Streptomycin Sulfate

摘要：在有利的人造环境中培养细胞已成为细胞和分子生物学中的一种多功能工具。培养的原代细胞和连续细胞系在基础、生物医学和转化研究的调查中不可或缺。然而，尽管它们扮演着重要的角色，但细胞系经常被其他细胞、细菌、真菌、酵母、病毒或化学物质污染或误认。此外，处理和操作细胞与特定的生物学和化学危害相关，需要特殊的防护措施，如生物安全柜、封闭容器和其他专门的防护设备，以最小化暴露于有害物质的风险，并保证无菌工作条件。这篇综述简要介绍了细胞培养实验室中最常见的问题以及一些预防或解决相关问题的指导方针。 1.引言 细胞培养实验在生物医学研究、再生医学和生物技术生产中被广泛使用。由于动物保护法律对实验室动物使用的限制，以及威廉·拉塞尔和雷克斯·伯奇提出的3R原则（替代、减少和细化）的严格执行，以改善动物福利，可以预期在未来几年中，细胞系的普遍使用将进一步增加，以替代基于动物的研究。然而，值得注意的是，如果操作不当，细胞培养实验容易出错。因此，至关重要的是，细胞培养研究应采用良好的细胞培养实践（GCCP）来确保体外实验的可重复性。 特别是，种间和种内交叉污染和细胞误认、遗传漂变、细菌、真菌、酵母、病毒或化学物质的污染，以及缺乏质量控制测试，是普遍存在的致命细胞培养问题，这些问题使得文献充斥着虚假和不可重复的结果。粗略估计表明，使用问题细胞系发表的论文数量约为16.1%。此外，国际细胞系鉴定委员会（ICLAC）在其2021年6月发布的最新登记册中列出了576种被误认或交叉污染的细胞系。 尽管很难估计有多少误导性文章实际上受到影响，但仍迫切需要更好地提高科学家对这个问题的敏感性。此外，当使用细胞系时，生物安全和伦理方面并不在公众意识中，甚至被忽视。例如，一些连续生长的细胞系是通过使用猴病毒40（SV40）大T抗原（SV40T）或其他具有致癌潜力的因子转化建立的，通过引入端粒酶逆转录酶（TERT）活性来实现永生化，来自基因修饰动物，或通过CRISPR/Cas9基因编辑等新技术。因此，许多细胞系需要被归类为需要充分安全关注的转基因细胞系（GMCLs）。 在过去的几十年中，科学家们制定了许多关于良好细胞和组织培养实践（GCCP）的指导方针，这些指导方针不断更新，提供了在进行细胞培养时应考虑的主要原则的指导。GCCP指导方针强调了质量管理问题、培养系统背景、文件记录和报告、一般安全指示、教育和培训信息，以及与细胞培养实验相关的伦理问题。此外，这些专家文件试图促进实验室实践的协调、合理化和标准化，包括制造和测试，以促进研究人员的工作符合法律、法规和伦理原则。此外，这些指导方针提供了关于建立和配备细胞培养实验室环境的基本、有益和有用的附加设备的信息，重点是国家和国际公认的标准。这些指导方针相当复杂和全面，因此它们将主要对有多年细胞培养实验经验的受过训练的研究人员感兴趣。 在本文中，将在更简化的层面上讨论使用细胞系的一些一般方面。特别是，总结了细胞系鉴定的测试、潜在的细胞培养污染物，以及生物医学研究中使用细胞系的伦理问题和生物安全指南的简要信息。因此，所提供的信息对于即将开始进行细胞培养实验的人来说应该是有用的。 2.细胞培养类型的分类  细胞系大致可以分为三组，即（i）有限细胞系，（ii）连续细胞系，也称为永生化或无限细胞系，以及（iii）干细胞系。有限细胞系通常来源于原代培养，生长缓慢。因此，它们可以在体外培养有限数量的细胞代数，然后最终经历衰老和衰老，这一过程表现为失去典型的细胞形状和细胞质脂质的富集。重要的是，有限细胞系是接触抑制的，在形成单层后在G0、G1或G2阶段停止。 相比之下，连续生长的细胞系通常来自转化或癌细胞，并且快速分裂，在体外培养中达到比有限细胞系更高的细胞密度。在某些情况下，这些细胞系表现出非整倍性（即，一个或多个染色体的数量多于或少于其他染色体）或异倍性（即，染色体数量不是单倍体数量的简单倍数）。它们通常可以在降低的血清浓度下生长，不接触抑制，并且可能形成多层。干细胞是一种未分化或部分分化的多能细胞类型，起源于多细胞生物。这些细胞可以扩展为相同类型的无限多的细胞，或者在适当的条件下被触发产生具有特殊功能的细胞。因此，它们可以作为许多不同细胞类型的多能前体。 在所有情况下，来自不同来源的细胞的生长需要一个人工但受控的环境，在这种环境中，有时需要高度专业化的培养基、补充剂和生长因子以确保适当的细胞生长。一种细胞类型可以生长附着（附着在表面），需要一个分离剂进行传代，或者可以自由悬浮。附着细胞可以进一步分为具有长形状的成纤维细胞样细胞和具有多边形形状的上皮样细胞。同样，每种细胞培养在形态、活性、倍增时间和遗传稳定性方面都有独特的属性，它们的处理和维护可能需要不同的培养基、培养条件和添加剂或处理剂，包括抗生素、分离溶液或细胞附着的表面涂层。非附着或悬浮细胞要么作为单个细胞生长，要么作为自由悬浮的团块在液体培养基中生长，这些细胞在传代过程中不需要酶促或机械分离。然而，在某些情况下，这些细胞需要摇晃或搅拌以进行适当的气体交换和适当的生长。非附着细胞的典型例子是来自血液、脾脏或骨髓的造血细胞系，它们在不附着在基质上的情况下增殖。尽管如此，一些附着细胞系也可以适应悬浮生长，这允许在特殊应用中以更大的规模和更高的产量进行更易于管理的细胞培养。此外，与附着细胞相比，悬浮培养的细胞通常更容易处理。例如，当需要通过分析流式细胞术或荧光激活细胞分选（FACS）分析附着细胞时，细胞必须首先从其基质上分离。然而，酶促消化或使用非酶细胞解离缓冲液可能导致表面蛋白的降解，这可能阻止它们在相应的协议中的后续识别和细胞分离。这使得使用流式细胞术对附着细胞进行表型和特征分析极为困难。例如，胰蛋白酶通常用于分离附着细胞。它依赖时间地降解大多数细胞表面蛋白，通过在不跟随脯氨酸的赖氨酸或精氨酸残基后切割肽键。这导致细胞解离过程中大多数表面蛋白的降解。类似地，其他酶如特异性胶原蛋白酶、丝氨酸蛋白酶弹性蛋白酶切割C末端中性、非芳香族氨基酸残基的肽键、肽酶Dispase水解非极性氨基酸残基的N末端肽键，以及许多其他分离剂引发蛋白质的显著降解。 因此，已经引入了几种较温和的酶混合物，如Accutase和Accumax，或非酶细胞解离试剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）和氨三乙酸（NTA）混合螯合二价金属阳离子，用于常规细胞传代和敏感细胞的操作。这些配方毒性较小，保留了大多数表位，以便后续流式细胞术分析。 最近，细胞在三维微环境中的培养已成为研究人员关注的焦点。这些3D细胞培养要么是通过在定义的支架内培养细胞产生的，如来自细胞外基质蛋白或琼脂糖或聚合物材料的水凝胶，要么是作为自组装系统，在这些系统中细胞以团簇或球状体生长。人们普遍认为，这些体外细胞模型提供了在封闭系统中研究细胞反应的可能性，这种系统比依赖于二维的细胞培养技术更接近生理情况。因此，这些模型对于那些研究细胞间相互作用、肿瘤形成、药物发现、干细胞研究和代谢相互作用的人来说特别有趣。与2D系统相比，3D模型有潜力彻底改变药物效力测试、疾病建模、干细胞研究和组织工程研究的方式。最后，这些系统将大幅减少某些研究领域对实验动物的使用，这是3R原则的一个关键方面。 3.培养基  适当的细胞培养基对维持和促进细胞培养的生长以及确保实验结果的可重复性至关重要。一些细胞还需要非必需氨基酸（丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸）以有效生长并减轻细胞的代谢负担。用于保存和维持广泛哺乳动物细胞类型的最常见标准培养基，例如，Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）和Roswell Park纪念研究所（RPMI）培养基。通常，这些培养基包含碳水化合物、氨基酸、维生素、盐和pH缓冲系统（表1）。常见的培养基如DMEM可提供现成的液体形式，或者以粉末形式出售，以便于储存和延长保质期。此外，许多培养基可以提供不同葡萄糖浓度（低或高葡萄糖）以及有无L-谷氨酰胺或稳定的谷氨酰胺的配方。最后，它们可以带或不带pH指示剂如酚红出售。重要的是，基础培养基通常不含蛋白质、脂质、激素或生长因子。因此，这些培养基需要添加胎牛血清（FBS），通常称为小牛血清（FCS），通常浓度为5-20%（体积/体积）。FBS是从健康的产前牛的胎儿血液中获得的。最终的血清通过离心凝固的血液去除细胞、纤维蛋白和凝血因子。值得注意的是，不同来源的FBS在生长因子和激素谱、病毒含量、内毒素负荷、渗透压、总蛋白和金属含量、糖类以及最终处理（例如，过滤、检测潜在污染）方面可能有所不同。因此，大多数科学家更喜欢购买可追溯的FBS批次，以获得可靠的批次间一致性，以在实验期间获得可重复的结果。此外，新生儿小牛血清（NBCS）来自20天以内的小牛，小牛血清（CBS）来自3至12个月大的小牛，以及从12个月以上的成年牛中分离的成年牛血清（ABS）经常用于补充细胞培养基。一些研究人员常规地在56℃下加热灭活血清15-30分钟，以灭活补体并破坏潜在的细菌污染物。然而，在大多数情况下，这不是必要的，应该省略，因为热灭活也会降低生长因子的浓度或生物活性，而这些生长因子是细胞正常生长所必需的。 然而，值得注意的是，含血清的培养基有许多缺点。血清是复杂的，具有不确定的成分，导致批次间变化，增加了污染的风险，并且使用血清通常与避免胎儿和动物痛苦的伦理问题有关。因此，血清免费培养基（SFM）的开发已成为过去几十年的研究热点。原则上，SFM可分为五种类型，即（i）普通SFM，（ii）含有人类来源但无动物成分的异种免费培养基，（iii）无动物培养基，（iv）无蛋白质培养基，以及（v）化学定义培养基。所有这些培养基都含有关键成分（例如，能源、维生素、氨基酸、脂质、微量元素和无机盐离子），并经常添加特殊补充剂，如抗剪切保护剂、核酸和其他需要改善某些细胞类型或应用的培养性能的成分。