ESO-T01(EsoBiotec)

免责声明：本文内容来自互联网，如有不慎侵害的您的权益，请告知我们，将尽快删除。 三十余年如一日，质量经得起考验！ 源于1994年毕龙转基因的毕特博生物（bitebo.com），值得您的信赖！ 本文由CDE闫莉萍团队在最新一期的《中国药物评价》中发表，“系统梳理了in vivo CAR-T的技术进展与非临床研究考虑。in vivo CAR-T兼具基因治疗与细胞治疗的双重属性，涉及多种递送载体，类型多样且机制复杂。其非临床研究可遵循基于风险、个案处理的原则，在现有相关技术指导原则框架下，合理设计并开展研究，以获取科学规范的试验数据来支持临床试验和上市批准。”全文摘抄如下：  01 in vivo CAR-T研究进展 in vivo CAR-T源于RNA药物、纳米技术、病毒学和CAR疗法等多个领域的交叉融合。目前，两种in vivo CAR-T技术平台正处于临床转化阶段：一种是基于工程化病毒载体的平台，可实现载荷在基因组中的整合，在需要较高药效以实现临床疗效的适应症中可能具有优势；另一种是基于脂质纳米颗粒（LNP）载体的平台，可实现载荷的瞬时表达，这在安全性要求更高的适应症中可能更具优势。 1.1 工程化病毒载体病毒载体作为in vivo CAR-T的核心技术之一，主要通过工程化慢病毒、γ-逆转录病毒或腺相关病毒载体，实现CAR基因在患者T细胞内的精准递送。早期研究发现，利用靶向CD8的慢病毒载体在小鼠模型中成功生成CAR-T细胞，证实了体内定向T细胞基因转导的可行性。这些工作奠定了病毒载体的核心机制——通过修饰病毒包膜（如尼帕病毒糖蛋白或VSV-G蛋白）实现T细胞特异性靶向，避免非目标细胞摄取，从而提高转导效率和安全性。关键进展包括消除天然受体结合、引入高亲和力结合剂以及优化融合元件，以促进基因组整合和持久CAR表达。 近年来，病毒载体技术得到显著优化，聚焦于提高靶向性、稳定性和可控性。工程化策略包括：采用CD3、CD8或CD4特异性结合策略实现T细胞亚群选择性转导；整合“不要吃我”信号（如CD47）以减少巨噬细胞对载体的消耗；以及开发新型假型化包膜以增强血清稳定性。多家公司已推动病毒载体平台进入临床阶段：Interius BioTherapeutics的INT2104（靶向CD7的慢病毒载体）在非人灵长类动物和人源化小鼠模型中显示出特异性T细胞转导和B细胞耗竭，并于2024年启动I期试验；Umoja Biopharma的VivoVec平台通过共刺激配体（如CD80/CD58）与抗CD3 scFv融合，模拟抗原呈递细胞功能，在非人灵长类动物中实现高达65%的CAR-T细胞生成；EsoBiotec的靶向TCRαβ的慢病毒载体在多发性骨髓瘤患者中诱导快速完全缓解，初步显示了临床疗效。这些进展凸显了病毒载体的高效靶向基因转导特性。 尽管病毒载体研究进展迅速，但仍面临诸多挑战：规模化生产存在巨大的技术难度；整合型载荷可能导致CAR-T细胞过度扩增或持续存在，引发细胞因子释放综合征（CRS）、免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）或迟发性毒性；需长期监测致癌性风险；针对某些病毒成分的免疫原性也可能影响该类产品的应用和重复给药。未来优化方向包括：开发细胞谱系特异性启动子或自杀开关以增强可控性；探索双特异性靶向策略（如CD3/CD8组合）提高精准度；以及结合基因编辑技术（如CRISPR（规律间隔成簇短回文重复序列））实现更安全的基因组整合。 1.2 LNP载体LNP载体通过脂质纳米颗粒递送RNA载荷，实现免疫细胞的瞬时工程化，从而克服传统ex vivo CAR-T在制造复杂性、可扩展性和安全性方面的局限。