Streptomycin Sulfate

1月20日是一个惊心动魄的节点。 贸易战2.0逼近，对日益全球化的中国医药产业链将有何冲击？鉴史知今，我们回顾贸易战1.0发现一个奇怪现象。 部分中国医药产品最初被列入2018年4月发布的拟议加征关税清单，据华西证券统计，包括 38项有机化学品（HS 29），涵盖常用中间体和原料药，主要为合成抗生素、抗病毒、抗癌、激素类药物中间体、还原剂和原料；47项医药产品（HS 30），涵盖如肝素、疫苗、含抗生素类药物、含胰岛素类药物、含青霉素 G 盐的药品、含有青霉素或链霉素的药品、含有麻黄碱或其盐的药品、含有芳香族或改良芳香族化合物合成的VB2 /VB12/VE药品。 但于2018年6月发布的最终清单看，之前涉及的有机化学品和医药产品全部被排除在外。 这种纠结的心态传递着什么信号？ 总之，2018-2019年的中美贸易摩擦，三轮加关税极少涉及医药生物产业。 部分医疗产品目前的关税情况 01  关税，不是想加就能加 如果贸易政策执意要对抗市场规律和经济法则，将导致不利后果，而且医药事关生命安全，稍有不慎可能酿成人道危机。 当年美方在对医药产品加关税上遇到的阻力，至今并没有改变。 美国医疗卫生负担较重 这可能是贸易战1.0极少涉及医药的主要原因。据《保险研究》2023年第6期一篇研究文章，美国的药品价格是高收入国家中最高的，达到其他高收入国家平均水平的2.56倍。每个美国人每年在处方药上的支出平均超过1500美元。从1990年1月到2023年2月，处方药的价格增长了215.42%，月均增幅达到1.36%，每年均增幅达到17.63%（均按几何平均法计算）。 为了控制医疗费用的支出，美国部分仿制药、耗材等产品对中国的依赖度相对较高。抗生素、解热镇痛、激素等大宗原料药的全球生产基本都集中在中国，这种在供应链上的地位，不可能被印度取代。 据KPMG-CII，从建厂时间来看，在中国建一个工厂大约需一年时间，而在印度建立一生产API工厂大约需三年或更长时间；从原材料成本来看，中国拥有强大的低成本后端原材料供应链用于生产原料药，故印度的原材料成本比中国高25-30%；从电力成本来看，印度的电费比中国贵20%；从劳动力成本和生产效率来看，印度的劳动力成本比中国低1.8倍，但中国的劳动生产率却比印度高1.5倍；从其它成本来看，印度的其他成本（包括融资、物流、生产和设置成本）比中国高出30%。 尤其针对发酵生产，中国具备较大优势奠定差异化竞争基础。发酵工业特点包括高功耗和用水量、玉米和液体葡萄糖的持续供应和低温。中国在内蒙古、山西等满足这三个条件的周边地区战略性地发展了发酵产业。发酵多用于生产如抗生素、溶剂（如乙醇）和中间化合物（如柠檬酸）、其他发酵产物包括治疗性重组蛋白和 DNA、抗病毒药物和单克隆抗体。激烈的竞争已导致印度原料药行业（以发酵为基础的生产）很多进入关停阶段。 2022年8月，美国《通货膨胀削减法案》实施，历史性地赋予美国联邦医保部门对药品价格进行控制的多项权力。如今美国通胀卷土重来，CPI节节高升，2024年12月已逼近3字头。 对医药加关税的主要阻力，事实上变得更大了。 全球医药产业链高度融合 中国是全球医药价值链中许多其他国家的主要供应国。据Cortellis generic Intelligence数据库，2020 - 2021年美国市场通用活性药物成分（API）全球第一大制造商是印度，占比62.1%，而中国向印度供应超70%原料药及中间体。 这怎么切割呢？ 其实，印度很想摆脱依赖，未遂。 据华西证券，印度从中国进口的原料药比例从1991年1%左右上升至现在70%左右，大多数原料药的KSM，如咖啡因、氯霉素、阿奇霉素、磺胺多辛、环丙沙星、二甲双胍、环丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、氨苄西林、阿莫西林和头孢菌素均来自中国。