槐耳通过上调miR-26b-5p基因抑制人肺癌细胞
增殖并诱导凋亡
吴唐维1,2 陈卫群1,3,4 刘水逸4 卢宏达4,5 王卉1 孔德勇1 黄晓东3,4 孔庆志3,4,5 宁勇2 卢忠心1,3,4
1.武汉市中心医院 检验科(中国湖北武汉)
2.湖北中医药大学 检验学院(中国湖北武汉)
3.武汉市中心医院 中心实验室(中国湖北武汉)
4.武汉肿瘤研究所(中国湖北武汉)
5.武汉市中心医院 肿瘤科(中国湖北武汉)
摘要 各种研究表明槐耳具有抗肿瘤作用。但这些机制尚未完全阐明。在这里，我们发现在经槐耳处理的肺腺癌A549细胞中有66个差异表达的miRNA，其中miR-26b-5p基因上调。用miR-26b-5p mimic转染A549细胞可抑制增殖并诱导凋亡，而用miR-26b-5 p抑制剂转染槐耳处理的A549细胞则可逆转槐耳的作用。EZH2被证实为miR-26b-5p基因的靶点。因此，我们的研究结果表明，槐耳可能通过miR-26b-5p-EZH2介导的方式抑制肺癌细胞增殖并诱导凋亡，这为理解槐耳的抗肿瘤作用提供了新的视角。
关键词 miR-26b-5p基因；槐耳；肺癌；EZH2；增殖；凋亡
一、介绍
肺癌是美国第二常见的癌症，也是导致男性和女性癌症相关死亡的主要原因[1]。现在，开发更安全、天然、无毒的化合物作为化疗/化学预防药越来越重要。在这方面，中药（TCM）作为副作用较少的合理抗癌药物在最近受到了关注[2,3]。
槐栓菌（Trametes robiniophila murris，以下称槐耳）是一种在中国发现的真菌，在中药中应用了大约1600年[4]。但最近几年才进行了必要的临床研究。蛋白多糖是槐耳清膏的主要有效成分，其含41.53%的多糖、12.93%的氨基酸和8.72%的水分[5,6]。最近，越来越多的证据表明槐耳具有抗肿瘤活性，如刺激乳腺癌细胞凋亡[7,8]，抑制血管生成[9]。然而，肺癌中槐耳活性的潜在机制仍不清楚。
小RNA（miRNA）是在转录后水平调节基因表达的小的且非编码内源性RNA。许多研究表明，异常表达的miRNA可能作为癌基因或肿瘤抑制因子参与人类癌症的发生和侵袭[10,11]。由于miRNA在人类癌症中起着至关重要的作用，我们假设miRNA可能参与介导槐耳的抗肿瘤作用。
在本研究中，为了研究miRNA参与槐耳的效果，我们通过miRNA微阵列分析检测了经或未经槐耳处理的A549细胞中miRNA表达谱的差异，然后探讨了特异性miRNA在槐耳抗肿瘤效果中的潜在作用。我们的数据为了解槐耳抗肿瘤作用的机制提供了重要的视角。
二、材料和方法
1.细胞和细胞培养
人类胚胎肾（HEK）293T和非小细胞肺癌（NSCLC）细胞株，包括A549、H1299、H1975、Hcc827和H460，购自美国模式培养物保藏所（ATCC）。肺癌95-D细胞来自中国科学院细胞库。A549、95-D、H1299、Hcc827和H1975细胞在RPMI-1640（Hyclone，美国犹他州）培养基中培养。HEK293T和H460保存在杜氏改良伊格尔培养基中（DMEM，Gibco，美国加州）。所有培养基均加有10%的胎牛血清（Hyclone）、100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素（Thermo，美国加州）。所有细胞均在37°C下、含5%CO2的湿化气体的培养箱中培养。
2.槐耳的制备
将槐耳清膏（盖天力药业，江苏）溶于磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，得到100mg/mL的储备溶液。使用前，用0.22μm的过滤器对溶液进行灭菌并储存在-20℃下。
3.细胞增殖实验
使用羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记法（Invitrogen，美国加州）分析细胞增殖。CFSE储备溶液为5mmol。在37℃下，将A549细胞悬浮在含有5μmol的CFSE（5×106个细胞/mL）的PBS中15分钟，以稳定CFSE标记物。然后将标记的A549细胞以1×105个细胞/孔的密度接种到12孔培养板中。24小时后，用槐耳处理的A549细胞或用miRNA mimic、抑制剂或EZH2 shRNA转染。在FACSAriaⅡ流式细胞仪（Becton-Dickinson，美国加州）上通过流式细胞术测量CFSE荧光。使用专用软件分析细胞增殖指数（PI）。细胞增殖指数为各代细胞总数除以计算得到的原始亲本细胞数。
4.细胞凋亡检测
在用不同浓度槐耳处理不同时间或用miRNA mimic或槐耳和抑制剂转染48小时后，获得A549细胞。用碘化丙啶和膜联蛋白V-FITC双染色法测定细胞凋亡（凯基生物科技有限公司，中国南京）。如上所述进行流式细胞术分析。实验进行三次。
5.miRNA微阵列分析