该平台的核心优势在于其非整合特性，允许通过重复给药精确控制CAR表达水平，避免基因组插入风险，并适用于安全性要求高的适应症，如自身免疫性疾病。近年来，借助COVID-19（新型冠状病毒肺炎）疫情期间mRNA-LNP疫苗的技术积累，LNP载体在脂质设计、靶向策略和载荷优化方面取得显著进展，例如通过可电离脂质的改进降低免疫原性，并利用抗体功能化实现细胞选择性递送，为体内免疫工程提供了高度模块化的工具。 在研究进展方面，基于LNP载体的体内CAR-T细胞工程平台可根据其递送系统的靶向策略分为两大类：一类依赖脂质纳米颗粒（LNP）的天然组织和细胞嗜性，另一类则为靶向修饰的LNP（tLNP），依赖细胞选择性靶向抗体，精确导向T细胞亚群，以增强递送特异性和效率。Myeloid Therapeutics利用髓系细胞嗜性LNP递送CAR mRNA，其候选产品MT-302（靶向TROP2）和MT-303（靶向GPC3）已进入I期临床试验，初步数据显示具有一定抗肿瘤活性及可控的细胞因子释放综合征；Capstan Therapeutics则开发了靶向LNP（tLNP），通过抗CD8抗体实现T细胞特异性工程化，在非人灵长类动物中实现深度B细胞耗竭、初始B细胞重新填充，并计划应用于自身免疫性疾病；Orna Therapeutics创新性地采用环状RNA载荷（抗CD20和抗CD19 CAR），结合免疫嗜性LNP，在啮齿类和非人灵长类动物模型中实现单次给药后持久的B细胞耗竭。这些进展凸显了LNP载体在协同利用多种免疫细胞（如T细胞、髓系细胞、自然杀伤细胞）方面的灵活性，以及通过高通量筛选和人工智能优化脂质组合以提升递送效率的趋势。 LNP载体应用前景广阔，但其临床转化仍面临挑战，包括制剂的免疫原性、急性输注反应风险以及非靶细胞转导可能导致的脱靶毒性等。未来发展方向需聚焦于进一步优化脂质配方以支持重复给药，同时增强组织特异性，并探索载荷多样化（如联合递送免疫调节因子）以提升载体安全性。 02  总体考虑 in vivo CAR-T通过递送遗传物质至体内细胞，在体生成CAR-T细胞，属于基因治疗药物；从药效作用物质和作用机制来看，其通过体内生成的基因修饰细胞发挥治疗作用。因此，in vivo CAR-T兼具基因治疗药物和细胞治疗药物的双重属性。其非临床研究除了需关注基因治疗和细胞治疗的常规属性外，还应特别关注其独特的“体内生成”属性所带来的新挑战。在参考国家药品监督管理局药品审评中心发布的《基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行）》、《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）》、《基因修饰细胞治疗产品非临床研究技术指导原则（试行）》等指导原则的同时，应遵循“基于风险”和“个案处理”的原则，科学合理地设计并开展非临床研究，以探索药物的靶向基因转导药理作用，充分暴露其在靶毒性、脱靶毒性以及与递送载体相关的风险，从而保障受试者安全。 03 非临床研究内容 3.1 动物种属通常，in vivo CAR-T需考虑采用相关动物种属开展非临床研究。选择相关动物种属时，应考虑产品到达靶部位或靶细胞的可行性/易感性、动物靶细胞的生物分布或生物学功能与人的相似性，以及荷载基因及其表达产物或转导产物的生物学功能与人的相似性。通常，此类产品的病毒载体靶向膜蛋白、LNP偶联的靶向抗体以及所荷载的基因可能具有种属特异性。若产品具有高度人特异性，无相关动物种属时，可能需要考虑采用人源化动物和/或采用替代产品开展非临床研究。