且所有以发酵为基础的产品，如青霉素 G、阿莫西林和四环素，都是大多数抗生素的基础化学品，对中国的依赖程度非常高。  为解决对中国进口的高度依赖，印度政府于2020年3月宣布一项 994亿卢比的一揽子计划用于原料药行业以促进国内生产和出口，结果如何？ 据印度DGCI&S 数据，2023-24 财年从中国的原料药和中间体总进口额为 32.6亿美元，较上一财年增长5.89%，中国进口占整体进口的71.72%。 美国存在严重的药品短缺问题 2023年，美国短缺化疗药物顺铂注射液，紧急向齐鲁制药采购，连中文包装盒都没来得及换。 美国药品短缺达到历史最高水平。据ASHP，截至2024年第一季度，美国有323种药物短缺，这是自2001年开始追踪短缺数据以来的最高纪录，“ 几乎所有类别的药物都面临着容易出现短缺的情况。一些最为令人担忧的短缺涉及非专利无菌注射药物，包括癌症化疗药物以及存放在医院急救车和手术区的急救药物。” 制药供应链不稳定，可能导致人道主义灾难，这是贸易战应该顾虑之处。 部分CXO海外产能布局 02  出海逻辑不会动摇 贸易战2.0初期，可能在情绪面上压制市场，但医药行业的出海逻辑不会动摇。 医药生物连跌4年后，悲观预期基本反应到位，处于业绩底、估值底和配置底三重底部。截至2024/12/31，中信医药PE（TTM，剔除负值）为26.38X，板块估值溢价率为114.48%，分别达到17.60%、2.30%的历史分位。 积极变量在增多，悲观预期有望反转。前期受监管和控费影响较大的院内市场正逐步复苏。商保改善支付端，创新药械定价阈值提高，抬升销售峰值预期。国产BIC/FIC创新药数量几何级增长，国际化空间广阔。 院内刚需+创新+出海，受经济周期影响小，将是2025年医药主线逻辑。 天弘国证生物医药ETF（159859）跟踪指数的成分股固定为30只，生物医药行业属性鲜明，前十大权重股既有高弹性的CXO、创新药龙头，也有防御品种血液制品，合计权重约60%（来源：国证指数公司，截至20241231）。根据wind数据，这是跟踪国证生物医药这个指数的ETF里规模最大，流动性较好，2024年以来日均成交额超7000万，位列同类靠前水平，12月24日单日份额净申购近1.7亿，创阶段新高。场外布局或者定投的话也可关注天弘国证生物医药ETF发起式联接（A：011040，C：011041）。 创新药 在所有医药细分行业中，最不怕贸易战的是创新药，因为毛利率通常在80%以上，厂商对成本不敏感，并且可将产能转移至美国。 美国对中国创新药出口额远大于中国对美国出口额。据财通证券，我国的西药类出口以西药原料为主，占比高达79%，而西成药和生化药占比仅21%，而进口的西药类恰恰相反，西药原料占比仅20%，而西成药和生化药占比高达80%。  在创新药的进出口上，美欧发达国家仍处于优势地位及拥有对中国贸易顺差，在创新药领域引发贸易冲突将更多损害美国企业利益。 CXO 一叶知秋，从药明生物发布的2024年业务运营简报可以发现两个趋势。 一是CXO与欧美绑定更密切。药明生物2024H1约一半新签项目来自美国，2024全年变成超过一半新签项目来自美国。国内规划总产能从37.1万升削减为25.1万升，海外规划总产能24万升，海内外均衡配置产能，平抑关税风险、地缘冲击。在美国生产原液/制剂，离客户更近并加强合作，在北美生产GMP物料实现9个月的交付时间，而同业交付周期为12-24个月。 二是跨国药企供应链转移是伪命题。药明生物的“赢得分子”战略，是指处于不同研发阶段（临床I/II/III期+ CMO）的项目从全球其它CDMO公司或大药企转入药明生物。2024H1获得9个“赢得分子”项目，2024H2获得11个“赢得分子”项目，加速复苏。2024全年获得20个“赢得分子”项目，比上年增加2个，其中包括13个临床三期和商业化项目，大部分来自美国。