Roblitinib

在4月21日的2026年美国肿瘤年会（AACR）上，伯汇生物首次报道了BB102作为FGFR4降解剂的作用机制及临床前研究结果。 原发性肝癌是全球范围最常见的恶性肿瘤之一，在我国尤其高发，我国每年新发病例数几乎占全球一半，其中85%～90%为肝细胞癌（HCC）。手术切除和肝移植是早期HCC患者获得根治的重要手段，但由于肝癌起病隐匿，仅有不超过30%的患者在确诊时具有手术切除或肝移植的机会；同时，HCC手术切除后的5年复发率高达40%～70%。对于晚期或不可切除的HCC患者，局部治疗（包括消融治疗、介入治疗等）和系统治疗（药物治疗）在延长生存期、提高生存质量方面起到至关重要的作用。 随着PD-1为代表的免疫治疗药物问世，抗血管生成药物联合免疫治疗药物在2020年之后逐渐成为系统治疗的一线标准疗法。相比于索拉非尼，抗血管生成药物联合免疫治疗药物的客观缓解率（ORR）、中位无进展生存期（mPFS）和总生存期（mOS）均有显著提高。但对于抗血管生成药物联合免疫治疗药物一线治疗失败进展的患者，目前尚无二线及后线标准疗法可以使用。 成纤维细胞生长因子受体4（FGFR4）是一种酪氨酸激酶受体，它选择性地结合成纤维细胞生长因子19（FGF19），并通过下游MAPK、PI3K/AKT等信号通路刺激细胞增殖、分化，抑制细胞凋亡。FGFR4基因过表达、突变或其配体FGF19过表达等异常信号转导在某些肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用，因此FGFR4也被认为是治疗FGF19/FGFR4依赖型肿瘤的潜在靶点。FGF19过表达在FGFR4正常的转基因小鼠中，有100%小鼠发展成为原发性肝细胞癌。 FGF19/FGFR4信号通路在肿瘤中的作用 自2018年起已有多款FGFR4抑制剂进入临床，成为最为拥挤的创新药赛道之一。早期Blueprint/基石的BLU554、诺华/云顶新耀的FGF401、Incyte的INCB062079等均因为疗效或安全性问题折戟于早期临床，但随着结构设计不断优化，2024年和誉的ABSK-011在ESMO公布了振奋人心的临床数据，在29例既往接受过至少接受过抗血管生成药物联合免疫治疗药物的FGF19过表达晚期HCC患者中，ORR达到44.8%，mPFS达到5.5个月。 据文献报道，肝癌细胞可以在2小时内重新合成新的FGFR4蛋白，第一代FGFR4抑制剂（如BLU554等）通过共价不可逆的结合方式对FGFR4蛋白磷酸化位点进行竞争性抑制，但对于新生成的FGFR4蛋白，则需要始终很高的血药浓度来维持抑制作用。而新一代FGFR4抑制剂BB102共价可逆结合方式抑制FGFR4磷酸化的同时，还能特异地降解肿瘤细胞中靶蛋白，通过双重作用机制更有效地阻断肿瘤生长。 BB102 是通过基于蛋白结构的药物设计开发的, 并通过 SAR 分析和药物化学迭代进行优化。BB102诱导的FGFR4蛋白降解, 在肿瘤细胞系和小鼠异种移植模型的肿瘤中都得到了证实。BB102 明显诱导 FGFR4 过表达 HuH-7、Hep3B 和 SJCRH30 癌细胞系中的 FGFR4 蛋白降解, 而溶酶体自噬抑制剂 Bafilomycin A1 阻断了 FGFR4 蛋白的降解。BB102 仅降解肿瘤组织中FGFR4, 而不能降解肺、肝脏组织中的FGFR4蛋白。 BB102 在携带 HCC 肿瘤异种移植物的小鼠中具有显着的抗肿瘤活性。 Ⅰ期临床数据表明，BB102安全性良好，不良反应程度较轻且可控，并在FGF19过表达的晚期HCC患者中展现出明显的治疗效果。目前BB102 Ⅱ期临床研究由复旦大学附属中山医院和中国科学技术大学附属第一医院（安徽省立医院）共同牵头，正在全国十余家知名医院同步开展。 POSTER详情请扫描上方二维码 招聘岗位 职位名称：商务拓展总监/VP 任职要求：硕士及以上学历，药学、金融等相关专业， MBA商业背景优先。5 年以上生物医药行业 BD、投融资相关经验，有创新药项目合作 / 投融资落地案例经验者优先。具备行业资源、商业洞察力及全流程项目操盘能力，精通商务谈判，英语可作为工作语言。 关于伯汇生物 是一家处于临床阶段的创新药物研发公司，聚焦肿瘤以及自身免疫性疾病。公司以“肿瘤免疫2.0”（免疫+靶向）为研发理念，针对未被满足的临床需求布局了多条研发管线，致力于开发全球新（FIC）的创新药物。公司成立以来获得多家业内知名投资机构的支持，搭建了极具特色的技术平台，积极开展与国内外药企合作，伯揽英才，汇智创新，让免疫治疗造福人类健康。更多信息请点击下方阅读原文访问公司官网。

会议推荐 2026第三届中国医药企业项目管理大会 2026第二届中国AI项目管理大会 2026第十五届中国PMO大会 2026第五届中国项目经理大会 本 文 目 录 1、共价药物:弹头的迭代更新? 2、用于药物设计的共价弹头(covalentwarheads) (一) 3、用于药物设计的共价弹头(covalentwarheads)(二)以及如何通过计算模拟判断共价弹头的反应性 4、扩展共价弹头探索——大数据研究靶向半胱氨酸可逆和不可逆共价激酶抑制剂 一、共价药物:弹头的迭代更新? （原创 刘剑锋&王磊 药物宇宙） —共价的道路上，没有终点，只有里程碑 经典的共价弹头如以丙烯酰胺为代表的α,β-不饱和羰基通过迈克尔加成反应与半胱氨酸的巯基硫形成共价键，以芳基磺酰氟为代表的硫（VI）弹头通过亲核取代反应与赖氨酸形成共价键。