Streptomycin Sulfate

庞昆 1徐龙兴 1安俊榴 1付天一 1千晔 1王彬 1熊亚南 1李冀 1刘顺成 2,3,4 袁丽杰 1  （1. 华北理工大学 基础医学院 河北省慢性疾病重点实验室 唐山市慢性病临床基础研究重点实验室， 河北 唐山 063210； 2. 华北理工大学医学部，河北 唐山 063210； 3. 河北省医工融合盐碱地综合利用重点实验室，河北 唐山 063210； 4. 河北省中医药管理局耐盐碱中药质量控制重点研究室，河北 唐山 063210 ） DOI：10.13344/j.microbiol.china.250801 ■■微生物学通报 本文刊发于《微生物学通报》2026年第3期，欢迎转发与转载！转载请注明来源！ 摘 要 背景极端高寒环境链霉菌是新活性天然产物的重要候选来源，在新型抗生素先导化合物发现中发挥重要作用。目前尚无对可可西里来源链霉菌资源的系统性研究。 目的对从可可西里独特土壤环境中分离筛选出的1株对多种检定菌具有广谱抑菌活性的放线菌进行鉴定，并深入探究其产生抑菌活性物质的生物合成潜力，为后续活性产物开发利用提供核心数据支撑。 方法采用Kirby-Bauer (K-B)纸片扩散法测定菌株24-1644发酵液对包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)在内的多种病原菌的抑菌活性，并评估该活性对热、酸碱及紫外照射的稳定性。应用antiSMASH在线工具对菌株基因组进行次级代谢产物生物合成基因簇(biosynthetic gene clusters, BGCs)预测与分析。运用COG与KEGG数据库进行基因功能注释分析。结合形态学、生理生化特征、16S rRNA基因序列系统发育分析、基因组系统发育分析及DNA-DNA相关性分析对菌株进行鉴定。 结果菌株24-1644发酵液对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、MRSA具有显著抑菌活性，同时对大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、大肠埃希氏菌耐药菌株、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)也表现出不同程度的抑菌活性，该活性在一定温度及pH范围内稳定，对紫外照射敏感。菌株24-1644基因组含有聚酮类、非核糖体肽类及萜类合成的关键生物合成基因簇，以及其他多种BGCs。其中有8个BGCs与已知结构相似性较低(15%-50%)，有16个BGCs与已知基因簇相似度低于15%，提示菌株24-1644有极大的合成新颖次级代谢产物的潜能。在COG、KEGG数据库中分别注释到4 082个和2 978个基因，其中分别有1 730个(占比42.38%)和1 680个(占比56.41%)编码基因参与生物代谢及代谢途径。基于形态学、生理生化指标、16S rRNA基因序列系统发育分析并结合基因组系统发育与DNA-DNA相关性分析，表明菌株24-1644与兰斯链霉菌(Streptomyces durocortorensis)的亲缘关系最近但遗传分化显著。 结论菌株24-1644代表1株与Streptomyces durocortorensis近缘的潜在链霉菌新资源，其发酵液具有广谱且稳定的抑菌活性；基因组分析显示该菌株含有聚酮类、非核糖体肽类、萜类等关键生物合成基因簇，蕴藏丰富的次级代谢潜能，预测存在较多的新颖生物合成基因簇，极具开发新型抗菌先导化合物的研究价值。 【 关键词 】//放线菌；可可西里；抗菌活性；次级代谢产物合成基因簇；菌种鉴定 微生物源抗生素作为临床抗微生物及抗肿瘤药物的基石，在重大疾病防治领域占据主导地位，并持续显现巨大的治疗潜力与发展空间[1]。放线菌具有卓越的代谢多样性，其代谢产物占已知微生物来源抗生素的70%以上[2]。在放线菌门内，链霉菌属(Streptomyces)不仅包含最多的已描述物种[3]，更是产生天然抗生素的主力军。数据显示，75%的放线菌来源抗生素由链霉菌属合成[4]，是众多临床抗生素及其他领域天然药物的重要来源。然而随着人们的大规模研发，从普通生态环境中分离出的放线菌资源及其代谢产物的重复率持续上升，在微生物来源的活性物质中，放线菌活性产物的占比也从早期的62%下降至当前的28.5%[4]，这促使研究人员开始将目光转向未被充分开发的特殊生态环境放线菌资源[5]。 可可西里自然保护区被誉为“生命的禁区”，其位于“世界屋脊”[6]青藏高原腹地，自然环境恶劣，气候高寒、低氧、少雨、辐射强、多大风[7]，是全球高海拔极端环境生态系统的典型代表。该区域独特的复合胁迫环境促使高原微生物进化出独特的适应机制，为放线菌的生长和演化提供了天然条件。目前针对可可西里地区可培养放线菌资源的探索仍较为匮乏，只有苏进进[8]从可可西里25份土壤样品中分离得到放线菌48株，分属于13个属，未进行抗菌活性评价。Zhang等[9]从青藏高原可可西里沱沱河附近土壤中分离到1株放线菌新种Z1027T，对大肠埃希氏菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有抗菌活性。