不幸的是，某些SFM的公司和供应商经常提供不完整或根本没有关于其培养基成分的信息。因此，研究人员十年前就开始建立一个在线无血清数据库，用于交流有关SFM的信息和经验。 通过向细胞培养基中添加抗生素和抗真菌剂，可以更好地预防由细菌、酵母、真菌和支原体引起的生物污染。它们中的大多数通过抑制细胞壁合成（例如，青霉素）、干扰膜通透性（例如，两性霉素B）或通过阻止细菌起始复合体在mRNA和细菌核糖体之间的组装来抑制蛋白质合成（例如，链霉素）。然而，常规使用抗生素可能会发展缓慢生长的持久/耐药细菌污染物，这可能导致细胞分化和行为的微妙变化。 此外，青霉素、链霉素和庆大霉素等抗生素可以显著改变基因表达和调控，可能会修改聚焦于药物反应、细胞调控和分化研究的结果。例如，最近的一项简洁回顾强调了众多出版物显示的抗生素和抗真菌剂如青霉素/链霉素、庆大霉素和两性霉素B对体外细胞特性（包括增殖、分化、存活和遗传稳定性）的影响。同样，一项全面的文献搜索发现了由不同抗生素引起的许多报告的副作用，再次支持在可能的情况下推荐使用无抗生素培养基，以确保细胞培养发现的可靠性和可重复性。因此，研究人员应避免在细胞培养中永久使用抗生素，并应更好地尝试实施严格的无菌工作条件，以防止细胞培养中的细菌污染。4.酚红 酚红，也称为苯磺酞，是细胞培养中最常用的pH指示剂。这种水溶性染料在低pH值时呈黄色两性离子，而在更碱性的条件下则变为红色阴离子或紫红色双阴离子（图1）。因此，这种染料被用作许多组织培养基中的惰性pH指示剂，用于检测pH变化、死亡细胞的废物产物，或通常会导致培养基酸化的污染物的过度生长。然而，由于其结构与某些非甾体雌激素相似，它具有与雌激素受体结合的能力，亲和力为雌二醇的0.001%，从而刺激雌激素受体阳性细胞的增殖。因此，在与雌激素反应性细胞系统工作时，建议在实验过程中避免使用酚红。 图1. 通过酚红监测细胞培养中的pH变化。酚红（Phenolsulfonphthalein）是一种三苯甲烷染料，用于细胞培养中监测pH变化。随着pH值的升高，其颜色逐渐从黄色过渡到红色和紫红色。 5.细胞污染  生物和化学因素都可能导致细胞培养中的污染（表2）。在大多数情况下，细胞生长缓慢、形态变化、培养基pH值快速变化以及培养中死亡或漂浮细胞数量增加是污染的后果。因此，应常规筛查细胞培养中可能的污染物，以防止结果不一致和其他严重后果。下表讨论了最重要的污染物。 5.1.支原体污染 支原体是细菌类摩洛哥菌纲中最小的自复制生物。它们由脂蛋白质膜、核糖体和一个由大小从580到2200 kb的环状双链DNA分子组成的基因组组成（图2A）。支原体的生物合成能力有限，需要进入适当的宿主，在其中繁殖并长时间存活。它们的微小尺寸（约0.1-0.2微米）使得在标准明场显微镜下无法识别，这也是它们在许多实验室中经常未被检测到的原因。它们缺乏细胞壁，对许多在细胞培养中使用的常见抗生素（如青霉素或链霉素）具有抗性。最重要的是，支原体污染不会产生其他细菌或真菌污染所特有的浑浊度。 图 2. 在细胞培养上清中检测支原体。(A) 支原体是最小的自复制细菌，没有细胞壁。它们由脂蛋白质膜、核糖体和一个由圆形双链DNA分子组成的基因组组成。(B) 一个被支原体污染的大鼠细胞系单层用DAPI染色，并在荧光显微镜下用适当的紫外线滤光片包(340/380 nm 激发)在400倍放大下进行分析。请注意那些非常小的明亮的细胞外核点，这是支原体的典型特征（由箭头标记）。比例尺代表50μm。(C) 在描述的分析中，2μL正常对照培养基（Medium(-)）和2μL从支原体感染的细胞系中取出的培养基（Medium(+)）使用Venor®GeM OneStep试剂盒（#11-8050, Minerva biolabs GmbH, Berlin, Germany）根据制造商的说明进行支原体感染测试。作为阳性对照，试剂盒系统内包含的2μL阳性对照也被共同扩增。每个样本中的内部控制在PCR反应中产生191 bp大小的扩增子，证明了PCR反应的功能，而265-278 bp大小的扩增子表明有支原体污染。PCR产物在含有乙二胺四乙酸的2%标准琼脂糖凝胶上分离，并通过标准凝胶成像仪可视化扩增子。 系统性研究已经确定了支原体进入细胞培养的典型方式。这些方式包括从其他研究实验室或商业供应商那里获得的受感染培养物、培养基、血清或试剂的交叉污染。此外，使用非无菌用品、实验室人员作为支原体携带者的感染、孵化器或生物安全柜中支原体的扩散、液氮罐中细胞培养的污染、通过空气传播的颗粒和气溶胶、过度使用抗生素以及培养皿密封不当也是有利于支原体污染的来源。 尽管支原体与宿主细胞竞争生物合成前体和营养物质，但受影响的细胞培养中观察到的生长速率变化通常很小，这就是为什么相应的污染不容易被检测到的原因。然而，支原体可以广泛影响宿主的DNA、RNA和蛋白质代谢，影响细胞内氨基酸和可用ATP水平，改变细胞表面抗原，并可能引起DNA断裂和其他重大染色体变化。因此，定期检测和快速识别这些污染物对于防止研究结果失真、误导性出版物和研究资金浪费至关重要。为了实现这一点，开发了许多敏感和特定的测试方法，这些方法允许检测相应的感染，通常不考虑来源或物种。在检测支原体污染的金标准中，首先将培养上清样本添加到支原体培养的液体培养基中，并在肉汤、琼脂或指示细胞上孵育几天。然而，这种方法耗时且其他更快的检测方法已经被引入。它们包括，除其他外，使用40,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）或Hoechst 33342（图2B）等荧光染料进行特异性DNA染色、酶联免疫吸附试验（ELISA）、用支原体特异性核糖体探针标记RNA、酶法程序、流式细胞术方法、比色法或基于条带的支原体检测试验、检测细菌16S rRNA的敏感PCR基础检测和复杂的傅里叶变换红外（FITR）显微光谱法。荧光染料染色相当非特异性，而大多数其他检测具有高分析灵敏度（即测试识别污染物的能力）和特异性（即测量支原体而不是密切相关的非支原体物种的能力）。特别是，依赖于常规（或终点）PCR的商业化试剂盒通常具有同时检测70-90种支原体的能力，因为这些试剂盒中包含的引物集通常设计为专门针对并扩增支原体基因组中高度保守的16S rRNA编码区域（图2C）。 支原体可以在受感染的培养物中产生几乎无限多的效果。因此，开发了广泛的消除相应污染物的代理和方法。有不同物理、化学、免疫和化疗治疗方法可用于消除支原体污染物。然而，许多这些方法不切实际，因为它们要么耗时，需要特殊设备，只捕获有限数量的支原体物种，或者总体效率低。最初，引入了几种抑制支原体生长的抗生素，但它们大多数效果一般，对真核细胞有害，或者由于对相应药物产生抗性而效果有限。尽管如此，现在有几种更具选择性和有效的抗支原体药物可用，这些药物通常允许在一轮治疗中就消除支原体感染（表3）。在大多数情况下，这些去除剂含有大环内酯类、四环素类、喹诺酮类或这些药物的组合。 常见的化合物Baytril®、Ciprobay®和Zagam®中包含的不同喹诺酮具有相似的化学结构（图3）。它们通过阻断细菌核酸合成来发挥抑制活性，通过破坏细菌拓扑异构酶II，抑制拓扑异构酶IV和DNA旋转酶的催化活性，并导致细菌染色体断裂。BM-Cyclin中包含的大环内酯类Tiamulin通过靶向细菌核糖体的50S亚基来抑制蛋白质合成，并进一步是肽酰转移酶的强抑制剂。它对支原体的活性通过四环素显著增强。其他现成的去除剂包含抗生素和抗菌作用肽的组合或属于不同抗生素家族的三种不同杀菌成分的组合。 图 3. 用于去除或预防支原体污染的选定化合物。(A) 贝尼尔（CAS号：93106-60-6），(B) 环丙沙星（CAS号：85721-33-1），(C) 扎加姆（CAS号：110871-86-8），以及 (D) 含有盐酸米诺环素（CAS号：13614-98-7）和富马酸替米考星（CAS号：55297-96-6）的BM-Cyclin是强大的抗支原体剂，用于消除或预防支原体污染。有关所描绘化合物的生物活性，请参考表3。 不同的杀菌成分在消除支原体感染方面具有高效性。通常，这些物质在施用两到三周后对所有常见的支原体菌株都有效。例如，图4展示了通过电子显微镜评估的大鼠细胞系中支原体的完全根除。 图 4. 通过电子显微镜评估大鼠细胞培养中支原体污染的清除情况。一个受污染的细胞培养物用Plasmocin处理了2周。展示的是处理前（A-C）和处理后（D）细胞的代表性电子显微镜图像，这些图像显示了广谱抗支原体试剂成功地从培养物中清除了支原体。图像的原始放大倍数为4646倍至27800倍。请注意（A）中支原体膜与宿主细胞质膜的特征性融合。 然而，使用这些产品治疗或预防支原体感染可能会引起显著的细胞毒性和遗传毒性效应。例如，米诺环素被证明能诱导Bcl-2的表达，Bcl-2在线粒体中积累，并与包括Bax、Bak和Bid在内的促死亡分子相互作用，从而保护细胞免于死亡。同样，替米考星通过阻断催化嘌呤5'单核苷酸转化为核苷的5'-核苷酸酶（CD73）的活性，抑制了人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和小鼠乳腺癌细胞系4T1的生长和转移。因此，用于去除支原体感染的化合物的应用是实验研究结果的一部分。 5.2.病毒污染 与支原体感染相比，细胞培养中的病毒污染物构成了更严重的威胁，因为检测它们的困难和缺乏治疗受影响细胞培养的方法。此外，一些病毒有能力将其基因组整合到宿主细胞中，这在某些情况下会导致新病毒颗粒的永久性产生。这对操作员来说是一个潜在的健康风险，并且可能是水平病毒传播到其他细胞系的源头。因此，这对受感染细胞系的生物安全分类有直接影响。不幸的是，用于系统评估病毒污染物的通用测试相当复杂且无针对性。没有对病毒真实性的确切了解，这些检测方法仅限于电子显微镜和逆转录病毒逆转录酶的测定。