Sodium Tetradecyl Sulfate

在药物研发的探秘之旅中，科学家们一直渴望拥有一双能够“穿透”活细胞、实时“观看”药物如何与靶点结合并引发后续连锁反应的“慧眼”。传统方法如同在细胞“破碎”后进行考古，丢失了关键的时空信息；而现有的活细胞技术又往往存在灵敏度不足或靶点覆盖有限的局限。 2025年11月25日，中国科学院大连化学物理研究所的叶明亮研究员团队在《Nature Communications》上发表了一项突破性研究。他们开发了一种名为 SICFA（溶剂诱导部分细胞固定法）的全新蛋白质组学技术。该技术如同对活细胞内的蛋白质进行“动态定格”，不仅能在保持细胞完整性的情况下，超高灵敏度地捕捉药物与直接靶点的结合，更能全景式描绘出由此触发的下游信号通路 时序性变化，为理解药物机制打开了前所未有的窗口。 一、研究亮点 ·活细胞原位“摄影”：直接在完整活细胞内评估蛋白质稳定性，完美保留细胞的生理状态与分子互作网络。 ·超高灵敏度：能检测到传统定量蛋白质组学方法难以捕捉的早期分子事件，例如在用药后4小时即发现5-氟尿嘧啶（5-FU）对RNA修饰酶稳定性的影响。 ·时序解码能力：结合时间分辨实验，可清晰勾勒药物作用的动态轨迹——从分子起始事件→早期事件→中间事件→结果事件。 ·与热稳定方法强互补：SICFA（溶剂变性）与TPP/PISA（热变性）原理不同，联合使用可将激酶靶点识别数量提升63%以上，极大扩展了靶点发现范围。 ·定量药效：通过剂量响应实验（ISDR-SICFA），可直接在细胞内测定药物与靶点结合的EC₅₀值，定量评估药效。 二、背景：药物靶点研究的“活细胞困境” 理解一个药物如何起效，关键在于厘清三个核心问题：1. 靶点是谁？2. 结合力多强？3. 后续引发什么通路变化？ 现有技术存在明显短板： ·传统生化方法（如SPR、ITC）：需纯化蛋白，脱离细胞真实环境。 ·基于裂解液的方法（如SIP、SPP）：破坏细胞结构，丢失空间信息和下游效应。 ·基于热稳定的活细胞方法（如CETSA、TPP）：对热不敏感或热稳定蛋白无效，可能漏检关键靶点。 因此，开发一种能在活细胞中高通量、高灵敏度检测蛋白质稳定性全景变化的技术，成为领域内的迫切需求。 三、SICFA原理：用“梯度固定”绘制蛋白质稳定性图谱 SICFA的核心思想非常巧妙：利用有机溶剂（丙酮:乙醇:乙酸 = 1:1:0.2%）对细胞进行梯度浓度的短时处理。溶剂会部分破坏蛋白质的水化层，诱导其变性聚集。稳定性不同的蛋白质，抵抗这种变性的能力也不同。 通过质谱分析经不同浓度溶剂处理后仍保留在可溶相中的蛋白质，即可为细胞内超过5600种蛋白质绘制出一张精细的“稳定性图谱”（以半变性浓度Cᵤ表示）。药物结合通常会稳定其靶蛋白，使其在更高溶剂浓度下仍保持可溶，从而在图上表现为Cᵤ值的“右移”。 图1 SICFA在全蛋白质组水平评估细胞内蛋白稳定性 ·(a)SICFA实验流程图：活细胞经梯度浓度固定液处理 → 裂解 → 离心取上清（可溶蛋白）→ LC-MS/MS分析。 ·(b)蛋白质变性热图：约6800个蛋白质的丰度随固定液浓度增加而变化的模式，颜色越深表示越易变性。 ·(c-e)在三次重复实验中，SICFA成功为约82%的K562细胞蛋白质组（5577-5638个蛋白）拟合出高质量的变性曲线，并计算出Cᵤ值，中位数为9.72%，且重复性极高（R > 0.93）。 ·(f,g)结构分析揭示规律：高Cᵤ值（更稳定）的蛋白富含β-折叠，而低Cᵤ值蛋白则含有更多内在无序区域。