Emicizumab

New Delhi: Executing the much-awaited overhaul of the Goods and Services Tax (GST) regime, the GST Council has brought a major relief for patients by reducing the indirect tax on medicines to 5 per cent, along with exempting as many as 36 life-saving medicines and other critical drugs. The GST council—a statutory body highest decision making body on indirect taxes led by the Union Finance Ministry at its 56th meeting in the national capital has recommended to reduce the GST on all drugs and medicines (finished formulations) from 12 per cent to 5 per cent under the new two-tier tax structure of 5 and 18 per cent slabs to be effective from September 22. Additionally the body has also recommended to exempt GST on 33 lifesaving drugs and on 3 other medicines used for treatment of cancer, rare diseases and other severe chronic diseases. Speaking at a press briefing after the council 10.5-hour long marathon meet, Finance Minister Nirmala Sitharaman said, “all recommendations have been cleared with zero reservations and have corrected various inverted duty structure problems, classification related issues and that this rationalization exercise will bring predictability and stability of GST.” “These reforms have been carried out with a focus on the common man, and after a rigorous evaluation process in most sectors including healthcare, the rates have come down drastically, she added. Previously, medicines in India were taxed at 5 per cent for life-saving and essential drugs, and at 12 per cent for others but following the announcement all medicines will attract a standard duty of 5 per cent with extensions for several medicines specified at the end of this article. Welcoming the move, Sudarshan Jain, Secretary General, IPA said, “the decision to exempt life-saving and cancer medicines from GST, is a step that will bring direct relief to patients and their families. and, the reduction in GST on a wide range of medicines from 12 per cent to 5 per cent will further help to ease the overall treatment burden and make essential therapies more affordable.” Meanwhile, for companies, the clarity on a 5 per cent slab and exemptions removes long-standing ambiguity, enabling