的共价方式结合受体。这意味着与非共价药物相比，它们具有更长的作用时间，并且能够在更小的剂量下发挥药效。近年来，共价药物因其效力和能力而越来越受到药物开发人员的关注。大名鼎鼎的治疗套细胞淋巴瘤的依鲁替尼（ibrutinib）和抗SARS-CoV-19药物Paxlovid中的活性成分nirmatrelvir都是共价药物（图1）。 图1. Ibrutinib和nirmatrelvir化学结构。 共价药物通常带有一个亲电基团，可以与受体蛋白上丰富的亲核基团产生共价反应，因此共价药物上的这个反应活性基团，也被形象地成为“弹头（Warhead）”，例如irutinib和nirmatrelvir上的亲电弹头就分别是丙烯酰胺与氰基。从蛋白受体的角度来看，氨基、羟基、甲巯基、巯基、咪唑基等亲核基团，都可以成为共价药物靶向的基团。其中，半胱氨酸巯基丰度较低，在众多适应症中发挥重要的生理学作用，而且去质子后巯基具有高度的亲核性，因而成为了绝大多数共价药物靶向的目标。Ibrutinib和nirmatrelvir均靶向受体上的关键半胱氨酸，前者瞄准的是布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）上的Cys481；后者则靶向SARS-CoV-19病毒的3C样蛋白酶（3CLPRO）上的Cys145。 尽管半胱氨酸因其上述特性成为了绝大多数共价药物靶向的基团，但仍然存在非半胱氨酸的氨基酸靶标，为其它的共价药物的开发提供了思路，例如在蛋白组中大量存在的赖氨酸。半胱氨酸作为共价结合位点尽管取得了很大的成功，但却存在不小的挑战。一方面，它具有一定程度的选择性——人体蛋白质的半胱氨酸的比例很小，因此可以实现较高的选择型和较低的脱靶效应。另一方面，由于半胱氨酸较低的丰度，使得靶向半胱氨酸的策略不能“放之四海而皆准”地适应共价药物的开发。与半胱氨酸不同，赖氨酸在蛋白质中广泛存在，它侧链的氨基同样具有较强的亲核性（尽管在生理条件下，大多数赖氨酸氨基被质子化），从这个角度来看，赖氨酸有望使更多人类蛋白质可用于靶向共价药物。赖氨酸残基的数量几乎是体内半胱氨酸的三倍，平均每种蛋白质大约包含32个赖氨酸残基。 半胱氨酸靶向共价药物的研究还发现，某些与癌症相关的蛋白质（例如表皮生长因子受体EGFR）可以产生突变，以将其关键的被靶向的半胱氨酸残基转换为其他氨基酸，从而使曾经的母体蛋白靶标不再被药物靶向，实现所谓的耐药性。与之相反，靶向赖氨酸的药物被卷入耐药性问题的可能性较低。这是因为对于某些大类蛋白质（例如激酶中），赖氨酸对蛋白质的功能至关重要，无法用另一种氨基酸代替。作为药物靶标，赖氨酸不仅用途广泛，而且产生耐药性的问题较少。尽管如此，专家仍然认为，靶向赖氨酸的共价药物开发至少要落后半胱氨酸十年以上。目前尚无靶向赖氨酸的共价药物上市，而靶向半胱氨酸的共价药物例如ibrutinib和osimertinib，不仅成功上市，而且在一定程度上制定了共价药物开发的基调。 图2. Osimertinib化学结构。 赖氨酸的潜力 尽管赖氨酸在蛋白质中普遍存在，但并非所有赖氨酸都可以作为药物的靶点。当暴露在酸性甚至弱碱性环境中时，例如生理 pH 值时，赖氨酸的侧链氨基都会质子化，不再具备亲核性。因此，药物开发通常会注重那些蛋白质内部赖氨酸，尤其是具有较低pKa的赖氨酸残基，它们可能会以中性而非质子化的氨基形式存在。 为了探索赖氨酸的潜力范围，研究人员最近绘制了人类蛋白质中赖氨酸的分布图，以寻找可成药的位点。他们的努力表明，在这个相对未开发的领域存在大量机会。康奈尔大学化学家 Mikail Abbasov 及其同事梳理了人体蛋白质可靶向赖氨酸的免疫细胞和癌细胞。[1] 研究人员绘制了超过 14,000 个赖氨酸，其中至少有 3,000 个可以用于开发共价药物。