在药物设计中，将这类共价弹头与配体相连，实现配体在口袋中的长时间占据。 然而，共价反应的活跃性常常导致脱靶结合、代谢稳定性差等问题。因此，作为反应中心的共价弹头的设计以及进一步的整体药物分子设计尤为重要。本文将介绍一些新型共价弹头以及它们在药物设计中的巧妙应用。  N-酰基-N-烷基磺酰胺类共价弹头 配体导向（Ligand-directed）化学是一种基于亲和力驱动的化学反应策略，由Itaru Hamachi教授提出，最初作为生物正交蛋白质标记技术的替代方案，用于配体脱离的化学生物学探针设计，由于其高效的反应动力学和独特的反应机制，在共价药物设计中得到应用。从2009年至今已发现了五种基于该策略的共价弹头，最新一代为2018年报道的N-酰基-N-烷基磺酰胺（NASA）和2023年改良的N-酰基-N-芳基磺酰胺（ArNASA）。NASA为赖氨酸靶向共价弹头，当赖氨酸ε-氨基亲核进攻缺电子的羰基碳后，发生电子转移，原有的酰胺键断裂，赖氨酸氨基与NASA的羰基形成新的酰胺键，这使得NASA氨基端的基团脱离，而羰基端的基团共价连接到蛋白质上（Fig.1）。以该弹头亲核取代反应的特性，可以进行如下分子设计：利用非共价配体进行定位，随后对氨基酸残基进行共价修饰，最后配体脱离。这种定位-共价-脱离的药物分子设计策略可以实现特定氨基酸残基的长时间标记，同时减少配体本身对靶标功能的影响。 Figure 1 Evolution of ligand-directed (LD) chemistry. DOI: 10.1021/jacs.8b11747 二价降解剂设计 2024年，Yu Chen等报道了一种基于NASA的多特异性分子，他们将90kDa热休克蛋白（HSP90）配体连接在NASA的氨基端（脱离端），目标蛋白（POI）配体连接在NASA的羰基端（共价结合端），从而实现HSP90蛋白的特异性标记，即共价反应使HSP90变为一个稳定的、能特异性识别并结合POI的降解子，而配体的脱离又减少了对HSP90功能的影响。理论上，靶标蛋白被降解后又会重新释放出其配体和降解子，进入下一轮结合与降解。通过该分子标记血小板中的HSP90，构建工程化的降解血小板（DePLTs），这些降解血小板会主动靶向伤口区域并激活。根据预标记HSP90的POI配体类型及其转运机制，激活后的DePLTs可通过泛素-蛋白酶体系统或溶酶体途径，在靶细胞内介导目标蛋白降解。其中，被包裹在血小板微粒中的HSP90利用泛素-蛋白酶体系统降解细胞内POI，而释放的游离HSP90则将细胞外POI导向溶酶体降解。在乳腺癌术后小鼠模型中，携带对应POI配体的DePLTs成功降解了细胞内溴结构域蛋白4（BRD4）和细胞外程序性细胞死亡配体1（PD-L1），从而有效抑制了癌症复发或转移（Fig. 2）。 Figure 2 Schematic illustration of platelet-based protein degraders with covalently labeled HSP90 realizing TPD for intracellular or extracellular targets in vivo. DOI: 10.1038/s41587-024-02494-8 2025年的另一项研究中，Rentang Huang等利用NASA的高选择性、快速反应性和生物相容性，将Z-DNA结合蛋白1（ZBP1）适配体和VHL配体通过NASA相连，NASA与ZBP1表面的亲核氨基酸残基发生亲核取代反应，将其打上“降解标签”，在缺乏ZBP1高亲和力小分子配体的情况下实现了其共价识别和高效降解，克服了传统PROTAC技术中非共价稳定性带来的挑战。通过共价PROTACs直接降解ZBP1为体内炎症性病毒感染提供了有效治疗手段（Fig. 3）。 Figure 3 Schematic of C-PROTAC design and its impact on ZBP1 signaling during viral infection. DOI: 10.1002/anie.202423524 翻译后修饰仿生调控剂设计NASA除了可以被用作二价降解剂的设计，也可以用来设计单价分子，实现翻译后修饰的仿生调控。赖氨酸酰化是广泛存在且结构多样的翻译后修饰，极大地扩展了人类蛋白质组的功能多样性。因此，靶向赖氨酸残基的酰化已成为调控蛋白质功能的仿生策略。传统的细胞内靶向赖氨酸酰化的策略往往依赖基因干预、内源性酰化机制的激活或非特异性酰化试剂。Elizabeth M. Ryan等开发了一种靶向赖氨酸酰化探针/调控剂：在POI配体的赖氨酸朝向区引入NASA弹头，NASA的羰基端为乙酰基、丁酰基等酰化基团。在分子动力学尺度，配体首先结合POI口袋，NASA从而接近待修饰的赖氨酸残基，与其发生亲核取代反应，最终，赖氨酸被特异性修饰预设的酰化基团，配体脱离口袋。这种方式避免了传统酰化方式对细胞内其他分子机器的调动，将酰化过程对环境的干扰大大降低，同时，精准酰化特定氨基酸残基，减少脱靶修饰。作者鉴定出选择性作用于旁系同源物的化学探针，可对干扰素刺激的抗病毒RNA结合蛋白中保守的赖氨酸进行乙酰化，从而生成具有阻断RNA相互作用的全新蛋白质构型，并进一步证实，通过靶向调控视黄醇代谢关键酶的乙酰化修饰，可诱导蛋白质形成具有构象变化的异构体，从而引发功能获得性表型（Fig. 4）。 