将A549细胞用4mg/mL的槐耳处理48小时，实验重复进行三次。使用mirVana PARIS试剂盒（Ambion，美国德克萨斯州）提取并纯化总RNA。在miRNA微阵列分析之前，我们汇总了三次产生的RNA。miRNA微阵列在上海伯豪生物技术公司（中国上海）进行。使用GeneSpringGX 11.0软件（安捷伦科技，美国圣克拉拉）进行数据分析。
6.miRNA的RNA提取和实时PCR分析
使用TRIzol（Invitrogen，美国加州）从所有肺癌细胞株提取总RNA。来自肺泡上皮细胞的总RNA购自原生原代生物医药科技（中国武汉）。使用TaqMan miRNA逆转录试剂盒、TaqMan miRNA分析试剂盒和TaqMan Universal PCR Master Mix（Applied BioSystems，美国加州）试剂进行定量化实时逆转录（qRT）-PCR。U6作为内参。值以2−ΔΔCt[2−(处理组Ct{miRNA}-处理组Ct{U6})-(对照组Ct{miRNA}-对照组Ct{U6})]显示。
7.miRNA mimic和抑制剂的瞬时转染
miR-26b-5p mimic、抑制剂和对照品购自Ambion。根据制造商的说明，用Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）试剂进行转染。miR-26b-5p mimic在100nmol的最终浓度下使用，而miRNA抑制剂在200nmol的最终浓度下使用。转染48小时后，分析细胞凋亡，并进行westernblot分析。
8.miRNA靶点预测
miR-26b-5p的靶基因由miRBase（版本19）[12]预测，其中包括MiRDB、TargetScan、PicTar、MiRanda和其他计算预测方法。首先筛选与增殖和凋亡相关的预测靶点。
9.质粒构建和荧光素酶报告分析
通过PCR，从人类A549细胞的基因组中扩增出含有假定miR-26b-5p基因识别元素的全长度EZH2 3′-UTR（正向：5′-TATCTAGACATCTGCTACCTCCTCCC-3′，反向：5'-ATGCGGCCGCGATTCAACAAGGACAA-3′）。EZH2突变3′-UTR也被扩增（正向：5′-TATCTAGACATCTGCTACCTCCTCCC-3′，反向：5′-CTGCTACCCC-3′）。将突变的3′AT野生型和突变的PCR产物克隆到pRL-TK载体的XbaI和NotI位点间报告基因下游区域（Promega，美国威斯康星州）。通过测序证实了两个架构。
将HEK293T细胞接种于96孔板中，用Lipofectamine LTX和Plus Reagent（Invitrogen）试剂，加了10ng的pGL3 control 载体(Promega，，美国威斯康星州)和10pmol的miR-26b-5p mimic或20pmol的抑制剂的100ng报告基因或相应的突变体转染HEK293T细胞。通过Dual-Glo荧光素酶报告分析系统（Promega）测量荧光素酶活性。所有检测均重复三次。
10.EZH2基因的敲除
两个针对人EZH2的shRNA和shRNA阴性对照序列如下：shRNA#1、GAGGTTCAGACGAGCTGAT；shRNA#2，AGACTGGAATGCAGTTGC[13]；shRNA对照，GGATTTCAGTCGATGTAC（OriGene，美国马里兰州）是一个针对萤火虫荧光素酶的序列，与BLAST分析确定的人类mRNA的特定区域不匹配。将shRNA架构分别克隆到RNAi-ready-pSIREN-RetroQ载体（Clontech，美国加州）中，并通过测序确定。然后用Lipofectamine LTX和Plus试剂（Invitrogen）将重组质粒转染到A549细胞中。检测EZH2 mRNA水平的引物如下：正向：5′-TTGTTGGGAAGCGTAATC-3′；反向：5′-TTGTTGGGAAGCCAAGC-3′[14]。转染后24小时和48小时检测EZH2 mRNA和蛋白水平，流式细胞仪分析细胞增殖和凋亡率。
11.Westernblot分析
将细胞溶解在RIPA缓冲液中并储存在-80℃下。细胞裂解物通过10%十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移到聚偏氟乙烯膜上。在含有吐温20（TBST）、5%的脱脂乳粉的Tris缓冲盐水中，用EZH2抗体（1:1000，Cell Signaling Technology，美国马萨诸塞州，）、β-连环蛋白（1:1000，美国加州圣克鲁兹）、bcl-2（1:000，美国加州圣克鲁兹）和β-肌动蛋白（1∶5000，Sigma，美国）抗体在中检测细胞膜。使用羊抗小鼠二级抗体（1:10000，Sigma）。使用ECL化学发光试剂盒（Thermo，美国）检测标记条带.
