Biotin

外泌体是细胞分泌的纳米级囊泡，它们在细胞间通讯中扮演着关键角色，并参与多种生理和病理过程。这些纳米级别的结构不仅能够携带蛋白质、脂质、以及核酸等生物分子，还能穿越生物屏障，如血脑屏障，为靶向药物递送和基因治疗提供了一个全新的平台。而工程化外泌体技术因能够通过基因或化学手段改善外泌体生物活性、稳定性以及靶向性，在外泌体药物递送及治疗应用中至关重要。其中通过基因工程方式进行内源性工程化外泌体改造是工程化外泌体应用的基石。 近日恩泽康泰工程化外泌体底层技术平台取得重大突破，其研究成果” PlexinA1 (PLXNA1) as a novel scaffold protein for the engineering of extracellular vesicles”登陆外泌体学术顶刊《Journal of Extracellular Vesicles》，代表着恩泽康泰成为全球少有的具有自己工程化外泌体操作系统的企业。下面一起来了解一下这项研究内容： 1. 研究背景 在过去的十年间，基于外泌体的创新疗法因为独有的优势而备受关注。这些优势包括有较低的免疫源性和良好的安全性(Gehrmann et al., 2014; Zhu et al., 2017) 、一定程度的组织选择性(Hoshino et al., 2015)，以及能够实现跨血脑屏障的药物递送等(Chen et al., 2016; Yang et al., 2015)。然而随着研究的不断深入，研究人员逐渐认识到外泌体的成药之路并非一片坦途。 首先，外泌体虽然携带有大量来自母细胞的生物分子，但是当我们聚焦到某个特定生物分子的含量时，就会发现其平均拷贝数之低，到了令人发指的程度。例如，看家基因的mRNA在天然外泌体中，大约每10000个外泌体中才有1个拷贝。而我们所熟知的在外泌体中富集的四跨膜蛋白，在每一个外泌体中也不过4到5个的水平（见表1）。 表1、天然外泌体内含物的平均拷贝数  不仅如此，经静脉注射的外泌体在外周血中的循环时间太短，半衰期通常在30分钟左右(Imai et al., 2015; Parada et al., 2021)。而且生物学分布受限，无论是什么细胞来源的外泌体都显示出以肝脏为主的被动靶向(Morishita et al., 2015; Wiklander et al., 2015)。除此之外，量产工艺不成熟，缺乏有效的表征手段和质量标准都限制了外泌体疗法的发展速度。面对这样棘手的问题，大家是不是也想长叹一声“难办”。 为了克服上述的问题，科研人员进行了一系列的尝试。说到这里就不得不提到一个被寄予厚望技术路径——外泌体的工程化改造。工程化改造是指通过基因或者化学手段，改变外泌体原有的组成，从而使其特定的属性，如生物活性、稳定性以及靶向性等，向有利于应用的方向改善。 工程化改造外泌体 （图片来源：Front Bioeng Biotechnol. 2023 Jan 24;11:1100310.） 2. 科学问题 外泌体的工程化改造可以通过不同的方式来实现。这其中通过与支架蛋白（内源蛋白元件）融合表达的方式，将目的蛋白（protein of interest，POI）定向导入工具细胞所分泌的外泌体中的方法被称为生成前的蛋白质改造（pre-mature protein modification）或内源蛋白质改造（Endogenous protein modification）。因为这种改造是对细胞而非外泌体进行的，因此可以通过构建单克隆细胞株的方式实现稳定大批量的重复制备。此外，根据需要还可以将POI展示在外泌体的胞外或者包裹在囊泡内部。因此这种改造方式是目前使用最为广泛，而且可实现的功能也最为丰富的一类。 目前，常见的外泌体支架蛋白分为三类，分别是四跨膜蛋白（CD63，CD9，CD81）、膜周蛋白（MFGE8），以及I型跨膜蛋白（Lamp2b，PTGFRN）三类(Choi et al., 2022)。然而，现有的这些支架蛋白或多或少都存在着一些不足之处，并不能彻底满足外泌体工程化改造的诸多需求。 例如，四跨膜蛋白的N端和C端均位于胞内，当需要在外泌体的胞外展示POI的时候只能从胞外的loop结构进行融合改造，加大了分子设计和验证的难度；膜周蛋白MFGE8虽然在外泌体上表达量很高，但是它和膜之间的作用力并不强，一旦融合分子量较大的POI后，在外泌体上的含量水平就会迅速降低；Lamp2b作为I型跨膜支架蛋白的主要代表，只适合在N端（即胞外段）融合POI，如果在C端进行融合就会破坏其YXXΦ信号的功能，从而影响融合蛋白向外泌体中分拣的能力。 外泌体工程化改造的实现方式， 图片来源(Choi et al., 2022) 为了让外泌体工程化改造技术能够更好得服务于外泌体创新疗法的开发，筛选新型支架蛋白的努力从未停止。而此前筛选外泌体支架蛋白的标准基本包括以下四个： 1.支架蛋白本身在外泌体上的表达水平越高越好； 2.