特别是，当怀疑有传染性病毒因子时，电子显微镜的多功能性是一种有效、通用且无偏见的手段。这种技术适用于获取高分辨率图像，从而提供细胞感染状态和病毒形状的即时概览。观察到的形态和大小进一步允许对病毒类型进行即时初步分类。例如，成熟的逆转录病毒通常是球形包膜颗粒，平均直径在100到200纳米之间，显示出与六个逆转录病毒属不同的独特形态。特别是，透射电子显微镜（TEM）适用于在不需要事先对传染性因子进行假设的情况下直接观察生物样本中的病毒。例如，广泛用于肝病研究的连续生长的小鼠肝星状细胞系GRX的逆转录病毒负荷首次通过TEM得到证实。经过这么多年，这个细胞系仍然能够大量产生逆转录病毒颗粒（图5）。 图 5. 小鼠细胞系GRX中的逆转录病毒污染。(A) 逆转录病毒的一般结构。逆转录病毒是直径约100纳米的包膜颗粒。由env基因编码的包膜由糖蛋白组成，这些糖蛋白在出芽过程中从宿主细胞的质膜中获得脂质的包裹。逆转录病毒基因组进一步由两个长度为7-9 kb的相同单链RNA分子组成。病毒衣壳的主要组成部分是群特异性抗原（gag），而逆转录酶（pol）对合成病毒DNA是必需的。(B) 通过电子显微镜分析评估的小鼠肝星状细胞系GRX中未指定逆转录病毒的发生。逆转录病毒颗粒可以在培养基和细胞质中找到。(C,D) 逆转录病毒的高倍图像显示了典型的球形结构。(E) 这幅电子显微镜图像显示了一个出芽过程，其中一个逆转录病毒颗粒通过扩散穿过宿主的质膜获得其包膜。放大倍数分别为10,000倍（B），100,000倍（C），27,800倍（D）和21,560倍（E）。 5.3.化学污染 任何在细胞培养中引起不良影响的非活性化合物都需要引起密切关注。即使是必需的营养物质，在浓度足够高时也可能产生毒性。杂质可能通过培养基、血清和水引入细胞培养。然而，塑料管道、细胞培养皿和储存瓶中的增塑剂，以及荧光或紫外线照射下在培养基中形成的自由基，或玻璃器皿和移液管上的沉积物，都可能导致污染。此外，CO2气流中的杂质以及用于消毒孵化器或生物安全柜的杀菌剂或杀虫剂残留物可能至关重要。最关键的是内毒素，它们来源于大多数革兰氏阴性细菌的外细胞膜。这些由相当稳定的脂多糖（LPS）组成，它们从细菌中脱落，并在细菌溶解过程中大量释放。因此，从玻璃器皿中去除热原需要在高温下进行广泛的加热，而这些物质对高压灭菌相当有抵抗力。因此，大多数市售的现成细胞培养基和补充剂都是以这种方式准备的，它们不含或含有非常低水平的内毒素。此外，可靠的细胞培养基和补充剂生产商会提供分析证书，表明相应溶液或化合物中的内毒素水平。 一些培养条件（例如，低血清浓度、高光照暴露）会促使形成高活性的自由基，可能导致DNA损伤、蛋白质交联、脂质过氧化物和诱导细胞凋亡。因此，通常向细胞培养基中添加具有自由基清除活性的抗氧化剂，如抗坏血酸、N-乙酰-L-半胱氨酸或维生素（维生素E、维生素A、维生素C），以防止氧化应激及其后果。或者，可以将微量元素硒作为抗氧化剂酶的辅因子，如谷胱甘肽过氧化物酶，添加到培养基中以消灭活性过氧化物。 此外，铅、镉和汞等重金属的高浓度对许多细胞类型是有毒的。因此，重要的是在准备培养基或补充剂之前，要对用于水和溶剂进行重金属测试。或者，如果实验室水不适合细胞培养，应使用提供分析证书的商业供应商的纯水。 5.4.种内和种间交叉污染 同一物种（种内污染）或另一物种（种间污染）的无关细胞污染细胞系是一个常见且反复出现的问题。特别是，当污染物是一种快速分裂的细胞系时，它会过度生长并取代原始培养物。如果污染未被检测到，这可能导致不可靠和不可复制的结果，从而歪曲生物医学文献。细胞系交叉污染的问题已经众所周知数十年，始于1960年代围绕HeLa细胞的争议。2010年发表的第一份综合分析引用了68个参考文献，列出了360个交叉污染的细胞系。随后，在2021年，旨在引起研究人员对这一问题关注的国际细胞系认证委员会（ICLAC）列出了来自不同物种的576个因交叉污染或其他方式而误认的细胞系（表4）。交叉污染的来源多种多样，包括通过气溶胶或未堵塞的移液管的不想要的传播，不同细胞系之间共享培养基和试剂，以及不注意使用条件培养基。 如今，有不同方法可用于确定细胞系交叉污染。种间交叉污染可以通过同工酶分析检测，该分析利用电泳结合模式检查物种间在一组细胞内酶的个别同工型结构和迁移性方面的微小差异。人类细胞的种内交叉污染可以通过人类淋巴细胞抗原（HLA）位点分型识别，这是一组位于第6染色体上的基因，编码参与免疫系统调节的高度多态性的细胞表面蛋白。此外，分子血清学方法、使用合成探针或引物的遗传测试以及基于直接DNA测序的序列分型可以区分不同的HLA基因型。 5.5.细胞误识别 类似于细胞交叉污染，细胞系的误识别导致数千篇误导性和错误的论文。在常规操作过程中由于注意力不集中、操作员工作量大或实验工作分心而引起的难以辨认的标签和细胞培养容器的误标记是误识别的最直接原因。可以理解的是，与更快速分裂的污染物细胞的污染可以迅速在几次传代中过度生长原始培养物，并在后续步骤中引起细胞系误识别。当使用同一移液管或同时进行多次培养的重新饲养操作和操作，作为不同细胞类型有意共同培养的结果，或在与饲养细胞工作时缺乏意识时，可能会导致这种过度生长。 6.短串联重复序列分析  如今，识别交叉污染和细胞误识别的最常用方法是短串联重复序列（STR）分析。该方法可以比较不同样本在DNA中特定位点的等位基因重复次数。尽管这些重复的相应等位基因变异相当多态性，但等位基因的数量非常小。因此，为了使不同的STR配置文件对识别或区分目的具有高区分统计能力，通常在多重PCR检测中同时分析多个STR位点。 在STR分析中，从模板DNA获得的扩增的可变微卫星区域在遗传分析仪上分离，然后使用软件进行分析，该软件计算每个变体位点的重复次数。如今，为许多物种建立了有效和标准化的STR小组。在这方面，建立包含19个鼠STR标记的多重PCR检测的鼠细胞系认证联盟是开创性的。这种多重PCR为不同的小鼠细胞系，包括密切相关的细胞系，提供了独特的STR配置文件。图6展示了广泛使用的永生化小鼠细胞系AML12获得的四个STR标记的代表性色谱图。 图 6. 小鼠细胞系的典型短串联重复（STR）标记色谱图。使用CellCheckTM Mouse系统（IDEXX, Kornwestheim, Germany）对小鼠AML12细胞的基因组DNA进行STR分析，该系统扩增分布在17条染色体上的19个物种特异性STR标记。在这张图中，展示了来自第17、18、19号染色体和X染色体的四个代表性STR配置文件。有关该细胞系的完整STR配置文件，请参考表5。 重要的是，当比较三种不同的小鼠细胞系之间的19个鼠STR标记时，每个细胞系都有独特的组合，允许明确区分每个细胞系（表5）。 如今，已有数据库可供存取用于小鼠、猫、狗、牛、马、人类等STR测试设置的引物信息。此外，Cellosaurus资源提供了大量信息，并提供了诸如STR相似性搜索工具（使用STR进行细胞系认证，CLASTR）等程序，用于比较STR配置文件。 7.细胞系变化和过度传代  通常，实验室中培养的永生化细胞系会经过许多代。然而，高传代次数或长时间培养的细胞系可能会出现染色体复制或重排、突变和表观遗传变化。这种现象通常被称为遗传漂变。因此，细胞的形态、增殖率、代谢能力或总体健康状况可能会发生显著变化，影响实验结果。因此，在进行实验时，记录细胞系传代次数（反映细胞被亚培养到新容器的次数）是一个重要考虑因素。 也有报道指出，传代次数的增加可能会增加病毒污染的风险。此外，过度传代的细胞会选择生长速度更快的细胞，这些细胞在某些情况下表现出降低的分泌率、介导转运和细胞旁通透性，而细胞通透性则增加。因此，当传代次数相差数百代时，不同实验室进行的类似或相同研究可能会得出完全不同的实验结果。尽管没有关于最佳传代范围的具体指南，但通常的做法是在使用20至30代后不再使用细胞。不幸的是，尤其是当细胞来自细胞库以外的来源时，通常无法准确知道传代次数，因为细胞库通常会提供细胞传代次数的数据。 在某些情况下，研究人员认为即使传代次数也不准确，因为不同实验室在传代过程中可能使用不同的初始细胞种植密度或分裂率，这会影响细胞在培养中的分裂次数。因此，引入了一个用于计算精确的人口倍增水平（PDL）的公式，该公式与细胞代时间同义，特别用于原代细胞。在相应的公式中，PDL是自体外初次分离以来细胞群中细胞翻倍的总次数，计算如下：PDL = 3.32 (log Xe − log Xb) + S，其中Xb是孵化时间开始时种植的细胞数，Xe是孵化时间结束时的细胞数，S是分裂前的起始PDL。 8.使用细胞工作的生物安全方面 细胞培养可能对人类健康和环境造成伤害，需要被指定到一个考虑多种因素的生物安全级别。在使用细胞系之前，必须准确了解这些风险，考虑到其内在属性、（遗传）操作类型，以及由于污染病原体而可能显著增加的相应细胞系的生物危害。尽管这些估计必须逐个案例进行，但有一些一般指南需要遵循。首先，被研究细胞与人类的遗传关系越近，对人类的风险就越高，因为污染病原体通常具有特定的物种屏障。然而，应该注意，因为一些污染生物体有潜力跨越通常的物种屏障。其次，细胞系的肿瘤诱导潜力强烈依赖于其来源。例如，上皮细胞和成纤维细胞的肿瘤诱导潜力较低，而造血细胞则显著更高。第三，已经在许多实验室中使用多年的、得到良好表征的细胞系，比未表征的持续生长细胞系或原代细胞的风险总体较低。在识别和评估潜在风险后，通过遏制、限制人员和设备进出细胞培养实验室、按照标准操作程序（SOPs）工作、避免在工作期间形成气溶胶或飞溅、定期进行细胞培养培训、以及实施和遵循良好实验室规范（GLP）的一般指南来定义避免或最小化这些风险的方法是至关重要的。此外，建议在与原代人类细胞培养工作时接种乙型肝炎病毒疫苗。然而，不同国家之间的生物安全和生物安全全球规范和国际标准往往差异很大，开始工作前应注意。 9.