一株来源于可可西里的放线菌KKD1对植物病原体具有显著的生物效能，并展现出对极端环境的适应能力[10]。可见，可可西里高寒荒漠生态系统中放线菌研究严重不足，代谢潜力亟待深入挖掘。 因此，我们聚焦于可可西里自然保护区土壤优质放线菌资源的挖掘，通过对分离菌株进行抑菌活性检测，筛选出具有良好抑菌活性的放线菌株，进一步评估菌株发酵液抑菌活性的稳定性，通过基因组学探究其抗菌活性物质的生物合成潜力并进行菌株鉴定，以期为后续深入挖掘新结构新活性抗菌化合物提供重要菌源和理论基础，也将有助于对极端环境微生物次级代谢产物合成机制的认识，为深入开发可可西里独特的放线菌资源提供依据。 1 材料与方法 1.1 样品 供试放线菌菌株24-1644，本实验室保存。 供试检定菌：大肠埃希氏菌(Escherichia coli) ATCC 25922T、大肠埃希氏菌耐药菌株(E. coli) ATCC 35218T、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) ATCC 700603T、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) ATCC 27853T、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii) ATCC 19606T、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC 29213T、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) ATCC 43300T、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ATCC 6633T、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、白色念珠菌(Candida albicans) ATCC 10231T，本实验室保存。 1.2 培养基、主要试剂和仪器 发酵培养基(g/L)：葡萄糖10.0，可溶性淀粉30.0，棉籽粉20.0，酵母膏3.0，(NH4)2SO4 3.0，K2HPO4 1.0，MgSO4 1.0，NaCl 1.0，CaCO3 5.0，pH 7.2；检定菌培养基：LB固体培养基(g/L)：酵母浸粉5.0，胰蛋白胨10.0，氯化钠10.0，琼脂粉15.0；YPD液体培养基(g/L)：蛋白胨20.0，葡萄糖20.0，酵母浸粉10.0；YPD固体培养基(g/L)：蛋白胨20.0，葡萄糖20.0，酵母浸粉10.0，琼脂粉16.0；ISP 2、ISP 3、ISP 4、ISP 5、ISP 6和ISP 7培养基参考文献[11]配制；Bennet’s培养基，北京酷来搏科技有限公司；察氏培养基参考文献[12]配制；营养琼脂和胰蛋白大豆琼脂，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。Chelex-100，Sigma-Aldrich公司；青霉素G和链霉素，杭州滨和微生物试剂有限公司；分析级甲醇，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；PCR仪和低温高速离心机，Eppendorf公司；凝胶成像系统，Bio-Rad公司。 1.3 菌株的发酵及抗菌活性鉴定 1.3.1 发酵液的制备 将菌株24-1644接种于ISP 2培养基中28 ℃活化7 d后转接至发酵培养基(装液量为1/5瓶容积)，在28 ℃、180 r/min条件下振荡培养5 d。发酵结束后，向发酵产物中加入等体积甲醇，充分混匀并于4 ℃静置浸提过夜。随后将混合物于4 000 r/min离心20 min，收集上清液。将上清液转移至玻璃平皿中，置于通风橱内挥干溶剂。所得残留物使用2 mL甲醇溶解，即得浓缩粗提物，于-20 ℃保存备用。 1.3.2 检定菌平板制备 将检定菌分别接种于LB固体培养基表面，于37 ℃恒温培养箱中培养12 h (耻垢分枝杆菌置于35 ℃培养，白色念珠菌置于28 ℃培养)。随后，挑取形态单一、分离良好的菌落，分别接种至20 mL LB液体培养基中(白色念珠菌使用YPD液体培养基)，在37 ℃、180 r/min振荡条件下培养至OD600为0.6。同时，制备适量LB固体培养基，经121 ℃灭菌20 min。待培养基冷却至适宜温度(约50-55 ℃)，将上述培养至对数期的检定菌悬液按1%接种量加入培养基中，充分混匀后倾注于无菌培养皿，静置凝固备用。 1.3.3 抗菌活性测定 采用Kirby-Bauer (K-B)纸片扩散法[13]测定供试放线菌浓缩粗提物的抗菌活性。取无菌空白滤纸片(直径6 mm)，滴加30 μL供试放线菌浓缩粗提物，室温下待甲醇完全挥发，将其贴置于检定菌平板。同时，以青霉素、链霉素作为阳性对照；以滴加等体积甲醇并挥发至干的滤纸片为阴性对照。将接种平板分别置于37 ℃恒温培养(耻垢分枝杆菌于35 ℃培养，白色念珠菌于28 ℃培养) 18-24 h。设置3个重复。采用十字交叉法测量并记录抑菌圈直径大小。 1.4 活性菌株的鉴定 1.4.1 形态特征观察 将活性菌株24-1644接种于ISP 2培养基，28 ℃恒温培养1-2周。