Figure 4 Strategies for targeted protein acylation and versatile chemical tools for post-translational lysine modifications in live cells. DOI: 10.1021/jacs.4c09073 可触发迈克尔受体共价弹头 除了亲核取代，通过迈克尔加成反应也可以实现“触发-释放”的化学反应。Jiaming Zhuang等提出了一种能同时响应硫醇和胺类等化学/生物活性强信号的化学开关。该硫醇/胺触发型化学开关基于带有β位优良离去基团的可触发迈克尔受体（TMAc）。受体通过“触发-释放”过程实现动态调节：硫醇/胺的加入会触发离去基团的级联释放，形成活性较低的受体。新生成的TMAc可通过二次亲核触发的“触发-逆向”过程，逆转释放原始硫醇/胺（Fig. 5）。 Figure 5 Chemical switch for bonding and debonding using Triggerable Michael Acceptors (TMAc). DOI: 10.1039/c9sc05841a 磷酸化靶向嵌合体设计 在基于事件驱动的多特异性分子研发浪潮中，由于蛋白质磷酸化是动态细胞过程（如信号传递、相变）中快速传递信息的核心机制，磷酸化靶向嵌合体（PHICS）和去磷酸化靶向嵌合体（PhosTAC）备受瞩目，其原理是利用小分子物理拉近激酶/磷酸酶和POI，实现POI的磷酸化/去磷酸化。大多数PHICS/ PhosTAC的效应器配体（激酶配体）采用非抑制性变构结合剂，防止配体结合的同时抑制效应器的激酶活性，然而相较于抑制剂，激动剂、别构分子开发更加困难，一些激酶缺乏合适的配体用来设计嵌合体。在一些研究中，使用基因编辑技术，给效应器连上FKBP-Tag，利用Tag配体，间接拉近效应器和POI，这种设计可以有效探索POI磷酸化/去磷酸化表型，却难以继续进行药物设计与优化。那么，能否利用效应器抑制剂开发事件驱动的多特异性分子呢？Rajaiah Pergu等给出了答案，他们将布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂通过甲基丙烯酰胺（一种可触发的迈克尔受体）与BRD4配体相连，当BTK抑制剂将分子定位到BTK口袋附近后，口袋附近的半胱氨酸巯基与迈克尔受体发生加成-消除反应，BTK抑制剂脱离而BRD4配体共价连接到BTK蛋白上，随后，ATP结合并催化BTK的激酶功能，使被募集的BRD4磷酸化。这种PHICS被验证在伊布替尼耐药细胞系中展现出积极活性（Fig. 6）。 Figure 6 Schematic representation of BTK tagging via inhibitor-directed addition−elimination,  ternary complex formation, and phosphorylation of BRD4. DOI: 10.1021/acscentsci.3c00200 思考与展望 随着药物研发的不断深入与学科交融的持续推进，新型化学技术在药物设计中的应用将可预见地持续增多，如何利用这些有机化学、化学生物学中的新技术进行分子设计是一个值得长期探讨的问题。新型共价技术在药物设计中的应用是一个很好的例子，我们讨论了这些机制独特的共价弹头如何在二价降解剂、翻译后修饰仿生调控剂以及事件驱动的多特异性分子中发挥作用，包括但不限于对1. 怎样对缺乏高亲和力小分子配体靶标进行高效降解；2. 怎样在不干扰靶标活性情况下实现特定氨基酸的精准修饰；3. 怎样在缺少效应器非抑制性配体的情况下设计事件驱动的多特异性分子这些问题的回答。未来，随着化学空间的拓展和有机合成技术的提升，将会有更多精妙的药物分子设计，解决长期困扰我们的临床问题。 参考资料： 1. Tsukiji S, Miyagawa M, Takaoka Y, Tamura T, Hamachi I. Ligand-directed tosyl chemistry for protein labeling in vivo. Nat Chem Biol. 2009;5(5):341-343. 2. Fujishima SH, Yasui R, Miki T, Ojida A, Hamachi I. Ligand-directed acyl imidazole chemistry for labeling of membrane-bound proteins on live cells. J Am Chem Soc. 2012;134(9):3961-3964.. 3. Takaoka Y, Nishikawa Y, Hashimoto Y, Sasaki K, Hamachi I. Ligand-directed dibromophenyl benzoate chemistry for rapid and selective acylation of intracellular natural proteins. Chem Sci. 2015;6(5):3217-3224..  4. Tamura T, Ueda T, Goto T, et al. Rapid labelling and covalent inhibition of intracellular native proteins using ligand-directed N-acyl-N-alkyl sulfonamide. Nat Commun. 2018;9(1):1870. 