来自患者的细胞系、类器官、异种移植模型和条件重编程 如前所述，已建立的细胞系在长期传代后可能会发生遗传漂变或表型变化。因此，它们可能不再忠实地代表它们最初来源的细胞类型所特有的所有分子特征。因此，科学家们已经开发了允许从健康供体或患有特定疾病的受试者的组织或血液中建立原代细胞的技术。对人类而言，这些来自患者的细胞系具有高度的临床转化相关性。 然而，自发永生化通常是一个罕见的事件，过去通常通过用病毒癌蛋白转化部分解除细胞周期调控或通过过表达TERT替换在细胞复制过程中丢失的短DNA片段（这些片段参与控制细胞衰老）来建立相应细胞。同样，CRISPR-Cas9介导的靶向癌基因，可以用于体外永生化细胞，已被确定为建立永生化细胞系的有效工具。 然而，应批判性地指出，这些操作可能会产生转录和细胞周期效应，此外，相应代理通过抑制DNA损伤信号通路导致突变的积累。最近，条件重编程（CR）已成为建立原代细胞长期培养的强大工具。CR技术最初于2012年建立，允许许多组织的正常和肿瘤上皮细胞无限期地在体外增殖。在这项技术中，可以通过与辐照成纤维细胞饲养层细胞和Rho激酶抑制剂Y-27632共同培养，使细胞条件性重编程。这项技术现在被广泛用于建立来自正常和病变细胞的患者源性细胞培养。在这个过程中，上皮细胞被重编程以获得成人干细胞特性，通过将细胞从标准培养基转移到CR培养基，逆转它们的分化状态，并允许大量产生用于患者衍生模型的细胞。因此，CR在精准医疗、再生医疗、药物测试、基因表达分析、异种移植研究以及确定从正常细胞表型向肿瘤细胞表型转变过程中发生的遗传、表观遗传和代谢变化方面提供了激动人心的可能性。重要的是，现在有复杂的协议进一步允许使用CR快速高效地扩展非上皮细胞，包括来自神经、神经内分泌、内分泌和间充质起源的细胞，这些细胞可以在条件下长期生长。 在个性化医疗中，类器官——通常源自多能性胎儿或成人干细胞的自组织3D组织——已引起了极大的兴趣。它们是器官的微型化和简化版本，形成于包含一组生长因子的选择性3D培养基中。特别是，来自患者的类器官(PDOs)已在癌症研究中被广泛引入。它们重现了原发肿瘤的基本特征，包括组织学的复杂性和遗传特征，因此理想地用于预测对抗癌药物的敏感性或肿瘤进展的方面。 同样，来自患者的异种移植(PDX)模型是动态实体，在其中可以实验性地监测癌症的演变。PDXs是通过在合适的动物宿主中植入并培养患者的肿瘤细胞而建立的癌症模型。在大多数情况下，接受者是植入了人类免疫系统的免疫缺陷小鼠。这些模型已成为研究人类免疫与癌细胞之间分子相互作用的有用实验工具。特别是，这些模型在基础研究中变得非常吸引人，以了解癌症进展和转移的方面。此外，PDXs经常用于临床前癌症研究，以识别新的预测性癌症生物标志物，测试癌症药物的效力，调查肿瘤内异质性和克隆动态，评估个性化治疗选择，并测试一般的转化假设。 所有这些更紧密地模拟细胞微环境的先进细胞培养技术如今已成为基础和临床研究的一个组成部分。然而，使用这些来自患者的模型(PDMs)需要广泛的专业知识、培训和质量控制。为了促进相应模型的发展，已建立了几个国际财团，旨在生成具有相关基因组和临床数据的新型人类肿瘤衍生的培养模型。国家癌症研究所(NCI)和人类癌症模型倡议(HCMI)已启动代表性倡议。 10.清洁和消毒  生物安全取决于实验室的清洁度。一般指南是严格遵循所有可能的安全规则。忽视或未能遵守任何安全规定可能导致与实验室相关的感染和环境污染。因此，需要通过对在实验室操作中使用的生物制剂进行消毒来降低生物风险。 在适当的废物管理中，应尽可能适当验证灭活方法。原则上，消毒有四个主要类别，即(i)通过热量进行消毒，(ii)用液体消毒，(iii)通过蒸汽和气体消毒，以及(iv)暴露于紫外线辐射。 高压蒸汽灭菌是消毒实验室材料和灭活或消毒生物制剂的最有效和可靠方法。这是一种使用高压水蒸汽进行消毒的方法，是培养基、玻璃器皿和移液管尖端消毒的首选方法。然而，必须保持足够的高温和压力一段时间，这也保证了孢子的灭活。通常，在121°C下高压蒸汽灭菌60-90分钟足以实现废物温度至少115°C持续20分钟。此外，只有受过培训的个人才能操作和维护高压蒸汽灭菌器，并且应定期通过生物指示剂检查高压蒸汽灭菌的成功。重要的是，接受高压蒸汽灭菌的废物或材料应放置在容器或密封的高压蒸汽灭菌袋中，以允许良好的热量穿透[98]。不应将危险化学品或放射性废物进行高压蒸汽灭菌。在防穿刺容器中收集受污染的解剖刀片、皮下注射针头、刀具和碎玻璃，并盖上盖子。在卫生水处理前，应先对大量液体废物和受污染的培养基进行消毒。 化学消毒通常是表面和家具消毒的首选方法。为了获得消毒剂的最佳效果，必须考虑几个因素。首先，消毒剂应对要去除的生物制剂具有特异性。第二，消毒剂应适合应用领域，因为当应用于表面或液体时可能会有显著的活动差异。最后，消毒剂在一般应用条件（例如，所需的接触时间、工作浓度）以及在其他影响因素（例如，酸、有机负荷）存在时的有效性可能会有所不同。 在封闭系统中应用的类似蒸汽和气体可以提供出色的消毒效果。一些实验室使用过氧化氢、二氧化氯、戊二醛、对甲醛、环氧乙烷和过氧乙酸的气溶胶来消毒生物安全柜或孵化器。然而，所有这些化学品都是危险的，使用这些物质进行消毒应只有经验丰富的受过培训的人员进行。 最后，暴露于紫外线(UV)辐射可以有效地破坏大多数微生物。特别是，UV-C光（光谱范围：100-280纳米），被大气吸收，对广泛范围的微生物具有最大的破坏力。因此，这个UV区域通常用于生物安全柜中，以减少表面污染。然而，暴露于UV可能导致操作员的眼睛和皮肤灼伤，因此应谨慎使用。因此，对于细胞培养初学者来说，在开始使用UV-C辐射设备进行清洁和消毒之前，建议接受专家的理论和实践培训。 11.结论  细胞培养在生物医学研究中扮演着重要角色。然而，细胞误识别、种内和种间交叉污染以及细菌感染、真菌、酵母或病毒的污染可能导致致命后果和科学文献的污染。因此，在每个使用细胞培养的实验室中，应强制进行定期污染检测和细胞鉴定测试。通过多种具有杀菌或杀菌作用的组分，可以有效地去除细菌、霉菌和酵母的生物污染。ICLAC错误识别细胞系的登记册和相关的Cellosaurus知识资源是极其重要的知识资源，并提供了诸如CLASTR等有用的搜索工具，用于比较STR配置文件。此外，实施良好的细胞培养实践和无菌技术对于提高细胞培养安全性、促进可复制的科学数据的产生以及促进不同实验室建立的结果的可比性至关重要。此外，适当的员工培训和标准化文档记录和报告细胞培养程序是进一步提高细胞培养实验室工作质量和安全的有效手段。最近，在生成更具生理相关性的PDMs，如PDOs和PDXs方面的进展已经彻底改变了常见的细胞培养方法，并帮助更好地理解人类生物学和病理生理学。在这方面，CR是一种有吸引力的技术，可以用于快速高效地建立来自患者的细胞培养，用于基础和临床研究，并进一步显著替代基于动物的研究。然而，应该记住，设计得最好、工程最精良的细胞培养实验室也只和其中最不胜任的工作者一样好。 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 时间：2024年10月16-17日 地点：上海张江（酒店定向通知） 规模：600-800人 主办单位：生物制品圈、抗体圈 演讲支持：Entegris、瑞孚迪、AS ONE CORPORATION 会议费用：免费FREE!（仅收取100元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），先到先得，报完即止！ 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！ 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 日程安排 更多嘉宾正在邀请中 第一届精彩回顾 第二届精彩回顾 第三届精彩回顾 第四届精彩回顾 第五届精彩回顾 第六届精彩回顾 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：来自成人干细胞（ASCs）和多能干细胞（PSCs）的类器官是研究癌症和开发治疗方法的重要临床前模型。在这里，我们回顾了来自原始组织的和PSC衍生的癌症类器官模型，并详细说明了它们如何在不同的器官环境中有潜力为个性化医疗方法提供信息，并有助于理解早期癌变步骤、癌症基因组和生物学。我们还比较了基于ASC和基于PSC的癌症类器官系统之间的差异，讨论了它们的局限性，并强调了最近对类器官培养方法的改进，这些改进使它们成为人类肿瘤的更好代表。 1.引言 全球癌症负担每年导致近1000万人死亡，并且预计这一数字还会增加。遗憾的是，有效的癌症治疗数量未能跟上这一趋势。其中的一个原因是缺乏能够准确模拟人类肿瘤、它们多样化的形态、分子特征和微环境的体外临床前模型。数十年来，由于相对容易使用、可扩展性和低成本，2D细胞培养已成为研究癌细胞生物学和药物发现的基石。它们使我们能够在分子机制上取得开创性的工作，这些机制是肿瘤发生的，帮助确定生物标志物和药物靶点以指导患者的治疗。然而，它们的功能有限，只代表一小部分癌症——其中只有少数来自早期或癌前阶段。2D培养通常不需要与原代细胞培养相同的生存利基因子，这意味着它们已经由于基因组中的异常和畸变以及表观遗传学上的修饰而失去了对利基的内在依赖。此外，2D癌细胞系，由于长期在体外传代，会发生快速的基因漂移，导致药物反应的显著差异。此外，匹配的正常细胞系并不总是存在，使得对癌症早期阶段的研究大多依赖于基因工程小鼠。在某些情况下，基因工程小鼠和患者衍生的异种移植（PDX）模型弥补了2D细胞系的不足，但高昂的成本、技术难度和缺乏可扩展性仍然是它们的限制。 最近，3D类器官培养的出现为癌症研究提供了一种替代方法，可以弥合体外2D细胞系和体内小鼠模型之间的差距。