观察并记录菌株在平板上的生长状况、菌落形态及颜色特征，同时采用光学显微镜对菌丝与产孢结构进行观察，记录分生孢子丝与分生孢子的形态特征。 1.4.2 培养特征观察 参照国际链霉菌计划[11]选用10种供试培养基。采用四分区划线法接种菌株24-1644，28 ℃倒置培养7-28 d，观察记录菌株的生长状况、基内菌丝与气生菌丝长势与颜色、可溶性色素产生情况。 1.4.3 生理生化 生理生化特征参照《链霉菌鉴定手册》[14]和《放线菌系统学：原理、方法及实践》[15]，测定菌株24-1644的明胶液化、淀粉水解、H2S生成、硝酸盐还原、牛奶凝固与胨化、纤维素水解、七叶苷水解、吐温-20水解、吐温-60水解、吐温-80水解、氧化酶、过氧化氢酶、DNA酶、脲酶、甲基红和V-P等指标。 1.4.4 16S rRNA基因测序及系统发育分析 采用Chelex-100法[16]提取菌株的基因组DNA。采用引物PA (5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′)和PB (5′-AAGGAGGTGATCCAGCC GCA-3′)进行16S rRNA基因序列扩增。PCR反应体系(50 μL)：引物PA (10 μmol/L) 1.0 μL，引物PB (10 μmol/L) 1.0 μL，2×Taq Master Mix 25 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 22 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，58 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，33个循环；72 ℃ 10 min。PCR扩增产物交由生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序。所得测序结果在EzBioCloud数据库[17] (https://www.ezbiocloud.net/)中与标准菌株序列进行相似性比对，使用MEGA 11.0软件基于邻接(neighbor-joining, NJ)法和Kimura 2-parameter模型[18]进行聚类分析，通过自展法重复取样1 000次评估系统发育树拓扑结构的相对稳定性，构建菌株的16S rRNA基因系统发育树。 1.4.5 菌株24-1644全基因组测序 将菌株24-1644单菌落接种于灭菌ISP 2液体培养基中，28 ℃、180 r/min培养5-7 d，收集菌体送生工生物工程(上海)股份有限公司进行菌体基因组DNA提取、琼脂糖凝胶电泳样本质检、文库制备与构建、全基因组测序与组装，通过基因预测、基因元件分析、基因注释等了解全基因组序列信息。 1.4.6 基因组系统发育与DNA-DNA相关性分析 利用JSpeciesWS在线服务平台，分别基于BLAST+ (ANIb)、MUMmer (ANIm)以及基因组间距离计算器(genome-to-genome distance calculator, GGDC)中的Formula 2[19]，计算菌株与其最亲缘菌株基因组间的平均核苷酸一致性(average nucleotide identity, ANI)和数字化DNA-DNA杂交值(digital DNA-DNA hybridization, dDDH)。从EzBioCloud数据库检索与菌株24-1644最近的系统发育亲缘菌株，在GenBank数据库中进行基因组下载，基于基因组序列的系统发育树通过模式菌株基因组服务器(type strain genome server, TYGS) (https://tygs.dsmz.de/)[20]平台构建。 1.5 发酵产物稳定性分析 基于抑菌谱筛选结果评估菌株24-1644活性产物的稳定性。以未经任何处理的原始浓缩粗提物作为对照，采用纸片扩散法[13]测定抑菌圈直径，考察发酵液在不同pH (2.0、4.0、6.0、8.0、10.0)，不同温度(4、28、40、60、80、100 ℃)及不同紫外光照时间(0.5、1、3、5、7、9、12 h)处理下的抑菌活性变化，设置3个重复。 1.6 次级代谢产物生物合成基因簇分析 运用antiSMASH (https://antismash.secondary metabolites.org)对菌株24-1644中的次级代谢产物合成基因簇进行注释、分析，进一步预测该菌株潜在的生物合成代谢物。 2 结果与分析 2.1 菌株24-1644抗菌活性 采用K-B法评估放线菌24-1644对10种检定菌的抑菌活性，如表1所示，放线菌24-1644对6种检定菌有抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌、耻垢分枝杆菌有明显抑制作用，抑菌圈直径超过20 mm；对MRSA抑菌圈直径大于18 mm；对大肠埃希氏菌、大肠埃希氏菌耐药菌株和枯草芽孢杆菌有一定抑制作用，抑菌圈直径在9.6-13.6 mm之间；对肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌无抑制作用。