MTFR1L（Cᵤ: 3.41%）和CYB5R3（Cᵤ: 19.68%）是这两种结构的典型代表。 四、验证：SICFA精准捕捉已知药物的靶点 研究团队首先用经典药物验证SICFA的准确性。 1. 拉立替辛（靶向TYMS）：Western blot显示，用药后TYMS在10-12%固定液浓度下的可溶量显著增加。蛋白质组学分析进一步确认，在5534个蛋白中，TYMS是唯一被显著稳定（p值最低）的靶点，特异性极高。 图2 SICFA测定活细胞中药诱导的蛋白稳定性变化 ·(a)实验流程示意图。 ·(b) WB验证拉立替辛稳定TYMS。 ·(c)火山图显示，在拉立替辛处理的细胞中，TYMS是唯一显著性突出的靶点。 ·(d)多靶点药物达沙替尼的SICFA分析火山图，成功识别出LYN、YES1等多个已知激酶靶点，并发现其相互作用蛋白CDKN1C的稳定性随之下降。 ·(e-g)对比甲氨蝶呤（MTX）在裂解液（SIP）和活细胞（SICFA）中的效果：在裂解液中，SIP只检测到直接靶点DHFR的稳定；而在活细胞中，SICFA还检测到代谢产物MTX-PG所作用的靶点TYMS的稳定，以及下游代谢通路中MTR和MTHFD1的稳定性变化，揭示了更完整的药物作用网络。 五、进阶应用一：ISDR-SICFA定量细胞内药物效力 研究团队进一步发展出ISDR-SICFA（等溶剂剂量响应SICFA）策略，用于在生理条件下精准测量药物与靶点的结合强度。 以激酶抑制剂十字孢碱（STS）为例，用不同浓度STS处理细胞后，进行SICFA分析。通过拟合剂量-响应曲线，成功计算出118个候选靶点的EC₅₀值，其中包含59个ATP结合蛋白。 图3 ISDR-SICFA揭示药物在活细胞中的结合效力 ·(a)ISDR-SICFA工作流程。 ·(b)STS处理的火山图，显示大量激酶和ATP结合蛋白的稳定性发生变化。 ·(c)候选靶点的pEC₅₀值环形分布图。 ·(d)ISDR-SICFA 识别的候选靶点的−log10（p 值）与 pEC50值之间的相关性。 ·(e)已知靶点PRKCA（蛋白激酶Cα）的剂量-响应曲线，其EC₅₀为160 nM。 ·(f)对比活细胞与裂解液实验：裂解液中94%的STS靶点是激酶，而活细胞中仅占33%，说明SICFA在活细胞中额外捕获了大量下游效应蛋白的信息。 ·(g) ISDR-SICFA 识别的 118 个候选靶点的GO和 KEGG富集分析。 ·(h-j)经典范例：STS通过抑制CDK激酶，导致其底物RB1去磷酸化，SICFA在活细胞中同步检测到CDK2/5/9稳定性上升和RB1稳定性下降，并计算出RB1的EC₅₀为557 nM，完美揭示了“激酶抑制-底物去磷酸化-功能改变”的因果链条。 六、进阶应用二：与热稳定方法（TPP/PISA）强强联合 由于变性原理不同（溶剂 vs. 加热），SICFA与TPP/PISA在靶点识别上存在显著互补性。 对比研究发现，两者在蛋白质变性曲线上仅有中等相关性（R=0.631），且各有数百个蛋白质只能被其中一种方法高质量检测。在实际药物靶点筛选中，SICFA能识别出一些TPP/PISA难以检测的靶点（如HDAC8），而联用两者可使激酶靶点发现数量提升超过63%。 图4 SICFA与TPP/PISA在靶点识别上的互补性 ·(a)不同方法鉴定ATP结合蛋白和激酶靶点数量的对比，SICFA在ATP结合蛋白鉴定上具有优势。 ·(b)韦恩图显示SICFA能识别出大量独特的激酶靶点。 ·(c)SICFA与任一TPP方法联用，均可大幅增加激酶靶点的发现总数。 ·(d-f)案例对比：对于STS的靶点PRKCA家族、CDK抑制剂SNS-032的靶点、以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂帕比司他的靶点，SICFA往往能给出更大的稳定性变化倍数（log₂FC），使得信号更显著、更易检测。 七、巅峰展示：时间分辨SICFA解码5-FU作用时序 本研究最精彩的篇章，是利用时间分辨SICFA，像播放电影一样，全景重现了抗癌药5-氟尿嘧啶（5-FU）在细胞内的作用全过程。 图5 时间分辨SICFA揭示5-FU对细胞生化通路的时序性影响 ·(a)5-FU的代谢途径及其对DNA和RNA的损伤作用示意图。 ·(b)时间分辨实验设计：在用药后30分钟、4、12、24小时，平行分析蛋白质稳定性（SICFA组）和蛋白质丰度（全溶组）。 ·(c)不同时间点的蛋白质稳定性变化火山图。 ·(d,e)关键发现：蛋白质稳定性的变化远早于且多于蛋白质丰度的变化。在用药4小时，已有15个蛋白的稳定性发生显著改变，而此时蛋白质丰度几乎无变化。这证明SICFA是探测早期药物效应的更敏感指标。 ·(f)生物过程富集分析清晰地勾勒出5-FU作用的四部曲： 1.分子起始事件（30分钟）：快速代谢并稳定直接靶点TYMS。 2.早期事件（4小时）：主要影响RNA修饰、核糖体生物合成等通路。 3.中间事件（12小时）：扩展至DNA复制、p53信号、嘧啶合成等。 4.结局事件（24小时）：引发细胞周期阻滞、线粒体功能障碍、内质网应激，最终走向凋亡。 八、机制深化：锁定5-FU早期作用新靶标——RNA修饰 针对4小时这个早期时间点，研究进行了深度挖掘。SICFA发现，5-FU早期稳定的蛋白主要富集在RNA转录后修饰和核糖体小亚基生物合成相关通路。 图6 SICFA分析揭示5-FU早期作用于RNA转录后修饰 ·(a)15个早期响应蛋白的稳定性和丰度变化热图。 ·(b)这些蛋白的功能互作网络，核心是RNA修饰和核糖体生成。 ·(c-e)重点酶类的验证：假尿苷合成酶（PUS1， PUS3， PUS10， TRUB1， TRUB2）、二氢尿苷合成酶（DUS3L）以及RNA甲基转移酶（TRMT2A， EMG1）的稳定性均在用药4小时后显著升高，且随时间持续增强。 ·(f)功能连接验证：通过质谱检测tRNA修饰水平发现，尽管相关酶的稳定性在4小时已改变，但tRNA上的假尿苷（Ψ）、甲基化尿苷（m⁵U）等修饰水平直到24小时才出现显著下调。这证实了SICFA检测到的稳定性变化先于并导致了最终的功能改变。 九、总结与展望 SICFA技术成功构建了一个在活细胞中系统研究药物靶点结合与下游通路的强大框架。它如同一台高时空分辨率的“细胞内摄像机”，实现了三大突破： 1.从“破碎”到“完整”：在保持细胞活性的前提下进行全局性分析。 2.从“静态”到“动态”：通过时间分辨实验，解析药物作用的因果与时序。 3.从“单一”到“互补”：与TPP等方法联用，最大化靶点覆盖。 未来，SICFA不仅可用于大规模药物筛选和机制研究，还可拓展至区分蛋白异构体功能、结合多种检测平台（如荧光微孔板）等领域。这项由中国科学院团队自主研发的技术，为全球药物发现提供了源自中国的创新工具和独特视角。 论文信息 ·标题：Solvent-induced partial cellular fixation decodes proteome-wide drug targets and downstream pathways in living cells ·DOIhttps://doi.org/10.1038/s41467-025-65497-2