免疫缺陷小鼠（如NSG， NCG）通过植入人免疫细胞（PBMC）或干细胞（CD34+）建立人源化动物模型，在此类模型中可采用临床拟用样品开展非临床研究，但该模型存在移植物抗宿主病（GvHD）、免疫系统不完整等问题；食蟹猴与人在生理、代谢和免疫系统上具有一定的相似性，具备完整的免疫系统，有助于更全面地评估靶向/脱靶风险和免疫原性/免疫毒性，但在此类模型中需采用替代产品开展试验，不能充分代表临床拟用样品，因而可能无法充分暴露其毒性风险，其毒性耐受剂量不适合作为拟定临床起始剂量的依据。鉴于动物试验开展存在困难，多个在研产品采用了药理、生物分布和毒性研究一体化的设计。 3.2 药理学在研in vivo CAR-T产品均开展了包括体外和体内药理/药效学试验在内的概念验证研究。体外试验一般会围绕基因转导特异性、基因转导效率、CAR的特异选择性、功能活性等展开。例如，Interius BioTherapeutics公司的候选药物INT2104采用靶向CD7的慢病毒载体，旨在递送CAR20转基因（编码抗CD20 CAR构建体），用于治疗B细胞恶性肿瘤。INT2104处理人外周血单个核细胞后，采用数字PCR等技术证实载体可成功转导CD4+和CD8+ T细胞，且转导效率与体外制备的传统CAR-T细胞相当，验证了其递送系统的效率。EsoBiotec/深圳普瑞金联合开发的ESO-T01为基于慢病毒载体的抗BCMA CAR产品，用于治疗多发性骨髓瘤。将ESO-T01处理的免疫细胞与多发性骨髓瘤细胞系共培养后，可见剂量依赖性的肿瘤细胞杀伤作用，并与细胞毒性因子（如颗粒酶B）的释放相关，初步证明了其功能性。Umoja Biopharma的VivoVec系统研究则更进一步，不仅验证了CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，还特别设计了连续再刺激试验，即反复多次将CAR-T细胞与新鲜肿瘤细胞共培养。结果显示，与缺乏共刺激信号的对照组（仅含anti-CD3 scFv）相比，含有CD80/CD58共刺激分子的VivoVec系统所产生的CAR-T细胞能够持续抑制肿瘤生长，表现出更强的持久性。 体内试验则重点关注CAR-T细胞的生成效率、扩增动力学、功能活性、持久性以及安全性指标等。通过检测外周血和组织中CAR表达细胞的百分比及绝对数量，以评估T细胞生成效率；通过监测靶细胞（如B细胞）耗竭程度、肿瘤负荷变化（通过影像学或生物标志物）和细胞因子释放（如IL-6、IFN-γ）来验证功能活性；通过长期观察CAR-T细胞的持续存在与记忆表型形成来考察持久性。尽管人源化小鼠非常适合作为体内CAR递送的概念验证模型，但大型动物模型（如非人灵长类动物，NHP）被证明对临床转化至关重要，非人灵长类动物模型在指导平台、产品和给药方案优化方面发挥了关键作用。复旦大学开发的荷载环状RNA的in vivo CAR产品，分别在BALB/c小鼠（OVA诱导哮喘模型）、BALB/c或C57BL/6小鼠（表达人HER2的MC38-HER2、CT26-HER2等同种移植瘤模型）、MRL/MpJ-Faslpr小鼠（系统性红斑狼疮模型）、17月龄衰老小鼠和食蟹猴中进行了概念验证研究。研究者分别构建了抗人CD19 CAR（circRNA-hCD19-CAR）、抗鼠CD19 CAR（circRNA-mCD19-CAR）和抗HER2 CAR，在小鼠中使用了上述3种CAR，而在食蟹猴中则使用了抗人CD19 CAR。在小鼠中，circRNA-CAR可抑制肿瘤生长，改善哮喘相关指标，并逆转衰老表型；在食蟹猴中，circRNA-CAR可导致B细胞耗竭，并持续约40-50天。Umoja Biopharma开发的VivoVec为表面工程化慢病毒载体平台，其载体系统可表达多结构域融合蛋白（抗CD3 scFv、CD80和CD58），从而实现靶向T细胞的高特异性。