2024H2 CMO（商业化生产）项目21个，环比增加30%，这说明已经从三星生物抢单的压力中企稳，2025年将加速增长。 医疗设备、耗材 2024年1-11月，中国医疗器械出口额为1256亿元，同比增长7.5%，实现贸易顺差443亿元，经历疫情波动后，恢复常态化增长。 低值耗材提前体验关税大战。去年9月，美国贸易代表办公室（USTR）宣布对中国部分医疗耗材产品加征关税，主要涉及注射器和针头、医用口罩、部分呼吸器在内的个人防护品、医用橡胶手套。其中，医用橡胶手套关税在2025 年提升到50%，在2026年进一步提升到100%。 英科医疗很淡定，最近“接单工作如期开展进行，保持满产满销状态”，因为加关税并不会减少需求，而且目前全球手套企业大部分无扩产计划。 英科医疗没有说的是，可通过海外建厂的方式，降低或者免除美国关税。公司正增加对非美国市场的出口，降低对美国市场的单一依赖，通过全球化布局，能够有效分散关税政策带来的影响，保障公司持续满产满销。 相同逻辑也适用于所有医疗设备和耗材企业。 对美国出口敞口不高也可降低风险。部分医疗器械企业，尽管海外业务比重较高，但公司本身出口敞口在欧洲或亚非拉，美国占比不高。 原料药 大宗原料药的全球生产基本都集中在中国，下游需求较为分散，中国的话语权较大，受到贸易战影响较小。 据银河证券，特色原料药需视具体品种和下游客户而定，肝素等特色化学原料药上游厂商和下游客户都相对集中，且更换原料药厂商程序较为复杂，美国需求刚性的局面下预计影响有限。 曾记否，2018年贸易战1.0期间，以恒瑞医药为代表优质药企相对抗跌，差点实现穿越周期，只是在最后一个月因为其他因素才撑不住了。 轮到贸易战2.0，中国医药产业的创新能力、在全球医药生态链中的重要地位，已今非昔比，也意味着拥有更强的抗压韧性。最近可关注底部资产生物医药ETF（159859）。 注：观点仅供参考，不构成投资意见，指数基金存在跟踪误差。同类对标跟踪生物医药指数的全部ETF，可比基金共3只，生物医药ETF（159859）24年日均成交排名1/3。

1973年，一组科学家成功地从发生流产的人类胚胎中的肾脏组织中分离出了一种最的胚胎肾细胞，即293细胞（人类胚胎肾细胞系293，HEK 293细胞）。这些细胞来源于一个父母谱系不明的胚胎，经过多次尝试后，科学家将转入变体腺病毒DNA片段进行转化。在最初的几个月里，细胞的转化过程相当困难，但最终科学家获得了一个稳定性较高且快速生长的HEK 293单克隆细胞株。自此，HEK 293细胞被成功培育出来。在细胞生物学和生物技术领域，HEK 293细胞的应用频率仅次于首个人类细胞系HeLa，并衍生出数百种不同的克隆细胞系。 1. HEK 293细胞概述1.1 细胞特性 该细胞系被5型腺病毒DNA片段转染，导致其永生化。HEK 293细胞具有以下特性： 生长特性：HEK 293细胞通常以贴壁生长方式培养，形态扁平，直径在11-15µm之间。它们也可以在悬浮培养条件下生长，此时细胞呈圆形。 遗传特性：HEK 293细胞是亚三倍体，具有64条染色体和三个X染色体拷贝。此外，细胞基因组整合了约4 kbp的腺病毒5型基因组片段，主要位于19号染色体上。 适应性：HEK 293细胞适应于多种培养基，包括Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）和DMEM培养基，通常添加10%胎牛血清（FBS）以及L-谷氨酰胺等营养成分。它们在37℃、5% CO2的条件下生长良好，pH值在6.9-7.1时可顺利贴壁生长。 转染效率：HEK 293细胞容易转染，常用的转染方法包括磷酸钙共沉淀法、脂质体介导转染和电穿孔等，转染效率可达90%以上。这使得它们成为基因功能研究和蛋白表达的理想工具。1.2 应用领域 HEK 293细胞在生物医学研究和工业生产中具有广泛的应用： 基因功能研究：由于HEK 293细胞易于转染，研究人员可以将目标基因导入细胞，研究其功能和调控机制。