支架蛋白本身的分子量不能够太大； 3.支架蛋白上需要有适合进行改造的位点； 4.支架蛋白本身不应该具有明显的生物学活性。 然而，能够同时满足上述四个条件的候选分子数极其有限。Zheng及其团队在2023年发表的研究中，将支架蛋白的分子量上限设为130kDa，最终找到的新支架蛋白仍然以四跨膜蛋白超家族为主(Zheng et al., 2023)。因此，在如此苛刻的筛选标准下，想要找到性能更好的支架蛋白，可能性十分渺茫。那么有没有可能通过放宽筛选标准的方法，找到更多更适合用于外泌体工程化改造的支架蛋白呢？为了回答这个问题，我们开展了本项研究。 3. 研究内容 在开展研究前，我们改变了此前的研究策略，将支架蛋白的筛选标准进行了大幅度的精简，从之前的四个减少到以下两个： 1.必须是具有外泌体主动分拣能力的I型跨膜蛋白； 2.在该蛋白的N端以及C端进行截短或融合等改造不会显著影响该蛋白向外泌体主动分拣的能力。 这一标准对于支架蛋白的分子量、在外泌体中的表达水平，以及是否具有生物学活性等不作要求。我们预计基于这两条标准，能够将大量原本不被考虑的蛋白纳入到候选分子列表中。我们之所以在第一个条件中，排除了I型跨膜蛋白之外的其他候选分子，一方面是为了避免候选分子列表过于庞大，另一方面是希望能够找到既能够用于胞外展示也能够用于胞内装载的理想的支架蛋白。 3.1、外泌体蛋白质质谱 首先，我们基于蛋白质质谱对不同蛋白的外泌体分拣能力进行了初步评估。质谱结果显示，丛蛋白A1（PLXNA1）与经典的外泌体富集蛋白（MFGE8、CD81、PTGFRN，以及SDCBP等）类似，其相对丰度在细胞裂解液、初纯外泌体（UC），和高纯外泌体（DGC）之中依次呈现出由低到高的趋势，而与外泌体无关的杂蛋白（CANX，histone）呈现的趋势则刚刚相反。并且该蛋白的在外泌体中相比细胞裂解液中的含量提高的倍数要显著高于几乎所有的经典外泌体富集蛋白，仅次于MFGE8。这一现象也得到了Westernblot的证实。这些结果提示PLXNA1满足我们所提出的第一条标准。 3.2、PLXNA1的截短和融合改造并不影响其外泌体分拣能力 按照之前的筛选标准，PLXNA1作为外泌体支架蛋白存在天然的劣势。首先，其N端和C端各有一个具有生物学功能的结构域。其次，该蛋白的分子量很大约为211kDa。所以全长的PLXNA1并不适合作为外泌体支架蛋白。于是我们开发了一种基于Westernblot和纳米流式的方法，并对PLXNA1的截短体进行了评价结果显示该蛋白的多个截短体都具有较高的外泌体分拣能力，这表明PLXNA1也同样满足我们提出的第二条筛选标准。 3.3、PLXNA1截短体是优秀的外泌体支架蛋白 确定了PLXNA1截短体能够作为外泌体支架蛋白使用后，我们将其与已知的I型跨膜支架蛋白（Lamp2b和PTGFRN）进行了头对头的比较。结果显示PLXNA1相比这两个蛋白表现出了明显的载量优势。 不仅如此，PLXNA1因其在胞外端和胞内端都能够融合表达POI，且不影响外泌体分拣能力，因此可以胜任多种工程化改造的用途。例如，可以用于内源mRNA的装载，以及胞外和/或胞内的蛋白展示等。而且，无论展示在胞外还是胞内，都不影响POI自身的生物学活性。这对于工程化外泌体的设计而言提供了极大的便利。 3.4、基于ALFAtag/NbALFA的通用外泌体 在本研究的最后，我们基于ALFAtag/NbALFA系统构建了一个通用的工程化外泌体。在这种通用的工程化外泌体的表面，我们将NbALFA纳米抗体融合表达在PLXNA1的N端。经过体外孵育，带有ALFAtag标签的重组蛋白能够与之结合从而固定在外泌体的表面。这种标记方法不仅具有很高的标记效率，而是能够在多个条件下长时间稳定保存。甚至可以在外泌体表面标记靶向特定抗原的抗体片段，从而实现对抗原表达阳性细胞的靶向递送。 4. 研究意义 本研究对于外泌体工程化改造技术及其应用有着十分重要的意义，其亮点可以简单总结如下： 1. 提出了一种全新的支架蛋白筛选标准，极大地拓展了候选支架蛋白的选择范围，为后续的研究提供了新的路径； 2. 鉴定了新型的外泌体支架蛋白PLXNA1，该蛋白不仅具有极强的外泌体分拣能力，而且还允许在外泌体的胞外和腔内分别或同时融合表达POI，为外泌体的工程化改造提供了强有力新的选择； 3. 发现了一个有助于蛋白分拣到外泌体中的关键基序，对于工程化外泌体的分子设计提供新的参考； 4. 开发了一种基于ALFAtag/NbALFA的通用外泌体，有望成为工程化外泌体载体或药物开发的重要工具。 点评专家：尹航教授 专家简介：清华大学校学术委员会委员、校科技伦理委员会委员，药学院原副院长，兼任Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (Elsevier)主编、Journal of Extracellular Vesicle (Wiley)责任主编、Cell Chemical Biology (Cell Press)编委、中国细胞外囊泡研究与应用学会顾问、中国生物医药产业链创新与转化联盟常务理事及重大需求专委会主任委员、全国中药标准化技术委员会委员等。