DelNS1-2019-nCoV-RBD-OPT1(Beijing Wantai Biological)

摘要：人类疾病，特别是传染病和癌症，对公共卫生安全和全球经济构成了前所未有的挑战。开发和分发新型预防性和治疗性疫苗是人类疾病的优先对策。在所有疫苗平台中，病毒载体疫苗提供了显著的优势，代表了对于传统疫苗方法难以控制的病原体的突出选择。目前，病毒载体疫苗仍然是诱导针对人类疾病的强烈体液和细胞免疫的最佳策略之一。包括水泡性口炎病毒、狂犬病病毒、副流感病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、流感病毒、腺病毒和痘病毒在内的许多不同家族和起源的病毒，被认为是在结构特征、设计策略、抗原呈递能力、免疫原性和保护效果方面有所不同的突出病毒载体。本综述总结了设计策略的总体概况、在推进中的进展以及为解决这些病毒载体疫苗部署障碍所采取的步骤，同时强调了它们在粘膜递送、癌症治疗应用以及其他关键方面对这些病毒载体疫苗合理应用的潜力。病毒载体疫苗在适当和准确的技术进步将巩固其作为加速新型疫苗突破和促进公共卫生紧急响应的领先方法的地位。 1.引言 传染病的爆发和癌症的发生对人类历史产生了巨大的影响。出血热，包括埃博拉、马尔堡和拉萨热，致死率高达50%。此外，自2003年以来，已有三波β冠状病毒的出现，其中2019年冠状病毒病（COVID-19）自2019年以来已造成数十亿确诊病例和数百万人死亡。全球每年估计有1930万新癌症病例和近1000万癌症死亡，这构成了主要的健康威胁。 对于传染病，疫苗接种和建立群体免疫至关重要。在所有疫苗技术中，重组病毒载体代表了有希望的疫苗平台，因为它们能够表达异源抗原并诱导细胞免疫反应和体液免疫反应，而无需外源性佐剂。病毒载体疫苗由基因组被修改以包含一个或多个编码目标抗原的外源基因的病毒颗粒组成。使用病毒传递“疫苗基因”的理由有几个方面。病毒载体疫苗是安全的，并且能够诱导先天和适应性免疫反应的两个方面，而不涉及完整的危险病原体。此外，由于表达多种病原体相关分子模式（PAMPs）和激活先天免疫，病毒载体具有内在的佐剂特性。同样，病毒载体可以被设计成将抗原传递到特定的细胞或组织。同样，它们可以被制成具有复制能力或无复制能力的，以增加它们的安全性并减少反应原性。值得注意的是，病毒载体疫苗可以再现特定病原体的自然感染过程，从而触发经典的急性炎症和通过自然产生PAMPs的免疫检测，使粘膜递送和诱导局部粘膜和系统免疫成为可能。几种基于病毒载体的预防性疫苗已进入III期临床试验或已获批准。在癌症领域，病毒载体是理想的溶瘤病毒（OVs），因为它们可以触发细胞免疫，并且可以被武装、屏蔽并针对肿瘤细胞。肿瘤相关抗原（TAAs）的释放可以激活和调节抗肿瘤免疫反应。几种OV制剂已获准上市，这为肿瘤免疫治疗提供了有希望的方向。 然而，这些病毒载体的系统性和比较性审查尚不完善。此外，这些病毒载体的普遍性和个体性尚未完全阐明。在这篇综述中，总结了水泡性口炎病毒（VSV）、狂犬病病毒（RABV）、副流感病毒（PIV）、麻疹病毒（MeV）、新城疫病毒（NDV）、流感病毒（IFV）、腺病毒（AdV）和痘病毒载体疫苗的一般概述，它们在应对威胁人类健康的致命性传染病以及癌症免疫治疗方面的应用。这些病毒载体的特征、优点和局限性进行了深入分析和呈现。综合考虑，这些问题将促使加速和批准新的病毒载体疫苗，以应对人类健康威胁。 1.1.病毒载体的结构和设计策略 非分段负链RNA病毒（NNSVs）作为疫苗载体。VSV和RABV是包膜NNSVs，属于弹状病毒科。弹状病毒科由五个结构蛋白组成，包括核蛋白（N）、磷酸蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和RNA依赖性RNA聚合酶（L）。PIV、MeV和NDV属于副黏病毒科。它们的核苷酸基因组包含六个结构基因，包括N、P、M、融合糖蛋白（F）、血凝素糖蛋白（H）和L。这两种表面包膜糖蛋白负责宿主细胞的结合和入侵。这些NNSVs的救援和操作是通过负单链RNA的反向遗传学方法完成的。1994年，RABV是第一个从克隆的cDNA中被救援出来的，这标志着NNSVs领域的一个重大里程碑。该病毒是从包含正义方向的完整基因组序列、两侧带有T7启动子和乙型肝炎δ病毒核糖酶的克隆cDNA中救援出来的。随后，其他NNSVs的反向遗传系统建立起来，这使得全长基因组的重建成为可能。对于这些NNSV载体，有两种主要的外源基因传递策略。(1) 删除病毒载体的糖蛋白基因，并用目标基因替换（NNSVΔG或NNSVΔF）（图1a、b）。(2) 在全长基因组中保留病毒载体糖蛋白基因的同时，涉及一个额外的转录单元用于外源抗原（rNSSV）（图1a、b）。外源基因可以作为额外的表达盒插入基因组的不同基因连接处。 图1 疫苗平台的水泡性口炎病毒(VSV)、狂犬病病毒(RABV)、副流感病毒(PIV)、麻疹病毒(MeV)、新城疫病毒(NDV)、流感病毒(IFV)、腺病毒(AdV)和痘病毒的设计策略。a rVSVΔG/rRABVΔG，其中载体的糖蛋白(G)被外源基因替换；rVSV/rRABV，基因组的G和L之间涉及一个额外的转录单元。N4CT1，涉及基因组3′端的额外转录单元，N基因的转位和VSV G细胞质尾部的截断。b 嵌合副黏病毒载体，其中副黏病毒的融合和血凝素糖蛋白被其他副黏病毒的糖蛋白替换；重组副黏病毒载体，涉及外源基因的额外转录单元。c 基于IFV的HA、NA和NS的基因组操作。c1. 基于HA的外源基因插入：外源基因插入HA头部的受体结合位点或HA的N端；保留包装序列的同时用外源基因替换HA。c2. 基于NA的外源基因插入：外源基因插入NA的茎部；保留NA的非编码序列和相邻编码区域以替换NA编码序列；在NA的5′端涉及额外的转录单元。c3. 基于NS的外源基因插入：在NS的第125个氨基酸后插入转基因；保留NS1和NEP，在NS1末端引入2个A自切割位点；用外源基因替换NS1。d AdV的基因组，E1、E3和(或)E4区域被设计用于转基因。e 痘病毒的基因组，D转录单元可以在启动子下被所需的转基因替换。（使用BioRender创建） 在NNSVΔG/NNSVΔF设计策略中，目标糖蛋白可以显示在重组病毒的表面。因此，重组病毒的细胞和组织趋向性在很大程度上取决于外源糖蛋白。在目标糖蛋白在分子大小和功能上与载体糖蛋白相似的情况下，NNSVΔG/NNSVΔF设计策略使重组病毒在生物学生长特性和最小化抗载体免疫方面理想化。尽管重组病毒可以重组大的外源基因，但重组病毒的生长滴度相对较低。例如，rVSVΔG-SARS-CoV-2-S和rVSVΔG-CCHFV-G代表了大约106 TCID50的最高生长滴度。为了解决这个问题，截断外源基因的细胞质尾部（CT）区域和筛选最佳病毒培养细胞系是替代措施。相比之下，携带额外转录单元的病毒载体可以实现更高的生长滴度。除了糖蛋白外，外源基因也可以被纳入重组病毒。在某些情况下，外源基因的跨膜（TM）和CT域应该被病毒载体的糖蛋白所取代，以最大化外源蛋白的病毒颗粒整合并优化免疫原性。特别值得注意的是，转录从基因组的3′端到5′端递减。例如，VSV转录的极性机制导致mRNA丰度梯度，最高在基因组的3′端，并逐渐向5′端减少，顺序为N > P > M > G > L，因此特定抗原的表达水平与插入位置相关。理想的外源基因插入位点应该平衡病毒复制和外源基因表达，并包含外源基因前后的优化基因连接序列排列。 分段RNA（IFVs）作为疫苗载体。IFV是包膜的、分段的RNA病毒，属于正交髓病毒科。IFV根据核蛋白（NP）分为四个属：流感A、B、C和D。其中流感A病毒（IAV）和流感B病毒（IBV）与公共卫生相关，因为它们有可能在人类中引起严重疾病。IAV和IBV携带8个单链、负义RNA片段，编码至少8种蛋白质：聚合酶基础1（PB1）、聚合酶基础2（PB2）、聚合酶酸性（PA）、血凝素（HA，表面糖蛋白）、NP、神经氨酸酶（NA，表面糖蛋白）、NB（表面糖蛋白）、基质蛋白1（M1和M2）、非结构蛋白（NS1和NEP）。基于IFV的反向遗传学方法，IFV的多个片段被操纵用于转基因，包括HA、NA、NS1等（图1c），也报告了IAV和IBV之间的嵌合体构建。当外源基因插入到HA头部的受体结合位点或HA的N端时，IFV HA的功能不受影响，因此保留了完整的复制能力。在构建无复制能力的重组病毒的情况下，只保留了HA的3′和5′端的包装序列，HA的编码区被外源序列替换。这种无复制能力的病毒可以在稳定表达HA蛋白的Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞系中复制。对于NA茎部，只有28-41个氨基酸插入是允许的。将外源序列插入NA茎部会影响病毒的毒力。另一种关于NA融合蛋白的策略是通过保留NA的非编码序列和相邻的编码区域来制备。在这个策略中，IFV大多是无复制能力的，需要添加外源性NA酶。还有一种策略涉及在IFV NA的5′端增加一个额外的转录单元，这保持了NA的完整结构和功能。大约允许680 bp的外源基因片段。总的来说，大约1.5 kb的外源基因被允许纳入IFV NA片段。 非结构蛋白1（NS1）和核输出蛋白（NEP）由IFV的NS基因编码，能够容忍250个氨基酸插入。IFV的NS1蛋白是一种毒力因子，能够抑制干扰素的产生，导致IFV逃避最初的免疫反应。NS1基因的删除显著减弱了病毒的毒力，已被应用于IFV载体疫苗的开发。NEP在调节IFV核糖核蛋白复合体和病毒成核中起作用。NS不参与病毒颗粒的形成，因此NS蛋白的变化不会改变IFV的抗原性。基于NS片段构建嵌合IFV载体疫苗有三种方法。第一种构建方法是建立双顺反子阅读框，即在第125个氨基酸后插入一个起始-终止阅读框（UAAUG）。第二种构建方法保留了NS1和NEP，并在NS1末端引入了2个自切割位点。最后，在NS1删除构建的情况下，重组病毒在MDCK细胞中的复制能力显著减弱。为了解决这个问题，M基因A14U的突变增强了NS1删除病毒在MDCK细胞中的复制。事实上，NS1基因的删除可能不仅仅是一种减毒策略，而且通过激活多维免疫反应，与冷适应IFV相比，可能表现出更强大和持久的免疫力。 腺病毒作为疫苗载体。AdVs是属于Adenoviridae的非包膜dsDNA病毒。AdVs具有广泛的宿主来源，并可被划分为多种血清型。它们的双链线性基因组范围从26 kb到45 kb，这个大小易于操作。AdVs已经从基因替代疗法的工具转变为真正的疫苗传递载体。它们作为疫苗载体具有吸引力，因为它们在哺乳动物宿主中同时诱导先天和适应性免疫反应。通过操纵早期1（E1）区域或其部分，可以使基于AdV的载体具有复制能力或无复制能力。此外，由于E3基因对病毒复制是可有可无的，因此可以删除早期3（E3）基因以扩大转基因插入的容量。因此，E1或E3删除区域是转基因表达的表达盒（图1d）。AdV载体已经建立得很好，易于操作，易于快速、廉价生产和无需冷链存储。参与疫苗载体的有人类、灵长类和禽类来源的AdVs。 痘病毒作为疫苗载体。痘病毒是最大的包膜DNA病毒。在20世纪80年代，通过使用牛痘病毒（VACV）接种成功根除了天花。在同一时期，VACA被用作转基因表达载体。亲本VACA的传代导致了随机突变和缺失，这有助于降低VACV的致病性。第三代痘病毒载体包括Listeria clone 16m8（LC16m8）、Dairen I株（Dis）、M65、M101、改良的安卡拉牛痘病毒（MVA）以及几种减毒的禽痘病毒。MVA通过在鸡胚上传代570代高度减毒。由于病毒组装受阻，MVA不产生传染性后代，同时在大多数哺乳动物细胞中保持了强大的DNA复制和抗原表达能力。其中，MVA-572、MVA-I721和MVA-BN在编码区的核苷酸序列上100%相同，但表现出显著不同的表型。其中，MVA-BN比其他两个菌株显示出更好的安全性和免疫原性。MVA是一种出色的第三代天花疫苗，已在德国超过120,000人中接种。MVA-VLP HIV疫苗候选物在包括免疫受损个体和HIV患者在内的500人的临床试验中显示出极佳的安全性。重组MVA遗传稳定，易于修改，安全，并显示出良好的免疫原性，即使在预先存在的抗载体免疫下，特别是与其他病毒载体疫苗，如AdV载体疫苗结合使用时。这些特性使MVA成为一个有前途的疫苗载体。除了MVA，其他用作载体的痘病毒包括金丝雀痘病毒（ALVACL）、来自李斯特菌株的C16m8以及纽约减毒牛痘病毒NYVAC（图1e）。病毒载体的比较总结在表1中。 1.2.病毒载体疫苗在人类疾病中的应用 1.2.1.水泡性口炎病毒载体 VSV载体疫苗的单剂量有效诱导持久保护：在大多数情况下，VSV载体疫苗被设计为单剂量方案。对于病毒性出血热，VSV载体疫苗的单剂量诱导了持久的保护。代表性地，rVSVΔG-ZEBOV，一种重组EBOV疫苗候选物，其中VSV G基因被扎伊尔埃博拉病毒（ZEBOV）的G基因替换，用于重组病毒的救援。rVSVΔG-ZEBOV的单次肌肉内（IM）剂量疫苗接种完全保护了小鼠和非人灵长类动物（NHPs）免受EBOV的致命挑战。具有延迟激活先天反应的动物对挑战死亡。在几内亚环疫苗接种中，2 × 107 PFU的rVSVΔG-ZEBOV单剂量疫苗在志愿者中显示出良好的安全性和免疫原性。rVSVΔG-ZEBOV对EBOV疾病提供了实质性的保护，总体保护效果为100%。疫苗接种后，抗体在第14天出现，大约在第28天达到峰值，并在2年内可检测到。rVSVΔG-ZEBOV已获得欧洲药品管理局（EMA）的批准，并已获得紧急使用许可。同样，表达其他出血热病毒如马尔堡病毒（MARV）、拉萨病毒（LASV）和克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）的糖蛋白的rVSVΔG载体疫苗的单剂量疫苗接种完全保护了NHPs。