例如，通过过表达或敲除特定基因，观察细胞表型的变化，从而揭示基因在细胞生长、分化和信号传导中的作用。 蛋白表达与生产：HEK 293细胞能够高效表达外源蛋白，常用于生产重组蛋白，如单克隆抗体、细胞因子和酶等。其人类细胞系的背景使得生产的蛋白在结构和功能上更接近天然人类蛋白，具有较高的生物活性和稳定性。 病毒载体生产：HEK 293细胞广泛用于腺病毒、慢病毒和逆转录病毒等病毒载体的生产。这些病毒载体在基因治疗、疫苗开发和基因功能研究中具有重要应用。例如，在新冠疫苗的开发中，HEK 293细胞被用于生产病毒载体，以实现病毒基因的递送和表达。 药物筛选与毒性测试：HEK 293细胞可用于药物筛选和毒性测试，通过将细胞暴露于不同药物或化合物中，评估其对细胞生长、代谢和基因表达的影响，从而筛选出具有潜在治疗效果的药物或评估药物的安全性。 细胞信号传导研究：HEK 293细胞在细胞信号传导研究中也有广泛应用。研究人员可以利用该细胞系研究细胞表面受体与信号分子的相互作用，以及信号在细胞内的传递途径和调控机制。例如，通过转染特定的受体基因，研究其在细胞信号传导中的作用和信号通路的激活情况。2. 细胞培养方法2.1 培养基与条件 HEK 293细胞的培养基通常为Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM)或DMEM培养基，其中添加10%胎牛血清(FBS)以提供细胞生长所需的营养物质和生长因子。此外，培养基中还需添加2 mM L-谷氨酰胺以满足细胞的氮源需求。在特定情况下，如需要进行无血清培养，可以选择不含血清的培养基，并添加适量的胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸盐等替代成分，以维持细胞的生长和功能。 培养条件对HEK 293细胞的生长和表达具有重要影响。细胞通常在37℃、5% CO2的加湿培养箱中培养，以维持培养基的pH值在6.9-7.1范围内。pH值过高或过低都会影响细胞的生长状态和代谢活动。此外，培养箱中的湿度应保持在95%，以防止培养基的过度蒸发和浓度变化。在培养过程中，应定期观察细胞的生长情况，及时更换新鲜培养基，通常每2-3天换液一次，以保证细胞的营养供应和代谢废物的清除。2.2 细胞传代技术 HEK 293细胞的传代是细胞培养过程中的关键步骤，旨在维持细胞的生长活力和遗传稳定性。传代时，首先需要将细胞从培养瓶中消化下来。常用的消化方法是使用0.25%的胰蛋白酶-EDTA溶液。将消化液加入培养瓶中，轻轻摇晃使消化液均匀覆盖细胞表面，然后将培养瓶放入37℃培养箱中消化2-3分钟。在显微镜下观察细胞消化情况，当细胞大部分变圆并开始脱落时，迅速拿回操作台，加入适量的完全培养基终止消化。轻轻吹打培养瓶，使细胞完全脱落并形成单细胞悬液。 接下来，将细胞悬液转移至离心管中，以1000rpm的转速离心5分钟，弃去上清液。加入适量的新鲜完全培养基重悬细胞，根据传代比例将细胞悬液接种到新的培养瓶中。传代比例一般为1:4-1:8，具体比例可根据细胞的生长状态和实验需求进行调整。接种后，将新的培养瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中继续培养。传代后的细胞需要定期观察其贴壁生长情况，通常在12-24小时内，90%以上的细胞能够重新贴壁生长。传代周期一般为24-48小时，即每1-2天进行一次传代，以保持细胞的旺盛生长和良好的生长状态。3. 细胞培养注意事项3.1 无菌操作 无菌操作是HEK 293细胞培养成功的关键。整个培养过程必须在无菌条件下进行，以防止微生物污染。操作前，需要对所有器具和试剂进行严格的消毒和灭菌处理。例如，培养瓶、移液管等器具应使用高压蒸汽灭菌，培养基和其他液体试剂应通过0.22µm滤膜过滤除菌。