Minocycline

*仅供医学专业人士阅读参考我们知道，抑郁症有一个普遍存在的现象，那就是快感缺失。具有快感缺失的抑郁症患者病情会更严重、自杀率也更高。事实上，快感缺失包括许多方面，其中动机缺陷，与多巴胺功能的关系最为密切。而所谓的动机缺陷，简单地说，就是指一个人不再愿意为获得奖励而努力。虽然，抑郁症患者出现动机缺陷的机制还不清楚，但是有研究显示，炎性细胞因子的释放（如肿瘤坏死因子，TNF；C-反应蛋白，CRP）会对奖赏回路和多巴胺环路产生影响，导致动机减少、快感缺乏。此外，一些随机临床试验结果显示，具有抗炎作用的药物，如氯胺酮、塞来昔布、英夫利西单抗和米诺环素对辅助治疗抑郁症有效。不过截至目前，关于抗炎药物能否有助于改善抑郁症患者的动机缺陷，还不清楚。近期，美国埃默里大学Michael T.Treadway团队发表了一篇研究。他们发现，一种抗炎药，TNF拮抗剂英夫利西单抗或可对抗炎症带来的动机缺陷，使抑郁症患者变得更加积极。具体来说，研究团队对42例存在高炎症且未经药物治疗的重度抑郁症患者进行了一项随机双盲、安慰剂对照试验。结果显示，与安慰剂相比，英夫利西单抗能改善抑郁症患者的动机缺陷，即接受英夫利西单抗的患者有着更强烈地为获得奖励而付出努力的意愿。此外，研究还发现，这种意愿的增加与炎症指标——可溶性肿瘤坏死因子受体2（sTNFR2）水平的降低有关。而神经成像数据也表明，sTNFR2的减少与患者大脑中努力决策相关脑区（背侧前额叶皮层dmPFC）的活动增强有关。这也意味着，英夫利西单抗或可通过降低炎症，来改善抑郁症患者的动机缺陷和大脑相关的神经活动。研究发表在《分子精神病学》上[1]。论文首页截图在这项随机双盲、安慰剂对照试验中，研究人员共纳入了42例重度抑郁症患者（他们C反应蛋白均>3mg/L，且4周内未服用任何精神治疗药物或抗炎药物，无慢性感染、自身免疫性疾病）。这些患者被随机分为两组，一组接受英夫利西单抗治疗（5mg/kg，静脉注射），另一组则接受安慰剂治疗。所有患者在基线和治疗两周后均接受了血检，与动机相关的行为任务（EBDM）以及功能性磁共振成像（MRI）检测，目的是观察药物对他们做任务时的动机和大脑活动的影响。EBDM指基于努力的决策任务，简单来说就是测试参与者在面对不同难度的任务时，愿意付出多少努力来获得奖励（任务通常是这样的：参与者需要在规定时间内，通过按按钮的数量来给予美元，奖励1-5美元不等。在这个任务中，你可以选择去做简单的事情拿小奖励，或者选择更困难的任务，获得更大的奖励。通过这种测试，研究人员可以看出抑郁症患者是否愿意在面对困难时选择努力和努力的程度）。患者特征结果显示，通过对比两组患者治疗前后的血液样本，研究人员发现，与治疗前相比，接受英夫利西单抗治疗的患者血液中炎症相关的标志物（如CRP和sTNFR2）水平显著下降，而在安慰剂组中，这些炎症指标则没有变化，这说明，英夫利西单抗的确产生了抗炎作用。随后，根据EBDM结果，研究人员发现，与安慰剂相比，接受英夫利西单抗治疗的患者有着更强烈的为获得奖励而付出努力的意愿，尤其是在面对更为困难的任务时，他们更愿意为获得高奖励而付出百分百的努力。英夫利昔单抗对患者的影响这一结果表明，英夫利西单抗提升了患者对高难度任务的接受度，改善了他们的动机缺陷。接下来的分析显示，sTNFR2水平的下降与患者对高难度任务的选择有直接关联，表现为炎症水平低的患者更倾向于选择高努力、高回报的任务。此外，MRI数据也表明，与安慰剂组相比，英夫利西单抗组患者在执行任务过程中大脑负责努力和奖励处理的dmPFC区域活动明显增强。而进一步的回归分析结果显示，sTNFR2的减少与患者dmPFC的活动增强呈正相关。这意味着，炎症水平的降低能改善大脑决策回路和相关神经活动。MRI数据总之，该研究发现，英夫利西单抗或可通过降低炎症，来改善抑郁症患者的动机缺陷和大脑相关的神经活动。这一结果也为使用抗炎药物作为抑郁症动机缺陷的治疗方法提供了证据支持，当然，本文纳入患者数量有限，未来还需要在更大规模的样本中验证这些发现。参考文献：[1]Treadway,M.T.,Etuk,S.M.,Cooper,J.A.et al.A randomized proof-of-mechanism trial of TNF antagonism for motivational deficits and related corticostriatal circuitry in depressed patients with high inflammation.Mol Psychiatry(2024).本文作者｜张金旭