对于MARV疫苗候选物，一种表达MARV（Musoke株）GP（rVSVΔG-MARVGP）的重组VSV基病毒在NHPs中显示对MARV安哥拉和Ravn株的交叉保护。rVSVΔG-MARV-GP接种的猕猴在接种后约14个月被挑战，接种动物未观察到疾病的临床迹象。在非近交豚鼠中，单剂量的基于VSV的重组病毒表达LASV GP（rVSVΔG/LASV-GPC）诱导了快速和长期的保护。疫苗接种后25天、6个月和1年的保护率分别为83%、87%和71%。对于CCHFV，单剂量的rVSVΔG载体疫苗表达CCHFV糖蛋白前体（GPC）显示出良好的耐受性，并在小鼠中实现了100%的保护，免受CCHFV的致命挑战。 美国汉坦病毒心肺综合症（HCPS）由安第斯病毒（ANDV）和新博雷病毒（SNV）引起。Prescott, J. 等人构建了一种rVSVΔG载体疫苗rVSVΔG/ANDVGPC，其中VSV的GP被ANDV GPC所替代。rVSVΔG/ANDVGPC的单次肌肉注射（IM）疫苗接种在仓鼠中诱导了高滴度的中和抗体（NAbs），并实现了无菌免疫。挑战后的保护效果为100%。在另一项研究中，疫苗在仓鼠接种后6个月内对ANDV感染有效，而在接种后1年观察到没有保护效果。Warner, BM等人构建了两种活载体疫苗，rVSVΔG/SNVGPC和rVSVΔG/ANDVGPC，分别表达了SNV和ADNV的GPC。104 rVSVΔG/SNVGPC和rVSVΔG/ANDVGPC都诱导了交叉免疫反应，并在叙利亚仓鼠中发挥了保护作用。 同样，基于VSV的疫苗单剂量接种表达其他病原体表面糖蛋白，如尼帕病毒（NiV）、寨卡病毒（ZIKV）、严重急性呼吸综合征冠状病毒1（SARS-CoV-1）和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV），在临床前动物模型中被证明是免疫原性和保护性的。上述研究强调了VSV载体疫苗在单次肌肉注射后能够完全保护大部分病原体，并且免疫反应持久，这代表了VSV载体疫苗的显著特点。 多价VSV载体疫苗保护动物免受多种病原体的致命挑战：在多种严重病原体重叠的地区，如西非，多价疫苗具有重要意义。根据先前的研究，rVSVΔG策略显示出减弱的神经毒力和较低的抗载体免疫。此外，表达不同外源蛋白的rVSV载体疫苗可以同时接种，不会干扰所有目标病原体的挑战后保护。这些结果启发了VSV载体疫苗多价给药的潜力。在一项临床前研究中，单剂量疫苗接种表达ZEBOV和ANDV糖蛋白的重组双价疫苗VSVΔG/DUAL在仓鼠中实现了对ZEBOV和ANDV的无菌免疫。Geisbert, T. W.等人进行了一项涉及苏丹埃博拉病毒（SUDV）、ZEBOV、科特迪瓦埃博拉病毒（CIEBOV）和MARV的多价疫苗。猕猴接种了由VSVΔG/SUDV GP、VSVΔG/ZEBOV GP和VSV ΔG/MARV GP等剂量组成的多价疫苗。在上述四种丝状病毒感染的挑战下，所有接种的猕猴都存活了下来。同样，表达来自LASV、EBOV、MARV和SUDV的抗原的四价VSV载体疫苗在两次剂量后实现了对包括LASV、EBOV、MARV和SUDV在内的四种出血热病毒的100%保护。在所有接种的动物中检测到针对四种丝状病毒糖蛋白的NAbs，而在大多数接种的猕猴中也检测到了针对糖蛋白的细胞介导的免疫反应。rVSV-N4CT1载体也被应用于针对EBOV、SUDV和MARV的三价疫苗开发。尽管三价疫苗与单价疫苗相比免疫原性降低，保护效果仍为100%。上述结果表明，基于VSV的单价疫苗是适用的。代表性的针对人类疾病的VSV载体疫苗总结在表2中。 1.2.2.狂犬病病毒载体 结合佐剂的灭活RABV载体疫苗提供完全保护并触发持久的免疫反应：尽管通过基因工程策略可以减弱活RABV，但由于安全问题，不太可能批准活重组RABV。同时，表达同源抗原的减毒和无复制能力的RABV载体疫苗与表达同源抗原的VSV载体疫苗相比免疫原性较低。另一种选择是，灭活RABV载体疫苗既安全又具有免疫原性，这是一个合理的选择。对于病毒性出血热，基于RABV BNSP333载体，生成了表达ZEBOV GP的复制能力和无复制能力的疫苗候选物。ZEBOV GP蛋白可以有效地整合到病毒颗粒中。接种活疫苗或灭活疫苗候选物诱导体液免疫，并在小鼠模型中对致命的RABV和EBOV挑战提供保护。在NHPs中的进一步评估表明，复制能力疫苗对EBOV感染提供了100%的保护，而无复制能力或灭活疫苗只提供了50%的保护。通过GP密码子优化增加RABV病毒颗粒中GP的整合量，以提高灭活疫苗的保护效果。之后，两剂或三剂BNSP333-coZGP（FILORAB1）与GLA-SE佐剂结合，诱导了强大的ZEBOV GP特异性IgG、NAbs，并在NHPs中对EBOV的致命挑战提供了100%的保护。同时，基于相同策略开发了SUDV和MARV疫苗。FILORAB3是一种基于RABV BSNP333载体的MARV疫苗，表达MARV安哥拉株的密码子优化GP。灭活的FILORAB3与Toll样受体4（TLR-4）激动剂（GLA-SE）佐剂结合，诱导了强大的MARV GP特异性IgG抗体。有趣的是，接种活FILORAB3疫苗的小鼠死于致命挑战，而单剂量灭活的FILORAB3与GLA-SE佐剂结合则提供了完全保护。NK细胞依赖的抗体介导的细胞毒性（ADCC）在小鼠的免疫保护中发挥了关键作用，这与RABV载体LASV疫苗的保护机制一致。RABV载体也被广泛用于基因组分段病原体的疫苗开发，如LASV和裂谷热病毒（RVFV）。LASSARAB是一种基于BNSP333的双价疫苗候选物，表达密码子优化的LASV GPC。灭活的LASSARAB与GLA-SE佐剂结合，在小鼠和豚鼠中诱导了对LASV和RABV的持久体液反应。LASSARAB主要通过非NAbs介导的ADCC和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用（ADCP）保护豚鼠和小鼠免受LASV挑战。我们的团队基于RABV SRV9株，表达了密码子优化的RVFV eGn糖蛋白，称为rSRV9-eGn。灭活的rSRV9-eGn结合聚（I:C）和ISA201VG佐剂诱导了细胞免疫反应和RVFV特异性IgG抗体。此外，接种rSRV9-eGn的小鼠产生了记忆T细胞主导的增殖T细胞。 灭活RABV载体疫苗在新出现的β冠状病毒中也显示出效果。完整的S蛋白整合到RABV载体中降低了重组病毒的生长滴度。因此构建了BNSP333-S1，它包含与RABV G蛋白C末端融合的MERS-CoV S1域。灭活的BNSP333-S1在小鼠中诱导高水平的NAbs，并提供了对MERS-CoV致命挑战的完全保护。在我们之前的研究中，对表达MERS-CoV S1蛋白片段的重组RABV SRV9载体疫苗候选物和展示MERS-CoV受体结合域（RBD）蛋白的革兰氏阳性增强基质（GEM）颗粒进行了平行比较。基于RABV载体的疫苗诱导了显著更早的抗体反应和更高水平的细胞免疫，而基于GEM颗粒载体的疫苗即使在1微克的低剂量下也诱导了更高的抗体反应。这项研究描述了MERS疫苗的平台依赖性方式。CORAVAX是一种灭活的RABV SADB19载体COVID-19疫苗候选物，表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）刺突（S）的S1。单剂量的CORAVAX疫苗在小鼠中诱导了高水平的SARS-CoV-2和RABV NAbs，但需要两剂量才能在鼻甲中完全清除病毒。CORAVAX非常有效，并在SARS-CoV-2挑战后对仓鼠模型提供了保护。TLR4激动剂（AddaVax）根据优质抗体滴度被确定为具有最大潜力。预先存在的RABV免疫对免疫反应没有显著影响。抗原特异性血清抗体滴度和脾脏和骨髓中长期抗体分泌细胞在CORAVAX免疫后持续超过1年。CORAVAX的人类临床试验正在进行中。我们的团队基于RABV SRV9株开发了灭活重组病毒载体疫苗，该疫苗在RABV基因组的额外转录单元中嵌合表达SARS-CoV-2的RBD或S1。结合聚（I:C）和ISA 201VG佐剂，三剂量的灭活重组病毒（SRV-nCoV-RBD或SRV-nCoV-S1）诱导了针对SARS-CoV-2和RABV的持久NAbs。值得注意的是，灭活的SRV-nCoV-RBD比SRV-nCoV-S1更早并更好地维持了抗体产生。在进一步评估中，灭活的SRV-nCoV-RBD在猫和狗中诱导了针对SARS-CoV-2和RABV的NAbs，具有相对广谱的对SARS-CoV-2变异株（VOCs）的交叉中和能力。 对于脑炎病毒，基于BNSP333构建了一种表达NiV G的重组NIV疫苗，称为NIPARAB。经活NIPARAB鼻内（IN）接种后，小鼠未显示疾病临床症状。尽管肌肉注射单剂量活NIPARAB或两剂量灭活NIPARAB的小鼠产生了NAbs和NIV-G特异性结合抗体，但只有在灭活疫苗组中观察到更高的抗体水平。值得注意的是，抗NIV G特异性免疫血清对另一种导致致命脑炎的副黏病毒亨德拉病毒（HEV）具有交叉反应性。对基于VSV和RABV的HEV疫苗进行了平行比较密码子优化使HEV G在RABV BNSP333载体中的整合增加了2-3倍，而与表达原始抗原序列的VSV载体疫苗候选物相比没有影响。令人惊讶的是，两种疫苗候选物都安全，并在小鼠中诱导了高水平的HEV G特异性抗体。三剂量的灭活疫苗比单剂量活疫苗诱导了更高水平的HEV G特异性IgG和NAbs。在相同条件下，基于VSV的活疫苗比基于RABV载体的活疫苗诱导了更高水平的HEV G特异性抗体和NAbs，这可能是由于VSV的快速复制能力。总体而言，考虑到生物安全问题和与基于VSV的疫苗相比RABV的免疫原性较低，灭活形式似乎是一个更具吸引力的方向。代表性的基于RABV载体的人类疾病疫苗总结在表3中。 1.2.3.副流感病毒载体 单次IN剂量疫苗接种的PIV载体疫苗提供对呼吸道疾病的完全保护：副流感病毒因其安全性、基因组稳定性和在多个细胞系中培养的能力而成为潜在的病毒载体。44 多种PIV血清型参与病毒载体，包括PIV1、2、3和5。此外，B/HPIV3是由牛/人PIV组成的嵌合体，其中牛PIV3（BPIV3）株Kansas的BPIV3 HN和F糖蛋白被人类PIV3株JS的糖蛋白所取代。BPIV3骨干提供了在人类中复制的宿主范围限制，这在幼儿中耐受性良好且具有免疫原性。到目前为止，没有证据证实PIV载体疫苗中增强的致病性。PIV是针对呼吸道上皮的儿科病原体，这使它们成为开发诱导粘膜免疫反应的疫苗的有吸引力的候选者。一种基于人类副流感病毒2型（hPIV2）载体BC-PIV的复制缺陷型COVID-19疫苗已经开发出来，它表达了SARS-CoV-2全长融合前稳定S蛋白，称为BC-PIV/S-2PM。在病毒表面整合了大量的S蛋白。单次IN剂量接种BC-PIV/S-2PM在小鼠中诱导了高水平的S特异性IgG和粘膜IgA抗体，并保护了仓鼠免受SARS-CoV-2感染。需要加强疫苗接种以在仓鼠中提供完全保护。也开发了几种具有复制能力的PIV载体COVID-19疫苗。CVXGA1是一种表达SARS-CoV-2 WA1 S蛋白的重组PIV5载体疫苗。为了最大程度地发挥保护性免疫反应，生成了S蛋白的天然构型。单次IN剂量的CVXGA1诱导了病毒特异性NAbs，并在K18-hACE2小鼠中提供了100%的保护，并阻止了与同居的天真雪貂的接触传播。当CVXGA1作为两剂量COVID-19 mRNA疫苗之后的加强剂进行给药时，与三剂量COVID-19 mRNA疫苗相比，PIV5载体疫苗产生了更高水平的交叉反应性NAbs。这些结果表明，CVXGA1可以作为针对新出现的变体的加强疫苗。CVXGA1目前在美国进行I期临床试验（NCT04954287）。通过表达天然或融合前稳定S蛋白（S-2P）也构建了基于B/HPIV3的COVID-19。融合前稳定增加了B/HPIV3体外S蛋白的表达。在仓鼠中，单次IN剂量的B/HPIV3/S-2P诱导了12倍的更高NAbs滴度和显著更高的SARS-CoV-2特异性IgA和IgG，与B/HPIV3/S相比。在SARS-CoV-2挑战后，B/HPIV3/S-2P比B/HPIV3/S提供了更好的保护。此外，优化版本的B/HPIV3/S-2P，涉及另外4个脯氨酸突变以巩固融合前稳定的S蛋白（B/HPIV3/S-6P）在猕猴中进行了评估。单次IN/气管内（IT）剂量的B/HPIV3/S-6P在猕猴中诱导了强烈的S特异性气道粘膜IgA、IgG反应以及高滴度的外周S特异性抗体，这些抗体有效地中和了SARS-CoV-2 VOCs，但中和Omicron亚系的能力被削弱。此外，B/HPIV3/S-6P诱导了强大的系统性和肺S特异性CD4+和CD8+ T细胞反应，包括肺部的组织驻留记忆细胞。B/HPIV3/S-6P疫苗接种有效地抑制和消除了免疫猕猴的上呼吸道和下呼吸道中的病毒增殖。也证明了基于自然减毒的人类副流感病毒3型（HPIV3）载体的COVID-19疫苗是有效的同样，基于PIV5表达糖蛋白F（PIV5/F）和G（PIV5/G）的SARS-CoV-1和MERS-CoV疫苗通过单次IN剂量给药在临床前是免疫原性的。 人类呼吸道合胞病毒（RSV）是全球婴幼儿和儿童严重急性呼吸道感染的主要病原体。迄今为止，还没有获得许可的RSV疫苗。基于PIV的RSV疫苗是通过在额外的转录单元中表达RSV-F蛋白构建的。在重组B/HPIV3中，RSV的F蛋白被设计为融合前构象，其TM和CT域被HPIV3 F所取代，以增加在载体病毒中的整合。