操作时应在生物安全柜内进行，避免快速移动和交谈，以减少空气流动和污染风险。 在进行细胞操作时，动作要轻柔、准确，避免产生过多的气溶胶和污染。使用无菌技术打开培养瓶和试剂瓶，瓶口应通过酒精火焰消毒后再进行操作。操作过程中，应定期更换无菌手套，避免手部污染。此外，培养箱和操作台面也应定期清洁和消毒，以保持整个培养环境的无菌状态。3.2 培养条件维持 维持稳定的培养条件对HEK 293细胞的生长和表达至关重要。首先，温度应严格控制在37℃，这是细胞生长的最佳温度。温度过高或过低都会影响细胞的代谢活动和生长状态。其次，CO2浓度应保持在5%，以维持培养基的酸碱平衡，确保细胞在适宜的pH值范围内生长。培养箱中的湿度也应控制在95%左右，以防止培养基的过度蒸发和浓度变化。 此外，培养基的pH值应维持在6.9-7.1之间。pH值过高或过低都会对细胞产生不利影响。定期监测培养基的颜色变化，如培养基变黄，说明pH值下降，需要及时更换新鲜培养基。在培养过程中，还应定期观察细胞的生长情况，及时更换新鲜培养基，通常每2-3天换液一次，以保证细胞的营养供应和代谢废物的清除。 总之，无菌操作和培养条件的维持是HEK 293细胞培养成功的基础。只有在严格的无菌条件下，结合适宜的温度、CO2浓度、湿度和pH值等培养条件，才能确保细胞的健康生长和高效表达。4. 常见问题及解决策略4.1 细胞贴壁问题 HEK 293细胞贴壁能力较弱，容易在操作过程中脱落。以下是一些常见原因及解决策略： 培养基pH值不适宜：HEK 293细胞适应的pH值范围为6.9-7.1，pH值过高或过低都会影响细胞的贴壁能力。解决方法是定期监测培养基的pH值，必要时进行调整。可以使用预调pH值的培养基，或者在培养基中添加适量的碳酸氢钠以维持pH值稳定。 培养瓶表面处理不当：培养瓶表面如果过于光滑或存在污染，会影响细胞的贴壁。解决方法是使用经过包被的培养瓶，如预先涂覆一层多聚赖氨酸、明胶或鼠尾胶原等物质，以增加表面粗糙度和细胞附着力。此外，确保培养瓶在使用前经过严格的消毒和灭菌处理，避免污染。 消化过度：在传代过程中，如果胰蛋白酶-EDTA消化时间过长或浓度过高，会导致细胞消化过度，从而影响细胞的贴壁能力。解决方法是严格控制消化时间和消化液浓度，建议在显微镜下密切观察细胞消化情况，一旦细胞变圆并开始脱落，立即终止消化。 接种密度不当：接种密度过低会导致细胞难以贴壁和生长，而密度过高则会导致细胞聚集和竞争营养。解决方法是根据细胞的生长状态和实验需求，合理调整接种密度。一般建议的接种密度为1×10^4-5×10^4个细胞/cm²。4.2 细胞污染预防 细胞污染是细胞培养过程中常见的问题，会导致细胞生长受阻甚至死亡。以下是一些预防细胞污染的策略： 严格无菌操作：在整个细胞培养过程中，必须严格遵守无菌操作规程。操作前，对所有器具和试剂进行严格的消毒和灭菌处理，如使用高压蒸汽灭菌、过滤除菌等方法。操作时应在生物安全柜内进行，避免快速移动和交谈，以减少空气流动和污染风险。 定期更换培养基：及时更换新鲜培养基可以有效清除培养基中的代谢废物和潜在污染物。通常每2-3天换液一次，换液时要轻柔操作，避免对细胞造成机械损伤。 使用抗生素：在培养基中添加适量的抗生素，如青霉素和链霉素，可以有效抑制细菌和真菌的生长，预防细胞污染。但需注意抗生素的使用浓度不宜过高，以免对细胞产生毒性作用。 定期监测细胞状态：定期观察细胞的生长情况和形态变化，及时发现异常现象。如果发现细胞出现污染迹象，如培养基变浑浊、细胞形态异常、生长缓慢等，应立即采取措施进行处理。可以使用显微镜观察细胞是否有微生物污染，必要时进行细菌、真菌和支原体检测。 培养箱和操作台面清洁：保持培养箱和操作台面的清洁，定期进行消毒处理。培养箱内的水盘要定期更换水，避免细菌滋生。操作台面在使用前后要用70%酒精擦拭消毒。5. 