VivoVec载体携带抗CD19 CAR在人源化小鼠（NSG MHC I/II KO小鼠植入PBMC）移植瘤模型中可实现肿瘤完全清除以及生存期延长；在食蟹猴中，VivoVec载体采用抗NHP CD3 scFv替代抗人CD3 scFv，保留CD80和CD58的人源胞外结构域（人和NHP序列高度同源），并选择靶向NHP与人类交叉反应表位的抗CD20 CAR。结果显示，VivoVec载体携带抗CD20 CAR在食蟹猴中可生成CAR-T细胞（占循环T细胞的65%），并导致B细胞完全耗竭，持续达76天。 3.3 药代动力学 3.3.1 生物分布in vivo CAR-T的生物分布研究旨在确定载体和转基因细胞在体内的分布模式，包括靶向器官、组织或细胞类型，以及潜在的脱靶分布，这有助于评估其靶向特异性、安全性和有效性。在研产品的生物分布研究形式多样，包括独立开展，以及结合药理学和/或毒理学试验开展等。例如，VivoVec平台首个研发项目UB-VV111编码靶向CD19的CAR，同时携带雷帕霉素激活的细胞因子受体（RACR），研究者开展了一系列生物分布试验。在非人灵长类动物中淋巴结（IN）和静脉注射（IV）给予替代产品，IN给药后，血液中未检测到载体RNA；IV给药后，血液中的载体RNA迅速达到峰值浓度（约在注射后5分钟），2小时后，不足峰值的5%。在表达LDL-R（VivoVec载体潜在结合配体）的组织（肝、肾上腺、肺、肾、结肠）中分离人原代细胞，未见荷载基因转导。在犬中采用与犬T淋巴细胞无靶向结合的受试物进行了IN或IV给药8周生物分布试验，以探索脱靶基因转导。结果显示，IN和IV给药，病毒载体转导仅限于免疫器官的免疫细胞，未观察到其他组织的非特异转导；且8周时任何器官均未观察到可量化的荷载基因转导。在CD34+人源化NSG小鼠13周毒理学试验中整合了生物分布研究，UB-VV111载体基因组整合呈剂量依赖性，且随时间减少，肝脏和脾脏中载体含量最高，转导细胞主要为免疫细胞，包括小鼠巨噬细胞或人T细胞。 3.3.2 脱落尽管目前in vivo CAR-T多使用复制缺陷型病毒，但研究者仍在生物分布等非临床研究中对病毒的脱落进行了检测。例如，在非人源化NSG小鼠静脉（IV）或腹膜内（IP）注射给予UB-VV111后的各时间点，在粪便中均未检测到载体RNA基因组。 3.4 安全性 3.4.1 安全药理学已上市CAR-T产品的主要毒性反应包括免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）。此外，此类产品所采用的载体也可能对重要生理功能（如心血管、呼吸和中枢神经系统）具有非预期影响。因此，可基于产品特点、临床适应症等考虑开展安全药理学研究。例如，Capstan Therapeutics在介绍其靶向LNP（tLNP）平台的安全性时[16,17]，特别强调食蟹猴静脉注射tLNP制剂后，未观察到中枢神经系统症状或癫痫发作。 3.4.2 一般毒理学现有研究显示，in vivo CAR-T的一般毒性反应主要包括：靶向免疫反应放大导致的毒性反应、脱靶免疫反应导致的毒性反应、脱靶基因转导导致的毒性反应，以及递送载体相关的生物安全性、免疫原性/免疫毒性、组织趋向毒性等。in vivo CAR-T可根据产品类型和临床适应症，参考ICH S9、ICH M3、《基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行）》等相关指导原则开展一般毒理学试验。此类产品的体内存续以及药效作用持久，设计试验时需考虑CAR+细胞的药代动力学指标，以充分评价毒性反应持续时间和可逆性。 如前文“相关动物种属”部分所述，此类产品通常需采用人源化动物或替代产品开展一般毒性试验。人源化小鼠和非人灵长类动物各有优缺点，对于此类高风险产品，有研究者通过多项研究对毒性风险进行了评估。若产品采用了全新的病毒载体，需考虑生物安全性，在开发早期可关注国家出台的一系列生物安全法规和政策。