12.统计分析
用t检验进行统计分析。P＜0.05被认为差异具有统计学意义。实验重复进行三次。
三、结果
1.槐耳抑制A549细胞增殖并诱导其凋亡
据报道，槐耳对许多癌症具有抗肿瘤作用[9,14-16]。我们一致观察到槐耳的处理（2-8mg/mL，持续24-72小时）抑制了A549细胞的增殖（图1A）并诱导A549细胞凋亡（图1B和C）。根据这些结果，我们选择用4mg/mL的槐耳处理48小时作为进一步实验的最佳处理浓度/时间。
图1 槐耳抑制A549细胞增殖并诱导凋亡。（A）在指定时间用指定浓度的槐耳处理A549细胞并通过CFSE分析评估细胞增殖。增殖指数（PI）值以期望值±标准差表示。（B和C）槐耳以浓度和时间依赖性方式诱导A549细胞凋亡。流式细胞仪分析细胞凋亡。显示了与对照细胞相比的凋亡细胞百分比（n=3，期望值±标准差）。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
2.槐耳上调A549细胞中miR-26b-5p基因的表达
接下来，我们研究了槐耳对A549细胞中miRNA表达谱的影响。如miRNA微阵列分析所示，槐耳的处理引起miRNA表达的明显变化（图2A）。在1886个人miRNA中，66个在槐耳的处理后表现出超过2倍的表达变化，33个上调的miRNA（包括miR-150、miR-192、miR-296、miR-26b等），以及33个下调的miRNA（包括miR-503、miR-575、miR-188、miR-494等）。结合来自微型核醣核酸晶片（microRNA）结果和文献检索的数据，我们分析了差异表达miRNA的功能，并确定miR-26b是一种已知在各种癌症中显著下调的miRNA[17,18]，在癌症中抑制增殖并诱导凋亡[19,20]。因此，我们选择miR-26b-5p基因进行Taqman MicroRNA分析验证。实时RT-PCR显示的槐耳处理的A549细胞中miR-26b-5p基因表达水平的上调与miRNA阵列分析的结果一致（图2B）。重要的是，我们发现六种非小细胞肺癌细胞株中的miR-26b-5p基因的表达比正常上皮细胞低得多（图2C）。总之，这些结果提供了强有力的证据，证明槐耳处理后非小细胞肺癌细胞中miR-26b-5p基因的低表达发生了改变。
图2 miR-26b-5p基因在槐耳处理后升高，在肺癌细胞中下调。（A）用槐耳（4 mg/mL）或PBS处理A549细胞48小时。在差异倍数＞2时，非监督分层聚类基于槐耳处理与未处理的A549细胞中miRNA表达谱。（B）通过qRT-PCR证实了miR-26b-5p在暴露于槐耳（4mg/mL）48小时的A549细胞中的相对表达。数据显示为相对2-ΔΔCt值。（C）通过qRT-PCR分析正常肺泡上皮细胞和六种肺癌细胞株中miR-26b-5p基因的相对表达水平。数据来自三次实验的平期望值。比例尺为标准差。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
3.miR-26b-5p基因抑制A549细胞的增殖和诱导凋亡，而miR-261b-5p基因的抑制逆转了槐耳的作用
鉴于miR-26b-5p基因在槐耳处理的A549细胞中上调，我们将含4mg/mL槐耳的miR-26b-5p mimic瞬时转染到A549细胞或miR-26b-5p抑制剂，以研究miR-26b-5p基因的作用。与对照组相比，miR-26b-5p mimic转染后的增殖指数（PI）显著降低（PI=14.26±0.38）（对照组：PI=18.54±1.68；图3A和C）。与用槐耳和抑制剂对照组相比，用4mg/mL槐耳和miR-26b-5p抑制剂处理的A549细胞的PI增加（PI=15.33±1.63）（对照组：PI=7.67±1.53；图3B和D）。此外，流式细胞术分析表明，与阴性对照相比，转染miR-26b-5p mimic的A549细胞的凋亡率增加了2.5倍以上（图3E）。此外，与用槐耳和抑制剂对照处理的组相比，用4mg/mL槐耳和miR-26b-5p抑制剂处理的细胞显示出凋亡率下降50%（图3F）。这些结果强烈提示miR-26b-5p基因在槐耳的抗肿瘤作用中起着关键作用。