transparent pricing and better market planning. The move will expand access in semi-urban and rural markets, ease litigation, and free up resources for innovation, said Manoj Mishra, Partner and Tax Controversy Management Leader, Grant Thornton Bharat LLP. Notably, on the issue of inverted duty involving APIs and key starting materials—which are currently taxed at 18 per cent against 12 or 5 per cent for finished formulations—further clarity is awaited from the industry. ETPharma earlier reported that, in a letter to the Finance Minister, the national chemist body, the All India Organisation of Chemists and Druggists (AIOCD) had urged, “to bring all medicines including vitamins, probiotics, nutritional, food supplements under the 5 per cent GST slab. The rate rationalization comes days after Prime Minister Narendra Modi had pitched for introducing next-gen reforms across sectors to “increase ease of living for the common man and strengthen the economy.” However, this rationalization brings a revenue shortfall challenge for governments with states likely to bear a greater share of the burden, as they receive over 40 percent of the inter-state inflows in addition to their own SGST collections. Responding to a media query at the media briefing Arvind Shrivastava, Revenue Secretary said that, based on the consumption of FY23-24 the ministry has estimated that the net revenue implication of this proposal will be around Rs 48,000 crore. “However the exercise will trigger buoyancy effects and will have a positive impact on consumer and compliance. And therefore we believe this proposal will be fiscally sustainable both for centers and the states,” Shrivastava noted. ' S.no. Drug Indication Brand name and (Company) 1 Onasemnogene abeparvovec SMA (One-time gene therapy) Zolgensma (Novartis) 2 Asciminib Blood Cancer Scemblix (Novartis) 3 Mepolizumab Asthma Nucala (GSK) 4 Pegylated Liposomal Irinotecan Pancreatic Cancer Onivyde (Ipsen) 5 Daratumumab Cancer Darzalex (J&J subsidiary) 6 Daratumumab subcutaneous Cancer Darzalex Faspro (J&J subsidiary) 7 Teclistamab Blood Cancer Tecvayli (J&J subsidiary) 8 Amivantamab Lung Cancer Rybrevant (J&J subsidiary) 9 Alectinib Lung Cancer