放线菌24-1644的拮抗病原菌平板见图1。 表 1   菌株24-1644发酵液抑菌活性Table 1   Antimicrobial activity of fermentation broth from strain 24-1644 -：无明显抑菌活性。 -: No significant antimicrobial activity. 图1   菌株24-1644对6种检定菌的抑制效果   A：枯草芽孢杆菌；B：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；C：金黄色葡萄球菌；D：大肠埃希氏菌；E：大肠埃希氏菌耐药菌株；F：耻垢分枝杆菌。C：Control，甲醇空白对照；PG：青霉素G；SM：链霉素。Figure 1   Inhibitory effect of strain 24-1644 against six common pathogenic bacteria. A: Bacillus subtilis; B: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA); C: Staphylococcus aureus; D: Escherichia coli; E: Drug-resistant strain of Escherichia coli; F: Mycobacterium smegmatis. C: Control, methanol blank control; PG: Penicillin G; SM: Streptomycin. 2.2 菌株24-1644鉴定结果 2.2.1 菌落特征 菌株24-1644在ISP 2培养基上生长良好，菌落呈圆形且中央凹陷，边缘不规则，表面干燥有褶皱，孢子丝呈散在分布，基内菌丝呈浅黄色，气生菌丝呈灰色(图2A)。分生孢子丝细长，侧面偶有单个分支，分生孢子呈串珠样，末端卷曲(图2B)。菌株24-1644在10种供试培养基上28 ℃倒置培养7-28 d，生长状况均良好，其基内菌丝以乳白色为主，气生菌丝以灰色和白色为主，具体培养特征见表2。 图2   菌株24-1644菌落形态   A：菌株24-1644在ISP 2培养基的菌落形态；B：分生孢子丝及分生孢子(400×)。Figure 2   Colonial morphology of strain 24-1644. A: Colonial morphology of strain 24-1644 on ISP 2 medium; B: Conidiophores and conidia (400×). 表2   菌株24-1644培养特征Table 2   Cultural characteristics of strain 24-1644 +++：生长良好；++：生长中等；+：生长较差；-：未观察到生长。 +++: Grows well; ++: Grows moderate; +: Grows poor; -: Not observed. 2.2.2 生理生化结果 生理生化结果表明，菌株24-1644的明胶液化、淀粉水解、硝酸盐还原、牛奶凝固与胨化、七叶苷水解、脲酶、过氧化氢酶、吐温-20、吐温-60、吐温-80试验结果为阳性，H2S生成、纤维素水解、甲基红、V-P、DNA酶、氧化酶试验结果为阴性(表3)。 表3   24-1644生理生化特征Table 3   Physiological and biochemical characteristics of strain 24-1644 +：阳性；-：阴性。 +: Positive; -: Negative. 2.2.3 16S rRNA基因测序及分析结果 提取菌株24-1644的基因组DNA并进行16S rRNA基因扩增，测序得到1 457 bp的DNA序列并提交至GenBank，登录号为PV877064。经EzBioCloud数据库比对显示与链霉菌属(Streptomyces)存在高度亲缘关系。与兰斯链霉菌(Streptomyces durocortorensis) 16S rRNA基因序列相似性高达100%。选取比对相似性较高菌株的16S rRNA基因序列，经MEGA 11.0构建系统发育树(图3)，结果显示菌株24-1644与S. durocortorensis RHZ10T聚类于同一分支，并且支持率为99%。 图3   基于16S rRNA基因序列构建的菌株24-1644的系统发育树   分支处数值表示bootstrap支持率；括号中为16S rRNA基因序列的GenBank登录号；标尺0.01表示序列的进化差异。Figure 3   Phylogenetic tree of strain 24-1644 based on 16S rRNA gene sequences. Numbers at branch nodes represent bootstrap values; GenBank accession numbers for the 16S rRNA gene sequences are given in parentheses; Scale bar 0.01 indicates sequence divergence. 