尹航教授团队在本领域一流期刊发表研究论文超过150篇；科研成果已申请专利超20项，并有多项成果转化。 尹航教授先后入选国家和中国科协海智计划特聘专家、获得国家自然基金委杰出青年科学基金、北京市卓越青年科学家奖、吴阶平-保罗·杨森医学药学奖、中国药学会科学技术一等奖、教育部自然科学二等奖、美国化学学会大卫·罗伯特森杰出药物化学家奖、美国国家科学基金会杰出青年教授奖、美国癌症研究学会格特魯德·B·埃利恩奖、中美化学及化学生物学教授联合会OKeanos-CAPA资深科学家奖、悉德尼·金梅尔学者奖等奖项。 点评内容： 近几年，无论是国内外的学界还是产业界，对细胞外囊泡（EVs）的关注度一直处于持续上升的态势。关于EVs创新疗法的研究，更是多次刊登在高水平的学术期刊上。这些研究给我们展示了EVs作为一种药物或者药物递送系统，相比现有疗法（modality）的种种优势以及丰富的可能性。但与此同时，我们也在这个过程中认识到了EVs疗法距离取得重大的临床突破，还有一系列的技术瓶颈有待克服。 此次，北京恩泽康泰团队针对EVs工程化改造中的一个关键问题，即支架蛋白筛选和改造的底层逻辑展开了研究，并取得了重要进展。首先，这项研究回答了为何在相当长的一段时间内，可用于EVs工程化改造的新支架蛋白的发掘陷入了低谷。另一方面，他们通过系统性的研究，证明简化原有的筛选标准有助于提高筛选到优质支架蛋白的成功率。在该研究的最后，他们基于新鉴定的支架蛋白（PLXNA1）开展了大量且深入的实验，向我们充分展示了工程化外泌体作为药物载体的应用潜力。 这项研究可以说代表了外泌体工程化技术的发展趋势，对于未来该领域的相关研究有着较大的指导意义。对于中国本土的企业能够凭借自己的努力取得这样的成绩，达到与国际接轨的水平，我也感到非常的高兴。希望我们国内学界和产业界的同行能够携手努力，让中国站在国际细胞外囊泡研究、应用，以及转化的最前沿。 参考文献： [1]Hang Zhao, Zhi Li., et al. (2024). PlexinA1 (PLXNA1) as a novel scaffold protein for the engineering of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles, 13:e70012. [2]Chen, C.C., Liu, L., Ma, F., Wong, C.W., Guo, X.E., Chacko, J.V., Farhoodi, H.P., Zhang, S.X., Zimak, J., Segaliny, A., et al. (2016). Elucidation of Exosome Migration across the Blood-Brain Barrier Model In Vitro. Cell Mol Bioeng 9, 509-529. [3]Chevillet, J.R., Kang, Q., Ruf, I.K., Briggs, H.A., Vojtech, L.N., Hughes, S.M., Cheng, H.H., Arroyo, J.D., Meredith, E.K., Gallichotte, E.N., et al. (2014). Quantitative and stoichiometric analysis of the microRNA content of exosomes. Proc Natl Acad Sci U S A 111, 14888-14893. [4]Choi, H., Yim, H., Park, C., Ahn, S.H., Ahn, Y., Lee, A., Yang, H., and Choi, C. (2022). Targeted Delivery of Exosomes Armed with Anti-Cancer Therapeutics. Membranes (Basel) 12. [5]Gehrmann, U., Naslund, T.I., Hiltbrunner, S., Larssen, P., and Gabrielsson, S. (2014). Harnessing the exosome-induced immune response for cancer immunotherapy. Semin Cancer Biol 28, 58-67. [6]Hoshino, A., Costa-Silva, B., Shen, T.L., Rodrigues, G., Hashimoto, A., Tesic Mark, M., Molina, H., Kohsaka, S., Di Giannatale, A., Ceder, S., et al. (2015). Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature 527, 329-335. [7]Imai, T., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Kato, K., Morishita, M., Yamashita, T., Matsumoto, A., Charoenviriyakul, C., and Takakura, Y. (2015). Macrophage-dependent clearance of systemically administered B16BL6-derived exosomes from the blood circulation in mice. J Extracell Vesicles 4, 26238. [8]Morishita, M., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Sano, K., Kato, K., Yamashita, T., Imai, T., Saji, H., and Takakura, Y. (2015). Quantitative analysis of tissue distribution of the B16BL6-derived exosomes using a streptavidin-lactadherin fusion protein and iodine-125-labeled biotin derivative after intravenous injection in mice. J Pharm Sci 104, 705-713. [9]Parada, N., Romero-Trujillo, A., Georges, N., and Alcayaga-Miranda, F. (2021). Camouflage strategies for therapeutic exosomes evasion from phagocytosis. J Adv Res31, 61-74. [10]Tian, Y., Ma, L., Gong, M., Su, G., Zhu, S., Zhang, W., Wang, S., Li, Z., Chen, C., Li, L., et al.(2018). Protein Profiling and Sizing of Extracellular Vesicles from Colorectal Cancer Patients via Flow Cytometry. ACS Nano 12, 671-680. [11]Wei, Z., Batagov, A.O., Schinelli, S., Wang, J., Wang, Y., El Fatimy, R., Rabinovsky, R., Balaj, L., Chen, C.C., Hochberg, F., et al.(2017). Coding and noncoding landscape of extracellular RNA released by human glioma stem cells. Nat Commun 8, 1145. [12]Wiklander, O.P., Nordin, J.Z., O'Loughlin, A., Gustafsson, Y., Corso, G., Mager, I., Vader, P., Lee, Y., Sork, H., Seow, Y., et al. (2015). Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. J Extracell Vesicles4, 26316. [13]Yang, T., Martin, P., Fogarty, B., Brown, A., Schurman, K., Phipps, R., Yin, V.P., Lockman, P., and Bai, S. (2015). Exosome delivered anticancer drugs across the blood-brain barrier for brain cancer therapy in Danio rerio. Pharm Res 32, 2003-2014. [14]Zheng, W., Radler, J., Sork, H., Niu, Z., Roudi, S., Bost, J.P., Gorgens, A., Zhao, Y., Mamand, D.R., Liang, X., et al. (2023). Identification of scaffold proteins for improved endogenous engineering of extracellular vesicles. Nat Commun 14, 4734. [15]Zhu, X., Badawi, M., Pomeroy, S., Sutaria, D.S., Xie, Z., Baek, A., Jiang, J., Elgamal, O.A., Mo, X., Perle, K., et al. (2017). Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells. J Extracell Vesicles 6, 1324730. 本文仅用于学术分享，转载请注明出处。若有侵权，请联系微信：bioonSir 删除或修改！

引言 细胞内钙离子（Ca2+）信号在生物学中普遍存在，是细胞信号传导的关键元素。现有的荧光传感器和报告基因虽然可以检测到Ca2+浓度升高的激活细胞，但这些方法需要通过植入物向深层组织传递光信号，无法在自由活动的动物中非侵入性地使用。8月5日Nature Methods的研究报道“Rapid, biochemical tagging of cellular activity history in vivo”，介绍了一种新型酶催化方法，通过在体内快速生化标记Ca2+浓度升高的细胞。该方法利用Ca2+激活的split-TurboID（CaST）酶，在外源生物素（biotin）分子的辅助下，在10分钟内标记激活的细胞。酶促信号随着Ca2+浓度和生物素标记时间的增加而增强，表明CaST可以作为总Ca2+活动的时间门控整合器。此外，与需要数小时才能产生信号的转录报告基因不同，CaST的读出可以在活动标记后立即进行。 细胞内离子浓度的动态变化使细胞能够响应和适应其局部环境，最终有助于机体的正常生理功能。例如，神经元作为大脑的基本功能单元，可以被各种外部刺激或药理化合物激活，导致细胞内Ca2+浓度的快速波动。因此，通过细胞内Ca2+水平的变化可以直接衡量复杂神经网络的活动。遗传编码的Ca2+指示剂已经极大地改变了我们在清醒和活动的动物中记录神经活动的能力。然而，荧光传感器的一个主要限制是其读出信号是瞬时的，并且通常需要侵入性的方法才能获得深层脑结构的光学信号。这使得将给定神经元的活动历史与其众多其他细胞特性（例如精确的空间定位、RNA表达或蛋白质表达）相结合变得具有挑战性。 为克服这一问题，先前的研究设计了正交转录报告基因（如FLARE、FLiCRE、Cal-Light）或荧光蛋白（如CaMPARI）以稳定标记在高细胞内Ca2+水平下激活的细胞。然而，这些方法都依赖光敏蛋白质，需要蓝光或紫外光来限制细胞活动标记的时间窗口。这一要求限制了其在深层脑区或无法植入光纤的体区的可扩展性。另一个稳定标记的方法包括基于即刻早期基因（IEG）的转录报告基因（如TRAP2和tetTag），这些方法利用药物注射而非光照来控制活动标记窗口。然而，虽然IEG活动已被证明与多种细胞类型的神经活动相关，但它远不如Ca2+作为通用的读出信号。此外，IEG表达的缓慢起效限制了在特定时间窗口内立即标记和识别激活的神经元的能力。 在该研究中，研究人员设计了一种依赖于Ca2+的酶，通过将外源生物素分子连接到激活的细胞上，来报告活细胞内Ca2+水平的升高。重新设计并重新利用了一种近距离标记酶split-TurboID，以在活细胞内通过外源生物素分子标记蛋白质来报告细胞内Ca2+水平的升高。这种方法在不需要光照的情况下，能够在几分钟内标记细胞，为神经活动记录提供了一种快速、非侵入性的新策略。 细胞内钙离子（Ca2+）作为一种重要的信号分子，几乎参与了所有的细胞信号传导过程。在神经元中，Ca2+浓度的变化与神经活动密切相关，是研究神经网络活动的重要指标。目前，利用荧光传感器和报告基因可以检测Ca2+浓度升高的激活细胞，但这些方法往往需要侵入性操作，例如植入物来向深层组织传递光信号，这使得在自由活动的动物中进行非侵入性检测变得困难。 为了克服这些限制，研究人员设计了一种基于酶催化的生化标记技术，能够快速标记Ca2+浓度升高的细胞。这项技术被称为Ca2+激活的split-TurboID（CaST），通过外源生物素（biotin）分子的辅助，在10分钟内完成标记。这种方法不仅快速，而且能够在不使用光照的情况下实现细胞标记，从而大大提高了其在深层脑区和其他体内组织中的应用潜力。 研究团队首先设计了一种依赖Ca2+的酶，这种酶能够在Ca2+浓度升高时重组并激活，从而标记目标细胞。具体来说，CaST由两部分组成：一部分是与Ca2+结合的钙调蛋白（calmodulin，CaM），另一部分是合成肽M13。这两部分分别连接到split-TurboID的两个不活跃片段上（sTb(N)和sTb(C)）。