Alecensa (Roche) 10 Risdiplam SMA Evrysdi (Roche) 11 Obinutuzumab Blood Cancer Gazyva (Roche) 12 Polatuzumab vedotin Blood Cancer Polivy (Roche) 13 Entrectinib Cancer Rozlytrek (Roche) 14 Atezolizumab Cancer (PD-L1 immunotherapy) Tecentriq (Roche) 15 Spesolimab GPP flares Spevigo (Boehringer Ingelheim) 16 Velaglucerase Alpha Gaucher Vpriv (Takeda) 17 Agalsidase Alfa Fabry disease Replagal (Takeda) 18 Rurioctocog Alpha Pegol Hemophilia Adynovate (Takeda) 19 Idursulphatase Type II Mucopolysaccharidosis Elaprase (Takeda) 20 Alglucosidase Alfa Pompe Myozyme (Sanofi) 21 Laronidase Type I Mucopolysaccharidosis Aldurazyme (Sanofi) 22 Olipudase Alfa ASMD Xenpozyme (Sanofi) 23 Tepotinib Lung Cancer Tepmetko (Maerck KGaA) 24 Avelumab Cancer (PDL-1 immunotherapy) Bavencio (Pfizer) 25 Emicizumab Hemophilia Hemlibra (Roche subsidiary) 26 Belumosudil cGVHD - 27 Miglustat Gaucher Zavesca (J&J subsidiary) 28 Velmanase Alfa Alpha-mannosidosis - 29 Alirocumab Cholesterol lowering drug (LDL-C) Praluent (Sanofi) 30 Evolocumab Cholesterol lowering drug (LDL-C) Repatha (Amgen) 31 Cystamine Bitartrate Cystagon - 32 CI-Inhibitor injection Hereditary Angioedema - 33 Inclisiran Cholesterol lowering drug (LDL-C) Leqvio (Novartis) 34 Agalsidase Beta Fabry disease Fabrazyme (Sanofi) 35 Imiglucerase Gaucher Cerezyme (Sanofi) 36 Eptacog alfa activated recombinant coagulation factor VIIa Hemophilia NovoSeven Note: Above is the list of medicines exempted from GST tax recommended by the 56th GST Council Meet/ Source: PIB By Abhijeet Singh ,

摘要：双特异性抗体（bsAbs）作为下一代治疗性抗体，凭借其 “同时靶向两个抗原” 的独特能力，在癌症免疫治疗、自身免疫疾病、罕见病等领域展现出不可替代的优势。截至 2024 年，全球已有超过 20 种 bsAbs 获批上市，另有数百种处于临床研发阶段。然而，bsAbs 的复杂分子结构（如多条肽链组装需求）使其生产面临三大核心挑战：链错配导致的杂质生成、易聚集的稳定性问题、大规模生产的工艺适配性。本文从工程表达平台、纯化工艺、生物分析方法、可开发性评估四个维度，系统解析 bsAbs 生产的关键技术进展 —— 包括单载体/四载体系统解决链错配、CHO 细胞与无细胞系统的表达选择、混合模式层析（MMC）突破纯化瓶颈、可开发性指数实现早期风险筛选等；同时展望未来技术方向，为 bsAbs 从实验室成果转化为临床药物提供全面参考。 1.引言：双特异性抗体 —— 开启靶向治疗的 “双引擎” 时代 传统单克隆抗体（mAbs）仅能结合一个抗原，在复杂疾病（如肿瘤、自身免疫病）的治疗中常受限于 “单一靶点无法覆盖多通路” 的瓶颈。而双特异性抗体（bispecific antibodies, bsAbs） 通过设计可同时结合两个不同抗原或表位，实现了 “1+1>2” 的治疗效果：例如，靶向 CD3（T 细胞表面分子）和 CD20（B 细胞肿瘤抗原）的 bsAbs，可精准 “牵引” T 细胞攻击肿瘤细胞；治疗 A 型血友病的 Emicizumab，则通过同时结合凝血因子 IXa 和 X，替代缺失的凝血因子 VIII 功能。 