2.2.4 基因组系统发育及DNA-DNA相关性分析结果 菌株24-1644全基因组序列总长度为7 571 626 bp，G+C含量为70.18%，无未知碱基。该菌株完整基因组序列已上传至NCBI GenBank数据库，基因组登录号为JBQPQW000000000。 菌株24-1644与Streptomyces durocortorensis基因组序列测定的dDDH值、ANIb与ANIm值分别为27.30%、82.14%、86.82%。低于70% dDDH值[21]和95%-96% ANI值[22]的种界阈值。基于基因组序列的系统发育树显示，菌株24-1644形成了一个独立的亚支系(图4)，并且与Streptomyces durocortorensis亲缘关系较为密切。综合基因组、16S rRNA基因系统发育及表型数据，菌株24-1644代表1株与S. durocortorensis近缘但遗传分化显著(16S rRNA基因序列相似度为100%，ANI<95-96%，dDDH<70%)的链霉菌新资源。 图4   菌株24-1644与相关参考菌株的系统发育基因组树   系统发育树节点处的数字表示在100次重复抽样中超过60%的伪自展值。该系统发育树平均分支支持率为98.0%，δ值为0.177。Figure 4   The phylogenomic tree of strain 24-1644 and related reference strains. Numbers at the nodes of the phylogenetic tree represent pseudo-bootstrap values (>60%) based on 100 replicates. The average branch support of this phylogenetic tree is 98.0%, with a delta value of 0.177. 2.3 菌株24-1644发酵产物稳定性 由图5A可知，菌株24-1644发酵液热稳定性良好，经过4-100 ℃处理2 h后，对MRSA、耻垢分枝杆菌的抑制作用整体呈下降趋势。以替考拉宁和万古霉素为代表的糖肽类抗生素，可通过抑制细胞壁合成、破坏细胞膜通透性和抑制细菌RNA合成三种方式对MRSA发挥抗菌作用，该类产物由非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase, NRPS)催化组装而成[23-24]，目前上市的糖肽药物大多以冻干形式储存在2-8 ℃，高温会加剧糖肽类药物的不稳定性[25]，从而影响其活性，由此推测菌株24-1644发酵液中可能含有类似化合物。对其余4种检定菌的抑制作用维持在较稳定水平。这种热稳定性符合某些抗生素的特征，如红霉素等聚酮类抗生素，通常具有复杂而稳定的芳香环或大环内酯结构[26]，这些共价键网络赋予了它们良好的化学和热稳定性。由图5B可知，发酵液经不同酸碱度处理，当发酵液pH值为2.0-10.0时，对金黄色葡萄球菌的抑制效果无明显变化，对MRSA的抑制效果随着pH的升高出现小幅升高；在pH>6.0的条件下，对枯草芽孢杆菌的抑制作用显著降低至消失；当发酵液pH<4.0和>8.0时，对大肠埃希氏菌、大肠埃希氏菌耐药菌株的抑制效果下降；对耻垢分枝杆菌的抑制效果在pH>8.0时明显下降；由此，控制发酵液pH值在4.0-8.0范围内最有利于活性物质的分离纯化。发酵液抗菌活性在不同pH下的变化规律暗示其核心活性物质可能是一种对酸碱度较为敏感的分子，其稳定性、溶解性、电离状态，以及与不同细菌特有细胞结构的相互作用可能均受pH调控。由图5C可知，将发酵液放置在室温距离紫外灯30 cm处，发酵液抑菌活性在紫外照射0.5 h后均明显下降，表明发酵液中可能含有对紫外光敏感的发色基团或化学结构，紫外光能够破坏化合物中的不饱和键(如C=C，C=O)或芳香环结构，引起光化学降解或聚合，从而导致失活[27]。 图5   菌株24-1644发酵液不同处理下抑菌活性变化   MRSA：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。Figure 5   Changes in antibacterial activity of strain 24-1644 fermentation broth under different treatments. MRSA: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. 2.4 菌株24-1644基因组生物信息学分析 将菌株24-1644的基因组信息导入蛋白质直系同源簇(clusters of orthologous groups of proteins, COG)数据库进行分类注释显示(图6)，菌株24-1644共有4 082个蛋白编码基因被注释，涉及23个功能类别，其中参与一般功能预测的基因最多，共536个(占13.13%)；此外，主要涉及的类别有转录(483个)、氨基酸的转运与代谢(373个)、碳水化合物的转运与代谢(305个)、能量生产与转换(264个)、信号传导机制(251个)、功能未知(229个)，分别占比11.83%、9.14%、7.47%、6.47%、6.15%、5.61%。