当细胞内Ca2+浓度升高时，CaM部分会被招募到M13，从而使split-TurboID重新组装并激活。在外源生物素存在的情况下，重组后的split-TurboID会标记自身及周围的蛋白质。 研究人员在HEK293T细胞中表达了不同版本的CaST工具，通过生物素和Ca2+处理细胞，并用Alexa Fluor 647（SA-647）结合的链霉亲和素（streptavidin）染色来检测生物素标记的蛋白质。结果显示，在外源生物素存在下，CaST能够在Ca2+浓度升高时有效地标记目标蛋白质。 为了验证CaST的有效性，研究团队进行了多种实验。他们将CaST的两个片段分别连接到不同的蛋白质上，并通过不同的组合方式表达在HEK293T细胞中。通过生物素和Ca2+的共同处理，研究人员发现其中一种组合（膜结合的CD4-sTb(C)-M13-GFP与胞质中的CaM-V5-sTb(N)）表现出最高的信号背景比（signal-to-background ratio, SBR）。他们进一步优化了转染比例，发现5:2的转染比例（CD4-sTb(C)-M13-GFP(N)）能够获得最佳的标记效果。 通过荧光显微镜和western blot，研究人员验证了CaST在不同Ca2+浓度和刺激时间下的标记效果。结果显示，CaST的标记信号随着Ca2+浓度的增加和刺激时间的延长而增强，表明其具有良好的时间和浓度依赖性。具体实验中，研究人员在HEK293T细胞中表达CaST，并通过生物素和Ca2+共同处理细胞。通过荧光显微镜观察到，在生物素和Ca2+共同存在时，细胞内的生物素标记信号显著增强，而在仅有生物素或Ca2+单独存在时，标记信号较弱或不存在。 CaST的功能和有效性验证（Credit: Nature Methods） 蛋白质结构预测：使用AlphaFold2预测了CaST的两个半部分蛋白质结构。图示展示了两部分在单独状态下（预期无Ca2+存在时）和复合状态下（预期高Ca2+存在时）的结构。两部分蛋白质在Ca2+依赖下可逆地重新组装。预测的生物素结合位点以蓝色显示。 CaST设计：CaST在HEK细胞中的表达设计示意图。包含sTb(C)-M13-GFP的部分通过CD4细胞膜蛋白的跨膜域锚定在膜上，而CaM-V5标签-sTb(N)部分则在胞质中表达。只有在细胞接受生物素处理并表现出升高的细胞内Ca2+时，CaST才会标记蛋白质。 荧光图像：HEK细胞的共聚焦图像，这些细胞同时转染了CaST的两个部分，并在±Ca2+的条件下处理30分钟生物素。细胞被洗涤、固定，并用抗V5和SA-647染色。抗V5信号标记了CaM-sTb(N)部分，而GFP荧光显示了CD4-sTb(C)-M13部分。蛋白质的生物素化通过SA-647染色检测。 Western blot分析：HEK细胞被转染CaST并在±50 µM生物素和±Ca2+（5 mM CaCl2和1 µM ionomycin）条件下处理30分钟。细胞随后用Dulbecco’s磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤，收集全细胞裂解液，并使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SA-HRP）或抗V5/HRP进行Western blot分析。‘N’表示预期的CaM-V5-sTb(N)片段大小，而‘C’表示预期的CD4-sTb(C)-M13-GFP片段大小。 生物素化蛋白质的定量：量化了Western blot实验中的生物素化蛋白质。两次独立的生物重复进行了量化，整个条带下方的75-kDa内源性生物素化条带被纳入量化（总原始强度像素值的总和）。 为了测试CaST的稳定性，研究人员将HEK细胞处理30分钟的Ca2+后洗涤10分钟，再加入生物素进行30分钟的标记。结果显示，洗涤后的细胞没有出现显著的标记信号，表明CaST的重组和激活是可逆的。此外，通过增加Ca2+浓度进行滴定实验，结果显示CaST的标记信号与Ca2+浓度呈线性相关，进一步验证了其高灵敏度和特异性。 研究表明，CaST能够在体外和体内高效地标记Ca2+浓度升高的细胞。在HEK细胞实验中，CaST在生物素和Ca2+共同存在时表现出显著的标记信号，而在仅有生物素或Ca2+单独存在时，标记信号较弱或不存在。这表明CaST能够作为一种Ca2+依赖的标记工具，有效区分不同条件下的细胞活动。 在进一步的实验中，研究人员通过荧光显微镜和西方印迹法验证了CaST在不同Ca2+浓度和刺激时间下的标记效果。结果显示，CaST的标记信号随着Ca2+浓度的增加和刺激时间的延长而增强，表明其具有良好的时间和浓度依赖性。 CaST的性能（Credit: Nature Methods） HEK细胞的荧光显微镜图像：图像展示了转染CaST的HEK细胞在50 µM生物素和±Ca2+（5 mM CaCl2和1 µM ionomycin）条件下处理30分钟的情况。