使用rB/HPIV3-RSV-pre-F作为加强剂，与使用活减毒RSV疫苗相比，在仓鼠和非洲绿猴中产生了显著更高水平的RSV NAbs。基于PIV的RSV疫苗提供了更大的RSV F抗原负荷，并与减毒RSV相比增加了免疫原性。然而，额外的减毒可能会使构建在人类中过度减毒，以至于免疫原性可能不是最佳的。由于这些原因，当rB/HPIV3-RSV-F过度减毒时，开发了rHPIV3 JS作为新一代载体。令人鼓舞的是，双价HPIV3/HRSV疫苗候选物在2个月以上的儿童中耐受性良好，并且优化版本正在进行进一步的临床开发作为儿童疫苗。基于PIV5的RSV疫苗分别构建了表达糖蛋白F（PIV5/F）和G（PIV5/G）的两种RSV疫苗。PIV5/F更具免疫原性，在动物模型中比PIV5/G提供了更好的保护。PIV5/F在RSV暴露后的非洲绿猴中增强了NAb反应。这些研究表明PIV5/F是RSV-naive和RSV-exposed个体的有前途的单剂量IN疫苗。此外，基于PIV5的RSV疫苗可以皮下注射，这对于可能因IN接种而鼻塞的婴儿来说是一个有利的接种途径。 基于PIV平台，通过将IAV H5N1的HA或NP整合到重组PIV病毒中，构建了几个IFV疫苗候选物。单次IN剂量接种携带IAV HA的重组病毒诱导了无菌免疫，并保护动物免受IFV的同源挑战。与HA相比，IAV的NP似乎更加保守，但其免疫原性较低。这个问题可以通过选择PIV基因组内适当的外源基因传递位置来解决。之后，单次IN接种携带IFV NA的PIV载体疫苗提供了对IFV的广泛保护。这些结果表明，NP可以作为IFV的广谱抗原进行进一步研究。 正在开发的基于PIV载体的EBOV疫苗：基于HPIV3载体，通过将EBOV的GP基因单独或与NP蛋白基因一起插入HPIV3基因组，构建了两种EBOV疫苗候选物。在上述疫苗候选物的单次IN接种后，豚鼠在两个疫苗组中均100%免受EBOV挑战。在猕猴中，任何表达GP的构建物的单剂量免疫对EBOV具有中等免疫原性，并对88%的动物免受EBOV引起的严重出血热和死亡的保护。两剂量疫苗接种具有高度免疫原性，所有动物在挑战后存活，没有疾病迹象和可检测的挑战病毒。基于PIV的EBOV疫苗的免疫反应与AdV载体疫苗相当，但低于基于VSV的疫苗。病毒特异性结合抗体滴度与保护效果直接相关。NP蛋白的整合对保护效果贡献不大。预先存在的抗载体免疫可能影响HPIV3的复制，但对抗原表达和免疫原性的影响有限。在预先存在HPIV3抗体的组中，针对GP蛋白的抗体滴度仅略低于对照组。第二次免疫后，两组之间的抗体滴度达到了相当水平。Bukreyev等人试图从HPIV3中去除HN和F蛋白，并用EBOV的GP蛋白替代其功能。他们成功地包装了不含HN和F蛋白的HPIV3载体EBOV疫苗。该疫苗保持了免疫原性，并完全保护豚鼠免受EBOV的致命挑战。最重要的是，该疫苗逃避了预先存在的HPIV3免疫。去除HN和F蛋白导致Ebola GP蛋白的表达水平更高。与此同时，也实现了病毒载体的减毒。同样，作为EBOV疫苗的IN传递，报告了一种表达EBOV GP膜锚定形式的减毒重组人类副流感病毒1型（rHPIV1）。GP经过密码子优化，表达为全长蛋白或工程嵌合形式，其中其TM和CT域（TMCT）被HPIV1 F蛋白所取代，以增强包装到载体颗粒中并提高免疫原性。GP基因插入到带有P/C基因（CΔ170）稳定减毒突变的rHPIV1的N基因之前（pre-N）或N和P基因之间（N-P）。这些构建物生长到高滴度并稳定表达EBOC GP。此外，重组病毒被减毒，在非洲绿猴的呼吸道中几天内以低滴度复制。从pre-N位置表达GP的候选物的两剂量比N-P病毒引发了更高的NAbs，未修改的GP比其TMCT对照物引发了更高水平的NAbs。未修改的EBOV GP被包装到HPIV1颗粒中，TMCT修饰并没有增加包装或免疫原性，反而降低了体内复制过程中GP表达的稳定性。这项研究表明，TMCT替代并不总是增强异位蛋白的整合和疫苗的免疫原性，这是由特定病原体的属性决定的。代表性的基于PIV载体的人类疾病疫苗总结在表4中。 麻疹病毒载体。活减毒麻疹病毒（MeV）疫苗是临床中最有效和安全的人类疫苗之一。因此，MeV疫苗的制造业已经非常成熟。鉴于MeV疫苗的显著成功，这种病毒被认为是针对其他疾病的病毒载体疫苗的支柱。其中，MeV株Schwarz和Moraten经常被应用为支柱。在基于MeV的疫苗方面取得了显著进展。表达不同形式抗原的MeV基疫苗提供对呼吸道疾病的保护：同源初免-加强免疫使用具有复制能力的rMeVs表达全长、截断或可溶形式的MERS-CoV S糖蛋白，在MeV易感小鼠中诱导了高水平的rMeV和MERS-CoV NAbs和T细胞。在MERS-CoV挑战后，接种疫苗的小鼠肺部病毒载量显著降低，与肺部病理变化减少相一致，表明rMeV-MERS疫苗对MERS-CoV感染提供完全保护。MeV表达的S的可溶版本没有增强NAb滴度，并且与表达全长MERS-S的MeV相比，略微损害了复制。这些结果表明，S蛋白的可溶结构阻碍了重组病毒的组装。同样，表达密码子优化S糖蛋白（S）的rMeV在小鼠中是免疫原性的。 麻疹病毒（MeV）基COVID-19疫苗的开发尝试：这些临床前候选物是通过携带膜锚定的野生型S蛋白、融合前稳定的S蛋白（S-2P）或带有自三聚体“foldon”结构域的分泌型S-2P构建的。两者在动物模型中都被证明是有效的。此外，新版本还被设计为编码在十二面体迷你铁蛋白骨架上展示的融合前稳定的、三聚体化的SARS-CoV-2 S糖蛋白。麻疹病毒表面糖蛋白被修改以绕过抗麻疹抗体。MeV基COVID-19疫苗的优化版本在小鼠中诱导了高滴度的NAbs。这些抗原工程策略也可能适用于麻疹基疫苗针对其他新出现的β冠状病毒。 不幸的是，在I/II期临床试验中，表达融合前稳定SARS-CoV-2 S蛋白（V591）的MeV基COVID-19疫苗在单次肌肉注射后的免疫原性不足，特别是在麻疹免疫个体中。目前，低免疫原性与抗载体免疫之间的关系尚不清楚。最重要的是，动物模型中进行了腹腔注射，而临床试验中应用了肌肉注射，这可能有助于解释临床前和临床试验结果之间的矛盾。 除了涉及另一个转录单元共同表达外源抗原的上述策略外，还构建了MeV的嵌合版本，其中MeV F和H的CT和TM域被保留，而MeV F和H的外细胞域分别被RSV F和G替代。嵌合MeV/RSV在棉鼠中诱导了针对RSV的NAbs，并在挑战后显著降低了病毒载量。外细胞域替代策略可能同样适用于其他副黏病毒，但在改变进入受体的趋向性时需要严格监控。 MeV基疫苗针对虫媒传播疾病：西尼罗河病毒（WNV）是一种节肢动物传播的黄病毒，导致众多人类脑炎病例。通过表达WNV的包膜糖蛋白构建了MeV基疫苗候选物（MeVSchw-sE）。MeVSchw-sE的腹腔注射在小鼠和松鼠猴中诱导了高水平的特异性抗WNV NAbs和对WNV致命挑战的保护。基孔肯雅病毒（CHIKV）是一种蚊子传播的甲病毒，导致严重的多关节炎。表达CHIKV衣壳和包膜结构蛋白的rMeV导致了病毒样颗粒（MeV-CHIKV）的配方。MeV-CHIKV引发了广谱和高滴度的CHIKV抗体以及细胞免疫反应。所有小鼠在单次腹腔注射免疫后对CHIKV的致命挑战存活了下来。免疫血清的被动转移对天真小鼠提供了保护，突出了体液免疫反应在保护CHIKV中的重要作用。MeV-CHIKV的最终临床前评估在猕猴中进行。同源初免-加强接种MeV-CHIKV保护了猕猴免受CHIKV挑战后的异常临床症状、病毒血症、血细胞指标、细胞因子变化。 这种基于Schwarz株的rMeV编码CHIKV VLP已经在I/II期临床试验中进行了。尽管存在预先存在的抗MeV免疫，MeV-CHIKV仍然具有良好的耐受性和免疫原性，免疫力持续了6个月。需要两剂量才能达到100%的血清转化率。此外，6个月后的疫苗加强似乎在更大程度上增加了NAb滴度。通过表达LASV的GPC、GPC + NP或GPC + Z蛋白，分别构建了MeV基拉沙热疫苗。在猕猴中，MeV-GPC + NP在单次皮下（SC）剂量疫苗接种后的免疫反应和挑战后保护效果方面被确定为最佳时间表。进一步评估证实，单次SC剂量的MeV-GPC + NP保护了猕猴免受同源（Josiah，第四系）和异源（第二系和第七系）LASV菌株的侵害。在单剂量MeV-GPC + NP疫苗接种后一年，100%的猴子免受同源致命挑战的侵害。这些研究表明MeV-GPC + NP对LASV提供了长期和广谱的保护。目前，MeV-GPC + NP的I期临床试验正在进行中（NCT04055454）。 鉴于VSV基疫苗共表达ZIKV的prM和E蛋白的理想结果，构建了编码ZIKV prM和可溶性E蛋白（MV-Zika-sE）的重组MeV。通过腹腔注射两剂量的MV-Zika-sE对小鼠进行了免疫。接种MV-Zika-sE的小鼠免受体重减轻和血浆病毒血症的侵害。还有人试图筛选表达ZIKV-E、NS1或两者的MeV基疫苗构建物的小组。尽管MeV-E2在小鼠中提供了100%的生存率，但并未实现完全病毒清除。需要NS1才能提供完全保护。代表性的基于MeV载体的人类疾病疫苗总结在表5中。 新城疫病毒载体。新城疫病毒（NDV）是另一种高度传染性的副黏病毒，可在禽类中引起不同程度的疾病，但在宿主限制上表现出严格的行为。在哺乳动物中，NDV触发了干扰素反应，限制了NDV的复制，同时对适应性免疫产生了佐剂效应。低毒力NDV株，如LaSota和B1，被广泛用作致死性NDV的活减毒疫苗，并用于兽医和人类疫苗的工程。 通过在附加的转录单元中表达SARS-CoV的S蛋白，开发了基于NDV的SARS-CoV疫苗。在两次IN剂量疫苗接种后，非洲绿猴发展了针对SARS-CoV的高滴度NAbs。在高剂量SARS-CoV挑战后，与对照动物相比，肺组织中的病毒滴度显著降低。 基于NDV的COVID-19疫苗已经构建并在临床前和临床中进行了评估。先前的抗原工程策略在基于NDV的COVID-19疫苗中再次出现，包括通过引入6个脯氨酸稳定S蛋白，以及添加NDV融合蛋白的TM和CT域以增强S蛋白在病毒颗粒表面的表达。代表性地，rNDV‐S是通过在NDV载体基础上表达SARS-CoV-2的S蛋白构建的。在小鼠中，rNDV‐S通过肌肉免疫诱导了体液和细胞免疫，尽管通过IN注射没有检测到NAbs，但诱导了更高S特异性T细胞反应。同样，与肌肉注射相比，仅通过IN接种的rNDV‐S在猪中的免疫原性较低，尽管两种递送途径的组合诱导了强烈的NAbs。有趣的是，通过IN接种的活rNDV‐S在仓鼠中诱导了与肌肉注射相当的抗体反应和保护效果。这些概念验证研究说明了rNDV‐S疫苗的动物模型依赖性，强调了需要明确准确反映人类接种后状态的动物模型的必要性。 灭活的rNDV‐S在I期临床试验中进行了评估，证明是安全和具有免疫原性的。的确，这种疫苗候选物可以廉价且可扩展地生产。然而，基于NDV的灭活疫苗似乎不如针对COVID-19的新型蛋白疫苗那么有吸引力。活rNDV‐S也在I期临床试验中通过肌肉注射、IN注射或IN后肌肉注射的初免-加强方案进行了评估。活rNDV‐S安全且耐受性良好。肌肉注射和IN后肌肉注射被证明具有免疫原性。表面上，猪中rNDV‐S的临床前评估似乎更好地反映了人类的临床结果。然而，由于存在不平等，应该解决复杂的问题，因为这些IN递送途径存在差异。对于IN接种，人类和猪通过鼻喷雾装置给药，而仓鼠在麻醉下给药，这使得rNDV‐S深入分布，更有可能代表气雾吸入疫苗。因此，应该小心设计和处理临床试验，以防在递送途径中存在微妙的划分。 通过表达来自IFV的嵌合HA，已经开发了针对NDV和高致病性禽流感（HPAI）的双价rNDV疫苗。这些疫苗候选物可以提供不同IFV系之间的交叉保护。与基于NDV的COVID-19疫苗类似，通过肌肉注射的灭活rNDV比IN接种更具免疫原性。这可以通过活NDV的粘膜趋向性来解释，而灭活NDV显示更多的抗原蛋白，并从佐剂效应中受益。目前基于NDV的IFV疫苗被用作墨西哥的兽医疫苗。 由于NDV是一种强大的干扰素产生和树突细胞成熟诱导剂，一种表达RSV融合糖蛋白的重组NDV被施用于BALB/c小鼠。单次IN剂量的疫苗接种保护了动物免受RSV挑战。在棉鼠中的进一步评估表明，疫苗接种也保护了它们免受RSV挑战，并在6个月内诱导了长期存活的NAbs。 与基于PIV3的EBOV疫苗相比，同一团队开发了一种表达EBOV GP的基于NDV的EBOV疫苗，称为NDV/GP。在通过NDV/GP进行一次IN加IT剂量接种后，与HPIV3/GP在猕猴中诱导的相比，EBOV特异性结合抗体和NAbs不可检测或较低。加强疫苗接种导致血清IgG ELISA滴度大幅增加，但仍然低于第二次HPIV3/GP接种诱导的滴度。相反，呼吸道中的分泌型IgA滴度和NAbs等于第二次HPIV3/GP接种后诱导的水平。这些结果表明，基于NDV的EBOV疫苗等同于或略逊于基于PIV3的EBOV疫苗的免疫原性，特别是在单剂量方案中。为了克服Ad5的抗载体免疫，通过表达EBOV的GP蛋白生成了rNDV，并与AdV-5-MakGP结合，作为一种异源初免-加强策略。这种策略在小鼠中比接受相同疫苗两次的产生了更强的EBOV GP特异性抗体和细胞免疫反应。这些结果表明，AdV-5初免-NDV加强方案在刺激EBOV特异性免疫方面比同源方案更有效。代表性的基于NDV载体的人类疾病疫苗总结在表6中。 1.2.4.流感病毒载体 单独或作为加强疫苗时，IN传递的基于IFV的COVID-19疫苗是有效的：现有的流感疫苗生产基础设施高度优化，每年能够交付超过十亿剂。为了对抗另一种呼吸道疾病，COVID-19，已经开发了多种基于IFV载体的疫苗。scPR8-RBD-M2被指定为一种单轮复制的基于IFV的COVID-19疫苗。