细胞冻存与复苏5.1 冻存步骤 HEK 293细胞的冻存是细胞培养过程中的重要环节，旨在长期保存细胞系，以便未来使用。以下是详细的冻存步骤： 细胞准备：选择处于对数生长期的健康细胞进行冻存，此时细胞生长旺盛，冻存后复苏成功率较高。当细胞融合率达到80%-90%时，进行传代培养，待细胞生长良好后，方可进行冻存操作。 消化收集细胞：使用0.25%的胰蛋白酶-EDTA溶液对细胞进行消化。将消化液加入培养瓶中，轻轻摇晃使消化液均匀覆盖细胞表面，然后将培养瓶放入37℃培养箱中消化2-3分钟。在显微镜下观察细胞消化情况，当细胞大部分变圆并开始脱落时，迅速拿回操作台，加入适量的完全培养基终止消化。轻轻吹打培养瓶，使细胞完全脱落并形成单细胞悬液。 离心收集细胞沉淀：将细胞悬液转移至离心管中，以1000rpm的转速离心5分钟，弃去上清液，收集下层细胞沉淀。离心时注意转速和时间的控制，避免对细胞造成损伤。 制备冻存液：冻存液的配制是关键步骤之一。常用的冻存液配方为70%的完全培养基+20%胎牛血清（FBS）+10%二甲基亚砜（DMSO）。DMSO是一种常用的细胞冻存保护剂，能够有效防止细胞内冰晶的形成，减少冻存过程中对细胞的损伤。配制时需注意DMSO的加入方式，应缓慢滴加，边滴边轻轻摇晃，以确保其均匀混合。 重悬细胞：向离心管中加入适量的冻存液，用枪头反复吹打重悬起细胞。取少量细胞悬液计数细胞浓度及冻前存活率，一般细胞浓度为2-5×10^6 cells/mL较适宜。重悬时动作要轻柔，避免产生气泡，确保细胞均匀分散在冻存液中。 分装冻存：将重悬好的细胞悬液分装到无菌的冻存管中，每管分装1-1.5 mL。分装时要避免气泡的产生，可采用边分装边轻轻摇晃的方式，使细胞悬液均匀分布。在冻存管上做好标记，注明细胞名称、冻存日期、细胞浓度等信息，以便于后续管理和使用。 程序降温：将冻存管放入程序降温仪中进行缓慢降温。降温程序一般为：先在4℃下放置30分钟，然后在-20℃下放置1小时，最后在-80℃下过夜。缓慢降温有助于细胞逐渐适应低温环境，减少冰晶的形成，提高细胞的存活率。 液氮保存：降温完成后，将冻存管从-80℃冰箱中取出，迅速放入液氮罐中长期保存。液氮温度极低，能够长期保持细胞的活性和稳定性。在液氮保存过程中，需定期检查液氮罐的液氮量，确保冻存管始终处于液氮环境中。5.2 复苏操作 细胞复苏是将冻存的细胞恢复到正常生长状态的过程，操作的正确与否直接影响细胞的复苏效果。以下是详细的复苏操作步骤： 准备工作：提前将水浴锅预热至37℃，并准备好无菌的离心管、培养皿、移液管等实验器具。同时，将完全培养基在37℃培养箱中预热，以备后续使用。 快速融化：从液氮罐中取出冻存管，迅速将其投入37℃水浴锅中，轻轻摇动，使冻存管内的细胞悬液快速融化。整个融化过程应在1-2分钟内完成，以避免细胞在融化过程中受到损伤。 稀释细胞：将融化的细胞悬液吸出，加入到含有预热完全培养基的离心管中，轻轻混匀。通常情况下，将1 mL的细胞悬液加入到9 mL的完全培养基中进行稀释，以降低DMSO的浓度，减轻其对细胞的毒性。 离心收集细胞：将稀释后的细胞悬液以1000rpm的转速离心5分钟，弃去上清液，收集细胞沉淀。离心时注意转速和时间的控制，避免对细胞造成损伤。 重悬接种：用适量的完全培养基重悬细胞沉淀，制成均匀的细胞悬液。将细胞悬液接种到预先准备好的培养皿中，轻轻摇晃使细胞均匀分布。接种密度一般为1×10^4-5×10^4个细胞/cm²，根据细胞的生长状态和实验需求进行调整。 培养观察：将接种好的培养皿放入37℃、5% CO2的培养箱中进行培养。在细胞复苏后的24小时内，尽量减少对培养皿的移动和观察，以免影响细胞的贴壁和生长。在随后的培养过程中，定期观察细胞的生长情况，及时更换新鲜培养基，通常每2-3天换液一次。 评估复苏效果：通过显微镜观察细胞的形态、生长状态和密度，评估细胞的复苏效果。