顶部显示SA-647染色的生物素化蛋白质，底部显示CD4-sTb(C)-M13-GFP。 单细胞分析：单细胞分析结果显示了不同GFP表达水平下细胞的SA-647标记与GFP荧光强度的散点图。结果表明，在加生物素和Ca2+条件下，SA-647染色显著增加，而仅有生物素时则没有显著增加。 SA-647/GFP荧光比率的分布：小提琴图展示了不同处理条件下单细胞SA-647/GFP荧光比率的分布。加生物素和Ca2+的条件下，SA-647/GFP比率显著高于其他条件。 CaST-IRES构建设计示意图：展示了双顺反子CaST-IRES构建的设计，用于在HEK细胞中同时表达CaST的两个部分。 CaST-IRES的荧光图像：展示了转染CaST-IRES的HEK细胞在50 µM生物素和±Ca2+条件下处理30分钟的情况。与之前类似，顶部显示SA-647染色的生物素化蛋白质，底部显示CD4-sTb(C)-M13-GFP。 单细胞分析（CaST-IRES）：散点图显示了不同处理条件下，GFP阳性细胞的平均SA-647与平均GFP荧光强度的关系。结果表明，在加生物素和Ca2+条件下，SA-647染色显著增加，而仅有生物素时则没有显著增加。 SA-647/GFP荧光比率的分布（CaST-IRES）：小提琴图展示了不同处理条件下单细胞SA-647/GFP荧光比率的分布。加生物素和Ca2+的条件下，SA-647/GFP比率显著高于其他条件。 CaST非IRES与IRES版本的比较：图表展示了CaST非IRES和IRES版本在不同条件下的SA-647/GFP荧光比率的分布。IRES版本的CaST在加生物素和Ca2+条件下的标记效果显著优于非IRES版本。 ROC曲线分析：ROC曲线分析显示了CaST非IRES和IRES版本区分Ca2+处理和非处理细胞群体的能力。非IRES版本的AUC为0.87，而IRES版本的AUC为0.93，表明IRES版本在区分活化与未活化细胞方面具有更高的精确度。 神经元实验 研究人员将CaST应用于培养的神经元中，验证其在神经细胞中的有效性。他们使用腺相关病毒（AAV）在大鼠海马神经元中表达CaST，并通过钾离子（KCl）刺激神经元，观察Ca2+浓度变化和CaST标记情况。结果显示，CaST能够在KCl刺激后的10分钟内有效标记Ca2+浓度升高的神经元。此外，研究人员还利用CaST检测了不同药理学试剂对神经元Ca2+浓度的影响。例如，多巴胺（dopamine，DA）和2,5-二甲氧基-4-碘苯丙胺（DOI）对神经元Ca2+浓度的调节效果。结果表明，DOI能够显著提高神经元内Ca2+浓度并引起CaST标记，而DA则未能显著影响Ca2+浓度。 CaST在培养的神经元中的性能（Credit: Nature Methods） 神经元中CaST的表达和标记：a部分展示了培养的大鼠海马神经元中表达CaST的荧光显微镜图像。这些神经元被腺相关病毒（AAV）感染，表达CD4-sTb(C)-M13-GFP和CaM-sTb(N)两个部分，并在±生物素和±KCl条件下处理30分钟。图像显示了生物素化蛋白质的SA-647染色，GFP荧光标记了CD4-sTb(C)-M13。 不同处理条件下的SA-647/GFP比率：b部分量化了图a中不同处理条件下的SA-647/GFP荧光比率。结果显示，+生物素 +KCl条件下的比率显著高于其他条件。 10分钟KCl刺激后的CaST标记：c部分展示了神经元在10分钟±生物素和±KCl条件下处理后的荧光显微镜图像。结果显示，在生物素和KCl共同处理下，SA-647标记显著增强。 10分钟标记的SA-647/GFP比率：d部分量化了图c中不同处理条件下的SA-647/GFP荧光比率。结果表明，在10分钟的KCl和生物素共同处理下，SA-647/GFP比率显著增加。 GFP+神经元中的SA-647标记比例：e部分量化了10分钟和30分钟标记实验中，GFP+神经元中SA-647+细胞的比例。结果显示，在生物素和KCl共同处理下，10分钟标记的SA-647+细胞约占GFP+神经元的35%，而30分钟标记的则约占65%。而在仅有生物素处理下，SA-647+细胞比例较低（约10%）。 不同药物处理后的CaST标记：f部分展示了大鼠海马神经元在50 µM生物素和10 µM DA、10 µM DOI或30 mM KCl条件下处理30分钟后的荧光显微镜图像。结果表明，DOI和KCl处理显著增加了SA-647标记，而DA处理未显著影响SA-647标记。 不同药物处理条件下的SA-647/GFP比率：g部分量化了图f中不同药物处理条件下的SA-647/GFP荧光比率。结果显示，KCl和DOI处理显著增加了SA-647/GFP比率，而DA处理未显著影响该比率。 动物实验 研究人员进一步在小鼠模型中验证了CaST的应用。他们在小鼠前额叶皮层（prefrontal cortex，PFC）中表达CaST，并通过迷幻药物（如psilocybin）诱导神经元活动。