利用嵌合基因编码基于2A肽的SARS-CoV-2 RBD和IFA M2的双顺反子蛋白盒。RBD的C末端连接到IFV HA的细胞质域，将RBD锚定在生产细胞和病毒包膜的表面。通过两次IN免疫，可以在小鼠中产生针对RBD的细胞、体液和粘膜免疫反应。疫苗诱导的抗体对SARS-CoV-2变体表现出广谱中和活性。MDCK-HA细胞提供的HA蛋白可能导致插入基因的不稳定性。为了解决这个问题，可以产生含有混合抗原/表位的疫苗混合物，以规避这些限制。Chaparian等人将SARS-CoV-2-RBD插入到IFV A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) HA中，接种这种组合疫苗的小鼠对SARS-CoV-2和IAV的致命挑战都产生了NAbs并提供了保护。 最近，基于一种冷适应的IFV株，没有NS1，制造了一种活减毒SARS-CoV-2疫苗，通过基因重组插入了SARS-CoV-2的RBD基因，称为CA4-dNS1-nCoV-RBD（dNS1-RBD）。在临床前研究中，dNS1-RBD通过在呼吸道引起强烈的先天和适应性局部免疫反应，对SARS-CoV-2挑战提供了快速、长期、广谱的保护，尽管循环中的反应较弱，这可能归因于鼻上皮中的先天免疫反应和局部交叉变体特异性T细胞免疫反应。通过疫苗接种，可以在肺部诱导RBD特异性的居住记忆CD4+和CD8+ T细胞，而且在小鼠中单剂量免疫后，肺部组织中产生的T细胞免疫反应比外周单核细胞（PBMCs）中的大约强26倍。此外，这种细胞免疫对大多数SARS-CoV-2 VOCs相对不受损害，特别是对最新的Omicron变体。此外，这种疫苗还提供对IFV H1N1和H5N1的交叉保护。在I/II期临床试验中，健康成年人通过IN接种接受了dNS1-RBD。dNS1-RBD在成年人中耐受性良好，观察到的疫苗相关不良反应不到20%，没有严重的不良事件。在I/II期试验中，疫苗接种者在第二次剂量后1个月，特异性T细胞免疫反应、RBD特异性IgG的血清转化率和RBD特异性s-IgA的阳性转化率分别为44%、10%和12%。总体而言，疫苗接种者对SARS-CoV-2的T细胞、体液和粘膜免疫反应较弱。这项研究提供了由于IN疫苗在管理过程中产生的气雾造成的交叉污染的证据，这可能有助于为未来其他IN疫苗的临床发展铺平道路。尽管通过与接种疫苗的人密切接触传播疫苗株的可能性被认为非常低。这个问题应该通过评估疫苗接种者的病毒脱落和特异性免疫反应、环境感染的概率来妥善解决。dNS1-RBD的III期临床试验正在进行中（ChiCTR2100051391）。值得注意的是，已经实现了对Omicron的广谱效果。dNS1-RBD对COVID-19住院治疗的总体保护效果为100%。对于没有免疫史的人，免疫后3个月dNS1-RBD的绝对保护效果为55%。对于有免疫史的人，鼻腔喷雾COVID-19疫苗在加强免疫后6个月内的绝对保护效果为82%（未公布数据）。2022年12月2日，dNS1-RBD在中国获得紧急使用批准。 基于IFV的疫苗针对其他病原体：冷适应的、活减毒流感疫苗（CAIV；FluMist，AstraZeneca，伦敦，英国）在2003年被美国食品药品监督管理局批准为安全有效的疫苗，并获准用于2-49岁的人群。在FluMist的人类挑战试验中，低抗体反应与低保护效果没有直接关联。在接受单剂量的103名18-45岁成年人中，IAV/H1N1、IAV/H3N2和IBV/Harbin的血凝抑制抗体的血清阳性率分别为23%、33%和3%，鼻腔冲洗中IgA抗体的反应率分别为14%、32%和18%。令人鼓舞的是，病毒挑战结果表明，FluMist对A/H1N1、A/H3N2和B/Harbin的保护效果分别为80%、78%和100%，高于诱导更高血清反应率（91%、76%和76%）的肌肉注射疫苗候选物（60%、67%和100%）。同样，PIV5/G疫苗在棉鼠中没有产生可检测的NAbs水平，但仍然提供了对RSV挑战的保护。以上结果表明，除了外周抗体反应外，免疫反应可能为这些呼吸道疾病提供保护益处。 我们的团队基于冷适应的（ca）IBV B/Vienna/1/99骨干构建了一种H5N1嵌合IAV/B疫苗。插入了修饰的H5N1 HA，同时保留了IBV HA的包装信号。重组病毒保持了温度敏感和冷适应表型。H5N1疫苗在小鼠中减毒。诱导了系统性体液和细胞免疫以及局部粘膜IgA。两次IN接种H5N1疫苗候选物在小鼠中对IFV H5N1的致命挑战提供了完全保护。2021年，在A/Switzer land/9715293/2013 (H3N2) HA的N末端插入了IFV离子通道蛋白M2（M2e）的保守胞外域（4 × M2e）。这种疫苗的鼻腔接种在小鼠中诱导了抗体和T细胞免疫反应，从而实现了对H1N1、H3N2、H5N1、H7N9和H9N2病毒的保护。代表性的基于IFV载体的人类疾病疫苗总结在表7中。 1.2.5 腺病毒载体 同源或异源初免-加强接种AdV基疫苗可提供针对病毒性出血热的保护：5型腺病毒（Ad5）是最常用的腺病毒载体，它已经建立并易于获取。在临床前试验中，猕猴在初次接种DNA疫苗后，通过复制缺陷型Ad5载体疫苗候选物Ad5-EBOV编码EBOV GP进行加强免疫。这些动物产生了强烈的细胞和体液免疫，并获得了完全的交叉保护。将接种疫苗动物的多克隆抗体被动转移到天真猕猴中未能提供针对EBOV致命挑战的保护，而体内CD8+细胞的耗竭则取消了对NHPs的保护。这些结果表明，CD8+ T细胞在rAd5-EBOV诱导的针对EBOV感染的免疫保护中起主要作用。在I期临床试验中，Ad5-EBOV安全且具有免疫原性。然而，预先存在的抗载体免疫影响了体液反应。同样，单一肌肉注射剂量的Ad5-MakGP，一种表达EBOV Makona株GP的重组Ad5，为NHPs提供了无菌免疫和100%的保护。在I期临床试验中，Ad5-MakGP显示出良好的安全性和免疫原性。观察到免疫反应的剂量依赖性幅度。EBOV特异性抗体反应和T细胞反应都被抗载体免疫的存在所削弱，特别是在低剂量组中。初次免疫后6个月用Ad5-MakGP进行同源加强免疫，刺激了更强的体液免疫反应。加强免疫一年后，仍可检测到100%阳性率的GP抗体。根据Ad5-MakGP在塞拉利昂的II期临床试验的临床结果，当疫苗剂量增加到8 × 1010个病毒颗粒时，疫苗不良反应是可以接受的，并且发生率甚至低于I期临床试验。然而，非洲参与者中EBOV特异性抗体的持续时间比中国参与者短，这也在非洲和欧洲的rVSV-ZEBOV临床试验中看到。在Ad5-MakGP的I/II期临床试验中，rVSV-ZEBOV + Ad5-EBOV初免-加强方案诱导了强烈的免疫反应。异源初免-加强策略可以迅速唤醒免疫记忆，并诱导更强的免疫反应，同时减轻抗载体免疫的影响。2015年12月，俄罗斯批准了这种疫苗的注册。 腺病毒26型（Ad26）是另一种有前途的疫苗载体，其血清阳性率低于Ad5。也构建了基于Ad26的EBOV疫苗。Ad26-ZEBOV疫苗候选物的单一肌肉注射剂量在NHPs中提供了部分保护。随后用腺病毒35型（Ad35）-ZEBOV加强免疫显著增加了体液和细胞反应，并提供了完全保护。 关于重组黑猩猩腺病毒（ChAdVs）诱导的免疫反应的质量和幅度，它们同样被用作病毒载体。基于ChAdVs的疫苗唤起了与人类AdV载体相似的体液和细胞免疫反应。黑猩猩腺病毒3型（ChAd3）载体双价疫苗（cAd3-EBO）编码EBOV和SUDV的GP，在猕猴中诱导了优越的体液和细胞反应，并与黑猩猩腺病毒63型（ChAd63）和（MVA）载体疫苗相比，对EBOV挑战提供了统一的保护。用MVA载体疫苗加强cAd3-EBO，在NHPs中产生了对致命挑战的持久保护。急性保护与抗体反应强烈相关，而长期保护需要产生效应和记忆CD8+ T细胞反应和细胞因子。在I期临床试验中，cAd3-EBO安全并诱导了剂量依赖的免疫反应。基于ChAd3的单价疫苗（ChAd3-EBO-Z）编码ZEBOV的GP也已构建。在I期临床试验中，ChAd3-EBO-Z诱导的抗体略低于rVSV-ZEBOV诱导的抗体。当ChAd3-EBO-Z用MVA-EBO-Z加强时，病毒特异性抗体和CD8+ T细胞分别增加了12倍和5倍。用ChAd3-EBO-Z初免的参与者在免疫后6个月病毒特异性抗体反应仍呈阳性，但显著低于接受MVA-EBO-Z加强的个体。其他I期试验验证了ChAd3-EBO-Z的安全性和免疫原性。此外，涉及ChAd3-EBO-Z和MVA-BN-Filo（MVA载体疫苗候选物，表达ZEBOV GP、SUDV GP和MARV-Musoke GP）的初免-加强策略提供了持久保护。免疫反应在12个月内基本维持。 还在MARV上进行了DNA初免-Ad5加强策略。基于DNA或Ad5平台，通过表达EBOV GP构建了疫苗候选物DNA-MARV-GP和rAd5-MARV-GP。在NHPs中，比较了异源DNA-MARV-GP/rAd5-MARV-GP初免-加强策略、单剂量rAd5-MARV-GP方案和DNA-MARV-GP同源初免-加强策略的保护效果。所有三种方案都防止了NHPs的EBOV致命挑战。单一剂量的rAd5-MARV-GP接种诱导了与两剂量DNA疫苗相当的体液和细胞反应。包含rAd5-MARV-GP的疫苗方案，无论是单独使用还是作为加强剂，都表现出CD8+ T细胞主导的细胞反应。CD8+ T细胞亚群的主导地位与临床症状的低频率呈正相关，表明CD8+ T细胞的幅度和功能表型决定了疫苗对MARV感染的效果。 Maruyama等人开发了一种表达LASV-GPC的Ad5载体疫苗候选物，称为Ad5-LASV。两剂量的Ad5-LASV为豚鼠提供了完全保护。所有接种疫苗的动物产生了抗GP抗体，而只有37.5%产生了NAbs。在致命LASV挑战后，接种疫苗的豚鼠中未观察到可检测的病毒。Zivcec等人构建了一种基于Ad5的疫苗候选物Ad-CCHFV-N，该候选物表达CCHFV的核蛋白。Ad-CCHFV-N诱导了抗N的体液免疫反应。Ad-CCHFV-N的单剂量疫苗接种为IFNAR−/−小鼠提供了针对致命CCHFV挑战的30%保护，而初免-加强方案将保护效果提高到78%。这项研究证明了遗传保守的N蛋白作为针对CCHFV的保护性抗原的可行性。 ChAdOx1是一种复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体，在人类腺病毒E中分类。Warimwe等人构建了一种复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体疫苗，称为ChAdOx1-GnGc，编码RVFV的Gn和Gc。ChAdOx1-GnGc在小鼠中诱导了强大的RVFV特异性NAbs和CD8+ T细胞反应。每种疫苗候选物的单剂量都保护了小鼠免受致命RVFV挑战。与此同时，两种商业可获得的佐剂，Matrix-M™和AddaVax™，被证明显著增强了ChAdOx1-GnGc诱导的RVFV特异性中和反应。ChAdOx1-GnGc的单剂量疫苗接种引起了与已获得许可的家畜疫苗Smithburn相当的强效NAb，并在最易感的自然宿主物种绵羊、山羊和牛中提供了完全保护，以应对挑战。 在COVID-19疫苗方面取得了显著进展。在COVID-19大流行期间，设计了疫苗候选物Ad5-nCoV以传递SARS-CoV-2的S蛋白。在I/II期临床试验中，Ad5-nCoV的单剂量肌肉注射在健康成年人中是可耐受的，并且具有免疫原性，诱导了结合抗体、NAbs和SARS-CoV-2特异性T细胞反应。然而，预先存在的抗载体免疫损害了SARS-CoV-2 NAbs的血清转化，并减少了接种后的T细胞反应。III期临床试验的结果表明，在疫苗单剂量注射后14或28天，总体保护效果分别为68.83%和65.28%。14或28天的严重疾病的保护效果分别为95.47%和90.07%。2021年2月5日，Ad5-nCoV的有条件上市申请获得批准。 哈佛医学院构建了一种基于Ad26的COVID-19疫苗，称为Ad26.COV2.S，其中包含野生型SARS-CoV-2引导序列、全长膜结合S蛋白、在弗林切割位点的突变以及两个脯氨酸稳定突变。Ad26.COV2.S的单次肌肉注射剂量在NHPs中诱导了强大的NAbs，并在SARS-CoV-2挑战后的支气管肺泡灌洗液和鼻拭子中提供了完全或近乎完全的保护。俄罗斯开发并在I期临床试验中测试了单剂量的基于rAd26载体的COVID-19疫苗（卫星光），在血清阴性和血清阳性参与者中均显示出良好的安全性，并诱导了强烈的体液和细胞免疫反应。根据Ad26.COV2.S单剂量在III期临床试验中的有效性和安全性分析，Ad26.COV2.S对中度至重度关键COVID-19提供了52.9%的保护，保护作用持续了6个月。 牛津大学开发了一种基于ChAdOx1的COVID-19疫苗，编码密码子优化的全长S基因，称为ChAdOx1-S。在猕猴中，ChAdOx1-S诱导了一定水平的免疫反应，但保护效果并不理想。初免-加强方案在猪中显著增强了抗体和T细胞反应，但小鼠中没有。在I/II期和II/III期临床试验中，ChAdOx1 nCoV-19被耐受，大多数志愿者观察到体液和细胞免疫反应，在HIV感染个体中诱导了可比的T细胞反应。抗体和保护效果至少持续了3个月。两剂量疫苗的整体有效性为70.4%。然而，III期临床试验曾因一例横贯性脊髓炎的病例报告而暂停。此外，疫苗接种相关的血栓是可能的。ChAdOx1的这些安全问题需要进一步评估。 异源初免-加强策略是减轻抗载体免疫的有效对策。俄罗斯开发了基于rAd26和rAd5载体的异源初免-加强COVID-19疫苗，称为卫星V。