如涉及到全新的辅料（如LNP新组分），可考虑参考辅料的相关指导原则对新组分的毒性风险进行研究。 例如，UB-VV111在CD34+人源化NSG小鼠中采用临床拟用样品开展了单次腹腔或静脉给药观察13周的GLP毒理学试验，同时在猴和犬中开展的生物分布研究中，也进行了一定的安全性观察，为毒性风险评估提供了多方证据[25]。Capstan公司开发的负载抗CD19 CAR的tLNP制剂采用食蟹猴开展了安全性研究。由于抗CD19 CAR对食蟹猴B细胞缺乏交叉反应性，选择了抗CD20 CAR作为替代产品（CD8-L289-tLNP-CD20）[16,17]。ESO-T01采用荷瘤（多发性骨髓瘤细胞NCI-H929）人源化（移植人CD34+造血干细胞）小鼠开展了体内研究，该研究为一体化试验设计，整合了药理学（抗肿瘤活性）、药代动力学（CAR-T细胞扩增和分布）和毒理学（细胞因子释放等）评估。 3.4.3 免疫原性和免疫毒性基于病毒载体和LNP载体的in vivo CAR-T均具有潜在免疫原性。对于病毒载体，多种因素可影响其免疫原性，包括病毒载体本身的成分、表达产物以及宿主的预存抗体等。在早期产品设计中应尽量降低免疫原性，以减少对in vivo CAR-T有效性和安全性的影响。例如，INT2104通过对VSV-G蛋白进行工程化改造（氨基酸替换减少脱靶结合）以增强其在血液中的稳定性；VivoVec颗粒采用Cocal融合病毒糖蛋白（假型化）以抵抗人血清的灭活作用，从而提高体内稳定性。对于LNP载体，因外源RNA本身和LNP均有可能诱导机体的固有免疫反应，同时该方法为瞬时工程化，可能需要重复给药以实现足够暴露，因此产品的免疫原性可能成为限制因素。有产品通过环化RNA（circRNA）以降低免疫原性并延长体内的表达持续时间。总之，在in vivo CAR-T的非临床安全性研究中进行全面的免疫原性评估至关重要，因为这直接关系到产品的安全性、有效性和临床转化潜力。 ex vivo CAR-T已累积大量临床数据，治疗相关不良事件主要为免疫毒性反应，包括细胞因子释放综合征（CRS）、免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）、免疫效应细胞相关噬血细胞综合征样综合征（IEC-HS）、中性粒细胞减少症，以及与低丙种球蛋白血症相关的B细胞耗竭。这些毒性主要源于CAR-T细胞在体内的过度激活、非特异性靶向或长期作用。而in vivo CAR-T通过直接在体内递送编码CAR的基因而生成CAR-T细胞，其安全性风险更为复杂：一方面，病毒载体的CAR序列在基因组中永久整合，可能出现CAR-T细胞活化、扩增和再扩增，引发免疫过度激活；另一方面，瞬时表达特性（如LNP平台）虽可能降低长期毒性，但重复给药或高剂量下仍可能诱发急性炎症反应。因此，开展系统的免疫毒性研究至关重要，通过早期识别CRS和神经毒性等信号，从而为临床试验设计提供安全性依据。例如，Kelonia Therapeutics开发的KLN-1010采用CD3靶向慢病毒载体，编码全人源抗BCMA CAR，非临床安全性研究数据显示，未见CRS或神经毒性；Capstan Therapeutics的tLNP制剂在食蟹猴中虽未引起中枢神经系统症状或癫痫，却观察到1例IEC-HS，提示即使短期CAR表达也可能触发全身性免疫反应。 3.4.4 遗传毒性已有文献报道，采用整合病毒载体的ex vivo CAR-T具有整合插入突变导致的致癌性风险。而对于in vivo CAR-T，由于体内环境更为复杂，比如载体（如慢病毒）整合可能影响非靶细胞（如造血干细胞）等，因此研究者通常会将遗传毒性研究作为评估in vivo CAR-T安全性的核心环节。例如，UB-VV111在非临床研究中开展了遗传毒性风险评估。