5. Kawano M, Murakawa S, Higashiguchi K, Matsuda K, Tamura T, Hamachi I. Lysine-Reactive N-Acyl-N-aryl Sulfonamide Warheads: Improved Reaction Properties and Application in the Covalent Inhibition of an Ibrutinib-Resistant BTK Mutant. J Am Chem Soc. 2023;145(48):26202-26212. 6. Tamura T, Hamachi I. Chemistry for Covalent Modification of Endogenous/Native Proteins: From Test Tubes to Complex Biological Systems. J Am Chem Soc. 2019;141(7):2782-2799. 7. Chen Y, Pal S, Li W, Liu F, Yuan S, Hu Q. Engineered platelets as targeted protein degraders and application to breast cancer models. Nat Biotechnol. 2025;43(11):1800-1812.  二、用于药物设计的共价弹头(covalentwarheads) (一) （原创 一位高手 AI-CADD药智引擎） 以可逆或不可逆方式与酶/受体残基发生共价作用的药物反应性官能团被称为 "弹头"。与非共价药物相比，共价药物具有更高的选择性、更长的停留时间和更强的药效等优势，因此近来逐渐成为人们关注的焦点。 什么是共价药物 研究人员一直在寻求非共价的抑制剂。因为人们认为含有高活性基团的共价抑制剂会增加毒性，因此不鼓励在药物设计中使用它们，所以基本都是偶然发现共价抑制剂。 共价药物由两部分组成：非共价骨架和弹头，前者与靶点形成最初的结合相互作用并提供选择性亲和力，后者通过共价键的形成进一步增强结合力。弹头是以可逆或不可逆方式与酶/受体残基发生共价相互作用的活性官能团。可根据目标对弹头和非共价骨架的特征进行微调，以达到最大抑制作用，同时将毒性降至最低。因此，共价抑制剂的发现方法已从偶然发现到合理设计。 共价化合物的设计过程首先选择靶点，然后选择适当的共价弹头，将其安装在与靶点结合亲和力高的非共价支架上。这些抑制剂被称为 "靶向共价抑制剂"（TCIs）。与标准的非共价药物相比，这些经过合理设计的 TCIs 具有显著优势，因此有几种 TCIs 已经上市或正在进行试验（图 1）。 图1 共价抑制剂具有药效更强的优势，因为它们能够长时间阻断酶/受体靶点。由于共价药物与靶点形成不可解离的复合物，它们不会与底物竞争，因此底物积累无效。这有可能延长药物的治疗寿命，使治疗方案更有效、更持久。 共价抑制剂作用过程中的酶活性受再合成率（resynthesis rate）控制；如果再合成率低，就不需要高浓度药物，这就大大减少了毒性问题。鉴于共价药物的长效性质，与非共价药物相比，共价药物也更符合患者的需求，因为其剂量和用药频率可以减少。 解离常数 Ki 表示非共价配体的结合亲和力。Ki 可通过靶标-抑制剂复合物形成反应的正向速率常数 k1 与反向速率常数 k-1 之比来确定（图 2a）。在共价配体中，初始结合步骤之后会有第二个共价键形成步骤，该步骤比初始步骤慢，并形成更紧密的靶标-抑制剂复合物（图 2b,c）。该步骤的正向和反向速率常数分别用 k2 和 k-2 表示。 图2 在不可逆共价配体中，复合物无法解离。因此，反向速率常数 k-2 等于或接近于零，k2 可称为 kinact（图 2c）。有些配体会与非目标生物亲核物发生非特异性共价反应。在这种情况下，不会观察到可逆的结合步骤，抑制剂只需一步就能与非靶标结合（图 2d）。Ki 表示非共价骨架的结合亲和力，而 kinact/Ki 比值则表示共价弹头的结合力。与希望 Ki 越低越好的道理一样，Kinact/Ki 越大越有效。 共价药物发现有两种主要策略：配体先行策略和亲电体先行策略。两种策略都从确定合适的目标残基开始，即可溶解（最好在蛋白表面）、保守性差、靠近药物口袋的残基。配体先行策略是通过合理设计或筛选开发出具有高结合亲和力的可逆配体。最后阶段是在可逆配体的结构中插入一个弹头，使弹头靠近目标残基，从而促进共价键的形成。在亲电优先策略中，首先要筛选确定能与目标残基结合的共价片段。 WHdb、CovPDB 和 CovalentInDB 等数据库的出现将进一步简化共价药物的发现。这些数据库包含有关靶残基、反应机理、共价复合物及其蛋白质数据库（PDB）ID 等数据。图 3 显示了三个数据库中针对每个残基的弹头数量。大多数弹头都以半胱氨酸、丝氨酸和赖氨酸为靶标；然而，蛋白质组的可药用性已显著扩大，21 个氨基酸中有 16 个都是共价靶标。CovalentInDB 还提供了针对辅助因子的共价弹头的详细信息，这可能被证明是一种新的靶向策略。 图3 影响共价药物设计的因素 弹头的反应活性 亲电性负责弹头的反应性，决定了弹头的结合特性。应仔细选择弹头，使其只与特定残基发生正确的构象反应，而不与其他细胞亲核物发生反应。反应性较高的弹头容易脱靶，并可能代谢为无活性或有毒的产物。因此，这类弹头应由反应性较低但足够的弹头取代。