与单剂量策略相比，基于异源rAd26和rAd5载体的COVID-19疫苗在参与者中诱导了明显更强的体液和细胞免疫反应。在I/II期研究中，卫星V在所有参与者中诱导了显著的体液反应，血清转化率为100%。在涉及近2万名受试者的III期试验中，报告了91.6%的保护效果。代表性的基于AdV载体的人类疾病疫苗总结在表8中。 1.2.6.痘病毒载体 结合其他疫苗平台的异源初免-加强策略：已有多次尝试通过使用更强的启动子、删除负责免疫调节的基因，以及将MVA181R/182 R替换为抗凋亡基因B13R来提高基于痘病毒载体的疫苗的免疫原性。不幸的是，这些尝试未能取得突破。通过与其他病毒载体疫苗候选物的初免-加强策略，可以改善痘病毒载体疫苗的保护效果。在一项随机临床试验中，进行了涉及AD26-ZEBOV和MVA-BN-Filo的初免-加强方案。在疫苗接种和8个月的随访期间，没有观察到严重的疫苗相关不良事件。Ad26-ZEBOV接受者的血清转化率高于MVA-BN-Filo组。所有疫苗接受者在接受替代疫苗加强和8个月随访后均有可检测的病毒特异性IgG。用Ad26-ZEBOV初免和MVA-BN-Filo加强引发了更强烈的细胞和体液免疫反应，持续了长达1年。Ad26-ZEBOV + MVA-BN-Filo方案于2020年7月1日获得EMA批准。 基于ChAdOx1和MVA，构建了一种基于保守区域的交叉丝状病毒免疫原，涉及丝状病毒N、M和L蛋白。这种疫苗候选物在小鼠中引发了针对埃博拉和MARV的保护。在缺乏GP特异性抗体和NAbs的情况下，ChAdOx1-MVA载体初免-加强策略引发了T细胞免疫并提供了完全保护，进一步证明了异源初免-加强策略的显著效果。对于具有复杂或多个免疫原优势蛋白的病原体，表达不同抗原的初免-加强策略是一种有前景的策略。Guillaume等人开发了分别表达NiV糖蛋白G和融合蛋白F的VACV载体疫苗，称为VV-NiV.G或VV-NiV.F。两剂量的VV-NiV.G或VV-NiV.F或联合两剂量方案在仓鼠中诱导了结合抗体和相对较低滴度的NAbs，并提供了100%的挑战后保护。此外，免疫血清的被动转移实验证明，抗体在免疫保护过程中发挥了重要作用。同样，使用鹦鹉痘病毒（ALVAC）载体构建了ALVAC-G和ALVAC-F。尽管所有方案都实现了完全保护，但接种ALVAC-F的猪显示低NAbs和少量病毒脱落，与基于VSV的NIV疫苗一致。接种两种抗原（ALVAC-F/G）的猪对HeV发展了中等水平的中和滴度。联合使用ALVAC-G和ALVAC-F诱导了最高水平的NAbs和抗原特异性抗体，很可能实现无菌免疫。猪的病毒脱落也被有效阻断，表明在切断NiV从猪到人的传播链中具有重要意义。 在III期临床试验中，ALVAC载体HIV疫苗ALVAC-HIV与重组糖蛋白120亚单位疫苗一起使用。然而，保护效果存在争议。表达基于痘病毒载体的VLP：VLP可以模拟天然病原体并呈现抗原的天然表达。Co-expression of VP40 and GP protein in EBOV resulted in the formation of EBOV-VLP and provided effective protection against challenge. Schweneker等人开发了MVA-BN-EBOV-VLP，其中基于MVA-BN载体共表达了EBOV Mayinga株的VP40和GP以及Tai森林病毒埃博拉的NP。感染MVA-BN-EBOV-VLP的人类细胞产生了大量EBOV VLPs，同时排除了痘病毒膜蛋白B5。接种MVA-BN-EBOV-VLP的小鼠产生了与MVA-BN-EBOV-GP定量相当的EBOV GP特异性细胞和体液免疫反应。同样，GP和VP40的共表达导致了VLPs的产生。然而，与MVA-BN-EBOV-GP相比，MVA-BN-EBOV-VLP疫苗候选物在免疫反应方面没有明显优势。此外，尽管1或2剂量的MVA-VLPs疫苗接种实现了完全保护，但在一些接种的豚鼠和NHPs中检测到低水平的短暂病毒血症。为了针对多种致病性EBOV物种，Karnail等人开发了一种包含ZEBOV和SUDV GP的双价球形埃博拉VLP疫苗。用双价VLPs接种的猕猴产生了强大的体液和细胞免疫反应。同时包含EBOV GP和SUDV GP显著扩展了与单独EBOV GP相比的NAbs和ADCC反应的广度。 GEO-LM01是一种基于MVA的疫苗，表达LASV GPC和Z蛋白，可以产生LASV VLPs。GEO-LM01的单次肌肉注射剂量在小鼠中诱导了高水平的CD4+和CD8+ T细胞，并提供了100%的针对LASV ML29的保护。Co-expression of ZIKV structural proteins PrM and E based on MVA resulting in the assembly of ZIKV VLPs. MVA-ZIKV VLPs induced potent NAbs and cellular immunity dominated by CD8 + T cell responses in mice.此外，MVA-ZIKV的单剂量在易感的免疫功能低下的IFNAR−/−小鼠中显著减少了ZIKV挑战后的病毒血症。 其他处于临床阶段的痘病毒载体疫苗：基于MVA的CCHFV（克里米亚-刚果出血热病毒）、MERS-CoV（中东呼吸综合征冠状病毒）和SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒2）疫苗已经被构建并推进到临床试验阶段。 单剂量的MVA载体疫苗候选物表达MERS-CoV S蛋白（MVA-MERS-S）在小鼠模型中诱导了高水平的NAbs。免疫反应是剂量依赖性的。对肺和支气管的组织病理学分析表明，MVA-MERS-S限制了MERS-CoV在动物模型下呼吸道的复制。MERS-CoV主要由单峰骆驼引入，因此在骆驼中进行了MVA-MERS-S的评估。在两次疫苗接种后，MVA-MERS-S在单峰骆驼中诱导了系统和局部免疫。在两次剂量免疫后，用MERS-CoV挑战时，排出的传染性病毒和病毒RNA显著减少。保护效果与NAbs的存在有关。此外，接种的血清对骆驼痘病毒具有交叉中和活性。I期临床试验表明，两次MVA-MERS-S接种以剂量递增的方式诱导了抗原特异性抗体和T细胞反应。未观察到严重不良事件。在最后一次加强12 ± 4个月后的第三剂MVA-MERS-S加强，持续诱导了长达2年的MERS-CoV-S特异性B细胞和抗体。 MVA-SARS-CoV-2-S是通过在MVA载体基础上表达全长SARS-CoV-2 S蛋白构建的。在两次疫苗接种后，在小鼠、黄金仓鼠和猕猴中诱导了针对SARS-CoV-2的结合IgG抗体和NAbs。在SARS-CoV-2挑战后，接种疫苗的动物显示出病毒载量、肺病理显著减少，并且无症状。肌肉注射、鼻内和腹腔内递送途径都已进行并证明有效。然而，没有进行MVA在相同动物模型中的点对点比较和递送途径依赖性方式。因此，很难确定最佳递送途径。代表性的基于痘病毒载体的人类疾病疫苗总结在表9中。 慢病毒载体（LV），最初来源于人类免疫缺陷病毒（HIV），是理想的疫苗平台，因为它们即使在单剂量免疫后也能产生高度免疫原性和持久的免疫反应。LV的生产涉及在适当的细胞系中共转染转移载体、包膜和包装质粒。待定，LV的复制和整合可以通过操纵长末端重复序列（LTRs）、包装信号和整合酶基因来废除。除了HIV，基于单剂量LV的疫苗在寨卡病毒和SARS-CoV-2的临床前研究中取得了进展，已被证明是免疫原性的、免疫反应持久的，并且在挑战模型中具有保护性。长期免疫可能归因于LV在体内的持久转录。据报道，在注射后3-6个月或更长时间，可以在免疫的小鼠和NHPs中检测到转基因表达。在细胞水平上，LV以染色体外形式存在，并为细胞的寿命产生编码蛋白，这引发了关于潜在插入突变的安全性问题的整合载体。与上文讨论的VSV/RABV ΔG策略类似，LVs的抗载体免疫可以与VSV GP血清型交换策略相结合，甚至是其他包膜糖蛋白。 病毒载体疫苗的粘膜递送诱导局部和外周免疫反应。粘膜递送和触发局部和系统免疫反应是病毒载体疫苗的非凡特征。通常，疫苗的粘膜递送途径包括鼻内、气管内、口服（OR）、气雾吸入等。已研究了通过鼻内或口服递送的VSV载体疫苗。当rVSVΔG/ZEBOVGP疫苗通过IN、OR或IM途径给予时，NHPs对ZEBOV的致命挑战100%保护。重组疫苗的IN免疫似乎比IM免疫更具免疫原性。对于COVID-19，通过rVSVΔG-S在黄金仓鼠和NHPs中的IN免疫比IM免疫显著提高了NAbs，并提供了更好的挑战后保护。在人类临床试验中，单剂量IM给药的rVSV-SARS-CoV-2的抗体反应不理想。这种令人失望的结果可能与疫苗递送途径的选择有关。对于呼吸道疾病，基于VSV的复制型COVID-19疫苗可以通过呼吸道更好地模拟SARS-CoV-2的自然感染过程，从而引发强烈和保护性的免疫反应。组织趋向性和血管紧张素转换酶2（ACE2）的表达和丰度，SARS-CoV-2的受体，可能有助于阐明rVSV-SARS-CoV-2在人类和动物模型中的递送途径依赖性方式。ACE2在上呼吸道和肺部广泛分布，而在骨骼肌中的分布较低。在SARS-CoV-2疑似动物模型中的挑战研究支持了这一假设。类似的结果在rVSV载体MERS疫苗的临床前研究中也有所呈现。 RABV载体作为口服双价狂犬病疫苗，被称为rERAG333E，其中包含RABV ERA株G蛋白的G333E突变。随后，拯救了表达ZEBOV或SUDV糖蛋白的重组病毒rERAG333E/ZGP和rERAG333E/SGP。两种疫苗在小鼠中诱导了病毒特异性NAbs和结合抗体反应。然而，rERAG 333E/ZGP诱导的ZEBOV NAbs低于通过OR或IM途径的VSV载体埃博拉疫苗。所有通过OR途径接种rERAG333E/ZGP的狗都发展了针对ZEBOV的持久NAbs，尽管预先存在抗RABV免疫。此外，基于rERAG333E载体表达NIV马来西亚株的附着糖蛋白（NIV-G）或融合糖蛋白（NIV-F）的rERAG333E/NiVG和rERAG333E/NiVF被构建。在小鼠和猪中通过OR免疫后，rERAG333E/NiVG和rERAG333E/NiVF均诱导了RABV和NIV NAbs以及高水平的NIV-G或NIV-F特异性Ig G。这项研究首次提供了一种安全方便的NIV口服疫苗。因此，活的rERAG333E是RABV和其他病原体流行区自由漫游动物的潜在口服双价疫苗。 基于PIV和NDV的粘膜疫苗已在本综述的第二部分中总结。这些通过IN递送的疫苗为儿科疾病和呼吸道疾病提供了独特的优势。此外，已在病毒性出血热中进行了初步应用，其效果似乎不如呼吸道疾病。有趣的是，PIV5-G表达RABV G通过IN、IM和OR免疫在小鼠中诱导了针对致命RABV挑战的保护性免疫反应，被作为有效的副黏病毒载体口服狂犬病疫苗。这符合无针疫苗策略，保护流浪狗和野生动物免受狂犬病的侵害。目前，粘膜递送的IFV载体疫苗仅限于呼吸道疾病。外源基因表达的有限大小和稳定性问题阻碍了IFV在其他传染病中的合理应用。 腺病毒（AdV）载体疫苗与粘膜递送兼容，这归功于它们独特的组织趋向性，涉及上呼吸道、下呼吸道、胃肠道或结膜。与肌肉注射免疫相比，Ad5-EBOV的鼻内（IN）给药同样能够为小鼠、豚鼠和非人灵长类动物（NHPs）提供完全保护，使其免受致命挑战。此外，IN给药可以绕过对Ad5载体的预先存在的免疫力。在仓鼠中，Ad5载体COVID-19疫苗通过口服或鼻内递送减少了疾病的严重程度和传播。异源加强免疫接种，使用雾化Ad5-nCoV在两次灭活COVID-19疫苗初免后，是安全且高度免疫原性的，NAbs显著高于同源初免加强策略。ChAdOx1 nCoV-19也在临床试验中通过IN递送进行了测试。只有少数参与者在IN疫苗接种后检测到粘膜反应，这些反应通常低于SARS-CoV-2感染后所见。IN疫苗接种后的系统反应通常比ChAdOx1 nCoV-19肌肉注射后的反应更弱。有趣的是，在IN疫苗接种后，接种了mRNA疫苗的参与者中可检测到粘膜抗体。Vaxart开发了一种口服片COVID-19疫苗，由Ad5载体表达SARS-CoV-2的S和N基因以及RNA佐剂组成。在I期临床试验中，该疫苗耐受性良好。疫苗接种者显示出粘膜分泌型IgA的增加，持续时间长达360天。然而，没有观察到血清NAbs。其对COVID-19的保护效果需要进一步研究。上述结果表明，粘膜疫苗可能是新型COVID-19疫苗的重要补充资源。同样，通过IN和IM途径单剂量免疫ChAdOx1-S表达MERS-CoV S蛋白，也在致死转基因BALB/c小鼠模型中诱导了强烈的免疫反应，并提供了对致命挑战的保护。 在上述概念验证研究中，基于VSV的疫苗通过IN或OR递送，在病毒性出血热和β冠状病毒中表现良好。IN递送途径甚至比IM递送更具免疫原性。这可能归因于VSV的快速复制和丰富的抗原表达，同时与复杂的肺部免疫环境有关，这使得大量抗原呈递并触发了局部和系统的免疫反应。RABV载体作为口服狂犬病疫苗参与，诱导了持久的免疫反应。然而，RABV基疫苗的其他粘膜递送途径尚未得到充分研究。PIV、NDV和IFV载体疫苗主要设计为IN递送方案，特别是在呼吸道疾病中。这些单剂量疫苗具有免疫原性和保护性。与基于VSV的疫苗中所见类似，AdV基EBOV疫苗的IN给药比IM免疫提供了更好的保护。这一现象进一步证实了IN接种的潜力。然而，正如所讨论的，这些病毒载体疫苗通过不同的方案设计和递送，针对不同的抗原，使得粘膜递送的平行比较不适用。据我们所知，粘膜递送的潜力可能与重组病毒的复制能力密切相关。 在不久的将来，这些病毒载体疫苗的粘膜递送值得进一步研究。