结果显示，UB-VV111的载体拷贝数（VCN）较低，平均每个CAR-T细胞仅1.77个拷贝，且整合插入位点分布类似于已上市的慢病毒载体ex vivo CAR-T，表现为低频整合于重复基因组区域，并倾向于内含子区域（而非启动子或外显子）。对于采用非整合病毒载体（如腺相关病毒载体、LNP载体）的in vivo CAR-T，因其非整合特性可能具有较低的遗传毒性风险，但仍需考虑可能导致遗传毒性风险的因素（如环状RNA、LNP脂质成分等），必要时需考虑开展相应的遗传毒性试验。 3.4.5 致癌性通常，需根据产品特征、临床适应症考虑评估致癌性风险。当标准致癌性试验不可行时，可考虑采用体外、体内等多种证据对其致癌性风险进行综合评估。证据可来自于如下数据：载体整合特性；靶向/脱靶转导特性；药物靶点和药理作用通路与肿瘤发生发展的相关性；非临床和临床研究的长期监测数据；生产体系中可能存在的潜在致癌风险；AI预测等。 3.4.6 生殖毒性in vivo CAR-T产品需根据产品特性、作用机制、临床适应症和拟用人群、一般毒理学试验中的发现、生物分布等信息，考虑评估潜在的生殖和发育毒性风险。病毒载体产品需关注生殖系传递风险，当其在性腺持续存在时，需考虑进一步研究其在生殖细胞（例如卵母细胞、精子）的暴露水平，如有暴露，应开展生殖系传递试验。基于LNP载体的产品虽基因整合风险低，但仍需评估LNP的组织嗜性所引起的潜在生殖/发育毒性风险。 3.4.7 制剂安全性in vivo CAR-T需基于给药途径，采用终产品制剂开展合适的制剂安全性研究。 3.4.8 平台技术产品研发的考虑in vivo CAR-T的研发中可能涉及相同递送载体的平台技术。目前监管机构虽常收到关于此类平台技术的沟通交流申请，但其界定标准非常严格，需基于载体特性、生产工艺、质量属性，并结合同一平台下其他产品的开发进程，进行药学、药理毒理、临床等多专业的综合评估。目前，鉴于in vivo CAR-T采用同平台技术荷载不同的CAR基因，CAR相关的“在靶”和“脱靶”风险差异较大，笔者认为此类产品可能不适合基于平台技术进行监管。然而，同一平台技术产品可能在载体生物分布、安全性等方面实现一定程度的研究数据共享。 04 结语与展望 in vivo CAR-T作为一项新兴技术，通过病毒载体或LNP载体平台实现体内免疫细胞工程化，有望克服传统ex vivo CAR-T在制造复杂性、可扩展性和安全性方面的局限。然而，其“体内生成”的特性也带来了远比传统产品更加复杂的研究与评价挑战。因此，开展系统且严谨的非临床研究将有助于推动该技术从概念走向临床应用。in vivo CAR-T兼具基因治疗和细胞治疗产品的双重属性，同时涉及不同类型的递送载体，应遵循“基于风险”和“个案处理”的原则，开展科学合理的非临床研究，以评价其药理/药效作用、毒性风险特征，以及与药物暴露/生物分布之间的关系。随着医药创新的不断发展，未来预计会出现更多新型递送载体、更多类型的靶向识别技术，以及更广泛的适应症拓展。本文中的相关考虑仅代表研究者当前的认识。研究者和监管方应紧跟研究进展，共同探索合理的非临床研究与评价策略，在积极促进药物研发的同时，切实保障用药安全有效。 Bitab 三十余年如一日 质量经得起考验 毕特博生物主要代理和经销的国外生物品牌公司有：Lonza(原Cambrex）、MPBiomedicals(MP、Qbiogene、ICN）、ENZO Life Sciences(Alexis、Biomol、Enzo)、Axxora(Alexis)、Cryologic、Mobitec、Tharmac、CORNING、Alomone、Prospec、Fitzgerald、Randox等。产品涉及：细胞生物学、分子生物学、免疫学、食品与水质检测、实验室及医疗试剂、设备等。