类器官可以从两种类型的干细胞中建立：成人干细胞（ASCs）来自成人组织，具有组织特异性，或者多能干细胞（PSCs）可以是诱导多能干细胞（iPSCs）或胚胎干细胞。在这篇综述中，我们特别关注这些类器官模型在癌症研究中的使用，描述并比较代表肿瘤形成不同阶段的各种基于类器官的癌症模型，并讨论它们对癌症研究的贡献以及它们的局限性。 2.类器官类型 ASC和PSC类器官的衍生协议基本上不同。ASC类器官由培养基中的生长因子混合物支持，这些生长因子模仿正常干细胞稳态期间存在的因素。PSC类器官建立涉及通过逐步添加生长因子的方式进行分化，这种方式模仿胚胎发育期间的细胞信号。产生的癌症模型也具有不同的优缺点（表1），在选择适当的研究模型时应考虑这些因素。尽管如此，ASC和PSC类器官是互补的方法，它们共同提供了研究几乎所有人类癌症整个肿瘤进展过程的机会（图1）。 图 1. 用于癌症模型的类器官 由成人干细胞（ASC）和多能干细胞（PSC）衍生的各种类型的癌症类器官模型及其应用。CTC，循环肿瘤细胞；CAF，与癌症相关的成纤维细胞。 3.ASC衍生的类器官和生物银行 2009年，一项开创性研究表明，可以从小鼠Lgr5+肠道ASCs中建立3D肠道类器官。细胞在Matrigel中生长，并在长期培养中维持，补充干细胞利基调节因子（noggin、R-spondin1和表皮生长因子[EGF]）。从本质上讲，这个系统旨在模拟肠道干细胞（ISCs）通常所在的利基的各个方面。在体内，肠道上皮组织被组织成数百万的隐窝绒毛结构，其中ISCs位于隐窝的基部。Wnt信号和R-spondin1作为Wnt激动剂，在支持隐窝增殖方面的重要性已经得到了很好的确立。此外，EGF通过激活Ras信号通路增强隐窝增殖。noggin抑制绒毛中的骨形态发生蛋白（BMP）信号，导致形成许多异位隐窝单元。引人注目的是，为了在培养中复制这一点，只需要添加R-spondin1、EGF和noggin就可以成功形成类器官。后续研究表明，位于Lgr5+干细胞之间的Paneth细胞提供了Wnt来源。Matrigel提供了形成3D类器官的基质成分，因为它类似于富含层粘连蛋白的肠道隐窝基部。这些类器官展示了肠道隐窝绒毛结构，包含所有肠道细胞类型，重现了来源组织的生理肠道结构。 同时，另一组开发了一种替代方法来培养肠道类器官：空气-液体界面（ALI）模型，涉及在部分空气暴露的胶原蛋白基质中培养包含上皮细胞和间充质细胞的小鼠肠道组织片段。自这两项突破性研究以来，已经成功地适应了从一系列正常组织及其相应的癌症中培养人类ASC衍生的类器官。对协议的改进提高了类器官形成的效率，使得从小活检、尿液、宫颈涂片甚至循环肿瘤细胞（CTCs）中建立肿瘤类器官成为可能。结果，成为可能建立大型的人类肿瘤类器官活体生物银行（图2A，在表2中详细总结）。近年来，类器官生物银行的数量激增，作为基础研究和临床设置中宝贵的资源。类器官模型也已通过各种途径商业化，如人类癌症模型倡议、美国典型培养物收集或MilliporeSigma。这些生物银行涵盖了广泛的肿瘤模型，重现了患者肿瘤的形态和分子异质性。相比之下，许多分子亚型没有代表性2D癌细胞系。 图 2. 现有的人类癌症和癌前类器官模型 (A 和 B) 文献中描述的(A) 癌症和(B) 癌前ASC衍生类器官的类型。ALC，酒精性肝硬化；NASH，非酒精性脂肪性肝炎；PSC，原发性硬化性胆管炎；PanIN，胰腺上皮内瘤变；UC，溃疡性结肠炎；TSA，传统锯齿状腺瘤；SSA，静止性锯齿状腺瘤；HP，增生性息肉。 此外，已建立了来自这些器官的癌前病变，如肠道增生性息肉、静止性锯齿状腺瘤（SSAs）/息肉、管状绒毛腺瘤、常规管状腺瘤癌前子宫内膜异位症、子宫内膜增生17 宫颈鳞状上皮化生胃肠上皮化生胃萎缩 Barrett上皮胰腺上皮内瘤变（PanIN）和一系列癌前肝病（图2B）。从携带杂合性胚系癌症易感性基因突变的个体中还生成了额外的ASC类器官（图2B；表3）。通过基于多组学的分析比较肿瘤衍生类器官和原始肿瘤组织，证实类器官在长期培养中稳定保持了亲本肿瘤的分子谱。 4.衍生ASC类器官的挑战 建立癌症类器官的当前协议已在其他地方详细总结。每个协议都是根据对器官/癌症类型的深入生物学知识以及广泛的试错研究来提高效率而开发的。图3总结了正常和肿瘤类器官培养的条件。每种癌症类型都进行了特定的修改，以帮助避免正常细胞污染，同时增强癌症干细胞的活力（在表2中总结）。尽管如此，原始混合中的正常类器官可以胜过肿瘤类器官，最终在培养中占主导地位，特别是当培养条件不能特别有利于肿瘤细胞时。前列腺胃肺结肠和胰腺癌症类器官的研究都报告了这一有问题的现象。因此，通过全外显子组测序（WES）或目标捕获面板测序验证肿瘤纯度至关重要，因为癌症类器官的形态常常与正常类器官无法区分。减轻正常细胞污染和提高协议效率的策略包括撤回一些癌症中不再需要的利基因子，因为普遍存在的致癌突变。例如，撤回Wnt3a和R-spondin1大大改善了结直肠癌（CRC）类器官的形成，而撤回EGF在创建胰腺导管腺癌（PDAC）类器官时有效，因为>80%的CRCs和>90% PDACs分别携带APC和KRAS突变。在胃癌（GC）中，添加nutlin3a，同时从培养基中去除Y-27632、A8301、EGF和FGF10也提高了成功率，样品获取方式的调整也可以产生影响。例如，沿着胃肠道的浆膜侧取样增加了肿瘤纯度，并在传代过程中手动挑选肿瘤类器官可以帮助消除正常细胞污染。提高肿瘤类器官活力的其他方法包括在培养横纹瘤类器官时添加Y-27632以及在培养子宫内膜癌类器官时去除p38抑制剂。使用无血清、Afamin稳定的Wnt3a可以稳定培养PDAC类器官，因为标准Wnt3a条件培养基中的血清会触发胰腺类器官的细胞衰老。 图3. 热图显示了各种正常和肿瘤类器官培养的条件 每一列代表之前针对特定类器官类型报告的培养条件协议。彩色框表示在类器官扩增协议中使用指定的生长因子成分。大多数类器官类型都在包含AdDMEM/F12、HEPES、GlutaMAX和青霉素/链霉素的基础培养基中培养，但也有一些例外。星号表示使用肝细胞培养基、GlutaMAX和Primocin，而^表示使用DMEM/F12培养基、神经基础培养基、GlutaMAX和低谷氨酸非必需氨基酸混合物。#Jung等人69在培养正常结肠类器官时添加了前列腺素E2，其中使用LY2157229代替A8301来抑制TGF-b信号。LGG，低级别胶质瘤；BLCA，膀胱尿路上皮癌；KIRC，肾透明细胞癌；MRTK，肾脏恶性横纹肌样瘤；HNSC，头颈鳞状细胞癌；MEC，小细胞癌；ACC，腺样囊性癌；AciCC，腺泡细胞癌；SDC，唾液腺导管癌；ESAD，食管腺癌；STAD，胃腺癌；CRC，结直肠癌；PDAC，胰腺导管腺癌；HCC，肝细胞癌；CC，胆管癌；NSCLC，非小细胞肺癌；GEP-NENs，胃肠胰神经内分泌肿瘤；BRCA，乳腺癌；CESC，宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌；UCC，子宫体子宫内膜癌；OVC，卵巢浆液性癌；PRAD，前列腺腺癌。 即使有了这些协议修改，一些常见的癌症类型仍然难以用类器官来模拟，这表明需要进一步优化协议。有趣的是，一种称为条件重编程的替代方法，涉及辐照的小鼠成纤维细胞饲养层细胞与消化后的原代健康或癌细胞在rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂（Y-27632）存在的条件下共同培养，允许几乎所有细胞类型来源的原代上皮细胞长期培养长达一百天，而无需遗传操作。这项技术已成功用于从非小细胞肺癌（NSCLCs）、前列腺癌和腺样囊性癌（ACC）细胞培养物生成患者衍生的细胞培养。条件重编程的前列腺和ACC癌细胞在异种移植的小鼠中产生了肿瘤，表明这可能是形成类器官率低的癌症类型的潜在替代方法。 5.ASC衍生的癌症类器官与2D癌细胞系的独特特征 5.1.利基因素和细胞-细胞/细胞-基质依赖性 ASC癌症类器官与2D癌细胞系之间的一个主要区别是，类器官仍然依赖于利基因素和细胞-细胞/细胞-基质相互作用来生存。因此，可以通过系统地撤回基本的利基因素、添加/撤回抑制剂或在无基质条件下培养，在肿瘤类器官上进行深入的功能表征。在此过程中，揭示了在癌变过程中发生的基因型-表型关联。 几项关于没有WNT下游基因突变的ASC衍生癌症类器官的研究，例如APC或CTNNB1，已经揭示了赋予Wnt/R-spondin独立的机制。这些研究为Wnt信号在塑造肿瘤内细胞状态形态多样性和异质性方面的贡献提供了见解。在正常胃类器官中双敲除CDH1/TP53导致与R-spondin独立相关的弥漫性GC表型。同样，撤回试验鉴定了PDAC类器官中独立于Wnt和R-spondin的亚群。还评估了撤回ROCK抑制剂和/或无Matrigel生长条件。一项关于GC类器官的研究表明，细胞-细胞/细胞-基质独立性与浸润性肿瘤边缘、晚期肿瘤分期和转移相关，并且与公共GC患者数据集中的总体和无病生存时间较短的转录组特征相关。从早期GC的深层黏膜中分离的肿瘤类器官比来自浅表黏膜的配对肿瘤类器官更不依赖于细胞-细胞粘附，表明同一患者的肿瘤的不同部分可能表现不同。 5.2.谱系多样性、细胞可塑性和细胞状态转换 类器官保留了来源组织的谱系多样性和细胞可塑性。例如，健康的前列腺和乳腺类器官包含能产生基底和腔系谱系的腔系和基底祖细胞。有趣的是，来自BRCA1突变携带者的乳腺上皮类器官显示出更高比例的腔系祖细胞，重现了在BRCA1突变携带者中作为癌症起始人群的腔系祖细胞的增加。单细胞RNA测序揭示了Wilms瘤衍生的类器官由三种不同的细胞类型（上皮、基质和胚细胞）组成，并且带有RSPO融合的APC野生型结肠癌细胞在Wnt撤回后仍保持其分化潜力，类似于健康的结肠类器官。撤回或补充外源性Wnt3a和R-spondin能够调节弥漫型GC或CDH1/TP53双敲除的正常胃类器官的组织学亚型规范和细胞可塑性，允许它们分别适应签戒细胞或非签戒细胞形态。