菌株24-1644与生物代谢相关基因占所有基因的42.38%，表明菌株具有活跃的代谢网络系统。 图6   菌株24-1644基因组COG功能注释分析Figure 6   COG functional annotation analysis of the genome of strain 24-1644. 将菌株序列与KEGG数据库进行比对注释，如图7所示，共注释到2 978个基因，涵盖代谢(metabolism)、环境信息处理(environmental information processing)、遗传信息处理(genetic information processing)、细胞过程(cellular processes)和有机系统(organismal systems)这5个代谢类别共29条通路。代谢途径相关基因占据显著地位，共有1 680个基因被注释，其中，碳水化合物代谢通路基因最多，有291个；其次是氨基酸代谢通路、全局与概述图谱通路，分别有271个和266个基因，辅助因子和维生素代谢相关基因有165个，能量代谢相关基因有158个，脂质代谢相关基因有108个，核苷酸代谢相关基因有103个。基因组注释分析结果表明菌株24-1644蕴藏着强大的代谢潜能。 图7   菌株24-1644的KEGG功能分类图Figure 7   KEGG functional classification map of strain 24-1644. 将菌株基因组信息导入antiSMASH次级代谢产物数据库中，进行菌株次级代谢产物生物合成基因簇(biosynthetic gene clusters, BGCs)分析。antiSMASH共预测出31个潜在的BGC，参与合成的次级代谢产物主要类型包括：萜类(terpene)、非核糖体多肽(NRPS)、聚酮类(Polyketide synthase, PKS)、类似核糖体肽(RiPP-like)、β-内酰胺类(blactam)及铁载体(NI-siderophore)等。其中，基因簇8、13、19、27分别与孢子色素(spore pigment)、黑色素(melanin)、土臭素(geosmin)、依克多因(ectoine)的生物合成密切相关，呈高度相似(相似度>75%)，基因簇15、16、24分别与carbapenem MM4550 (抗生素碳青霉烯类MM4550)、hopene (禾烯)、desferrioxamin B (去铁胺素B)生物合成基因簇呈中度相似，相似度介于50%-75%之间，这表明菌株24-1644具有合成抗菌、抗氧化、铁螯合、渗透调节等多种生物活性物质的潜力。除此之外，还有8个BGC与已知代谢物基因簇的相似度较低(15%-50%)，有16个BGC与已知代谢物基因簇相似度低于15%，表明菌株24-1644的次级代谢物合成基因簇具有产生多种新型次级代谢产物的潜力(表4)。 表4   菌株24-1644基因组中的次级代谢产物生物合成基因簇Table 4   Secondary metabolite biosynthetic gene clusters in the genome of strain 24-1644 High: >75%; Medium: 50-75%; Low: 15-50%; -: < 15%. 3 讨论 当前，鉴于病原体耐药性持续加剧与新型抗菌药物研发不足，亟须探索新型抗菌化合物[28]。2024年世界卫生组织(World Health Organization, WHO)更新了耐抗生素细菌优先病原体清单，其中抗生素耐药细菌家族由2017年的12个增加到15个[29]。与此同时，放线菌来源的活性化合物在微生物活性代谢产物总量中的占比也呈下降趋势[4,30]。特殊生态环境是指在结构功能方面表现出显著异质性或独特性的生存区域，这类区域明显区别于普通环境，最终致使其中栖息的生物类群在品质或数量上产生巨大差异[31]。特殊生态环境对于探寻未知微生物种类、代谢产物生成菌及微生物药物研发至关重要，其往往孕育着独特丰富的放线菌资源及丰富多样的生物合成新基因[32]。Charlop-Powers等[33]研究表明土壤微生物次级代谢产物生物合成基因的多样性及其产生新化合物的潜力与地理距离和生境差异显著相关。挖掘未充分探索的极端或特殊生境，以获取能合成新型生物活性物质的放线菌资源，是当前放线菌开发的关键，也是持续满足新型天然产物需求的重要途径之一[34]。Sivalingam等[35]发现，高山寒冷生境中的放线菌菌株能合成一系列具有生物活性的次级代谢产物(包括抗生素、海藻糖、甘油和脂肪酶等)，这些代谢物很可能是其环境适应性与生存的重要基础。Liu等[36]从青藏高原西部阿里地区分离到稀有放线菌拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.) A133，其培养液具有广泛的抗菌活性，从中鉴定出利福霉素W (1)、原霉素I (2)、原霉素B (4)、利福霉素S (5)和一个新的天然利福霉素成员利福霉素W-m1 (3)。由此可见，高海拔恶劣生境塑造了放线菌独特的生理和代谢特征，赋予其强大的环境适应力，并驱动合成丰富的生物活性代谢产物。 