截至目前，科研人员已开发出超过 50 种重组 bsAbs 格式，主要分为两大类： IgG 样 bsAbs：保留 Fc 段，具有较长的体内半衰期和抗体依赖的细胞毒性（ADCC），如 Symmetric 型（如 Emicizumab）、Asymmetric 型（如 Glofitamab）； 非 IgG 样 bsAbs：无 Fc 段，分子量小、组织穿透性强，但半衰期短，如片段化的 Blinatumomab（BiTE 格式）、Tebentafusp（双亲和重定向格式）。 尽管 bsAbs 的治疗潜力巨大，其生产过程却远比 mAbs 复杂。核心难点在于： 正确组装难题：多条不同肽链（如两条重链、两条轻链）易发生 “链错配”，生成同源二聚体、半抗体等无活性杂质，部分 Asymmetric bsAbs 的错配杂质占比甚至高达 90%； 稳定性挑战：额外的结构域（如 scFv）或突变（如为促进异二聚化的 KIH 突变）会增加分子柔性，导致聚集风险上升—— 例如某 IgG-scFv 型 bsAbs 在 5mg/mL 浓度下，聚集率可升至 50%； 下游纯化复杂：bsAbs 与杂质（如宿主细胞蛋白 HCPs、病毒、错配片段）的理化性质差异小，传统 mAbs 的纯化工艺无法直接套用。 解决这些挑战，需要从 “上游工程表达” 到 “下游纯化分析” 的全流程技术创新 —— 这正是本文接下来要重点解析的内容。2. 上游工程与表达平台：为 bsAbs “搭好骨架” bsAbs 的正确表达是生产的第一步，核心在于通过载体设计和表达系统优化，实现 “高产量、低错配、高活性” 的目标。近年来，载体系统的进化和表达平台的多样化，为这一目标提供了关键解决方案。2.1 载体系统：从 “多质粒混乱” 到 “单载体精准” 早期 bsAbs 表达依赖 “多质粒系统”—— 即每条肽链（重链 1、重链 2、轻链 1、轻链 2）分别由不同质粒编码，通过共转染进入宿主细胞。但这种方式存在两大问题：一是质粒转染效率差异导致链表达不平衡，加剧错配；二是操作复杂，批次重复性差。 为解决这些问题，载体系统经历了三次关键进化：（1）单载体系统：一条质粒编码所有链 单载体系统将 bsAbs 的所有链（如两条重链、两条轻链）整合到一个质粒中，通过内部核糖体进入位点（IRES） 或2A 肽实现多链协同表达。例如，利用 2A 肽的 “自剪切” 特性，可使不同链从同一转录本中高效释放，确保表达比例平衡 。这种系统大幅降低了转染 variability，使正确组装率提升 30% 以上。（2）双载体 / 四载体系统：应对复杂格式 对于结构更复杂的 Asymmetric bsAbs（如需要 4 条不同链的分子），单载体系统的插入片段过长，易导致质粒不稳定。此时，四载体系统（每条链单独一个质粒）结合转座子技术（如 Sleeping Beauty、Leap-In Transposase®）成为优选：转座子可将外源基因高效、稳定地整合到宿主基因组中，不仅提升表达产量（CHO 细胞中滴定度可达 5-10g/L），还能通过调控各质粒比例，减少错配。 例如，某团队利用 Sleeping Beauty 转座子系统，将 Asymmetric bsAbs 的 4 条链分别导入 CHO 细胞，通过优化质粒比例（重链 1: 重链 2: 轻链 1: 轻链 2=1:1:2:2），使正确异二聚体比例从 35% 提升至 82%。（3）附加体载体：无需整合，灵活表达 附加体载体（如基于 EB 病毒 EBNA1 蛋白的载体）无需整合到宿主基因组，即可在分裂细胞中稳定留存，尤其适合需要精准翻译后修饰（如特定糖基化）的 bsAbs。例如，利用附加体载体表达的抗 HER2 bsAbs，其糖基化均一性比整合型载体高 20%，且无基因组插入导致的随机突变风险。 图 1 展示了 bsAbs 从格式设计到载体选择的全流程方向，清晰呈现了不同格式与载体系统的适配关系。 [图 1 双特异性抗体（bsAbs）发现与生产的主要方向](此处为图表位置，原文图 1 内容：A. bsAbs 格式分类（对称型、不对称型、片段型）；B. 载体系统进化（多质粒→单载体→四载体 + 转座子）；C. 可开发性评估关键参数；D. 上下游工艺优化方向)2.2 表达系统：从原核到无细胞，各有优劣 选择合适的表达系统，是决定 bsAbs 活性、产量和成本的关键。目前主流系统分为四类：原核系统（大肠杆菌）、哺乳动物细胞（CHO、HEK293）、无细胞系统，各有适用场景。（1）大肠杆菌：早期研发的 “快速选择” 大肠杆菌（E. coli）是最早用于 bsAbs 表达的系统，优势在于生长快、成本低、操作简单—— 从接种到收获仅需 24-48 小时，适合早期候选分子的快速筛选。例如，已获批的 Tebentafusp（治疗转移性葡萄膜黑色素瘤）即通过 E.coli 表达 。 但大肠杆菌的局限性也很明显： 无法进行糖基化修饰：而糖基化对 IgG 样 bsAbs 的半衰期、ADCC 活性至关重要； 易形成包涵体：复杂 bsAbs（如多结构域分子）在 E. coli 中易折叠错误，形成不溶性包涵体，需后续复性，过程繁琐且回收率低（通常 <30%）。 因此，大肠杆菌目前主要用于非 IgG 样 bsAbs（如 scFv、BiTE）的表达，或早期研发阶段的快速验证。