这些观察结果与人类GC中的体内情况非常相似，签戒细胞在RSPO3低表达的区域中可见，非签戒环细胞弥漫形态与基质中RSPO3的表达相关。同样，PDACs在转录上可以分为两种细胞状态，更具侵略性的基底样状态和经典状态。通过单细胞RNA测序，一项研究确定了癌细胞在从经典状态过渡到基底样状态时可能经历的中间细胞状态。引人注目的是，使用患者活检和匹配的类器官的研究报告称，类器官在体外倾向于失去基底状态，这可以通过撤回培养基中的基本利基因素来恢复。用TGF-b处理的类器官被推向更具侵略性的基底样状态，而撤回TGF-b导致类器官恢复到经典状态。这些发现表明，生长条件或微环境可以调节细胞可塑性和细胞状态。不同的细胞状态随后导致不同的抗癌药物敏感性。这些结果与另一项谱系追踪研究一致，该研究将表达多色荧光蛋白的PDAC类器官移植到小鼠中，证明经典和基底样表型可以来自单个植入的细胞。因此，肿瘤的亚型受微环境的影响大于遗传学。 这项工作清楚地表明，类器官对于未来研究人类癌症中肿瘤可塑性和细胞状态转换的机制具有巨大的前景，这两个过程由于它们有限的异质性而无法在细胞系中研究。结合CRISPR-Cas9编辑将报告基因、谱系追踪和消融盒敲入癌症类器官，然后进行小鼠异种移植，可以进一步利用类器官技术评估肿瘤细胞亚群，包括癌症干细胞和癌症启动、转移和药物耐受性。例如，在患者衍生的CRC类器官中敲入EGFP和谱系追踪盒到LGR5位点证实了EGFP-LGR5+癌细胞干细胞以高效率启动肿瘤异种移植，并且肿瘤细胞采用类似于正常结肠上皮的层次结构。另外两项研究将CRISPR工程化的LGR5特异性消融盒的CRC类器官异种移植，观察杀死LGR5+癌细胞干细胞在肿瘤中的效果。在这两项研究中，LGR5+细胞的消除最初阻止了肿瘤生长，但当LGR5特异性消融关闭后，由分化谱系中再生Lgr5+细胞的人群推动了肿瘤的再生。异种移植的类器官携带可诱导的Lgr5-EGFP-Confetti报告基因，证明肝脏转移是由Lgr5细胞播种的，但转移性生长取决于Lgr5+细胞的重新出现。在异种移植的人类CRC类器官中进行的活体遗传谱系追踪系统鉴定了休眠的LGR5+p27+细胞，这些细胞赋予了可逆的药物耐受状态，该状态依赖于细胞基质界面上COL17A1的粘附。类似地，另一项谱系追踪研究表明，一种独特的CRC干细胞群体，潜伏的Lgr5+细胞，表达高水平的Mex3a，可以下调Wnt/干细胞基因程序以保护自己免受化疗，并成为治疗后的主要残留肿瘤群体。然而，另一项研究发现，负责CRC复发的残留肿瘤细胞特征是高EMP1表达，CRISPR工程化的EMP1+细胞消融防止了异种移植小鼠中转移的复发。 5.3.保留异质性和病毒基因组 癌症类器官保留原发性肿瘤的肿瘤内异质性和亚克隆结构是其另一个独特特征。在胃类器官队列中，几个案例显示了具有和不具有ERBB2或FGFR2的致癌性扩增的细胞亚群，模仿了体内肿瘤组织中观察到的区域异质性。引人注目的是，这种异质性在长期培养中得以维持。癌症类器官还显示出在长期培养中维持病毒基因组，使得能够研究与感染相关的癌症。从与Epstein-Barr病毒（EBV）相关的胃癌或鼻咽癌（NPCs）中建立的类器官能够保留EBV病毒基因组和病毒潜伏期，与大多数2D NPC细胞系已经失去了它们的EBV基因组形成对比。因此，与2D细胞系相比，癌症类器官更密切地重现了原发性肿瘤，为研究信号通路、肿瘤内异质性和与感染相关的肿瘤发生提供了强大的工具。 6.ASC衍生的类器官用于研究癌症发病机制 能够从多种器官中培养出健康的上皮细胞，为研究癌症逐步发展和理解环境致癌物暴露的影响提供了激动人心的机会。图4总结了使用正常结肠ASC类器官或癌前/早期肿瘤类器官来模拟早期肿瘤转化和肿瘤进展的研究报告示例。上皮器官的癌症是与老龄化人群相关的最常见的恶性肿瘤，但导致ASCs中体细胞突变积累的因素以及它们如何促进恶性转化尚不清楚。肠道隐窝提供了一个独特的模型，用于研究体细胞突变和克隆扩展。从肠道粘膜中建立的混合类器官培养通常是多克隆的，来源于许多腺体的集合，每个隐窝都有由亚克隆体细胞突变特征的，主要是乘客突变（图4A和4B）。ISCs在个别隐窝内竞争，最终走向单克隆性。因此，来自单个正常细胞的克隆类器官可以进行功能研究，对于理解癌症相关过程可能非常有价值。例如，从患有溃疡性结肠炎的患者中分离的克隆类器官显示出经常是双等位基因的截断突变，涉及IL-17-NF-kB途径，这与在溃疡性结肠炎组织中观察到的克隆扩展一致（图4D）。尽管这些突变在癌症中没有富集，但它们赋予了克隆类器官对IL-17A诱导的凋亡的抗性，提高了炎症环境中的细胞存活率。 图4. 结肠类器官的类型，从正常到癌前病变及其应用 (A) 正常结肠上皮包含不同异质性克隆的混合物。(B) 正常结肠类器官的长期培养导致克隆优势。克隆类器官可以长期培养，有或没有CRISPR工程化的肿瘤驱动基因突变，或暴露于细菌/药物。亚克隆培养，随后进行测序是一种可以用来询问基因组景观随时间或添加剂变化的方法，这一点通过在LS正常结肠上皮中确认基因组稳定性和在各种类器官模型中识别几种突变特征的原因得到了证明。(C) 在正常结肠类器官中重新创建特定组合的癌症驱动基因突变或进行全基因组CRISPR筛选，产生了各种癌前和肿瘤类器官模型，以及识别赋予Wnt激活和TGF-b抗性的目标。(D) 溃疡性结肠炎(UC)上皮展示了克隆扩展的概念，炎症微环境推动了抵抗IL-17途径的突变克隆的扩展。(E) 不同腺瘤类器官模型在研究癌症发病机制中的多种用途。正常类器官工程化了5个肿瘤驱动基因突变发展了微小转移，而CIN腺瘤但不是GS腺瘤类器官工程化了3个肿瘤驱动基因突变在异种移植小鼠模型中发展了巨大转移。UC，溃疡性结肠炎；LS，Lynch综合征；SSA，静止性锯齿状腺瘤；TSA，传统锯齿状腺瘤；CRC，结直肠癌；FAP，家族性腺瘤性息肉病；GS，基因组稳定；CIN，染色体不稳定性。 克隆健康类器官也可以在有无药物、感染因子的情况下进行长期培养，或使用CRISPR-Cas9基因编辑来识别固有的遗传不稳定性、表征突变特征，并识别致突变剂（图4B）。在培养的终点，可以进行最终的克隆步骤，以扩展单个克隆细胞进行测序。随后，从亲本克隆中筛选出突变，以揭示体外获得的突变。一项研究使用CRISPR-Cas9删除DNA修复基因，MLH1和NTHL1，然后进行亚克隆和WGS。他们发现，MLH1缺陷的类器官具有与错配修复缺陷的CRC一致的突变特征，而NTHL1缺陷的类器官具有与突变特征30相关的特征，这之前在一名携带NTHL1胚系无义突变的乳腺癌患者中被识别出来。 此外，将肠道类器官暴露于两种药物的组合，更昔洛韦（GCV）和莫昔芬（MMF），重新创建了在之前接受这两种药物治疗巨细胞病毒感染和移植物抗宿主病的CRC患者中观察到的突变特征，表明类器官中的突变特征是由GCV诱导的，并且被MMF进一步增加。相比之下，来自携带杂合性胚系突变的Lynch综合征患者的正常胃或肠道类器官没有显示出增加的突变率，表明在第二个失活突变建立之前不存在单倍体不足。 6.1.与正常和癌前类器官共培养的微生物 通过感染微生物可以在类器官中重现突变特征。经过5个月反复腔内注射基因毒性pks+大肠杆菌的肠道类器官，这种病原体已知会在培养细胞中诱导双链DNA断裂，显示出在一部分人类CRC患者中观察到的突变特征，但在其他癌症类型中没有。这一发现暗示了过去暴露于pks+ E. coli可能是那些患者的潜在致癌因素。健康的人类类器官也被其他类型的微生物感染，包括已知与癌症发展相关的细菌和病毒。例如，人类胃类器官被幽门螺杆菌感染，这种病原体会导致胃溃疡和胃癌，导致通常在体内观察到的炎症反应和上皮增殖增加。另一项研究从正常人类口腔粘膜组织中生成类器官，并将它们分别暴露于HSV和HPV感染。这两种类器官系都显示出病毒DNA的增加，即使在传代后也得以维持，暗示持久感染。此外，iPSC和ASC模型突出了人类肝脏类器官模型在体外研究乙型肝炎病毒（HBV）感染和复制方面的潜力，未来可能用于研究与HBV相关的HCC进展。这些研究为解决微生物组在肿瘤发生中的参与提供了方法，由于缺乏适当的体外和动物模型，这一点以前探索得很少。 6.2.ASC衍生的小鼠类器官模型用于研究癌症发病机制 直接从患者样本中建立肿瘤类器官仍然是一个挑战。或者，可以从基因工程小鼠模型（GEMMs）中衍生ASC类器官，并在体外快速扩展以建立生物银行。来自人类或GEMMs的正常或早期肿瘤类器官作为研究癌症早期演变途径的良好工具（图4E）。一项共培养研究表明，小鼠Apc突变类器官分泌Notum。当这些Apc突变类器官与野生型小鼠肠道类器官共培养时，Notum通过推动野生型ISCs分化并导致Apc突变ISCs的克隆固定，抑制了野生型类器官的生长（图4E）。与这些发现一致，在小鼠中诱导Apc突变之前用Notum抑制剂处理减少了腺瘤的形成。这些研究突出了遗传小鼠模型和类器官如何协同工作并被利用，从而显著加速研究发现。小鼠类器官易于基因组编辑以诱导驱动突变，并且可以植入同种型和免疫能力的小鼠中以模拟肿瘤发生和转移。例如，为了模拟CRC的发展，携带不同组合驱动突变的小鼠类器官，无论是来自GEMMs的肿瘤/转移还是通过体外基因编辑，都被移植到同种型小鼠的盲肠壁上，用于原位肿瘤形成和转移发展。这些模型证实了TGF-b信号在肿瘤微环境中的作用，促进免疫逃逸并介导癌症转移。另一项研究生成了一种人类化的微卫星稳定的CRC小鼠模型，并确定EMP1+细胞是转移复发的起源细胞。类似地，乳腺肿瘤类器官可以从GEMM肿瘤中衍生出来，在2-3周内并原位移植形成肿瘤，重现原始肿瘤的上皮形态和药物反应。也已经开发了免疫能力的基于类器官的小鼠模型用于卵巢癌和肺腺癌。它们可能代表了与GEMMs相比，模拟癌症发病机制的更强大的平台，GEMMs可能开发起来耗时且技术上具有挑战性。 