特别是，粘膜免疫与保护效果之间的关系应该明确界定。 病毒载体作为癌症治疗疫苗的应用。免疫疗法是癌症治疗中的一种有效方法，其中溶瘤病毒疗法是肿瘤免疫疗法的一个重要分支。简而言之，溶瘤病毒（OVs）是自然发生或基因工程改造的，它们优先在肿瘤细胞中复制并选择性地杀死肿瘤细胞，释放肿瘤相关抗原（TAAs），并通过外源基因递送刺激抗肿瘤免疫反应。目前，全球已有四种OV疗法获得批准，包括针对黑色素瘤、鼻咽癌、黑色素瘤和胶质瘤的Rigvir、Oncorine、Imlygic和Delytact。 图2 溶瘤病毒(OVs)的靶向和溶瘤机制。OVs靶向功能失常的信号通路。(1) 靶向Wnt信号通路，重组腺病毒表达肺癌抑制因子-1(TSLC1)，通过下调Tcf4/β catenin的转录活性，抑制CyclinD1和C-myc的表达，从而杀死Wnt异常激活的肝癌细胞。(2) 删除E1A(922-947)的AdVs复制并裂解肿瘤细胞。OVs针对肿瘤微环境(TME)的适应或改善。(3) VSV在缺氧条件下复制，eIF-2α的磷酸化亚基增加，并通过对翻译启动因子eIF-4E的去磷酸化抑制宿主细胞蛋白的翻译。(4) 缺氧诱导因子(HIFs)启动子被应用于AdV，以在缺氧条件下靶向递送基因。(5) VSV自然靶向血管内皮细胞并抑制肿瘤细胞的生长。(6) OVs表达血管生长因子抑制剂(sFlt-1)和抗血管生成细胞因子(IL-24)以抑制肿瘤血管生成。OVs靶向免疫抑制的TME。(7) 设计OVs表达多种细胞因子、趋化因子、免疫检查点抑制剂(ICIs)和新抗原。(8) 同时表达细胞因子(GM-CSF)和ICIs(iPD-L1)的OVs。(9) 编码新抗原的OVs和异源初免-加强策略(AdV+MVA)。(10) OVs激活免疫细胞进行肿瘤溶解。(11) 结合肿瘤特异性启动子衍生的转录靶向与转导靶向（通过病毒衣壳整合抗人癌胚抗原单变量域）。(12) 结合OV疗法与化疗、放疗和其他免疫疗法等。（使用BioRender创建） 与传染病的预防性疫苗相比，治疗性癌症疫苗更具挑战性，因为它们的活性可能会受到牢固的免疫抑制复杂肿瘤微环境（TME）和自体TAAs的低免疫原性的阻碍。有关OVs的靶向和溶瘤过程的几个方面，包括肿瘤细胞的表面受体、肿瘤相关信号通路、TME和抗肿瘤免疫细胞。通过基因组的改造和操纵，可以使OVs有效靶向并杀死肿瘤细胞，前提是选择了正确的肿瘤抗原，特别是所谓的肿瘤新抗原。针对肿瘤相关信号通路：肿瘤的发生和发展与细胞内信号通路的异常调节密切相关。Wnt信号通路在肿瘤中异常激活，主要是由于结肠腺瘤性息肉病的截断突变，使β-Catenin稳定形成，随后β-Catenin进入细胞核，结合Tcf/Lef家族转录因子并激活cyclin D、C-myc和其他Wnt靶基因，导致肿瘤发生。RB-E2F是另一个涉及肿瘤的信号通路。在正常细胞中，视网膜母细胞瘤肿瘤抑制蛋白（RB）通过招募组蛋白去乙酰化酶抑制E2F活性。当RB功能失常时，E2F释放并招募转录激活因子促进肿瘤的发生和发展。IFN信号通路与抗病毒免疫相关，同时也与肿瘤相关。IFN与干扰素受体（IFN-R）结合并诱导蛋白激酶R（PKR）的表达。当病毒的dsRNA结合到PKR时，激活的PKR导致elF-2α的磷酸化，抑制蛋白质合成，从而抑制病毒在细胞中的复制。OVs进入后，细胞IFN反应是溶瘤敏感性的关键决定因素。已设计出基因表达签名来预测溶瘤病毒治疗效果，指定恒定的IFN途径激活。基因工程化的OVs旨在作用于这些功能失常的信号通路。针对Wnt信号通路，构建了表达肺癌抑制因子-1的重组腺病毒Ad.wnt-E1A(Δ24bp)-TSLC1。Ad.wnt-E1A(Δ24bp)-TSLC1可以靶向并杀死Wnt信号通路异常激活的细胞，而对正常细胞没有明显的杀伤效果。进一步研究表明，TSLC1下调了Tcf4/β catenin的转录活性，并抑制了CyclinD1和C-myc的表达，从而杀死了Wnt异常激活的肝癌细胞，这在人肝癌SMMC-7721细胞的裸鼠移植瘤模型中得到了进一步证实。在AdV基因组中，E1A的922-947 bp是RB家族的结合区域。因此，删除E1A的922-947 bp构建了重组腺病毒dl922-947。感染RB缺乏的肿瘤细胞后，dl922-947可以复制并裂解肿瘤细胞。dl922-947还可以有效抑制乳腺癌异种移植模型中肿瘤转移的发生。正如所综述的，NS1蛋白是IAV的毒力因子，可以抵抗IFN信号通路中PKR介导的抗病毒反应。NS1缺失的IAV不能在正常细胞中复制，而激活的Ras可以在肿瘤细胞中去磷酸化PKR，因此NS1缺失的IAV可以在Ras激活的肿瘤细胞中复制。Bergmann等人敲除了IAV的NS1片段构建了delNS1。然后分别在正常细胞和表达N-ras基因的正常细胞中测试了delNS1。结果表明，delNS1选择性地在表达N-ras基因的正常细胞中复制，这证实了IAV作为一种有效的OV，针对IFN信号通路。因此，针对异常激活的信号通路可以提高OVs的靶向性。 靶向或改善肿瘤微环境（TME）的适应性：缺氧、新生血管生成和免疫抑制状态是决定肿瘤发生、进展和转移的微环境问题。因此，溶瘤病毒（OVs）通过改善缺氧环境、抑制新生血管生成和调节肿瘤的免疫抑制状态来发挥作用，相应地抑制肿瘤细胞的增殖和扩散。此外，OVs最常见的肿瘤靶向机制是处理与复制相关的基因，即在癌细胞中不需要复制功能的病毒基因的失活，但在健康组织中病毒复制是必需的。 巧合的是，在缺氧条件下，VSV在mRNA产生方面更有效。VSV能够在感染后期克服缺氧条件下增加的eIF-2α磷酸化亚基，并在感染初期抑制病毒蛋白合成。同时，VSV感染可以通过去磷酸化翻译启动因子eIF-4E来抑制宿主细胞蛋白翻译，这抑制了肿瘤细胞的生长和增殖。后来，在体外和体内证实了VSV的复制和细胞病变效应。缺氧诱导因子（HIFs）启动子也可以应用于缺氧下的靶向基因递送。作为肿瘤缺氧环境中的主要分子，HIFs在缺氧条件下被激活。缺氧诱导因子-1（HIF-1）通过直接结合缺氧反应元素（HRE）在缺氧条件下启动转录反应。因此，HIF-1和HRE基因是缺氧环境中肿瘤细胞的靶标。HYPR-Ad#1是一种改良的AdV，其中E1A基因受HIF-1启动子控制。HYPR-Ad#1只能在显示HIF-1激活的缺氧肿瘤细胞中复制。在HIF-1激活的脑肿瘤细胞中感染HYPR-Ad#1后，E1A过度表达，超过90%的细胞显示出显著的细胞病变效应（CPE）。以上结果表明，HYPR-Ad#1可以在被缺氧和HIFs激活的肿瘤细胞中复制。 肿瘤血管生成在侵袭性肿瘤的生长和转移中起着关键作用。因此，通过自然靶向杀伤效应或间接表达血管生长因子抑制剂来抑制肿瘤血管生成，可能有助于抑制肿瘤血管生成。VSV可以自然靶向血管内皮细胞。VSV感染可以有效抑制肿瘤细胞的生长。以前的研究表明，野生型VSV特异性感染肿瘤组织中的内皮细胞（ECs）并显示抗肿瘤效应。此外，OVs表达血管生长因子抑制剂可以提高它们抑制肿瘤血管生成的能力，从而抑制肿瘤生长和转移。ZD55-sflt-1是一种表达可溶性血管内皮生长因子受体抑制剂sFlt-1的溶瘤AdV。它在人类结肠癌动物模型中对肿瘤血管生成显示了抑制作用。具体来说，IL-24是一种有效的抗血管生成细胞因子，可以抑制血管生成并诱导肿瘤细胞凋亡。IL-24基因被插入AdV中，称为HE1B55D-RGD-IL-24。在此基础上，将额外的抗血管生成阻断片段插入AdV以构建HE1B55D-RGD。在裸鼠黑色素瘤移植瘤模型中给予这两种溶瘤腺病毒后，抑制了血管内皮生长因子（VEGF）和转化生长因子β，从而导致抗血管生成活性。 溶瘤效果可以通过肿瘤分泌的基质金属蛋白酶（MMP）进一步激活。最初，MeV融合蛋白包含一个furin切割位点，并依赖于细胞内蛋白酶处理蛋白质并激活颗粒。因此，用被基质金属蛋白酶识别的序列或尿激酶型纤溶酶原激活剂替换furin切割位点增加了肿瘤特异性，即表达修饰F蛋白的重组MVs只传播在分泌MMP的细胞中。这些研究强调了OVs在肿瘤微环境中的靶向和颗粒激活的结合。 靶向免疫抑制的TME：癌细胞适应通过表达多种抑制性配体来严格限制抗肿瘤免疫，这些配体为免疫细胞提供所谓的“免疫检查点”分子，从而传递抑制性信号，阻止T细胞的激活和存活。为了调节免疫抑制状态并增强抗肿瘤免疫，OVs被设计为表达各种细胞因子、趋化因子和免疫检查点抑制剂（ICIs），并与嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）联合作用。此外，新抗原被认为是癌症疫苗的有前途的肿瘤抗原，没有自我耐受，但有可能诱发强大和选择性的T细胞反应。新抗原的发现和使用取决于下一代测序等新技术。肿瘤特异性新抗原的定义以及有效ICIs的批准，有助于新型基于载体的癌症疫苗的临床发展。 表达如IL-12、IL-13、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、趋化因子CCL19和CD40L等细胞因子的OVs已被证明可以有效地招募和激活抗原呈递细胞（APCs）和CD4+T细胞和CD8+T细胞，并减少TGF-β和VEGF的表达，从而缓解免疫抑制。值得注意的是，80%的胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤过度表达白细胞介素-13受体α2（IL-13Rα2）。为了通过IL-13Rα2重新靶向GBM，通过展示人类IL-13生成了MeV-GFP-HAA-IL-13。MeV-GFP-HAA-IL-13在IL-13Rα2过度表达的胶瘤系中表现出强大的合胞体形成。MeV-GFP-HAA-IL-13在GBM12同种异体植入GBM小鼠模型中的体内治疗显著延长了生存期。在小鼠中枢神经系统中给予MeV-GFP-HAA-IL-13后未观察到神经毒性。 水痘病毒VV-IPDL1/GM通过同时表达GM-CSF和程序性死亡配体抑制剂（iPD-L1）构建。在肿瘤细胞中，iPD-L1与程序性死亡配体（PD-L1）结合，从而恢复抗肿瘤细胞免疫。在B16-F10小鼠黑色素瘤模型中，VV-IPDL1/GM的肿瘤内给药可能促进肿瘤浸润树突细胞（DCs）的成熟和肿瘤特异性T细胞的激活。VV-IPDL1/GM为靶向肿瘤治疗提供了更有效的治疗方案，特别是对于对PD1/PDL1阻断疗法有抵抗力的患者。 远离使用传统的免疫介质，从TME中清除免疫抑制分子也已被考虑。一种溶瘤VACA被设计为表达前列腺素失活酶15-(NAD)（HPGD）。HPGD的表达选择性地耗尽了Treg和骨髓源抑制细胞（MDSCs）群体，从而通过上调与Th1相关的趋化因子来增强抗肿瘤免疫反应。同样，通过设计表达瘦素的溶瘤VACA实现了TME的代谢重编程。在OV诱导的免疫浸润背景下，瘦素改善了肿瘤浸润淋巴细胞中的线粒体氧化磷酸化（OXPHOS），防止了CD8 + T细胞的代谢耗竭，从而增强了治疗效果和抗肿瘤记忆的发展。 已开发出一种编码多达50个患者特异性新抗原的溶瘤腺病毒平台MY-NEOVAX。MY-NEOVAX治疗在改善两位患有最后一线治疗耐药的结直肠癌和高级别神经内分泌癌患者的生存方面证明有效。基于来自非人类大猩猩的AdVs，研究了一种新型大猩猩腺病毒（GAd）编码多种新抗原的效力和效果。预防性或早期治疗性接种GAd在小鼠中有效控制肿瘤生长。相比之下，需要将疫苗与检查点抑制剂结合以根除大肿瘤。与单独使用抗PD1相比，用GAd和抗PD1治疗的动物中活化的肿瘤浸润T细胞更丰富，TCR谱系更多样化。这项研究表明，在高肿瘤负担存在的情况下，疫苗的有效性与新抗原特异性T细胞的广度相关，并需要通过检查点阻断同时逆转肿瘤抑制。异源初免-加强策略也已应用于肿瘤疫苗，以克服抗载体免疫。Leoni等人为治疗微卫星不稳定性（MSI）肿瘤开发了一种基于新抗原的初免-加强疫苗。新抗原（FSP）被选择并克隆到非人类GAd和MVA载体中，产生一种病毒载体疫苗，称为Nous-209。在小鼠中，Nous-209能够有效地诱导广泛的FSP特异性CD8+和CD4+ T细胞反应。此外，FSP在体外由人类APCs处理，随后激活人类CD8+ T细胞。Nous-209编码许多在MSI肿瘤中共享的新抗原，这些新抗原诱导了最佳的免疫反应广度，可能实现临床治疗和预防MSI肿瘤的益处。另一种基于非复制AdVs与溶瘤马拉巴病毒MG1的异源初免/加强方案，两者都表达MAGE-A3，在Macaca中已显示可诱导TAA特异性免疫反应的扩增和长期持久。这些结果表明，异源初免-加强策略在癌症治疗中同样适用。 转录和转导双靶向：理论上，通过OVs的自然趋向性或基因修饰OVs基于表面受体靶向肿瘤细胞是可行的。然而，这种基于受体的策略对于具有广泛受体和细胞趋向性的OVs来说并不适合，这阻碍了对肿瘤的精确杀伤。通过在病毒颗粒上工程化TAA特异性配体（或抗体），实现了OVs对肿瘤特异性抗原的重新靶向。保持了OVs的完整复制活性，同时不损害它们的安全特性。 为了进一步提高靶向的精确度，人们尝试将肿瘤特异性启动子衍生的转录靶向与转导靶向（通过病毒衣壳整合抗人癌胚抗原单变量域）结合起来。结果显示，将单变量域遗传整合到AdV纤维中，提高了感染的特异性和单变量域靶向溶瘤AdV的复制效率。双重靶向，无论是转录层面还是转导层面，都是提高这些先进一代条件复制AdVs治疗指数的有希望的手段。这种重新靶向策略为OVs提供了对肿瘤细胞的选择性，同时使病毒从其自然受体上解靶向。这种方法被认为适用于系统递送，因为它最小化了在健康组织中的病毒复制。 免疫细胞的激活：MeV自然且优先在恶性细胞中复制，这有助于抗肿瘤免疫和肿瘤溶解。为了提高MeV激活的NK细胞针对肿瘤细胞的细胞毒性活性，开发了一种编码NK细胞上的CD16A和作为模型肿瘤抗原的癌胚抗原（CEA）的溶瘤MeV疫苗，称为双特异性杀手参与剂（MV-BiKE）。