虽然传统的药物化学方法可以优化 Ki，但也可以通过调节弹头的反应活性来优化 kinact/Ki 的比率。亲核体攻击后，活化基团通过诱导和共轭效应稳定 intermediate anion 的能力，以及离去基团通过诱导效应稳定 intermediate anion 的能力，在很大程度上决定了弹头的反应活性。 弹头的亲电性越高，并不总能保证其与目标亲核残基发生反应。亲核残基的反应性取决于多种因素，包括立体效应、诱导效应、共轭效应、pKa 和残基的环境。目标残基的不同旋转异构体也会影响抑制剂的共价结合。当目标蛋白质具有多个反应性亲核残基时，必须调整亲电体的反应性，使其只与目标残基发生反应。这还能确保更快地参与反应，并防止脱靶反应和代谢失活。 亲核物与具有 polarizability 和 hardness 的亲电物发生有效反应，可以控制共价反应。Hard 亲电体通常是 polarizability 低的化合物，因为电子密度被限制在中心附近。相比之下，soft 亲电体的 polarizability 较高，因为电子不规则地分布。当两个反应分子的 hardness 不同时，势能差就会增大，从而导致反应活性降低。 大多数亲核体因含有氧或硝基而性质 Hard，只有硫醇等含硫基团的亲核体容易被氧化，性质 soft。因此，Hard 亲电体最好与 DNA 碱基或蛋白质残基（如赖氨酸或丝氨酸）中的 Hard 亲核体发生反应。相比之下，soft 亲电体则优先与较 soft 的半胱氨酸亲核体发生反应。图 4根据 Ábrányi-Balogh 等人的研究描述了一些生物亲核物的软硬程度，并排列了常见弹头化学物质的反应活性。 图 4. 共价药物设计中生物亲核体和亲电弹头反应性的重要性。(a) 生物亲核体的硬度/软度水平（按硬度递增）(b) 常见亲电化学物质对半胱氨酸残基的反应性（按递增顺序） 弹头的可逆性 弹头的可逆性取决于共价反应的可逆性。与靶标发生可逆共价作用并以快于蛋白质周转率（turnover rate）的速度解离的弹头称为可逆弹头。这就降低了不良脱靶风险。弹头的可逆性有助于控制共价配体的停留时间，因此在需要药物快速脱离靶标时非常有用。 相比之下，不可逆弹头会形成不可解离的复合物，这种复合物会在蛋白质的整个生命周期或比再合成速率更长的时间内保持不变。这类弹头更有可能与目标细胞外的亲核物（如谷胱甘肽）或无关蛋白质中的高活性亲核物形成不可解离的复合物。共价反应的可逆性主要取决于所形成的复合物的稳定性。 图5.用于靶向半胱氨酸残基的代表性弹头 弹头攻击角度 除了弹头的内在特性外，弹头攻击目标残基的方向/角度也是影响共价抑制成败的一个重要方面。要形成共价键，弹头必须位于目标亲核物的轨道上。 黄芩素（baicalein）和杨梅素（myricetin）等黄酮类化合物与冠状病毒 3C 样蛋白酶（3CLpro）的结合模式差异说明了这一现象（图6 a,b）。虽然这两种分子相似的结构，但黄芩素是一种非共价抑制剂，而杨梅素则起共价作用。黄芩苷与残基有更多的疏水和氢键相互作用，其中焦棓酸与 Leu141、Gly143 和 Ser144 形成多个氢键（图 6a）。与此相反，在杨梅素中，焦棓酸起着弹头的作用，与 Cys145 结合（图 6b）。因此，焦棓酸相对于 Cys145 的取向对于共价键的形成至关重要。 图 6. 黄芩素和杨梅素与（SARS-CoV-2）3CL 蛋白酶的不同结合模式 扭曲弹头的攻击角度也已成为表皮生长因子受体靶点对共价抑制剂的一种抗性机制。Callegari 等人发现，L718Q 突变通过阻止丙烯酰胺与 Cys797 残基之间的共价反应，对第三代表皮生长因子受体抑制剂（如 osimertinib）产生耐药性。突变的 Gln718 残基与丙烯酰胺形成 H 键相互作用，使osimertinib稳定在一种构象中，从而使弹头远离其靶点（图 7）。 图7. osimertinib与野生型和突变型表皮生长因子受体（EGFR）（T790M/L718Q）靶点的结合（在野生型蛋白中，配体碳原子为绿色；在突变体蛋白中，配体碳原子为青色）。在突变蛋白中，丙烯酰胺弹头通过 H 键（虚线）与 Gln718 相互作用，因此远离 Cys797 最近开发的 JAK3 选择性共价抑制剂的研究表明，目标亲核体的旋转异构体会影响其与弹头的反应。初步研究显示，1（图 8a）与 JAK3 Cys909 残基的相互作用方式不同寻常。虽然所采用的旋转异构体与之前开发的抑制剂中观察到的不同，但两种异构体之间的能垒很低（∼7.2 kcal/mol）。这表明这两种异构体都有可能出现在口袋中。然而，1 的结合并不理想；因此，对支架进行了修改，减小了环的尺寸，并加入了一个原子的连接体，以优化弹头的定位。新分子 2（图 8b）添加的氨基茚满改变了弹头的位置，从而有利于在低能状态下与目标物形成共价键，且无空间位阻。此外，还额外形成了氢键。正如这些示例所示，弹头必须与亲核分子的方向一致，才能确保共价作用的成功。 图 8. Janus 激酶 3 (JAK3) 共价抑制剂与靶位点的结合 选择性和毒性 共价抑制剂比非共价抑制剂更受青睐的主要原因是选择性。毒性也取决于选择性。共价配体的选择性和毒性主要受三个方面的影响：弹头的亲电性、靶残基的亲核性以及非共价支架结合相互作用的数量和质量。 就弹头的亲电性而言，高活性亲电物的选择性较低，因为它们也容易攻击细胞亲核物而非目标物。这可能会导致有毒产物的形成，从而引发免疫反应。即使可以通过避免使用高活性亲电物来缩小选择性范围，特异性反应也是有可能发生的。