通过测量小鼠的头部摆动反应（head-twitch response，HTR），研究人员发现，psilocybin能够显著增加PFC神经元的Ca2+浓度，并引起CaST标记。这一结果表明，CaST能够在自由活动的小鼠中，非侵入性地标记和检测神经活动。 CaST在小鼠体内非侵入性标记和检测psilocybin激活的神经元的能力（Credit: Nature Methods） 实验示意图：a部分展示了使用CaST标记psilocybin激活的神经元的实验流程。小鼠注射CaST病毒后，在自由活动状态下进行psilocybin处理，并通过生物素标记激活的神经元。随后进行SA-647染色和头部摆动反应（HTR）的测量。 mPFC区域的SA-647和GFP荧光图像：b部分展示了前额叶皮层（mPFC）区域的荧光显微镜图像，对比了注射生物素+生理盐水和生物素+psilocybin的小鼠。结果显示，psilocybin处理的小鼠mPFC区域的SA-647标记显著增加。 单个神经元的SA-647与GFP荧光强度：c部分量化了b部分中每个GFP+神经元的SA-647与GFP荧光强度。水平虚线表示生物素+生理盐水组中所有SA-647神经元的第90百分位阈值。 FOV的SA-647/GFP比率：d部分量化了c部分中不同视野（FOV）的SA-647/GFP荧光比率。结果显示，psilocybin处理的小鼠比率显著高于生理盐水处理的小鼠。 SA-647+神经元的比例：e部分展示了所有GFP+神经元中SA-647+神经元的比例。结果表明，psilocybin处理组中大约70%的GFP+神经元表现出强SA-647标记，而生理盐水处理组中这一比例较低。 SA-647+神经元与HTR的相关性：f部分展示了SA-647+ mPFC神经元在HTR测量期间的细胞掩膜。具有相同数量HTR的视野来自相同的小鼠，但来自对侧半球的独立CaST注射。 HTR数量与SA-647+神经元数量的关系：g部分量化了f部分数据中每平方毫米SA-647+神经元数量与HTR数量的关系。结果表明，SA-647+神经元数量与HTR数量呈正相关。 HTR数量与SA-647/GFP比率的关系：h部分量化了f部分数据中所有神经元的平均SA-647/GFP比率与HTR数量的关系。结果显示，psilocybin处理组中具有HTR的小鼠的SA-647/GFP比率显著增加。 与c-Fos的对比：i部分展示了psilocybin处理后mPFC区域的CaST GFP、SA-647和c-Fos染色图像。结果显示，psilocybin处理显著增加了SA-647标记，但对c-Fos标记影响较小。 c-Fos+神经元数量：j部分量化了每平方毫米c-Fos+神经元数量。结果显示，psilocybin处理未显著增加mPFC区域的c-Fos标记。 SA-647+神经元数量：k部分量化了每平方毫米SA-647+神经元数量。结果显示，psilocybin处理显著增加了mPFC区域的SA-647标记。 SA-647+/GFP+神经元比例：l部分展示了每平方毫米FOV中SA-647+神经元占GFP+神经元的比例。结果表明，psilocybin处理显著增加了该比例。 CaST技术的出现为细胞活动的非侵入性标记提供了一种新的工具。相比于传统的荧光传感器和转录报告基因，CaST具有标记速度快、非侵入性和高效的特点。这使得它在深层脑区和其他难以光学访问的体内组织中具有广泛的应用前景。 未来，CaST有望被用于研究神经网络活动与行为之间的关系。例如，在研究迷幻药物对神经活动的影响时，CaST可以用来标记和分析药物作用下的神经元活动。此外，CaST还可以与其他空间分子成像技术结合，揭示特定时间窗内激活的神经元的基因表达和蛋白质分布情况，从而为神经科学研究提供更全面的视角。 总之，CaST作为一种快速、非侵入性和高效的细胞活动标记工具，具有广阔的应用前景和重要的研究价值。通过进一步优化和扩展其应用范围，CaST有望在神经科学和其他生物医学领域产生深远的影响。 参考文献 Zhang R, Anguiano M, Aarrestad IK, Lin S, Chandra J, Vadde SS, Olson DE, Kim CK. Rapid, biochemical tagging of cellular activity history in vivo. Nat Methods. 2024 Aug 5. doi: 10.1038/s41592-024-02375-7. Epub ahead of print. PMID: 39103446. https://www.nature.com/articles/s41592-024-02375-7 责编|探索君 排版|探索君 转载请注明来源于【生物探索】 End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell 综述