MV-BiKE介导了感染肿瘤细胞中功能性BiKE的分泌。在结直肠癌或胰腺癌细胞中，MV-BiKE通过NK细胞指定了抗肿瘤细胞毒性，并介导了效应细胞因子的表达和脱颗粒。在这项概念验证研究中，证明了利用NK细胞作为抗肿瘤效应器的病毒载体疫苗。类似地，OVs也可以增加髓系和浆细胞样DCs介导的细胞毒性，将巨噬细胞调节为抗肿瘤表型并激活中性粒细胞，导致相关细胞因子的分泌。 NDV已被报道为临床中的OV。儿童高级胶质瘤用溶瘤病毒MTH-68/H治疗，这是NDV的减毒株，结合口服丙戊酸。上述治疗导致丘脑胶质瘤的深远退缩，尽管随后需要第二次神经外科手术。这项研究记录了NDV的溶瘤效应，针对病毒存在和在肿瘤细胞中的复制。在GBM患者的I/II期试验中，当通过静脉内递送应用高剂量时，溶瘤NDV被良好耐受。 临床中的先进OVs和批准的OVs：1型单纯疱疹病毒（HSV-1）是一种杰出的OV，通过肿瘤内复制和诱导抗肿瘤免疫反应来工作。Talimogene laherparepvec（T-VEC，Imlygic）是一种基于HSV-1的OV，用于无法切除的IIIB–IV期黑色素瘤。在细胞系和动物模型中进行了临床前评估，T-VEC在临床试验中得到了广泛评估。在I期临床试验中，HSV-1被设计为表达GM-CSF，通过招募和成熟树突细胞，另一种增强局部和系统抗肿瘤免疫的机制被激发。进一步，在II期临床试验中评估了T-VEC的疗效。在50名晚期黑色素瘤患者中，有10名患者在接受了六次T-VEC注射后有完全反应（CR），3名患者有部分反应（PR），总有效率（ORR）为26%。总体生存率在1年时为58%，在24个月时为52%，这些证据证明了T-VEC的系统有效性。T-VEC在III期临床试验中改善了晚期黑色素瘤患者的持久反应。持久反应率在T-VEC治疗组（16.3%；95%CI，12.1–20.5%）明显高于GM-CSF治疗组（2.1%；95%CI，0–4.5%）；比值比，8.9；P < 0.001）。T-VEC治疗组的ORR和总体生存率也更优越，尤其在IIIB、IIIC或IV期黑色素瘤患者中疗效最明显。T-VEC仍然是唯一广泛批准的OV治疗，在临床应用过程中进行了优化。 G207是第二代溶瘤HSV-1，涉及γ34.5基因的缺失和ICP6基因的失活。这些修改减少了致病性并促进了抗肿瘤特性。除了直接的溶瘤活性外，G207在小鼠肿瘤模型中被证明可以加强抗肿瘤免疫。在恶性胶质瘤患者中，G207在肿瘤切除前后应用以及其他肿瘤治疗中被证明是安全的。在进化过程中，第二代溶瘤HSV-1的alpha47基因的缺失和US11启动子区域的重叠，增强了肿瘤特异性复制能力和肿瘤细胞中的细胞病变效应。这种第三代HSV-1，即G47Δ，在体内显著比其母体G207更有效，同时保持了安全特性。在I/II期临床试验中，G47Δ用于治疗残留或复发的胶质母细胞瘤患者，最多六剂或2周内两剂。G47Δ治疗与提高生存率和中位总体生存率相关。总体而言，在随访期间观察到患者的反应和稳定疾病。活检显示，通过增加肿瘤浸润性淋巴细胞的数量，TME得到了改善。G47Δ（Delytact）已在日本获得胶质母细胞瘤的批准。 H101是E1B-55 kDa基因缺失的复制选择性AdV，已在中国（Oncorine）作为OV批准。在III期随机临床试验中，H101用于治疗鼻咽癌。H101与化疗联合应用实现了72.7%的ORR，而单独化疗为40.3%。总体而言，H101对鳞状细胞癌患者安全有效。同样，基于AdV的OVs，DNX-2401，在复发恶性胶质瘤的临床试验中进行了测试，结果显示出强大的反应和长期生存，这可能归因于病毒的直接溶瘤效应，随后引发免疫介导的抗胶质瘤反应。Nadofaragene firadenovec（rAd-IFNa/Syn3）是一种复制缺陷型rAdV，将人干扰素alfa-2b cDNA传递到膀胱上皮，适用于卡介苗无反应的非肌层浸润性膀胱癌。Nadofaragene firadenovec治疗后，53.4%（55/103）的原位癌患者在首次剂量后的3个月内有完全反应，这种反应在12个月时在45.5%（25/55）的患者中得以维持。以上结果表明，nadofaragene firadenovec是有效的，并提供了有利的益处。 ECHO-7（Rigvir），一种批准用于I–II期黑色素瘤的肠道病毒，与其它实验性免疫疗法相比，降低了疾病进展的风险。 OVs的关注点和前景：天然病毒作为第一代溶瘤病毒疗法。尽管它们在治疗实体瘤和少数转移瘤方面取得了一定的疗效，但它们存在诸如靶向性差、副作用、无法有效引发肿瘤免疫以及只能瘤内给药等缺陷。此外，通过插入细胞因子等提高肿瘤靶向性、减少毒性副作用和增强抗肿瘤免疫反应，一直是治疗难治性实体瘤和转移瘤的研究方向。尽管溶瘤病毒疗法取得了巨大进展，但在治疗过程中也存在许多障碍。除了预防性病毒载体疫苗中出现的这些问题外，OVs的给药途径和临床患者的选择在OVs的开发过程中也将是困难的。尽管上述一些问题可以通过预防性病毒载体疫苗中的同等解决方案来解决，但还需要额外的对策。 为了进一步提高OVs的治疗效力，在溶瘤病毒疗法T-VEC、抗PD-1抗体和化疗的联合治疗中取得了显著的突破。在黑色素瘤治疗中，T-VEC与PD-1抗体联合使用，使肿瘤客观反应率达到62%，完全反应率为33%。对于对抗体治疗有抗性的患者，Oncorine与抗体药物的联合治疗提供了额外的好处。患者症状改善，并在肺组织部分坏死的情况下实现了病情稳定。这些发现表明，溶瘤病毒疗法与肿瘤相关抗体和化疗药物的结合，可能通过改变肿瘤微环境而表现更好。 然而，OVs诱导的免疫反应与抗肿瘤效力之间的相关性在很大程度上仍然未知，无论是先天还是适应性抗肿瘤免疫。关于OV和CPI联合使用的临床知识将有助于更好地了解如何优化这些病毒在癌症治疗中的使用。重要的是，深入理解和准确利用OVs的基础生物学和药理学可能实现OVs的系统给药，并扩大其在癌症中的应用范围。 1.3.病毒载体疫苗的几个关键方面 以递送途径依赖的方式触发免疫反应。阐明递送途径依赖的免疫反应对于疫苗设计和特定病原体的递送途径选择具有重要意义。图3（以重组AdV为例）说明了病毒载体疫苗肌肉注射后触发的抗原呈递和免疫反应的潜在机制。病毒通过受体和配体识别进入肌细胞。然后病毒通过内吞作用被吸收。在细胞质中，病毒从内体中逃逸，部分解聚衣壳，并通过微管网络进入细胞核。目标基因的转录在细胞核中进行，然后在内质网和高尔基体中分别完成抗原蛋白的翻译和翻译后修饰。APCs捕获抗原蛋白，分别通过MHC I类和MHC II类向CD8+ T细胞和CD4+ T细胞呈递。CD8+ T细胞在细胞因子的调节下介导感染细胞的溶解。同时，刺激的B细胞分化为记忆B细胞和浆细胞。浆细胞产生NAbs和结合抗体。这些抗体参与病毒中和和Fc介导的功能，包括ADCC和ADCP等。 图3 肌肉注射递送病毒载体疫苗的抗原呈递机制。(1) 重组病毒载体疫苗的构建和接种。(2) 病毒载体疫苗通过内吞作用被肌细胞摄取。(3) 病毒载体疫苗从内体逃逸。(4) 部分解体的病毒衣壳运输到细胞核，启动转录过程。(5) 在内质网和高尔基体中进行蛋白质翻译和翻译后修饰。(6) 抗原蛋白呈递给抗原呈递细胞。抗原可以装载到MHC I类分子上，直接呈递给CD8+ T细胞，以及装载到MHC II类分子上，直接呈递给CD4+ T细胞。(7) T细胞在细胞因子的介导下裂解感染细胞。(8) 刺激的B细胞分化为记忆B细胞和释放抗体的浆细胞。(9) 抗原蛋白被抗体识别，包括能够介导Fc效应功能的抗体，包括抗体介导的细胞毒性和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用。(10) 中和抗体中和病原体并阻止它们进入。（使用BioRender创建） 在呼吸道的独特情况下，先天和适应性免疫反应被紧密调节，并在病原体清除、免疫调节和组织修复之间进行持续的平衡。与肌肉注射相比，重组病毒载体疫苗的鼻内递送诱导局部和外周免疫反应（图4，以rVSV为例）。疫苗接种和病毒进入粘膜后，由上皮下浆细胞产生分泌型免疫球蛋白（sIgA和sIgM）。它们与先天免疫对应物一起提供抗原特异性靶向。同时，招募了先天免疫细胞。它们中的一些将抗原处理并传递给APCs，主要是DCs。活化的DC迁移到引流淋巴结。在T细胞区，DC训练naïve T细胞并导致克隆扩增。然后，抗原识别通过T细胞激活B细胞。活化的B细胞进入生发中心（GC），进行扩增，导致长期记忆B细胞和高亲和力浆细胞。 图4 鼻内递送病毒载体疫苗诱导的局部和外周免疫反应。(1) 鼻内递送病毒载体疫苗和重组病毒的进入。(2) 由上皮下浆细胞产生的局部分泌型免疫球蛋白A。(3) 抗原被先天免疫细胞和抗原呈递细胞识别和处理。(4) 免疫细胞的招募，包括中性粒细胞、自然杀伤细胞和单核细胞。(5) 活化的树突细胞通过传入淋巴管流向引流淋巴结，以启动适应性反应。在淋巴结T细胞区，外源性抗原在II类MHC上呈递，促使CD4+ T细胞训练，而内源性抗原在I类MHC上处理并呈递给CD8+ T细胞。(6) 抗原呈递细胞促进naïve CD4+和CD8+ T细胞的成熟和扩增。CD8+细胞毒性T细胞和CD4+ T辅助细胞亚群流回感染部位。(7) 活化的B细胞经历扩增和B细胞受体（BCR）的体细胞突变，结果BCR特异性强烈结合在滤泡树突细胞（FDCs）表面维持的肽段。B细胞通过迭代轮次的扩增/体细胞突变和亲和力选择，导致选择高亲和力BCRs。(8) 与滤泡辅助性T细胞（Tfh）的相互作用导致B细胞分化和类别转换为长期记忆B细胞和高亲和力浆细胞，它们流向感染部位或作为长期记忆群体维持。（使用BioRender创建） 几个疫苗候选物在口服疫苗接种后显示出强大的潜力。然而，关于口服递送的重组病毒载体疫苗与复杂的口胃肠道（GI）环境之间的相互作用的数据有限，因此尚不清楚病毒进入以及在系统和粘膜部位建立体液和细胞免疫反应的机制。目前的证据表明，咽扁桃体和腺样体以及小肠的Peyer斑可能是诱导疫苗接种后免疫反应的潜在部位。值得注意的是，Peyer斑是刺激免疫反应的核心部位。这个过程涉及M细胞摄取抗原、抗原的运输和释放，以及T细胞的活化。然而，由于胃和肠道的化学条件恶劣，病毒载体疫苗似乎很难在没有特定材料包裹的情况下到达小肠。在不久的将来，需要进一步研究病毒载体疫苗口服接种后的抗原呈递机制。 选择病毒载体平台，平衡安全性和免疫原性。安全性和免疫原性是有望成为疫苗的关键组成部分。在大多数情况下，需要根据具体情况实现微妙的平衡。对于针对高死亡率的致命性出血热的紧急大规模疫苗接种，rVSV载体复制型疫苗是合理的选择，因为它具有单剂量方案、强大的免疫原性和快速的免疫反应特征。对于流感和COVID-19等经常出现的呼吸道疾病，PIV、IFV和NDV载体疫苗为鼻内递送的单剂量疫苗或加强疫苗提供了合适的选择。对于具有相应医疗条件的医疗工作者，多剂量接种基于RABV的灭活疫苗或基于AdV和痘病毒载体的异源初免-加强方案，在最小化抗载体免疫的同时结合了免疫原性和持久性。异源初免-加强方案可以最大化特定单一载体中看到的好处并规避限制。在不久的将来，需要更清晰地定义这些病毒载体的一般和独特特征，以进一步支持病毒载体的选择。 根据对这些NNSV载体疫苗的点对点比较的有限研究，VSV载体疫苗在单剂量肌肉注射后似乎比RABV或PIV和DNA病毒载体疫苗更具免疫原性和有效性。上述现象可以归因于VSV的强大复制动态。作为一种活载体，PIV被认为是一个相对安全的疫苗载体，这比其他开发的NNSV载体具有优势，后者遇到了病毒逆转、残留毒力等问题。特别是，PIV载体疫苗的安全性已在2个月以上的儿童中得到评估，这代表了儿科疾病的一个理想平台。 图5 口服递送病毒载体疫苗诱导免疫反应的潜在部位。在口腔内，病毒载体疫苗通过包括咽扁桃体、管扁桃体、腭扁桃体和舌扁桃体等的口腔淋巴组织进入。在小肠中，Peyer斑是免疫反应的核心部位(1) T细胞从血管进入Peyer斑。(2) M细胞通过内吞作用和吞噬作用摄取抗原。(3) 抗原通过M细胞在血管中运输并在基底表面释放。(4) Peyer斑中的T细胞遇到抗原并被树突细胞激活。（使用BioRender创建） 确实，复制型病毒载体疫苗为粘膜递送和免疫反应持续时间提供了额外的好处。相比之下，强大的复制能力可能伴随着更高的副作用风险，特别是在像孕妇、婴儿和老年人这样的免疫受损个体中。因此，需要一种减毒策略来解决生物安全问题。理想情况下，病毒载体疫苗的减毒应该保持免疫原性。对于VSV，实施了第二代rVSV设计策略，称为N4CT1，它涉及在基因组的3′端增加一个额外的转录单元，将N基因转移到第四个转录单元，以及截断VSV G CT域（图1a）。N4CT1通过改变基因组中特定蛋白的基因位置来减毒，已在人类临床试验中得到验证。这种策略也适用于其他NNSVs。此外，病毒mRNA帽（甲基转移酶，MTase）活性是活减毒病毒载体疫苗开发的一个极好靶点，因为病毒mRNA帽对mRNA稳定性、蛋白质翻译和先天免疫逃逸至关重要。MTase的缺乏已被证明在免疫能力和免疫受损的小鼠中完全减毒，同时免疫原性并未减弱。此外，利用L111A的温度敏感组装缺陷突变，并结合rVSV M蛋白中的M51R突变，显著降低了病毒的致病性，同时保持了高效的病毒生产。这些策略可以单独使用或组合使用，以提高复制型病毒载体疫苗的安全性。在RABV中，先前的减毒策略集中在删除致病基因（G/P/M）。然而，这些策略使重组病毒复制缺陷，从而降低了挑战后的保护效果，使它们不太有吸引力。 相反，基于SADB19的减毒策略，SADB19是欧洲授权用于野生动物疫苗的菌株。涉及G蛋白R333E突变的RABV SADB19被证明在神经毒力上显著减毒。