（2）CHO 细胞：工业生产的 “黄金标准” 中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是目前 bsAbs 工业生产的首选系统，全球已获批的 bsAbs 中，80% 以上由 CHO 细胞生产（表 1）。其核心优势在于： 人源化翻译后修饰：能实现与人类抗体一致的糖基化（如唾液酸化、岩藻糖基化），避免免疫原性； 高产量与 scalability：通过培养基优化（如化学限定培养基）和培养工艺（如灌注培养），CHO 细胞的 bsAbs 滴定度可达到 10-15g/L，且能轻松放大至 2000L 生物反应器； 遗传稳定性强：经过数十年改造，CHO 细胞（如 CHO-K1、CHO-DG44）具有良好的遗传稳定性，批次间差异小。 例如，治疗多发性骨髓瘤的 Elranatamab、治疗滤泡性淋巴瘤的 Mosunetuzumab，均通过 CHO 细胞实现大规模生产，且产品纯度可达 99% 以上。（3）HEK293 细胞：瞬转表达的 “灵活补充” 人胚胎肾（HEK293）细胞的优势在于瞬转效率高—— 通过钙 phosphate 或脂质体转染，2-3 周即可获得 bsAbs 表达，适合早期候选分子的快速评估。此外，HEK293 细胞的糖基化更接近人类天然抗体，对于部分对糖基化敏感的 bsAbs（如靶向中枢神经系统的分子），其活性比 CHO 细胞表达的更高。 但 HEK293 细胞的缺点是长期培养稳定性差，且滴定度低于 CHO 细胞（通常 3-5g/L），因此主要用于临床前研究或小批量生产，难以满足商业化大规模需求。（4）无细胞系统：新型快速生产平台 无细胞表达系统（如 ALiCE®、XpressCF+™）是近年来的新兴技术，其原理是利用细胞提取物（如烟草 BY-2 细胞、E. coli 裂解液），在体外实现 bsAbs 的转录和翻译，无需活细胞培养。 这类系统的核心优势是快速、灵活： 速度快：从基因到功能 bsAbs 仅需 24-48 小时，比 CHO 细胞快 10 倍以上； 无细胞毒性限制：可表达对活细胞有毒性的 bsAbs（如某些细胞毒性融合蛋白）； 易修饰：可直接加入非天然氨基酸，实现 bsAbs 的定点标记（如荧光标记、PEG 修饰）。 例如，LenioBio 公司的 ALiCE® 系统（基于烟草 BY-2 细胞提取物），可在 48 小时内生产出活性良好的 IgG 样 bsAbs，且聚集率 <5%；Sutro Biopharma 的 XpressCF+™系统（E. coli 提取物），已用于多个 ADC 类 bsAbs 的早期研发。 表 1 汇总了截至 2024 年 11 月全球已获批的 bsAbs 及其表达系统，清晰展现了不同表达系统的临床应用情况。 表 1 截至 2024 年 11 月已批准的双特异性抗体（bsAbs） 2.3 哺乳动物细胞平台的优化：解决 “链错配” 与 “产量低” 尽管 CHO/HEK293 细胞是主流，但 bsAbs 的多链组装问题仍需针对性优化。近年来，三大技术策略成为解决核心难题的关键：（1）链配对工程：让肽链 “正确牵手” Knob-into-Hole（KIH）技术：在两条重链的 CH3 结构域分别引入 “旋钮”（如 T366W 突变）和 “孔洞”（如 Y407A 突变），通过空间互补促进异二聚化，使正确组装率提升至 90% 以上。例如，CrossMab 技术（KIH 结合轻链交换）可同时解决重链和轻链的错配问题，某抗 HER2/CD3 bsAbs 采用该技术后，错配杂质从 45% 降至 5% 以下； 可控 Fab 臂交换（cFAE）：将两个亲本 mAbs 的 CH3 结构域引入特定突变（如 S354C、T366W），在体外通过还原 - 氧化反应实现 Fab 臂交换，生成 bsAbs。该技术是 DuoBody 平台的核心，已用于 Glofitamab 等多个获批 bsAbs 的生产 。（2）细胞培养优化：提升产量与质量 培养基与培养工艺：采用化学限定培养基（无血清、无动物源成分），并通过 “流加培养”（定期补加葡萄糖、氨基酸）或 “灌注培养”（持续更换培养基）维持细胞高活性 —— 例如，某 CHO 细胞流加培养工艺通过优化谷氨酰胺和半胱氨酸浓度，使 bsAbs 滴定度从 6g/L 提升至 12g/L； 培养条件调控：降低培养温度（如从 37℃降至 30-33℃）可减少细胞凋亡和蛋白降解，某研究显示，温度降低后 bsAbs 的聚集率从 15% 降至 3%；添加 sodium butyrate（丁酸钠）可促进抗体分泌，产量提升 20-30%。（3）细胞系开发平台：高效筛选高产克隆 工业界已开发出多个专用细胞系开发平台，加速 bsAbs 高产克隆的筛选： AbZelectPRO™（Abzena）：结合 CHO-K1 细胞和 2G UNic® 载体技术，10 周内可完成从候选序列到研究细胞库（RCB）的构建，且细胞滴定度可达 8-10g/L； Apollo™X（FUJIFILM）：采用单轮克隆筛选策略，确保 monoclonality（单克隆性）>99%，适合 bsAbs 和 Fc 融合蛋白的大规模生产，某案例中其筛选的 CHO 克隆产量达 15g/L； Beacon®（Brukker）：利用光电子定位技术，将单个细胞置于纳升级 NanoPen® chambers 中，实时监测抗体分泌，可在 1 周内筛选出高产克隆，比传统方法快 5 倍。