图3 miR-26b-5p基因对A549细胞增殖和凋亡的影响。（A、C和E）用miR-26b-5p mimic或对照物（100nmol）瞬时转染A549细胞48小时。通过CFSE测定细胞增殖。流式细胞仪检测细胞凋亡。结果是三个独立实验的期望值±标准差。（B、D和F）用4mg/mL的槐耳加200nmol的miR-26b-5p基因抑制剂（槐耳+抑制剂）或槐耳和抑制剂对照（槐耳+对照）处理A549细胞48小时。如上所述进行细胞增殖和凋亡测定。途中显示了描绘细胞增殖和凋亡的代表性直方图。**P＜0.01，***P＜0.001。
4.EZH2是miR-26b-5p基因的直接靶点
为了进一步阐明miR-26b-5p基因参与槐耳抗肿瘤作用的机制，我们接下来尝试鉴定miR-261b-5p基因的功能靶点。在miRBase预测的靶基因中，EZH2在多种癌症中上调[21-23]，并参与癌细胞的增殖和凋亡[24,25]，成为我们的研究兴趣点。
我们首先通过qRT-PCR测定了非小细胞肺癌细胞株中EZH2 mRNA表达的变化。有趣的是，我们发现miR-26b-5p基因与EZH2呈负相关；EZH2的表达在非小细胞肺癌细胞株中上调（图4A），而miR-26b-5p基因中下调（图2C）。此外，荧光素酶报告分析表明，在用miR-26b-5p mimic转染后，含有野生型EZH2-3′-UTR（而不是种子区缺失突变体）的报告子的萤光素酶活性降低（图4B和C）。相反，当pRL-TK-EZH2-3′-UTR与miR-26b-5p抑制剂共转染时，荧光素酶活性明显高于miR-261b-5p基因阴性对照；在突变组中未观察到这种效应（图4D）。因此，我们的数据支持EZH2是miR-26b-5p基因的直接靶点。
图2 EZH2用作验证miR-26b-5p基因靶点。（A）通过qRT-PCR检测六种非小细胞肺癌细胞株和一种正常肺泡上皮细胞株中EZH2 mRNA的表达。β-肌动蛋白用作内参。每个样品分析进行3次一式三份。*P＜0.05。（B）显示了EZH2的3′-UTR中预测的miR-26b-5p基因结合位点。还发现了突变EZH2 3′-UTR。（C和D）将HEK-293T细胞与携带wt或突变3′-UTR序列的pRL-TK和miR-26b-5p mimic（10pmol）或miR-261b-5p抑制剂（20pmol）共转染48小时。荧光素酶报告分析进行三次，结果基本相同。**P＜0.01。
5.A549细胞中EZH2基因敲除及槐耳和miR-26b-5p基因对EZH2s、β-连环蛋白和bcl-2蛋白表达的影响
接下来，我们使用shRNA在A549细胞中敲除EZH2（图5A和B），并研究这种干预对增殖和凋亡的影响。与shRNA对照相比，敲除EZH2导致PI降低（图5C）和凋亡增加（图5D）。与未处理的细胞相比，在用4mg/mL的槐耳处理或用miR-26b-5p mimic转染48小时后，A549和H1299细胞中的EZH2、β-连环蛋白和bcl-2蛋白水平均降低（图5E和F），而对miR-261b-5p基因的抑制减弱了槐耳上调A549和H299细胞中上述蛋白水平的作用（图5F）。总之，槐耳的处理和miR-26b-5p基因过度表达在很大程度上归因于EZH2及其相关蛋白的表达减少。这些数据进一步证实，EZH2去调节可能在肺癌细胞中槐耳-miR-26b-5p通路的抗肿瘤作用中发挥重要作用。