本研究中链霉菌24-1644来源于青海省可可西里地区特殊生境，具有广谱抗菌活性，综合基因组、16S rRNA基因系统发育及表型数据，确定菌株24-1644代表一株与Streptomyces durocortorensis近缘但遗传分化显著的链霉菌新资源。该菌株对MRSA、大肠埃希氏菌等6种检定菌具有广谱抗性，其中对金黄色葡萄球菌、耻垢分枝杆菌的抑菌效果显著，抑菌圈直径达20 mm以上，同时对MRSA、大肠埃希氏菌的抑菌圈分别达到18 mm和13 mm；此外，活性产物在不同热处理及一定酸碱范围内仍保持稳定，表明其活性物质可能具备良好的成药潜力。另外，其抗菌活性对长时间的紫外照射敏感，提示可能存在对光不稳定的化学基团，这为后续活性物质的分离纯化及储存提供了关键信息。 目前，天然产物发现的起点正在从提取物的表型筛选转向微生物基因组中新遗传元素的探索[37]。微生物基因组包含大量编码复杂天然产物生物合成的基因簇(biosynthetic gene clusters, BGCs)，这些基因簇为微生物合成具有独特结构和生物活性的次级代谢产物提供了遗传基础。解析这些基因簇对于理解微生物的生理功能及其代谢至关重要，同时也是发现新结构新活性化合物的关键途径，为后续新型药物和农用化学品的研发打下坚实基础[38]。基因组分析揭示菌株24-1644蕴藏着巨大的新颖次级代谢产物合成潜力。检测到的PKS和NRPS相关基因簇是合成结构复杂、生物活性多样的聚酮类和非核糖体肽类的关键遗传基础[39-40]。大环内酯类化合物作为聚酮类天然产物的典型代表，具有抗菌或抗真菌活性，被广泛应用于临床药物治疗[41]。临床一线药物万古霉素是由NRPS等“多酶复合体”催化形成的糖肽类抗生素，用来治疗耐药菌如耐甲氧西林葡萄球菌和艰难梭菌(Clostridioides difficile)引发的感染[24]。通过antiSMASH分析预测到31个BGC，其中有8个属于PKS和NRPS相关基因簇；此外还存在8个与已知代谢物基因簇相似度较低(15%-50%)的BGC以及16个与已知代谢物基因簇相似度低于15%的BGC，预示菌株24-1644具有产生多种新型生物活性及新结构的次级代谢产物的潜力。较高比例的低相似度BGC提示，可可西里独特的环境压力(高寒、低氧、强辐射)极有可能驱动了菌株24-1644进化出新型生物合成途径，使其成为新结构或新活性天然产物发现的理想候选菌株[42]。此外，在用于同源蛋白注释、预测蛋白质功能的COG数据库中，分析注释到4 082个蛋白编码基因，其中42.38%的基因与菌株生物代谢相关。在研究代谢通路的KEGG数据库中，分析注释到2 978个基因，其中有关代谢途径的相关基因数量最多，有1 680个。上述2个从不同角度解析基因组的数据库分析结果表明，菌株24-1644具备较高的次级代谢产物合成潜力，这些多样化代谢特征的存在提示菌株24-1644进化出了对其极端栖息地的特定适应能力。 本研究不仅为开发应对耐药菌感染的新型候选药物提供了极具潜力的出发菌株和坚实的理论基础，也深化了对高寒极端环境微生物资源及其独特次级代谢能力的认知，为未来系统挖掘和利用这类特殊生境微生物资源奠定了重要基础。 4 结论 本研究自青海省可可西里高寒极端环境中分离得到一株链霉菌新资源24-1644，该菌株不仅对MRSA、金黄色葡萄球菌及大肠埃希氏菌等多种病原菌表现出广谱且稳定的抗菌活性，还具备丰富而新颖的次级代谢潜能。基因组分析显示其编码大量低同源性BGCs，尤其是PKS和NRPS类基因簇，提示可能合成结构新颖的活性化合物。该菌株高度多样化的代谢特征与其所处的高寒、低氧、强辐射环境密切相关，体现了其对极端生境的适应性进化。综上，菌株24-1644不仅为开发新型抗菌药物提供了重要的种质资源，也为探索微生物适应机制与次级代谢进化提供了理想的研究对象。 推荐阅读 ◆ 极端耐旱链霉菌D67对梨火疫病原菌毒力因子的抑制作用 ◆ 链霉菌HKIB0006中collismycin A葡萄糖酸修饰产物的发现 当年目次 2026年53卷第1期 2026年53卷第2期 2026年53卷第3期 欢迎加入科微学者交流群 扫描二维码 关于本刊 《微生物学通报》1974年创刊，月刊，由中国科学院主管，中国科学院微生物研究所和中国微生物学会共同主办，国内外公开发行，以微生物学应用基础研究及高新技术创新、应用为主的综合性期刊。期刊聚焦微生物学前沿进展与关键技术，推动学科理论创新与成果转化。通过刊发基础研究、应用技术及交叉学科的高质量论文，搭建国内外学术交流平台，促进微生物资源开发、生物技术突破及产业应用。2024年入选中国科技期刊卓越行动计划中文领军期刊，及中国科学院精品科技期刊建设试点项目，是北大中文核心期刊、中信所中国科技核心期刊、中国科学引文数据库CSCD核心期刊。据中国科学技术信息研究所信息统计，本刊核心总被引频次、综合评价总分等期刊主要引证指标多年稳居微生物学、病毒学类第1。连续12次入选“百种中国杰出学术期刊”，为“中国精品科技期刊顶尖学术论文（F5000）”项目来源期刊。本刊已被《剑桥科学文摘(美)》(CSA)、《化学文摘（美）》(CA)、《哥白尼索引》(IC)、日本科学技术信息集成系统 (JST)、化学文摘服务 (CAS)、中国科学引文数据库 (CSCD)、中国知网 (CNKI)、万方数据库等国内外多个检索数据库收录。 期刊订阅 1.直接联系联合编辑部订购，发行部E-mail：bjb@im.ac.cn；Tel：010-64807336； 2.各地邮局订阅：邮发代号2-817； 3.网上购买：搜淘宝店、微店店铺名称：中科期刊（订阅及销售过刊）；科学出版社期刊发行部：联系电话010-64017032  64017539； 或扫描下方二维码： ——中文期刊联合编辑部出品 点击“阅读原文”了解本期详情