3. 下游纯化策略：为 bsAbs “去芜存菁” bsAbs 的下游纯化是生产的 “瓶颈环节”—— 由于其杂质（同源二聚体、半抗体、HCPs、病毒等）与目标分子的理化性质（如分子量、电荷、疏水性）高度相似，传统 mAbs 的 “捕获 - 中间纯化 - 精制” 三步法需大幅优化。本节将解析 bsAbs 纯化的核心挑战与解决方案。3.1 bsAbs 纯化的核心挑战 与 mAbs 相比，bsAbbs 的纯化面临三大独特挑战： 杂质多样性：除了 HCPs、DNA、病毒等常规杂质，还存在大量产品相关杂质，如同源二聚体（重链错配）、半抗体（仅一条重链 + 一条轻链）、轻链片段、聚集物等，部分杂质的分子量与目标 bsAbs 差异仅 5-10%； 易聚集特性：bsAbs 的额外结构域（如 scFv）或突变导致分子柔性增加，在纯化过程中（如低 pH 洗脱、高浓度）易发生聚集，影响产品活性和安全性； pH 敏感性：部分 bsAbs 在传统蛋白 A 层析的低 pH 洗脱条件（3.0-3.5）下易降解，需开发温和的洗脱策略。3.2 纯化全流程：从捕获到精制的技术创新 bsAbs 的纯化流程通常包括 “捕获→低pH病毒灭活→中间纯化→精制→病毒过滤→超滤/渗滤” 六个步骤（图 2），每个步骤均有针对性技术突破。（1）捕获阶段：高效富集目标分子 蛋白 A 亲和层析是 IgG 样 bsAbs 捕获的首选技术，其原理是蛋白 A 与抗体 Fc 段的特异性结合，可从细胞培养上清中快速富集目标分子，一步纯化后纯度可达 80-90%。但针对 bsAbs 的特点，需进行以下优化： 工程化蛋白 A 配体：传统蛋白 A 易与 bsAbs 的 VH3 结构域结合，导致错配杂质无法分离。新型配体如 PrismA（Cytiva）通过改造蛋白 A 的 B 结构域，增强对目标 bsAbs 的特异性，某案例中其可将同源二聚体杂质从 20% 降至 5% 以下；MabSelect SuRe LX（Cytiva）的动态结合容量（DBC）比传统蛋白 A 高 30%，适合高滴定度料液的处理； 温和洗脱条件：Purolite Jetted A50 HipH 树脂可在 pH 4.0-5.0 下洗脱 bsAbs，避免低 pH 导致的聚集 —— 某 pH 敏感型 bsAbs 采用该树脂后，回收率从 65% 提升至 90%； 缓冲液优化：添加 CaCl₂（氯化钙）或 L-Arg-HCl（L - 精氨酸盐酸盐）可增强杂质与蛋白 A 的分离，某研究显示，CaCl₂添加后半抗体杂质从 12% 降至 2%；添加 sodium caprylate（辛酸钠）可去除 HCPs，某案例中 HCP 残留从 500ng/mL 降至 50ng/mL。 对于非 IgG 样 bsAbs（无 Fc 段），需采用其他捕获技术： 蛋白 L 层析：蛋白 L 与抗体轻链的 κ 链结合，适合 Fab、scFv 等片段的捕获，如 Capto L（Cytiva）可用于 Blinatumomab 的捕获，纯度可达 85%； IMAC（固定化金属亲和层析）：通过在 bsAbs 上融合 His 标签，与镍 / 钴离子结合实现捕获，某 BiTE 分子经 IMAC 捕获后纯度达 90%，后续结合 SEC（体积排阻层析）可进一步提升至 99%。（2）中间纯化与精制：去除残留杂质 捕获后的 bsAbs 仍含有少量杂质（如 HCPs、聚集物、同源二聚体），需通过中间纯化和精制进一步去除。核心技术包括离子交换层析（IEX）、疏水作用层析（HIC）、混合模式层析（MMC），其中 MMC 是 bsAbs 纯化的 “利器”。（1）离子交换层析（IEX）：基于电荷差异分离 阳离子交换层析（CEX）：适合去除聚集物和半抗体，常用树脂如 Capto SP ImpRes（Cytiva）、ProPac WCX-10（Thermo）。某案例中，CEX 通过线性 pH 梯度（pH 5.0-7.0）洗脱，将 bsAbs 的聚集率从 8% 降至 1%； 阴离子交换层析（AEX）：主要去除 HCPs 和 DNA，常用树脂如 POROS HQ（Thermo）、MonoQ（Cytiva）。在 “流穿模式”（flow-through mode）下，带负电的 HCPs 和 DNA 结合到树脂上，目标 bsAbs 流穿，某案例中 HCP 残留从 100ng/mL 降至 10ng/mL。（2）疏水作用层析（HIC）：基于疏水性差异分离 HIC 通过高盐浓度下蛋白疏水区与树脂的相互作用实现分离，适合去除同源二聚体和聚集物。常用树脂如 Capto Phenyl ImpRes（Cytiva）、TOYOPEARL Butyl 600M（Tosoh）。某研究显示，采用 Capto Phenyl ImpRes 树脂，通过优化硫酸铵浓度，可将同源二聚体杂质从 15% 降至 2%。（3）混合模式层析（MMC）：多作用协同分离 MMC 结合了静电作用、疏水作用、氢键等多种相互作用，分离能力远超单一模式层析，是 bsAbs 精制的 “核心技术”。