7.CRISPR-Cas9编辑ASC衍生的类器官 CRISPR-Cas9被用来在健康类器官中工程化组合驱动突变，以重新创建癌症（图4C；表4）。两项开创性研究同时证明，工程化APC、TP53、KRAS或PIK3CA和SMAD4突变的组合结果是人类肠道类器官，这些类器官在所有干细胞利基因素的独立下生长，并能够在小鼠中形成具有侵袭性癌症特征的肿瘤移植物。这些四重突变类器官的原位移植到小鼠盲肠引起了宏观的肺和肝转移。在三重敲除（APC-/-，TP53-/-和KRASG12D）人类类器官中过表达Noggin，当Noggin没有过表达时，在体内具有有限的生长潜力，导致与四重突变类器官相似的肝脏转移。由于这些类器官能够独立于所有利基因素生长，这些发现提出了利基独立可能介导转移的可能性。然而，不能排除其他未知因素。例如，患者衍生的原发性CRC和配对的转移性类器官总是显示出一致的利基因素依赖性，一些患者衍生的肝转移类器官仍然高度依赖于利基因素。染色体不稳定性也可能是一个贡献因素， 如下文更详细讨论。 已经发表了几种CRC的锯齿状肿瘤途径模型。一项研究通过工程化大染色体重排来生成RSPO融合基因，以及在人类结肠类器官中的BRAFV600E和TP53突变（图4C）。将这些人类结肠类器官异种移植到小鼠结肠中产生了锯齿状病变，重现了人类的SSAs。在类器官中除了BRAFV600E、TP53敲除和RSPO融合外，过度表达GREM1，结果在小鼠中形成了息肉状肿瘤，其组织学特征类似于传统的锯齿状腺瘤。有趣的是，与正常结肠类器官相比，RNF43-/-人类SSA类器官对RSPO的依赖性较小，为RNF43突变在锯齿状肿瘤途径中的致病作用提供了功能支持。另一项研究将正常结肠类器官与BRAFV600E突变工程化后，用TGF-b处理。TGF-b在正常类器官中触发了凋亡，但在BRAFV600E突变类器官中没有，而是诱导了上皮-间充质转化（EMT）和转录特征，模仿了在人类锯齿状肿瘤病变中观察到的特征。除了由癌症驱动基因突变引起的遗传损伤外，使用类器官还可以探索肿瘤进展过程中染色体不稳定性的作用。具体来说，工程化了五种肿瘤驱动突变（APC、SMAD4、TP53、KRASG12V和PIK3CAE545K）的正常结肠类器官能够在注射到小鼠脾脏后在肝脏形成微小转移灶（图4E）。相比之下，染色体不稳定而不是染色体稳定的腺瘤类器官，工程化了三种驱动因素（SMAD4、TP53、KRASG12V或PIK3CAE545K），在肝脏中形成了大的转移肿瘤，显示出组织学恶性。随着越来越多的癌前或早期肿瘤类器官模型的可用性，这些模型捕获了不同形式的遗传或表观遗传异常，研究人员现在有了前所未有的机会进行精细的调查，以确定有助于肿瘤发生的因子。 使用CRISPR-Cas9基因编辑在各种组织的正常类器官中成功模拟其他癌症类型的示例总结在表4中。这些包括在人类胃类器官中工程化ARID1A和TP53突变以模拟胃肿瘤；在胰腺类器官中KRAS、CDKN2A、TP53和SMAD4突变以模拟PDAC38；在乳腺类器官中TP53、PTEN、RB1和NR1突变以模拟管腔肿瘤；在人类导管类器官中TP53、SMAD4、NF1、PTEN和BAP1突变以模拟胆管癌；在小鼠食管类器官中Sox2过表达和p53和p16突变以模拟食管鳞状细胞癌。 全基因组CRISPR筛选也已在正常类器官中使用，以确定肿瘤发生的目标。两项研究在人类肠道类器官中进行了CRISPR-Cas9筛选，并确定了赋予对TGF-b介导的生长抑制的抗性的基本目标，这对于CRC发展至关重要。在培养中对小鼠胃类器官进行Wnt3a撤回，进行了类似的筛选，以确定以前未被重视的赋予Wnt激活的因素。总的来说，这些在正常或早期肿瘤类器官中的研究表明，多个癌症驱动基因的基因组编辑，无论是顺序还是组合，都可以模拟体内癌症发病机制。它们为这些基因在癌症进展中的基本功能提供了宝贵的见解。此外，将全基因组CRISPR筛选应用于正常类器官的成功，为将来在肿瘤类器官中识别治疗反应或抗性的遗传脆弱性提供了概念验证。 8.PSC衍生的类器官 类器官也可以从PSCs，无论是胚胎的还是诱导的，生成。人类胚胎干细胞受到伦理规定的限制，这阻碍了它们的广泛使用。相比之下，iPSCs涉及将体细胞重新编程回到多能性。第一步是将iPSCs定向分化为三个胚层（内胚层、外胚层和中胚层）。然后，细胞在3D基质中培养，使用特定的生长和信号因子引导它们朝着所需器官的细胞系发展。这一模型的主要挑战是在体外忠实地模拟所有体内生化线索，这些线索在正确的时间、位置和浓度下推动细胞分化和3D组织形成，就像在胚胎发育过程中发生的那样。最初通过使用活化素A处理人类PSCs来建立PSC衍生的类器官，以驱动内胚层身份，随后与FGF4和Wnt3a共同孵化以促进后肠分化。这一协议最终产生了表达特定肠道标记物的肠道类器官，如CDX2和KLF5。自那时以来，PSC类器官技术已广泛用于疾病建模。到目前为止，已经成功创建了许多PSC衍生的类器官，包括用于大脑、 胃、 肺、 胰腺、食管、肾脏、肝脏、等等。所有这些模型都为干细胞生物学和器官发育提供了重要的见解。然而，使用PSC衍生的类器官进行癌症研究的一个重要警告是，它们缺乏直接从肿瘤组织中衍生的ASC类器官在培养中保留的获得性癌症基因突变。为了绕过这个问题，人们尝试将癌细胞直接重新编程为PSCs以了解肿瘤过程。然而，成功的结果相对较少，其中大部分主要涉及血液癌症，包括从急性髓性白血病、 慢性髓性白血病、和幼年型单核细胞白血病。有趣的是，尽管携带相同的遗传异常，从白血病细胞衍生的iPSCs通常缺乏白血病潜力。然而，当它们被诱导分化为造血干细胞时，它们的白血病表型重新出现。尽管如此，这种方法为存储白血病样本和研究患者特定突变与疾病表型之间的相互作用提供了机会。或者，将致癌突变工程化到PSC细胞中，然后诱导分化为特定器官以模拟来自胰腺、肺、胃、视网膜和大脑的癌症是另一种策略（表4）。这种方法在从PSCs生成大脑类器官方面特别成功，使用CRISPR-Cas9编辑用于工程化大脑类器官，这些类器官具有在脑肿瘤中观察到的最频繁的单次和组合突变。产生的肿瘤性脑类器官代表了不同的脑肿瘤类型，包括中枢神经系统原始神经外胚层肿瘤和胶质母细胞瘤。此外，分化的PSC衍生的脑类器官被用作健康大脑替代品，以研究肿瘤-胶质细胞相互作用。通过与胶质瘤干细胞或传统的肺癌细胞系共培养，可以模拟大脑环境并分析细胞迁移和细胞-细胞相互作用，模仿胶质母细胞瘤侵袭或上皮性恶性肿瘤转移到大脑。最后，从患有癌症易感性综合征的患者的体细胞中重新编程为PSCs被用来模拟来自具有胚系APC、GNAS或BRCA1突变的患者的癌症类型（表3）。 9.使用类器官研究药物反应 体外模型相对于动物模型的一个优势是它们对高通量药物敏感性筛选的适应性。具体来说，癌细胞系几十年来一直被用于在应用到体内模型之前评估药物效力。这由癌症细胞系百科全书（CCLE）和癌症药物敏感基因组学（GDSC）进行的研究证实。这些项目的目标是构建一个有用的数据库，以识别药物反应和癌症基因组之间的相关关联，并反过来指导个性化治疗。同样，癌症患者衍生的类器官可以适应大规模机器人药物筛选。使用患者衍生的CRC类器官的概念验证研究说明了西妥昔单抗和Nutlin-3a对KRAS和TP53野生型癌症类器官生长抑制的有效性。在癌症类器官中还进行了其他药物筛选测定，包括乳腺癌、 膀胱、头颈鳞状、肝脏、NPC、 卵巢、 胰腺、前列腺、和胃癌症类器官。其中一些体外药物反应进一步使用体内异种移植进行了验证。进行药物筛选的详细协议，从细胞分离到数据分析，已在其他地方总结。最近对协议的改进使得可以在正常、前体和肿瘤类器官中进行筛选；提高了可扩展性；并将读数从细胞活性测定扩展到基于图像的高含量表型分析。在HER2过表达的乳腺癌类器官中也描述了有利的基因-药物相关性，这些类器官对阿法替尼敏感，在ARID1A突变的胃类器官中对共济失调毛细血管扩张和Rad3相关激酶（ATR）抑制剂敏感，在MTAP突变的胰腺癌类器官中对PRMT5抑制剂有反应，40 在CHFR表观遗传学沉默的结肠癌类器官中对紫杉醇有反应。除了使用癌症类器官来确认已知的基因-药物关联外，类器官模型预测标准疗法的临床反应的能力也经过了严格的测试。一个转移性CRC和食管胃类器官的生物银行证明了患者和癌症类器官对标准治疗药物紫杉醇和5-氟尿嘧啶之间的一致反应。其他癌症类器官类型的研究也证明了它们在预测患者治疗反应方面的稳健性。此外，从同一个体建立的纵向PDAC类器官反映了逐渐获得对化疗治疗的抗性。除了预测药物反应外，几个先进的直肠癌症类器官模型在体外以及在通过内窥镜注射到小鼠直肠后显示出预测对化疗放疗的反应的潜力。值得注意的是，这些研究大多数只涉及少数患者，需要进行更大规模的相关研究和更长时间的患者随访，以验证这些患者衍生的类器官的真正预测潜力。 类器官药物筛选的另一个目标是确定新的治疗靶点。不同类器官队列的初步药物筛选研究已经取得了令人鼓舞的数据，为癌症患者提出了几种治疗策略，尽管需要在更大的癌症类器官队列中进一步验证。例如，一部分原发性肝癌类器官在接受细胞外信号调节激酶（ERK）抑制剂（SCH772984）治疗后显示出生长抑制，但它们对其他大多数临床相关化合物都具有抗性，这些结果在异种移植的小鼠中得到了验证。另外，儿童Rhabdoid癌症类器官模型和相应的PDX模型已经确定Neddylation作为一个有吸引力的治疗靶点。更重要的是，这项研究评估了Neddylation抑制剂MLN4924对健康组织（包括肾脏、肝细胞和小肠类器官）的毒性，强调了使用正常类器官进行毒性测试的可行性。另一项研究产生了一大型针对癌症干细胞的双靶点双特异性抗体库，并使用患者来源的CRC类器官生物库进行功能性筛选。作者还使用了配对的健康类器官来评估治疗抗体在药物筛选管道的最早阶段的毒性。该研究成功鉴定了一种针对几种表达LGR5的上皮癌症类型的潜在治疗性双特异性抗体，MCLA-158，具有EGFR和LGR5臂。