因此，反应活性较低的弹头更受青睐，因为只有在与目标发生最初的非共价结合步骤后，才能与目标亲核体发生反应。控制立体构型和电子密度也有助于调节反应活性，从而降低毒性。 影响选择性的另一个重要因素是目标亲核性。如前所述，目标亲核体的反应性是立体、电子、共轭、感应效应及其环境。目标物的 pKa 表示其失去质子的倾向，并表明目标蛋白质中去质子化和质子化形式的相对稳定性。一般来说，pKa 值较低的亲核物对亲电弹头的反应性更强，因为去质子化形式普遍存在，可以快速、方便地与弹头发生反应。 与靶点的非共价相互作用也会赋予抑制剂选择性。为实现高选择性，非共价支架的 Ki 值应足够高，以便选择性地与其靶点结合并保持较长的停留时间。要做到这一点，可以通过修改非共价支架的设计使弹头的方向更接近靶标，而不是提高弹头本身的反应活性，因为后者可能会产生有害影响。 有几种弹头依赖于靶位点相邻酸性或碱性残基的激活。例如，在蛋白质中，组氨酸残基可能表现为碱基或酸性，组氨酸的这些不同作用使弹头具有选择性，因为它们依赖于目标质子化或去质子化。此外，调节配体非共价部分的药代动力学 (PK) 可以确保药物到达选定的靶器官。另一种方法是开发能在靶点特异性激活的原药。 停留时间 停留时间是指共价配体与目标物保持结合的时间长度。如前所述，不可逆配体会形成不可解离的复合物，并在蛋白质的整个生命周期或比再合成速率更长的时间内保持不变。停留时间越长，药理作用时间越长，药效也就越高。此外，研究表明，如果能保证较长的停留时间，共价配体就能阻断靶点，而不受靶点抗药性突变的影响。 如果认识到毒性与靶点抑制有关，则应调节停留时间，不可逆抑制并非最佳选择。此外，在酶再生速度较快的情况下，延长停留时间超过再生速度会导致更大的毒性。 三、用于药物设计的共价弹头(covalentwarheads)(二)以及如何通过计算模拟判断共价弹头的反应性 （原创 一位高手 AI-CADD药智引擎） 弹头分类 最常用的弹头包括丙烯酰胺类、氯乙酰胺类和腈类，这些物质因其安全性和可调反应性而被纳入许多共价药物中。一些论文全面讨论了早期发现的弹头（J. Med. Chem. 2019, 62, 12, 5673–5724；J. Med. Chem. 2022, 65, 1, 58–83；Biochemistry 2019, 58, 52, 5234–5244），下面搬运了文献中报道的弹头以及70多种较新的弹头及其作用机制。 图1  表1. 具有亲核取代机制的半胱氨酸靶向弹头（弹头为蓝色，残基为红色。TP 表示目标蛋白质；R 表示非共价骨架连接点。） 表 2. 具有亲核加成机制的半胱氨酸靶向弹头 表3. 具有加成-消除机制的半胱氨酸靶向弹头 表 4. 通过氧化作用靶向半胱氨酸的弹头 表 5. 针对其他残基（赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸）的弹头 表 6. 多靶向弹头 表 7. 光活性弹头 表 8. 新颖弹头 有关新型弹头详细的化学机制、反应活性、选择性等特性请见参考文献！（参考文献1） 如何通过计算模拟判断共价弹头的反应性 Richard等人总结了共价弹头的反应性预测（参考文献2），如上图所示，论文中概述的所有方法通常都能很好地预测与苯基环直接相连的弹头。Hammett 参数的计算速度最快，因此是估算添加取代基对反应性影响的最合适方法。对于连接到饱和环上的丙烯酰胺，不能使用Hammett参数，pKa 计算方法是速度最快、性能合理的方法。对于所研究的大多数示例，加成能量的 QM 计算性能相当不错，其优点是与参数无关，因此可以预期在化学空间的不同区域也同样表现出色。这种方法的明显局限性在于，计算成本会随着基函数数量的增加而呈指数增长。这一限制可以通过使用更精细化合物的较小模型来克服，这些模型可以捕捉到足够多的化学特征，从而对弹头反应性进行合理估计。pka的预测网站https://playground.calculators.cxn.io/。LUMO能量直接反应化合物电子亲和力，表征化合物受亲核体攻击的敏感性，LUMO能量值越高，得电子的可能性越大，计算LUMO能量仅需使用高斯进行几何优化和单点能计算即可得到，速度较快，并且本人对某系列共价化合物进行了LUMO计算，结果是LUMO分布在共价弹头上，且与活性线性相关。hammett常数越大表示取代基的吸电子能力越强。最早的定义就是把待测取代基接到安息香酸对位或者间位上，然后实验测量其在水溶液中的pKa值就是hammett常数。hammett取代基常数预测的方法：先把计算得到的量（比如电荷、能量)与己有的hammett常数关联，然后预测其他的hammett取代基常数的取代基。加成能的QM计算是通过计算过渡态结构和前体分子之间的自由能差来近似所研究的共轭反应的活化自由能（与实验得到的结果相关性最好（参考文献3）），但计算涉及反应过渡态以及需要计算溶剂条件下的吉布斯自由能，比较耗时。个人认为pKa和QM LUMO是最快且较准确的计算方法。 1.The expanding repertoire of covalent warheads for drug discovery, Drug Discovery Today, 2023, 28（12）, 103799 2.Expanding the Armory: Predicting and Tuning Covalent Warhead Reactivity，J. Chem. Inf. Model. 