该小组还进行了实验，以评估各种反应基团在不同位点与赖氨酸共价结合的效率，为共价药物设计提供起点。 共价/非共价相得益彰 赖氨酸的亲核性比半胱氨酸较低，因此可能需要活性更高的亲电弹头。但从共价药物的角度来看，过强的亲电基团可能会导致药物本身的化学稳定性出现问题（例如含有醛羰基的化合物，其对湿度较为敏感），而且过强的亲电性会导致共价药物的选择性降低，导致它们可能与血液中的水、酶或其他化合物发生反应。开发者因此需要在亲电药物设计中平衡反应性和稳定性。由加州大学河滨分校的 Maurizio Pellecchia 领导的团队已经在这个平衡点的追求过程中取得了显著的进步：他们从高亲电性的磺酰氟开始，通过调整正确的给电子基团来调和它的亲电性。[2] 在另一个案例中，研究人员设计了一种芳基氟磺酸酯（图3），可以与受体上的赖氨酸发生选择性共价结合。[3] 图3. 靶向赖氨酸的含芳基氟磺酸酯的共价药物候选物。 共价药物的亲电弹头不能与药物分子中的其它部分割裂开来，否则单独地合成一个芳基氟磺酸酯岂非就可作为共价药物？图3分子上的多肽部分需要与受体蛋白实现有选择性的非共价作用，将其亲电弹头递送到靶向的赖氨酸附近，从而促进氟磺酸酯与赖氨酸之间的共价反应。抗SARS-CoV-19药物Paxlovid中的活性成分nirmatrelvir，就是依靠这种非共价为基础、共价结合为重点的模式，实现对于3C样蛋白的绑定而使其丧失关键的生物学活性。 共价键的形成与断裂 可逆共价抑制剂也是共价药物发展的一个方向，所谓的可逆并非有机化学层面的可逆，而是指产生的共价键在某种情况下可以断裂。例如nirmatrelvir中，通过分子上的氰基与半胱氨酸巯基之间形成的硫代亚胺酸酯，可以在水解的条件下分裂为巯基和酰胺。它并没有恢复初始的氰基，因此从有机化学家的角度来看，这并非一个可逆反应，而是反应产物继续的降解。但从药理学来看，巯基被恢复，因此受体得到了再生，所以属于可逆过程。 醛基可以靶向赖氨酸氨基，产生可逆共价结合的效果。以醛基为弹头的共价药物已经实现了商业化，例如2019年通过FDA审批的治疗镰状细胞病的voxelotor（图4），就是通过药物分子中的醛基结合血红蛋白上的 N 端氨基实现药效的。 图4. Voxelotor化学结构。 尽管Novartis因为商业原因放弃了voxelotor，但还是开发了可逆共价抑制剂 roblitinib，一种靶向半胱氨酸的含醛基共价药物，并通过了2期临床试验，作为肝癌的潜在疗法。虽然voxelotor和roblitinib都不靶向赖氨酸，但针对赖氨酸的共价药物，似乎离问世不算太遥远了。 靶向赖氨酸的共价药物，任重而道远 制造有效的共价药物需要平衡各种因素，药物分子骨架、亲电基团的选择、恰当的反应活性以及靶标赖氨酸周围的微环境。尽管含量丰富，但赖氨酸并不意味着能够取代半胱氨酸作为首选的共价靶标。相反，研究人员希望半胱氨酸和赖氨酸能够相互补充，以扩大整体可成药空间。[4] 除了赖氨酸之外，丝氨酸与酪氨酸也成为了研究的靶标（丝氨酸实际上已经在阿司匹林的神话里面成功地成为了靶标）。尽管困难重重，但一旦成功，共价药物抑制剂的开发经迎来崭新的舞台。 end 本公众号声明： 1、如您转载本公众号原创内容必须注明出处。 2、本公众号转载的内容是出于传递更多信息之目的，若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请作者或发布单位与我们联系，我们将及时进行修改或删除处理。 3、本公众号文中部分图片来源于网络，版权归原作者所有，如果侵犯到您的权益，请联系我们删除。 4、本公众号发布的所有内容，并不意味着本公众号赞同其观点或证实其描述。其原创性以及文中陈述文字和内容未经本公众号证实，对本文全部或者部分内容的真实性、完整性、及时性我们不作任何保证或承诺，请浏览者仅作参考，并请自行核实。