目前应用最广泛的 MMC 树脂包括： Capto Adhere ImpRes（Cytiva）：配体为 N - 苄基 - N - 甲基乙醇胺，可同时去除 HCPs 和聚集物。某 KIH 型 bsAbs 经该树脂流穿纯化后，HCP 残留降低 35 倍，聚集率从 10% 降至 4%； Capto MMC ImpRes（Cytiva）：配体为 N - 苯甲酰高半胱氨酸，适合去除半抗体和轻链片段。某 WuXiBody 型 bsAbs 经该树脂精制后，半抗体杂质从 8% 降至 1%； 陶瓷羟基磷灰石（CHT，Bio-Rad）：具有钙结合位点（C-sites）和磷酸结合位点（P-sites），可通过调节磷酸盐浓度实现多杂质同时去除。某案例中，CHT 层析一步即可去除聚集物（从 12% 降至 0.5%）、HCPs（从 50ng/mL 降至 5ng/mL）和病毒（log reduction value, LRV>4），纯度达 99%。（3）病毒清除与超滤/渗滤 病毒清除：采用 “低 pH 灭活 + 纳米过滤” 两步法 —— 低 pH（如 pH 3.0-3.5，维持 30-60 分钟）可灭活包膜病毒（如 VSV），纳米过滤（如 0.02μm 滤膜）可去除非包膜病毒（如 parvovirus），某工艺的病毒总 LRV>6，满足 regulatory requirements； 超滤/渗滤（UF/DF）：通过 30kDa 分子量截留膜，实现 bsAbs 的浓缩（如从 1g/L 浓缩至 50-100g/L）和缓冲液交换（如交换至组氨酸 - 盐酸缓冲液），为后续制剂做准备。某案例中，采用切向流过滤技术，bsAbs 的回收率达 95% 以上。 图 2 展示了 bsAbs 的下游纯化全流程，对比了传统工艺与新型 MMC 优化工艺的差异。 [图 2 双特异性抗体（bsAbs）的下游纯化流程](此处为图表位置，原文图 2 内容：A. 传统流程（捕获：蛋白 A 层析→中间纯化：AEX→精制：CEX→病毒过滤→UF/DF）；B. MMC 优化流程（捕获：蛋白 A→中间纯化：MMC→精制：CEX→病毒过滤→UF/DF）；C. 高效 MMC 流程（捕获 + 中间纯化：MMC→精制：CEX→病毒过滤→UF/DF）)3.3 典型杂质的针对性去除方法 bsAbs 的杂质类型多样，需根据杂质特性选择合适的纯化技术。表 2 汇总了主要杂质的去除方法、所用树脂及作用机制。 表 2 双特异性抗体（bsAbs）主要杂质的层析去除方法 4. 生物分析与可开发性评估：为 bsAbs “保驾护航” bsAbs 的质量控制和可开发性评估是确保其临床安全有效的关键 —— 需通过一系列分析技术验证分子的完整性、活性、稳定性，并在早期筛选阶段识别高风险候选分子，避免后期开发失败。4.1 bsAbs 的质量分析技术 bsAbs 的质量分析需覆盖 “结构完整性”“结合活性”“稳定性”“体内特性” 四大维度，核心技术如下：（1）结构完整性分析 变性毛细管电泳（CE-SDS）：通过 SDS 变性处理，分离 bsAbs 的重链、轻链及片段，评估链完整性。例如，某 Asymmetric bsAbs 经 CE-SDS 分析，发现其重链错配率 <5%； 体积排阻色谱（SEC）：检测 bsAbs 的聚集物和片段，常用 SEC-MALS（多角度光散射）联用技术，可同时测定分子量和聚集率。某研究显示，SEC-MALS 可检出 0.1% 的低分子量（LMW）片段； 反相高效液相色谱（RP-HPLC）：基于疏水性差异分离同源二聚体和目标 bsAbs，某案例中 RP-HPLC 的分辨率达 0.8，可有效区分 pI 差异仅 0.1 的两种同源二聚体； 质谱（MS）：解析 bsAbs 的分子量、翻译后修饰（PTMs）和序列完整性。通过 deglycosylation（去糖基化，如 PNGase F 酶解）可减少糖基异质性，某 MS 分析显示，去糖基化后 bsAbs 的分子量测定误差 <0.1%；此外，MS 可检测氧化（如甲硫氨酸氧化）、脱酰胺（如天冬酰胺脱酰胺）等 PTMs，某研究发现，某 bsAbs 的 Asn31 脱酰胺率 > 10% 时，结合活性下降 50%。（2）结合活性分析 桥联 ELISA：通过包被两个不同抗原，检测 bsAbs 同时结合两个抗原的能力，是筛选 bsAbs 的核心方法。某桥联 ELISA 可检出 0.1ng/mL 的活性 bsAbs，比传统单抗原 ELISA 灵敏 10 倍； 表面等离子体共振（SPR）：测定 bsAbs 与两个抗原的结合动力学（ka、kd、KD），评估结合亲和力。例如，SPR 分析显示，某抗 PD-1/CTLA-4 bsAbs 与 PD-1 的 KD 为 1nM，与 CTLA-4 的 KD 为 2nM，表明其双靶点结合能力均衡； 细胞水平活性分析：评估 bsAbs 的生物学功能，如 T 细胞激活实验（检测 IL-2 分泌）、肿瘤细胞杀伤实验（检测 LDH 释放）。某 T 细胞结合 bsAbs 的细胞杀伤实验显示，其 EC50（半数有效浓度）为 0.1nM，比亲本 mAbs 低 10 倍。