图5 A549细胞中EZH2敲除以及槐耳和miR-26b-5p基因对EZH2、β-连环蛋白和bcl-2蛋白表达的影响。（A）在用EZH2 shRNA或阴性对照转染后24小时，通过qRT-PCR分析EZH2 mRNA。期望值来自所有情况下的三次重复实验，误差比例尺以标准差表示。**P＜0.01。（B）诱导EZH2 shRNA表达48小时后，用westernblot法检测EZH2蛋白水平。（C和D）在空载体和shRNA转染的A549细胞中，在48小时后通过CFSE检测评估增殖指数和凋亡率。以期望值±标准差表示。**P＜0.01。（E）在A549和H1299细胞中，用4mg/mL的槐耳处理48小时后，对EZH2、β-连环蛋白和bcl-2进行westernblot分析。（F）在用miR-26b-5p mimic、mimic对照、4mg/mL的槐耳加miR-261b-5p抑制剂（槐耳+抑制剂）或槐耳与抑制剂对照（槐耳r+对照）转染48小时后，对A549和H1299细胞中的EZH2、β-连环蛋白和bcl-2进行westernblot分析。β-肌动蛋白用作内参。
四、讨论
miRNA微阵列分析和Taqman MicroRNA分析的结果显示，槐耳处理后肺癌细胞中通常较低的miR-26b-5p基因水平增加。将miR-26b-5p mimic转染到A549细胞中显著降低了A549细胞的增殖并增加凋亡。重要的是，抑制miR-26b-5p基因逆转了槐耳抗肿瘤作用，促进细胞增殖和抑制凋亡。这些数据表明，槐耳的抗肿瘤机制可能部分由miR-26b-5p基因上调所介导。
然后通过荧光素酶报告分析将EZH2确定为miR-26b-5p基因的靶点。EZH2是多梳抑制复合物2组蛋白H3赖氨酸27甲基转移酶，在多种类型癌症中过度表达[26]。蔡克敏等人报道，Let-7a通过针对鼻咽癌细胞中的EZH2来抑制增殖并诱导凋亡[27]。据报道，在肾癌[28]、胶质母细胞瘤[29]和前列腺癌[30]中，EZH2也被miR-101抑制。通过荧光素酶报告分析，我们的数据证实EZH2是miR-26b-5p基因的靶点，敲除shRNA介导的EZH2与槐耳的处理和miR-261b-5p基因过度表达具有相同的效果。在经过槐耳处理和miR-26b-5p基因过度表达后，EZH2蛋白水平下调，而抑制miR-261b-5p基因则减弱了槐耳上调EZH2水平的作用。这些结果表明EZH2可能是槐耳-miR-26b-5p抗肿瘤作用的通路。
为了进一步研究EZH2在槐耳处理的肺癌细胞中的作用机制，我们检测了几种EZH2相关蛋白。在正常细胞功能期间，通过典型Wnt信号通路中的APC/axin/GSK-3β破坏复合物，细胞质β-连环蛋白维持在低水平[31]。但EZH2可以使Wnt通路拮抗剂沉寂，导致Wnt/β-连环蛋白信号的激活，并最终上调β-连环蛋白[32,33]。此外，β-连环蛋白的突变可以激活β-连环蛋白/Tcf信号，增加c-Myc，提高E2F1表达，并增强结肠肿瘤中的Bcl-2表达[34]。因此，过度表达的EZH2可能通过激活β-连环蛋白上调Bcl-2。我们的数据表明，槐耳处理、miR-26b-5p基因过度表达或抑制影响β-连环蛋白和Bcl-2，进一步将这两种蛋白与EZH2联系了起来。综上所述，我们的数据表明EZH2、β-连环蛋白和Bcl-2可能在槐耳处理后有助于随后的细胞增殖和凋亡。显然，需进一步研究EZH2/β-连环蛋白/Bcl-2通路。
总之，miR-26b-5p基因介导的对EZH2、β-连环蛋白和bcl-2的抑制可能是一个关键的调节机制，通过该机制，槐耳介导了肺癌细胞增殖减少和凋亡的增加。我们的研究首次揭示了肺癌细胞中的槐耳/miR-26b-5p/EZH2通路，为了解槐耳的抗肿瘤作用提供了新机制，并进一步为临床治疗提供了新的基础。
利益冲突声明
作者没有相互竞争的利益。
作者的贡献
吴唐维、陈卫群和刘水逸进行分子生物学分析，参与研究设计和临床样本收集，并起草文稿。卢宏达、王卉、孔德勇、黄晓东和孔庆志进行临床标本收集，参与数据分析并进行统计分析。宁勇和卢忠心构思并设计了这项研究，参与数据分析和协调，并帮助起草文稿。所有作者都阅读并批准了最终版本。
致谢
本研究得到了国家高技术研究与发展计划（863计划）（批号2011AA02A111）、湖北省自然科学基金（批号2012FFB05905）和武汉市卫生局“黄鹤英才”计划研究基金（批号WX11A03）的资助。资金来源未涉及研究设计/概念、数据收集/分析/解释及文稿撰写/提交。
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