尽管ASC癌症类器官是探索药物-基因相互作用的探索性模型，但具有CRISPR工程化致癌突变的ASC或PSC衍生类器官，具有低体细胞突变背景，可以精确地确定合成致死伙伴或药物（单一或组合）以针对特定基因或途径。最近，在ARID1a/TP53敲除胃类器官中对>2,000种小分子进行了高通量筛选，确定了ARID1a突变细胞对组蛋白去乙酰化酶和Survivin抑制剂的敏感性。类似地，在携带Trp53、Rb1和Pten突变以及Kras和c-Myc过表达的小鼠来源的膀胱癌类器官上进行了表观遗传药物的小分子筛选，确定了Sirt1作为治疗靶点。此外，在PSC衍生的肿瘤性脑类器官上成功进行了一小组EGFR抑制剂的药物筛选。尽管需要长达40天的治疗期，但这项研究证明了Afatinib对EGFR过度激活的GBM类器官亚群的生长抑制作用。与正常视网膜类器官相比，用卡铂、雷帕霉素或两种脾酪氨酸激酶（SYK）抑制剂处理PSC衍生的RB1缺陷类器官模型的视网膜母细胞瘤，提供了除人类视网膜母细胞瘤细胞系之外的替代模型，以进一步验证它们的有效性。最后，来自经过验证的转基因小鼠模型的ASC衍生类器官允许快速表征药物反应及其细胞、机制、功能和药理效应。来自代表不同GC亚型的转基因小鼠模型的肿瘤样本的胃类器官在体外显示出不同的药物治疗效果。另一项研究表明，表达RhoAY42C/+与Cdh1缺失的弥漫性GC细胞系以及来自弥漫型GCs转基因小鼠模型的胃类器官都对焦点粘附激酶（FAK）抑制剂敏感，支持FAK作为这种癌症类型的治疗靶点的相关性。这些配对的类器官-小鼠模型允许高效、无偏见、并行地测试由一组定义的基因组异常引起的药物反应。 10.使用类器官衍生的异种移植作为临床前模型 尽管PDX模型被认为是体内肿瘤的良好代表，但它们成本高，移植成功率低，需要长时间的培养。患者衍生的类器官异种移植模型可能为这一未满足的需求提供解决方案，并在表2中进行了总结。最简单的方法涉及将健康、癌症或基因修饰的类器官与Matrigel共注射到小鼠侧腹， 这不需要高级的外科技术来执行，并给出一个容易观察的读数。然而，皮下类器官移植的植入率可能很低，并且不能重现自然的肿瘤微环境，因为缺乏血管系统阻碍了为肿瘤生长提供必要的利基因素。为了解决这个问题，几个小组将癌症/工程化类器官注射到裸鼠的肾下囊或脾脏中，这两个都是高度血管化的环境，确保了丰富的营养、激素、生长因子和氧气供应给移植的类器官，大大增强了植入率。移植的细胞可以直接进入血液并转移到肝脏，在那里它们增殖形成次级病变，这使得它成为研究人类肿瘤肝转移的理想平台。然而，这个模型仍然不能复制癌症的自然肿瘤微环境。这个限制由一个研究所说明，在该研究中，依赖Wnt和R-spondin的GC类器官未能在肾下囊植入，除非它们与产生Wnt和R-spondin的、来自肠道类器官的成纤维细胞共注射。 已经开发了几种原位异种移植模型，为异种移植形成提供了更具生理学相关性的微环境。然而，它们涉及复杂和侵入性的外科手术。与肾囊或皮下空间相比，原始组织环境提供了支持类器官植入的生长因子，这一点通过在结肠环境中弥漫型GC类器官的异种移植效率增加得到了证明，最有可能是由于该位置的Wnt和R-spondin的可用性。到目前为止，癌症类器官已经被直接注射到胰腺尾部、胃浆膜和卵巢囊的NGS小鼠中，这些研究都证明了类器官重现肿瘤过程的能力。几项研究还成功地进行了小鼠类器官的原位移植到盲肠粘膜壁，这不需要外科切口。这种方法随后被改编为将患者来源的CRC类器官和正常人类结肠类器官移植到小鼠结肠中。这些方法允许对异种移植形成进行内窥镜监测，并可以应用于正常人类类器官进行体内谱系追踪。另一项研究报告说，体外药物敏感性可以在其体内原位模型中重现。总的来说，这些报告强调了基于类器官的原位异种移植模型在促进我们对相关生理环境中肿瘤发生的了解方面的高价值，为它们在转化研究和个性化治疗中的使用铺平了道路。 11.局限性与未来展望 尽管类器官技术已经彻底改变了癌症研究，并具有广泛的潜在应用，但它仍然面临技术限制。尽管来自ASC的肿瘤类器官在基因组上通常是稳定的，但也有例外。如上所述，来自肠道腺体的普通类器官在长期培养中可能会倾向于克隆优势，这影响了用于全基因组CRISPR筛选的普通类器官的使用。类器官在长期培养中也可能获得新的突变，尽管这些突变通常是亚克隆的、随机的，并且主要影响非编码区域。具有固有基因组不稳定性的类器官可能会更快地获得突变，正如一项研究所示，该研究使用了一个微卫星不稳定的肿瘤类器官。有趣的是，这种固有的不稳定性已被用来模拟肿瘤演化的早期阶段。例如，一项研究追踪了经TP53突变工程化的胃类器官中染色体拷贝数的变化，并注意到在2年的时间里逐渐出现的非整倍性。即使类器官基因组和突变谱是稳定的，表型不稳定性也可能由生长条件的变化引起。一个亚群的尿路上皮癌类器官在亲本肿瘤中显示了腔系亚型，但随后作为类器官转变为基底亚型，尽管亚克隆突变的频率没有可检测的变化。这些基底类器官在异种移植中生长时又恢复了腔系表型，表明类器官培养条件与异种移植环境是这种表型可塑性的原因。显然，对调节表型的因子的更好理解将导致类器官模型的改进。已经改良生长因子，以提高肠道类器官中的分泌系规范和肝脏类器官中的肝细胞规范。在低氧或无锚定条件下培养也可能为肿瘤类器官相对于普通类器官提供选择优势。 目前，使用类器官的高通量药物筛选大多涉及直接对肿瘤类器官有影响的药物。除非使用更复杂的共培养模型，否则单独的类器官在筛选阻断肿瘤-基质或肿瘤-免疫相互作用的药物时不会提供有用的结果。利基因子的存在可能进一步限制筛选中使用的小分子抑制剂的类型。例如，BMP和TGF-b抑制剂在常规类器官培养中是必需的，这阻止了相关激动剂在药物清单上的使用。只有在肿瘤类器官自分泌Wnt的情况下，Wnt抑制剂筛选才有可能，但它无法模拟来自肿瘤基质的Wnt来源的阻断。类器官培养中增殖性干细胞的主导地位可能会夸大它们对针对细胞周期的药物的反应。最后，培养条件和类器官大小已被证明可以改变细胞可塑性，如在PDAC和CRC类器官中所示，这反过来可能影响药物反应。因此，基于类器官药物筛选的发现将需要通过临床前研究和临床试验进行广泛验证。 迄今为止，几种类器官培养方法已经开始将微环境的一些组分，如基质细胞、血管和免疫细胞，纳入它们的类器官中，使它们在生理上更具相关性（图1和4）。与癌症相关成纤维细胞共培养的胰腺肿瘤类器官表明，来自基质的外源性Wnt供应可以增加依赖Wnt的PDAC细胞的肿瘤潜力。此外，将肿瘤类器官和自体T细胞共培养导致患者特异性肿瘤反应性T细胞的扩增，这是采用性T细胞转移的潜在临床策略。另一种方法涉及基于3D生物打印的模型，该模型由组织基质的关键组分组成，包括癌症相关成纤维细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，创建了一个多层的“组装体”。引人注目的是，内皮细胞能够形成功能性的血管网络，支持肿瘤生长。对组装体的分析揭示了一个旁分泌循环，即成纤维细胞分泌的BMP在肿瘤中诱导FOXA1表达，这反过来又推动了增强子重编程，赋予肿瘤亚型可塑性。与传统的膀胱肿瘤类器官相比，组装体对化疗药物的敏感性也较低。此外，还描述了一个“器官-血管网”模型，该模型涉及将人类CRC或正常肠道类器官与修饰形式的内皮细胞共培养，这些细胞过度表达胚胎限制E26转化特异性（ETS）变异转录因子2（ETV2），形成可灌注的血管网络。有趣的是，这种共培养模型表明，与CRC类器官中预后不良和转移相关的基因上调。最后，AL方法已成功适应建立100个ALI肿瘤类器官，来自28种不同的癌症类型。另一种方法从患者肿瘤的针刺活检中生成微器官球体。将肿瘤消化成Matrigel中的悬浮细胞，然后与油混合以生成基于微流体的液滴进行后续培养和药物筛选，可在14天内得出结果。这两种模型都能保留肿瘤微环境，包括肿瘤浸润性淋巴细胞，使未来在免疫肿瘤学研究中具有潜在应用。当然，这些改进和对现有协议的调整是令人兴奋的，但模拟癌前环境又是另一个挑战。癌前细胞与基质组分之间的相互作用无疑在肿瘤发生中起作用。事实上，与L2-IL-1B小鼠的中性粒细胞共培养的小鼠Barrett食管类器官以剂量依赖性方式增加增殖和类器官生长，表明中性粒细胞对BE上皮细胞有直接刺激作用。未来，看到其他方法如何将癌前微环境纳入类器官模型将是有趣的。 用于类器官培养的试剂和协议，无论是用于癌前研究还是更普遍的研究，都需要改进和标准化，如果类器官要在临床应用中使用的话。目前，Matrigel是类器官培养协议中最广泛使用的支架，但它是动物来源的，定义不清，批次间变化，并且存在免疫原转移的风险。所有这些限制都阻止了它在临床应用中的使用。也许在低百分比基质条件下的悬浮培养技术或使用下一代设计基质将解决这个问题，并将类器官的应用扩展到临床环境。重要的是，类器官系仍然大多是手动生成的，每个实验室都使用自己的修改协议。最终，类器官衍生/增殖协议将必须标准化和自动化，以增加可重复性和可扩展性。 12.结论 鉴于迄今为止已经成功建立的健康和癌症类器官的广泛多样性，发展微流体方法以提高药物筛选的吞吐量，以及将肿瘤微环境纳入这些设备的潜力（在图5中总结），我们可能会在不久的将来看到类器官模型测试作为患者药物处方的补充。此外，类器官模型及其与动物模型的协同作用将为分析复杂的旁分泌相互作用提供手段，加速发现到癌症发展的最早步骤，从而提供发现有效的癌症预防策略的机会。 图5. 显示了癌症模型中类器官培养技术进展的时间线。与ASC衍生类器官相关的主要事件以蓝色文本列出，而与PSC衍生类器官和ALI类器官模型相关的事件分别以黄色和绿色文本显示。ASC，成人干细胞；PSC，多能干细胞；ALI，空气-液体界面；PDAC，胰腺导管腺癌。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。