（3）稳定性分析 差示扫描量热法（DSC）：测定 bsAbs 的 melting temperature（Tm），评估热稳定性。IgG 样 bsAbs 的 Fc 段 Tm 通常为 75-80℃，若 Tm<70℃则需优化 ； 差示扫描荧光法（DSF）：通过荧光染料结合变性蛋白的疏水区域，快速筛选热稳定性，适合高通量分析。某研究用 DSF 筛选 100 个 bsAbs 候选分子，1 周内识别出 20 个 Tm>75℃的高稳定性分子； 加速稳定性实验：在高温（如 40℃）、强光（如 4500lux）、反复冻融（-80℃至室温）条件下，监测 bsAbs 的聚集率和活性变化。某 bsAbs 在 40℃放置 1 个月后，聚集率 <5%，活性保留> 90%，符合临床要求。（4）体内特性分析 血清稳定性：在 37℃下孵育人血清，评估 bsAbs 的降解情况。某研究显示，某非 IgG 样 bsAbs 的血清半衰期 <2 小时，需通过 PEG 修饰延长至 24 小时； 药代动力学（PK）：在小鼠、食蟹猴等动物模型中测定 bsAbs 的血药浓度 - 时间曲线，评估半衰期（t1/2）和清除率（CL）。IgG 样 bsAbs 的 t1/2 通常为 2-3 周，非 IgG 样 bsAbs 需通过白蛋白融合、PEGylation 等技术延长半衰期； 药代动力学 - 药效动力学（PK-PD）模型：预测 bsAbs 的体内疗效，某 PK-PD 模型显示，某抗 CD3/CD20 bsAbs 的血药浓度 > 1μg/mL 时，肿瘤抑制率 > 80%。4.2 bsAbs 的可开发性评估 可开发性评估的核心是 “早期筛选、降低风险”—— 需在候选分子阶段（如临床前）评估其 “可制造性”“稳定性”“安全性”，关键参数和方法如下：（1）关键可开发性参数 聚集性：通过 SEC 和 DSF 评估，聚集率 > 5% 或 Tm<70℃的分子需优化； 疏水性：通过 HIC 或 RP-HPLC 测定保留时间（RT），RT 过长（疏水性过高）易导致非特异性结合和聚集； 电荷异质性：通过等电聚焦（cIEF）或离子交换色谱（IEX）评估，pI 不在 7-9 范围内的分子易吸附到层析树脂，导致纯化损失； 浓度耐受性：通过超滤浓缩至 50-100mg/mL，评估粘度和聚集率，粘度 > 20cP（厘泊）的分子不适合皮下注射。（2）可开发性评估工具 可开发性指数：通过计算分子的疏水相互作用、静电相互作用得分，预测聚集风险。某可开发性指数≥0.8 的 bsAbs，后期开发成功率比 <0.5 的分子高 3 倍； DOTAD 数据库：整合了 1000 + 治疗性抗体的序列、可开发性数据（如 Tm、聚集率、pI），为计算工具提供训练数据，帮助研究者快速评估候选分子的可开发性； in silico 预测工具：通过机器学习预测 bsAbs 的热稳定性、聚集性。某工具基于 1000 个抗体的序列和 Tm 数据，预测准确率达 85%。（3）可开发性评估案例 T 细胞结合 bsAbs：这类分子常含 scFv 结构域，易聚集。某研究发现，scFv 的 VH-VL 界面引入二硫键后，聚集率从 20% 降至 3%，可开发性显著提升； 非 IgG 样 bsAbs：半衰期短是主要问题。某 BiTE 分子通过融合白蛋白结合结构域，半衰期从 2 小时延长至 36 小时，且无免疫原性； 高疏水性 bsAbs：某抗 EGFR/HER2 bsAbs 因疏水性过高，纯化回收率 <50%，通过突变 CDR 区的疏水残基（如 Phe→Ser），疏水性降低 30%，回收率提升至 85%。5. 结论与未来展望 双特异性抗体（bsAbs）作为下一代治疗性抗体，已在癌症、罕见病等领域展现出巨大临床价值，但仍面临 “生产工艺复杂”“下游纯化瓶颈”“可开发性评估不足” 三大挑战。近年来，通过载体系统进化（如四载体 + 转座子）、表达平台优化（如 CHO 细胞流加培养）、纯化技术创新（如 MMC、CHT）、分析方法升级（如 SEC-MALS、SPR），bsAbs 的生产效率和质量已大幅提升 —— 例如，某 Asymmetric bsAbs 的正确组装率从 35% 提升至 90%，纯化回收率从 60% 提升至 90%，为其临床转化奠定了基础。 未来，bsAbs 生产技术将向三大方向发展： 下游工艺创新：目前上游表达工艺（如 CHO 细胞滴定度）已达 15g/L，而下游纯化的收率仍 < 80%，需开发新型层析树脂（如靶向杂质的亲和树脂）和连续纯化技术（如多柱逆流溶剂梯度纯化），进一步提升效率； AI 辅助设计：利用 AI 预测 bsAbs 的链配对效率、聚集风险、纯化工艺参数，例如，某 AI 模型可基于序列预测 bsAbs 的 Tm 和聚集率，筛选效率比传统方法快 10 倍； 临床应用扩展：除了癌症和自身免疫病，bsAbs 在神经退行性疾病（如阿尔茨海默病，通过血脑屏障转运）、 感染性疾病（如 HIV，同时靶向病毒和免疫细胞）的应用将成为研究热点，需开发相应的生产工艺（如低免疫原性修饰）。 随着技术的持续突破，bsAbs 将从 “小众疗法” 走向 “主流疗法”，为更多未满足医疗需求的患者提供精准、高效的治疗选择。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。