健康的复苏细胞应贴壁生长良好，形态正常，无明显的污染迹象。若发现细胞生长异常或污染，需及时采取相应措施进行处理。6. 细胞培养优化技巧6.1 提高细胞活性 提高HEK 293细胞活性是确保实验成功和获得可靠结果的关键。以下是几种有效的方法：优化培养基成分 添加氨基酸和维生素：在培养基中添加非必需氨基酸和维生素，如谷氨酰胺、丙酮酸钠、维生素C和维生素E等，可以促进细胞生长和代谢，提高细胞活性。例如，谷氨酰胺是细胞生长的重要氮源，添加2 mM的L-谷氨酰胺可显著提高细胞活性。 使用胎牛血清替代品：胎牛血清（FBS）是培养基中常用的添加物，但其成分复杂且批次间差异较大。使用经过优化的胎牛血清替代品，如无血清培养基添加剂，可以提供更稳定的生长环境，提高细胞活性。改善培养条件 控制温度和CO2浓度：HEK 293细胞最适宜的生长温度为37℃，CO2浓度为5%。使用精确控制温度和CO2浓度的培养箱，可以维持稳定的培养环境，有利于细胞的生长和活性维持。 调节pH值：培养基的pH值对细胞活性有重要影响。使用缓冲体系，如HEPES缓冲液，可以维持培养基的pH值在6.9-7.1范围内，从而提高细胞活性。采用细胞保护剂 抗氧化剂：在培养基中添加抗氧化剂，如谷胱甘肽、维生素C和维生素E等，可以清除细胞内的活性氧（ROS），减少氧化应激对细胞的损伤，提高细胞活性。 细胞凋亡抑制剂：使用细胞凋亡抑制剂，如Z-VAD-FMK等，可以阻断细胞凋亡途径，减少细胞死亡，提高细胞活性。定期传代和细胞计数 定期传代：细胞在培养过程中会逐渐衰老，定期传代可以去除衰老和死亡的细胞，保持细胞群体的年轻和活力。一般建议每2-3天进行一次传代。 细胞计数：在传代和实验操作前，进行准确的细胞计数，以确保细胞密度适宜，避免细胞过度拥挤或稀疏，从而维持细胞的正常生长和活性。6.2 提升转染效率 转染效率的提升对于基因功能研究和蛋白表达等实验至关重要。以下是几种有效的方法：选择合适的转染方法 脂质体介导转染：使用脂质体介导的转染试剂，如Lipofectamine 2000或Lipofectamine 3000，可以高效地将核酸导入HEK 293细胞。这些试剂通过形成脂质体-核酸复合物，促进细胞内吞作用，提高转染效率。 电穿孔转染：电穿孔转染通过短暂的高电压脉冲在细胞膜上形成瞬时孔洞，使核酸更容易进入细胞。这种方法适用于较难转染的细胞类型，但对细胞有一定的损伤，需优化电穿孔参数。优化转染试剂和核酸的用量 调整转染试剂和核酸的比例：不同的细胞类型和实验需求可能需要不同的转染试剂和核酸用量。通过实验优化，找到最佳的转染试剂和核酸的比例，可以显著提高转染效率。例如，对于HEK 293细胞，常用的转染试剂和质粒DNA的比例为3:1。 核酸的纯度和质量：确保所使用的核酸纯度高、无污染，且具有良好的超螺旋结构。核酸的质量直接影响转染效率，使用高质量的核酸可以提高转染的成功率。优化细胞状态和密度 细胞状态：选择处于对数生长期的健康细胞进行转染，此时细胞生长旺盛，转染效率较高。避免使用处于静止期或衰老期的细胞。 细胞密度：在转染前，将细胞密度控制在50%-80%之间。过低的细胞密度可能导致转染效率低，而过高的细胞密度则可能影响细胞的生长和转染效果。使用细胞转染增强剂 转染增强剂：使用细胞转染增强剂，如聚乙烯亚胺（PEI）等，可以提高转染效率。这些增强剂通过与核酸结合，形成稳定的复合物，促进细胞内吞作用，增加核酸在细胞内的摄取。优化转染操作步骤 转染复合物的制备：在制备转染复合物时，需严格按照试剂说明书进行操作，确保核酸和转染试剂充分混合。混合后需静置一段时间，使复合物充分形成。 转染后培养条件的调整：转染后，适当调整培养条件，如降低培养基中的血清浓度或添加抗生素，可以提高转染效率和细胞的稳定性。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。