2017, 57, 12, 3124–3137 3.Chemical and Computational Methods for the Characterization of Covalent Reactive Groups for the Prospective Design of Irreversible Inhibitors，J. Med. Chem. 2014, 57, 23, 10072–10079 四、扩展共价弹头探索——大数据研究靶向半胱氨酸可逆和不可逆共价激酶抑制剂 （原创 安玉龙 早研早聊） 侃侃而言 刚看到一篇ChemRxiv预刊的文章，主要对靶向激酶半胱氨酸残基的可逆和不可逆共价抑制剂弹头种类的扩展性探索进行了总结。 作者汇总了来自12,381个独特共价激酶抑制剂（CKI)的共16,961个数据点，其中涵盖146种激酶。重点研究了数据集包含的“扩展弹头”（弹头+邻近片段)。总共涵盖30种常见弹头、以及1,344种独特的邻近片段，并对其进行性质和模式进行了分析。 这篇文章从大数据统计的角度分析，对于共价激酶抑制剂的设计、合成、和优化具有非常重要的参考价值。末尾阅读原文提供原文献地址，内容开源可获得。 Part 1、激酶抑制剂 截至作者撰稿为止，FDA批准激酶靶向的小分子药物有80种，仅仅靶向24种激酶，相比于人类疾病相关的激酶组，这是相当小的一部分比例。这也意味着，基于激酶的抑制剂、探针、和药物具有巨大的开发空间。 根据激酶抑制剂与靶点的结合模式，可以将其分为4种类型： 类型I：结合在ATP结合位点的抑制剂，具有类ATP的活性（DFG-in）激酶构象。这类抑制剂，一般具有一个腺嘌呤类似物的核心片段，能够与铰链区域形成2-3个氢键相互作用。 类型II:结合在无活性(DFG-out)激酶构象的ATP结合位点，同时还延申到附近变构口袋的抑制剂。 类型III:结合在邻近ATP结合口袋的变构口袋位置的变构抑制剂。 类型IV：结合在远离ATP结合口袋的变构口袋位置的边沟抑制剂，如分布在C端叶上的口袋。 为了获得良好的选择性和效力，还可以开发其他类型，如大环抑制剂和共价抑制剂。大环抑制剂顾名思义是指具有一个大环(>12元环)的抑制剂。共价抑制剂是那些与非催化性亲核残基以共价反应结合到结合袋中的化合物。 由于非催化亲核残基保存性差，共价相互作用提供了更多的机会来提高整个激酶组的选择性。到目前为止，FDA已经批准了10种共价激酶药物，分别针对表皮生长因子受体(EGFR)、布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)、成纤维细胞生长因子受体2 (FGFR2)和Janus激酶3 (JAK3)，如图1所示。 图 1、 10种FDA批准的共价激酶抑制剂以及他们的主要靶点和上市时间 数10种常用的亲电试剂已被应用于发现CKIs，其中半胱氨酸、酪氨酸和苏氨酸作为亲核试剂，丙烯酰胺为常用的亲电弹头。通过亲电弹头的可操作修饰，改进亲和力元件进行共价抑制剂的设计，非常具有性价比。但是，就目前已知的信息，可用做亲电弹头的亲电试剂数量有限。 为了增加共价弹头的多样性，作者提出扩展亲电弹头，把与参与作用的亲电弹头的邻近片段的信息也收集起来进行分析，分析弹头与邻近片段的组合，以此来获得更多有价值的“扩展弹头”的信息。 从文章数据起来的数据来看，这非常具有可操作性！ 作者收集了已经发表报道的数以万计的CKIs，聚焦在半胱氨酸靶向的CKIs研究反向，鉴于其具有广泛的应用和多样性的生物活性数据。 Part 2、CKI数据集 图 2、CKI在人类激酶组进化树上的分布 每个点代表一个激酶已经揭示的CKIs，其中蓝色表示报道的、紫色表示已经批准上市；点的大小代表着已揭示的CKI的数量，正相关 调研共获得了16,961个安装有亲电弹头的生物活性数据点，包括12,381个独特的CKIs，作用于208个在ATP结合位点附近具有可用的半胱氨酸的激酶中的146个激酶。 如上图图2显示了这146种激酶在人类激酶组系统进化树中的分布，涵盖了所有蛋白激酶组(TK、TKL、STE、CK1、AGC、CAMK、CMGC、以及其它)。 在这146个激酶中，有95个只有个位数的CKIs报道，而排列前9个激酶的CKIs分布都超过了500个，如下图图3所示。 图 3、 CKIs数排列前9的激酶 而已经批准上的10种CKIs（图1）竟然还都分布在这Top 9激酶之中，是其中的4种激酶靶标，按报道CKIs数排列如下：BTK (3款上市)、EGFR （5款上市）、FGFR2 (1款上市)、和JAK3 (1款上市)。 这表明CKIs的发现非常具有挑战性。尽管成千上万的CKIs已经发表或获得专利，但最终进入临床的很少。这种分布，也意味着随着CKIs的积累，更有希望靶向更多激酶的共价药物可能出现。 Part 3、共价抑制剂弹头 图 4、 靶向Cys的可逆和不可逆共价抑制剂弹头 作者调研、筛选了30种常见的Cys靶向共价弹头，如上图图4，其中包含不可逆性共价弹头22种、可逆性共价弹头8种。 如下图图5，显示了不同的共价弹头和相应报道的CKIs数量的分布。 图 5、 共价弹头对应编号涉及的CKIs数量分布 可以看出，不可逆CKIs的研究远大于可逆CKIs。丙烯酰胺及其衍生物占CKIs的绝大多数，占据10,870枚(弹头1)和2,780枚(弹头2)CKIs。 第二主要类型是炔酰胺及其类似物，分布占有976(弹头4)、和45(弹头5)个CKIs。 在可逆共价弹头23-30中，醛和α-氰基丙烯酰胺类分别以770个(弹头26)和716个(弹头23-25)CKIs占主导地位。 