世界卫生组织提出“到2035年终结结核病”，2025年中国首次进入到全球结核病中低流行国家行列，实现历史性的进步。进入2026年，我国进入了消除结核病的“下半场”，如何实现终结结核病的目标？ 3月24日是世界防治结核病日。在日前由北京大学社会化媒体中心、全球健康药物研发中心（GHDDI)共同主办的“科研创新如何重塑结核病消除的‘下半场’”研讨会上，来自国际组织、疾控系统、科研一线和创新企业的专家，研讨全球及中国结核病防控现实挑战，专家们一致认为，要打赢与结核病的这场战争，科研创新将成为破局的关键。 科技创新起重要作用 世界卫生组织驻华代表处的陈仲丹博士介绍，在人类和结核病的漫长斗争中，科技创新始终起到至关重要的作用。 20世纪前几乎没有什么手段治疗结核病，原始的人工气胸、胸廓成形肺切除等手段，治疗效果非常差。1882年3月24日罗伯特·科赫发现结核分枝杆菌，3月24日也被定为世界防治结核病日，罗伯特·科赫也获得了诺贝尔医学生理学奖。之后，相关的卫生防控措施应运而生，遏制了结核病传播。 病菌的发现推动了诊断和预防工具的发明，1907年发明了结核菌素皮肤试验，1921年发明了卡介苗，1943年发现了链霉素，1943年发现了对氨基水杨酸，1952年开始使用异烟肼。到20世纪50年代，多联用法形成了更有效的方案，结核病的发病率、死亡率大幅下降。 多领域创新升级防控“武器库” 本次研讨会上，诊断、药物研发、疫苗等多领域的科技创新成果成为焦点，一系列新技术、新工具持续丰富结核病防控“武器库”，精准破解传统诊疗、研发中的核心痛点。 当前结核病诊断仍依赖痰液检测这个“金标准”，但无痰、痰液不达标等问题造成巨大诊断缺口，肺外结核、儿童结核、艾滋病合并结核感染等人群更是诊断难点。清华大学生物医学工程学院院长胡晔分享了基于血液标志物的诊断技术突破，利用 CRISPR 方法检测血液中的游离 DNA，在此基础上，团队研发的便携检测方法。予果生物创始人兼 CEO 夏涵则介绍了国内首款获批的基于舌拭子样本的结核PCR检测试剂盒，为推动实现“2035年全球终结结核病”目标提供了创新工具与中国方案。 曾经制约结核病药物研发速度的问题，也因为人工智能技术的飞速发展而找到了破题关键。全球健康药物研发中心首席科学官张儒民将药物研发形容为“纳米战争的艺术”，他表示，AI 技术正朝着“一药多靶”和“全新药物组合”两大方向探索。未来的药物将朝着缩短疗程的目标迈进，“最好是打一针就见效，而不是需要天天吃药。”张儒民说。 中国防痨协会副理事长兼秘书长高磊提到，去年世界卫生组织已推荐将AI影像诊断用于活动性结核病的筛查和分诊场景。推想医疗研发的低能耗移动 X 光盒子，将 AI 应用于肺结核影像诊断，已进入数十个低资源、高需求国家，成为中国技术“走出去”的典型案例。 疫苗研发方面，我国自主研发的抗结核 mRNA 疫苗取得重要进展，该疫苗研发者、北京胸科医院细菌免疫室主任逄宇介绍，该疫苗今年将开展更大规模临床研究，有望为全球结核病防控贡献中国方案。 以创新与行动终结结核流行 与会专家指出，要实现 2035 年终结结核病流行的目标，需凝聚多方力量，从工具优化、研发创新、推广落地等多方面发力，构建速度、质量与覆盖面三位一体的防治体系，让科研创新及早惠及目标人群。 陈仲丹强调，从“控制结核病”到“终结结核病”，核心是实现“三个提速”：研发速度更快，让新工具、新药物早日问世；转化落地速度更快，缩短从实验室到临床再到注册上市的周期；推广覆盖速度更快，让先进技术抵达基层、普遍惠及重点人群。 “目前我们有更好的耐多药的短程治疗方案，但是推广速度比较慢。”陈仲丹认为，结核病防治需要新的工具，优化使用当前工具，但除了研发以外，还需要创新，筹资方式、管理方式、服务提供方式都需要创新，AI、数字金融、精准医学可以发挥很大的作用。 陈仲丹同时指出，不必等待“完美工具”，优化现有工具的策略性使用同样能取得显著效果，印度一个高负担聚集性试点地区通过 8 年的潜伏感染筛查和预防性治疗，在无新疫苗、新药物的情况下实现结核病发病率83%的降幅，就是最好的例证，“关键是让现有工具发挥最大效用”。 “自主创新是科技落地的关键。”清华大学全球发展和健康传播研究中心高级顾问桓世彤认为，只有坚持自主创新，才能让药物、诊断技术、疫苗等防控产品实现价格可及、落地可行，中国不仅要加强本土自主创新，更要推动创新成果走向世界，为全球结核病防控贡献中国智慧。 专家指出，结核病防控是一场持久战，需要医疗、疾控、科研、产业等多方形成联合战线，既要传承防控工作者的坚守与精神，更要以科研创新为核心动力，打通科技创新的“最后一公里”。同时，要加强公众健康素养提升，消除社会歧视，动员全社会共同参与，通过科研创新与社会共治双重发力。来源：中国科普网 作者：项铮