同样，在PIV载体疫苗中，过度减毒可能导致在人类中的效力不足。因此，在病毒载体减毒方面，应及时考虑并保持免疫原性。 目前，已有三代AdV载体。第一代AdV载体缺乏E1或E3基因。这种载体可以引起强烈的炎症反应和免疫反应。在第二代AdV载体中，进一步删除了E2A或E4基因，导致免疫反应减弱，但提高了容量和安全性。第三代AdV载体失去了所有或大部分AdV基因，仅保留了倒置末端重复（ITR）和包装信号序列。第三代AdV载体引起的细胞免疫反应进一步减少。AdV载体的演变也是安全性和免疫原性之间平衡的过程。 总之，选择病毒载体，复制型、单轮复制或灭活，是安全性和免疫原性之间的平衡，取决于给定病原体的特性和目标人群。粘膜递送是病毒载体疫苗的一个显著特点。由于内在的佐剂特性和活跃的粘膜感染，病毒载体疫苗可以通过粘膜途径递送，并提供几个独特的优势。(1) 除了系统免疫反应外，粘膜疫苗诱导的局部粘膜免疫反应将作为对抗外来病原体的第一道防线，预计会阻止病毒进入并提供更广泛的异亚型保护。如已综述，外周血单核细胞（PBMCs）中的体液免疫反应并不总是评估粘膜疫苗的独家指标。例如，自然感染SARS-CoV-2后，鼻腔中的分泌型免疫球蛋白A（SIgA）可以持续约9个月，而注射疫苗在产生和增强血液中的抗体以及预防严重疾病方面有效，但对鼻腔IgA水平影响很小。(2) 局部CD8+ T细胞和SIgA比NAbs具有更广泛的谱效应，这对于经常突变的病原体（如IFV和SARS-CoV-2）尤其重要。(3) 粘膜免疫可以在一定程度上减轻抗载体免疫对病毒载体疫苗的影响。(4) 这些粘膜免疫途径比注射疫苗更方便、更易接受，尤其是对于害怕针头的人群，这将有助于群体免疫的全面建立。同时，对于动物源性疾病，粘膜递送的疫苗方便且可行。鼻内或吸入接种可以在大型动物群体中实现大规模免疫，而口服接种有助于在野生动物栖息地中全面分配疫苗。(5) 在全球大多数人至少接种了两剂注射型COVID-19疫苗的情况下，无论是mRNA疫苗还是灭活疫苗，用粘膜递送的病毒载体疫苗加强将巩固系统免疫反应并提供额外的粘膜免疫反应。(6) 粘膜疫苗可能有助于填补传统疫苗的空白。例如，众多已授权SARS-CoV-2疫苗的临床试验结果表明，老年人的效力低于年轻人。而dNS1-RBD，一种通过鼻内递送的COVID-19疫苗，在18至86岁的所有参与者中耐受性良好，老年人（60岁及以上）的免疫原性与年轻参与者相似。(7) 对于那些通过呼吸道或消化道传播的粘膜相关病原体，病毒载体疫苗可以最大限度地模拟特定病原体的自然感染过程。因此，提供全面的免疫反应和保护。(8) 呼吸道和消化道并不完全分离。例如，Ad5nCoV通过口腔吸入喷雾给药，然后在呼吸道中完全分布，主要在肺部。也就是说，通过鼻内递送的疫苗可以转换为口服-呼吸道气雾吸入疫苗，因为吸入疫苗比鼻喷疫苗提供更好的免疫反应和保护。 然而，局部粘膜免疫与保护效力之间的关系尚未完全确立，特别是在人类临床试验中。应注意动物与人之间的转化差距。临床前动物研究中的结果可能不一定预示着人类的安全性和效力。人类免疫系统更为复杂，人类鼻腔或呼吸道的局部环境在参与试验之前可能已经暴露于各种病原体，而处于受控实验室环境中饲养的动物可能尚未接触过这些病原体，这可能影响对疫苗接种的免疫反应。这种物种间的差距需要进一步探索。此外，对于评估那些仅组装外源糖蛋白的复制型病毒载体疫苗，动物模型应严格反映人类在受体-配体识别、预先或暴露后以及免疫系统组成的实际情况。 最近，mRNA疫苗和蛋白亚单位疫苗等新型疫苗技术引起了关注，并也参与到粘膜疫苗平台中。对于mRNA疫苗，通过鼻内给药的COVID-19 mRNA疫苗在全身范围内诱导了与肌肉注射组相当的S特异性结合抗体和NAbs。然而，这项研究中在鼻甲和肺泡灌洗液中未检测到分泌型IgA，因此局部免疫反应以及组织驻留T或B细胞的激活情况尚不确定。对于蛋白亚单位疫苗，注意到了一种名为“初免和加强”的疫苗策略，通过鼻内给药的S蛋白疫苗加强肌肉注射的COVID-19 mRNA疫苗。在小鼠的呼吸道粘膜中诱导了强大的驻留记忆B细胞和T细胞反应以及IgA。实际上，这种策略在已经通过初次疫苗接种产生免疫的情况下，通过蛋白疫苗在呼吸道引发了粘膜免疫记忆。理论上，所有疫苗方法都可以像“初免和加强”一样进行。总的来说，关于mRNA疫苗和蛋白亚单位疫苗的粘膜疫苗的临床前数据有限。在很大程度上，仅由mRNA疫苗诱导的局部粘膜免疫是不确定的。蛋白亚单位疫苗的粘膜递送需要预先存在的免疫。相比之下，病毒载体平台在粘膜疫苗中得到了很好的建立，无论免疫状态如何，都能诱导局部和系统的免疫反应。 重要的是，先天髓样细胞，如单核细胞/巨噬细胞，在随后的接触中可以产生强烈的反应，即所谓的“天然免疫记忆”或“训练免疫”，这可能为粘膜递送的病毒载体疫苗提供支持。如报道所述，呼吸道病毒感染模拟了肺泡巨噬细胞记忆，并产生了训练免疫，促进了对二次挑战的持续反应，这个过程甚至可能获得效应CD8 T细胞的帮助。 免疫反应的持续时间。理想情况下，持久的保护效力将有助于根除病原体，减轻医疗和经济负担，特别是对发展中国家而言。单剂量肌肉注射的VSV载体疫苗已显示出潜力。如综述所述，接种rVSV-ZEBOV疫苗后2年，100%和89%的参与者分别保持高或低剂量的血清阳性。NAbs的持久性较差，在28天时血清阳性率为64-71%，6个月后降至27-31%。同样，VSV载体疫苗在其他出血热病毒中也实现了持久的免疫反应。VSVΔG/LASVGPC诱导了对LASV的快速和长期免疫。在豚鼠中进行单剂量肌肉注射后，保护率分别为100%、87%、83%和71%，分别在第14天、第25天、第6个月和第1年。进一步评估了通过鼻内或口服递送的VSV载体疫苗的持久性。 总的来说，RABV载体疫苗被设计为灭活或口服递送，而PIV载体疫苗通过鼻内递送。多样化的免疫程序阻碍了这些病毒载体之间的点对点比较。用rERAG333E单剂量口服接种的小鼠产生了强烈且长达一年的针对RABV的NAbs。100%的接种动物在免疫后12个月免受RABV挑战。接受rERAG333E单次或两次口服接种的狗产生了持续3年以上的强烈保护性NAbs反应，并且在唾液中也检测到适度的RABV特异性IgA。在PIV载体COVID-19疫苗的情况下，测量并比较了仓鼠接种一剂或两剂CVXGA疫苗后免疫反应的持续时间，以及两次COVID-19 mRNA疫苗接种后的免疫反应。在接种后第36天，2X mRNA诱导了最高的抗S ELISA滴度，接种2X CVXGA1的仓鼠比接种1X CVXGA1的仓鼠诱导了更高的抗S滴度。有趣的是，第108天的抗S滴度在所有三个疫苗接种组中都是相当的。与mRNA疫苗相比，CVXGA1疫苗组的抗S ELISA滴度和NAb滴度得到了很好的维持。动物挑战研究证实了这一现象。当仓鼠在接种后9个月受到挑战时，接种CVXGA1的仓鼠比接种mRNA疫苗的仓鼠得到了更好的保护。减毒活MeV疫苗也被证明可以引发持久的B细胞和T细胞反应，据报道麻疹特异性抗体的半衰期超过200年。保护性免疫反应的持续时间可以归因于MeV在淋巴组织中的长期复制和传播。 在IFV载体COVID-19疫苗中也观察到了持久的保护效力。例如，dNS1-RBD在仓鼠模型中至少持续一年的保护性免疫反应。上述结果表明，尽管通过不同的递送途径，复制型病毒载体疫苗在持久性保护免疫方面显示出卓越的特性，可以对抗多种病原体。 相比之下，AdV和痘病毒载体疫苗大多被设计为单轮复制或复制缺陷构建物。尽管这些疫苗的单剂量方案已在人类临床试验中进行了测试或获得批准。与复制型病毒载体构建物相比，当单独使用或作为单剂量方案应用时，观察到的免疫持久性较差。通常，为了延长免疫反应的持久性，采用了初免-加强策略。 克服抗载体免疫。预先存在的抗载体免疫是所有病毒载体疫苗面临的共同问题，尤其是在AdV载体疫苗中。相对较少的NNSVs由于其单剂量方案、低血清阳性率或表面糖蛋白的替换，受抗载体免疫的影响较小。然而，AdV的血清阳性率在全球范围内普遍存在，范围在58.4%到90%之间。目前的解决方案包括增加剂量、选择血清阳性率低的载体、改变递送途径和异源初免-加强策略。上述解决方案在一定程度上减少了抗载体免疫的影响。为了根本解决这个问题，新的解决方案涉及一种免疫逃逸策略，即删除或修改病毒载体中被预先存在的免疫识别的相关区域、序列或表位。例如，AdV中和的主要决定因素在纤维蛋白和六边形蛋白的高变区（HVRs），而将Ad5六边形蛋白表面的七个短高变区替换为稀有AdV血清型Ad48相应的HVRs，成功地绕过了抗Ad5免疫。在未来，确定抗载体免疫的主要位点和基于基因组修饰的免疫逃逸策略应该进行，以解决抗载体免疫的问题。 NNSV载体具有多个优点。NNSV的RNA不太可能整合到宿主基因组中，因此重组很少发生。此外，NNSV可以快速生长到高滴度，并在适当的细胞系中传播，便于大规模生产。同时，NNSV的基因组简单且易于操作，因此插入一个或多个外源抗原并挽救重组病毒是方便的。携带外源基因的NNSV基因组相对稳定。它没有像阳性链RNA病毒基因组那样经常发生基因组重组和外源基因丢失的问题。通常，NNSV的血清阳性率较低，并且可以通过更换糖蛋白进一步减轻抗载体免疫。关于这些NNSV载体的生物安全问题，已在第3.2部分进行了审查。 IFV有18个亚型的HA和11个亚型的NA。通过替换HA和NA，可以通过反向遗传学拯救嵌合病毒。目前，IFV疫苗生产平台高度优化，允许大规模生产。然而，容量限制可能阻碍了IFV的完全应用，因为外源基因插入的长度限制在大约1.5 kb或更少。更重要的是，需要改进IFV载体疫苗的转基因稳定性。最近，A/PR/8/1934 (H1N1) (PR8) 和 A/WSN/33 (H1N1) (WSN) 是最常用的IFV骨架。尽管它们都具有低致病性，并且可以在生物安全等级二级(BSL-2)实验室中处理，但鼻内免疫可能会与流通菌株发生重组，留下安全隐患。改变递送途径可以避免重组。需要进行额外的研究，以克服IFV的物种特异性限制，解决流感中的重组问题。 AdVs是在人类临床试验中得到充分评估的成熟病毒载体。这些单轮复制的重组病毒在人类中安全且耐受性良好。随后，这些疫苗的免疫原性和持续时间需要进一步优化。 痘病毒载体具有一些独特的特性。(1) 由于它们在细胞质中复制，不与宿主基因组整合。(2) 抗载体免疫的流行率较低。(3) 在人类中可接受的安全性概况，特别是对于ALVAC和MVA，它们不能在哺乳动物细胞中复制，进一步奠定了它们的安全性概况。(4) 建立了大规模生产临床级材料的程序。 与NNSV或AdV载体相比，痘病毒在预防病毒性出血热或β冠状病毒的疫苗应用中似乎免疫原性较低，因为痘病毒载体疫苗的临床试验大多与其他疫苗平台结合使用。为了优化痘病毒载体，已经实施了几种策略，包括异源初免/加强方案、使用共刺激分子、删除痘病毒基因组中仍存在的病毒免疫调节基因、增强病毒启动子强度、增强载体复制能力、优化外源异源序列的表达，并联合使用佐剂。 2.结论和展望 为了应对急性公共卫生事件，病毒载体疫苗平台促进了及时响应。值得注意的是，在COVID-19大流行期间，病毒载体COVID-19疫苗在人类临床试验中取得了显著进展，并在短时期内获得批准。尽管已经提供了强大的免疫反应和保护效力，但这些病毒载体疫苗的内在特性和非凡优势尚未得到充分利用，特别是粘膜递送和粘膜免疫。在治疗性癌症疫苗中也可以看到，病毒载体疫苗的进步依赖于对病毒生物学的改进理解以及对病毒与宿主免疫系统之间相互作用的更新见解。 在不久的将来，对这些病毒载体的相似性和个体性有更好的理解将推动革命性的进步。通常，NNSV是一个大组病毒载体，它们共享集体病毒生物学特性并面临同源障碍。事实上，由于对这些NNSVs的全面了解，包括反向遗传学方法、极性转录机制、保留TMCT原始来源的嵌合策略用于外源抗原的整合，以及减毒修饰，已经取得了一些进展。特别重要的是，呼吸道病毒引起的训练免疫为抗微生物感染和抗肿瘤活性提供了实质性的好处。 然而，在深入掌握病毒载体之间的相似性时，应该考虑更多的方面。相应地，像抗载体免疫和安全问题这样的问题可以以相同的方式解决。此外，应该根据目标病原体或肿瘤明确阐明这些病毒载体的个体性。在这个过程中，跨学科合作、结构生物学、人工智能和基因编辑等可能提供额外的支持。 正如已经详尽回顾的，VSV和MeV是杰出的病毒载体，有潜力进行粘膜递送并诱导持久的局部和系统免疫反应。然而，默克公司发起的基于VSV和MeV的COVID-19疫苗V590和V591在I期临床试验中得到了令人失望的反应，尽管临床前研究结果显示前景光明。这可能归因于临床前和临床试验之间联系和协调不足，具体来说，是递送途径选择不佳。理想情况下，动物模型应该准确全面地反映人类的免疫状态和接种后反应，反之，来自不适当动物模型的结果会误导临床试验的实验设计，最终决定最后的方向。对于VSV和MeV，它们在粘膜递送的潜力在很大程度上尚未被探索，特别是在临床试验中。因此，这些NNSVs的基本属性需要在人类临床试验中进一步研究，基于临床前试验中取得的令人信服的方法。总体而言，适当和准确的技术进步、充分探索潜力，以及临床前和临床研究之间的紧密联系将巩固病毒载体疫苗的地位，并推动新型病毒载体疫苗的加速和批准。 为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。 名称：2024第三届新型疫苗研发峰会 时间：2024年8月16-17日（周五-周六） 地点：苏州（酒店定向通知） 主办单位：四叶草会展、生物制品圈 媒体支持：药时空、抗体圈、细胞基因研究圈 会议费用：点击二维码即可查询。 报名方式：扫描下方二维码→ 填写表格 → 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