图 6、 共价弹头在人类激酶组中的分布（深蓝色球） 如上图图6所示，分析不同共价弹头在人类激酶组中的分布。 13,650个含丙烯酰胺的CKIs靶向132个激酶，图6a。 含炔酰胺的CKIs靶向43种激酶，图6b。 含醛的CKIs靶向41种激酶，图6c。 含α-氰基丙烯酰胺的CKIs靶向21种激酶，图6d。 这些针对多种激酶的弹头显示出各自专有的属性，并为在新的CKIs开发中重新利用这些弹头提供了设计策略。 值得注意的是，丙烯酰胺、氰丙烯酰胺和炔酰胺在结构上是相似的，因为它们都含有一个共同的酰胺结构特征，并且在激酶共价药物设计中已被证明是可调控的。 然而，醛类在药物发现中并不常用，因为它们可能与脱靶酶发生意想不到的反应，从而产生有毒的副产物。 因此，对于激酶靶向共价药物设计，必须对用作可逆共价的醛进行分析，因为它具有高反应性、代谢和化学不稳定性。 Part 4、扩展弹头 通过修饰靶向分子来提高化合物的选择性和亲和力是药物设计中的一个关键过程。而对于CKI的设计，重要的是要有一个亲电弹头来瞄准理想的亲核试剂。 由于亲电试剂的选择有限，修饰共价弹头的邻近片段是一个获得扩展弹头多样性的不错的选择。 因此，作者系统地分析了弹头及其相邻碎片(统称为扩展弹头)，构建了相邻片段库(AFL)，共包含17,309个相邻片段和1344个独特片段，将支架与相应的弹头部分连接起来。 通过分层聚类分析，将相邻的片段聚类为7个簇(C1-C7，图7)。每个簇都有不同的特征，但7个簇中有6个是环基片段，如芳香环基片段(C1、C5、C6和C7)、杂环基片段(C2和C5)或环烷基片段(C4)。相邻片段的多样性为潜在CKIs的设计提供了广阔的构象空间！ 图 7、 分层次聚类分析 a. 7簇不同的片段以不同的颜色显示 b. 7簇邻近片段中每一种结构类型展示 作者计算了CKI数据集中1,344个不同相邻片段的出现频率。 其中，近900个分子片段只出现在1 ~ 2个CKIs中。 相反，在490多个CKIs中，有6个常用的相邻片段，即:苯胺(T1)、哌啶(T2)、6氮杂螺[3.4]辛烷(T3)、喹唑啉(T4)、吡咯烷(T5)、哌嗪(T6)，如图8a。 图 8、  a. 1,344个独特邻近片段中最频繁的6种 b. 6种最频繁的独特邻近片段覆盖的激酶数量分布 c. 6种最频繁的独特邻近片段安装的共价弹头数量分布 这些邻近片段都发生在多个CKI中，靶向不同的激酶(图8b)、或配备不同的共价弹头(图8c)，具有很强的可塑性(可适应不同的CKI弹头或支架)。 例如T2哌啶， 10种弹头的相邻片段，发生在24个激酶中。 芳香环基T4作为3种弹头的相邻片段，存在于61种激酶中，对不同激酶的不同CKIs表现出较强的弹性。 当然，各种相邻片段产生不同的化学性质，如不同的结构大小，或基于芳香环，为CKI设计提供了丰富的库，具有多种功能。 Part 5、用于可逆CKIs的扩展弹头 对共价抑制剂的一个主要的担忧，是担心其脱靶共价修饰引起的意想不到的毒性。 可逆CKIs (RCKIs)提供长停留时间的共价结合，但避免永久性的蛋白质修饰，在一定程度上规避了这种担忧。 到目前为止，RCKIs已经通过调节10种激酶的弹头亲核试剂的反应性来建立，如EGFR、BTK、JAK3和核糖体S6激酶2 (RSK2)。 相应地，在RCKI设计中已经成功地使用了多弹头，例如弹头23-30 (图4)。 基于作者收集的CKI数据库，最大数量的RCKIs是安装有醛的CKIs，共770个。在其中，包含有121种不同的邻近片段，如图9a。 图 9、 基于醛的可逆CKIs邻近片段分布 排列前3个分别是四氢萘啶片段(A1)、甲氧基酚片段(A2)、和β-萘酚片段(A3)。都有芳香环。扩展的弹头瞄准1~2个激酶，因此具有很强的特异性(图9b)。 目前，其中一种RCKIs Roblitinib (FGF401)正在进行ii期临床试验，该药物靶向成纤维细胞生长因子受体4 (FGFR4)，治疗肝细胞癌和其他FGFR4和klotho β (KLB)阳性表达的实体肿瘤。 装备氰基丙烯酰胺的CKI是第二大类，有716个RCKIs。 作者提取了98个不同的相邻片段，前3个分别是哌啶(Cy1)、2-甲基吡咯烷(Cy2)、和3-氨基哌啶(Cy3)，如图10a。 与醛基RCKIs相比，哌啶与基于氰基丙烯酰胺组合的RCKIs可靶向10种激酶。排列1-3的相邻片段均为杂环基(图9b)，与乙醛弹头芳香环基相邻片段不同。 图 10、 在氰基丙烯酰胺装备的RCKIs中的邻近片段 写在最后 算法的内容这这里就不多写了，（我也搞不懂），作者在SI中已公开，开源内容，感兴趣的可以通过阅读原文找到报道内容。 大数据提供的信息在共价化合物的发现和优化中或许可以提供很大的帮助。 参考文献：10.26434/chemrxiv-2024-b0bbz end 本公众号声明： 1、如您转载本公众号原创内容必须注明出处。 2、本公众号转载的内容是出于传递更多信息之目的，若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请作者或发布单位与我们联系，我们将及时进行修改或删除处理。 3、本公众号文中部分图片来源于网络，版权归原作者所有，如果侵犯到您的权益，请联系我们删除。 4、本公众号发布的所有内容，并不意味着本公众号赞同其观点或证实其描述。其原创性以及文中陈述文字和内容未经本公众号证实，对本文全部或者部分内容的真实性、完整性、及时性我们不作任何保证或承诺，请浏览者仅作参考，并请自行核实。