摘要：在有利的人造环境中培养细胞已成为细胞和分子生物学中的一种多功能工具。培养的原代细胞和连续细胞系在基础、生物医学和转化研究的调查中不可或缺。然而，尽管它们扮演着重要的角色，但细胞系经常被其他细胞、细菌、真菌、酵母、病毒或化学物质污染或误认。此外，处理和操作细胞与特定的生物学和化学危害相关，需要特殊的防护措施，如生物安全柜、封闭容器和其他专门的防护设备，以最小化暴露于有害物质的风险，并保证无菌工作条件。这篇综述简要介绍了细胞培养实验室中最常见的问题以及一些预防或解决相关问题的指导方针。 1.引言 细胞培养实验在生物医学研究、再生医学和生物技术生产中被广泛使用。由于动物保护法律对实验室动物使用的限制，以及威廉·拉塞尔和雷克斯·伯奇提出的3R原则（替代、减少和细化）的严格执行，以改善动物福利，可以预期在未来几年中，细胞系的普遍使用将进一步增加，以替代基于动物的研究。然而，值得注意的是，如果操作不当，细胞培养实验容易出错。因此，至关重要的是，细胞培养研究应采用良好的细胞培养实践（GCCP）来确保体外实验的可重复性。 特别是，种间和种内交叉污染和细胞误认、遗传漂变、细菌、真菌、酵母、病毒或化学物质的污染，以及缺乏质量控制测试，是普遍存在的致命细胞培养问题，这些问题使得文献充斥着虚假和不可重复的结果。粗略估计表明，使用问题细胞系发表的论文数量约为16.1%。此外，国际细胞系鉴定委员会（ICLAC）在其2021年6月发布的最新登记册中列出了576种被误认或交叉污染的细胞系。 尽管很难估计有多少误导性文章实际上受到影响，但仍迫切需要更好地提高科学家对这个问题的敏感性。此外，当使用细胞系时，生物安全和伦理方面并不在公众意识中，甚至被忽视。例如，一些连续生长的细胞系是通过使用猴病毒40（SV40）大T抗原（SV40T）或其他具有致癌潜力的因子转化建立的，通过引入端粒酶逆转录酶（TERT）活性来实现永生化，来自基因修饰动物，或通过CRISPR/Cas9基因编辑等新技术。因此，许多细胞系需要被归类为需要充分安全关注的转基因细胞系（GMCLs）。 在过去的几十年中，科学家们制定了许多关于良好细胞和组织培养实践（GCCP）的指导方针，这些指导方针不断更新，提供了在进行细胞培养时应考虑的主要原则的指导。GCCP指导方针强调了质量管理问题、培养系统背景、文件记录和报告、一般安全指示、教育和培训信息，以及与细胞培养实验相关的伦理问题。此外，这些专家文件试图促进实验室实践的协调、合理化和标准化，包括制造和测试，以促进研究人员的工作符合法律、法规和伦理原则。此外，这些指导方针提供了关于建立和配备细胞培养实验室环境的基本、有益和有用的附加设备的信息，重点是国家和国际公认的标准。这些指导方针相当复杂和全面，因此它们将主要对有多年细胞培养实验经验的受过训练的研究人员感兴趣。 在本文中，将在更简化的层面上讨论使用细胞系的一些一般方面。特别是，总结了细胞系鉴定的测试、潜在的细胞培养污染物，以及生物医学研究中使用细胞系的伦理问题和生物安全指南的简要信息。因此，所提供的信息对于即将开始进行细胞培养实验的人来说应该是有用的。 2.细胞培养类型的分类  细胞系大致可以分为三组，即（i）有限细胞系，（ii）连续细胞系，也称为永生化或无限细胞系，以及（iii）干细胞系。有限细胞系通常来源于原代培养，生长缓慢。因此，它们可以在体外培养有限数量的细胞代数，然后最终经历衰老和衰老，这一过程表现为失去典型的细胞形状和细胞质脂质的富集。重要的是，有限细胞系是接触抑制的，在形成单层后在G0、G1或G2阶段停止。 相比之下，连续生长的细胞系通常来自转化或癌细胞，并且快速分裂，在体外培养中达到比有限细胞系更高的细胞密度。在某些情况下，这些细胞系表现出非整倍性（即，一个或多个染色体的数量多于或少于其他染色体）或异倍性（即，染色体数量不是单倍体数量的简单倍数）。它们通常可以在降低的血清浓度下生长，不接触抑制，并且可能形成多层。干细胞是一种未分化或部分分化的多能细胞类型，起源于多细胞生物。这些细胞可以扩展为相同类型的无限多的细胞，或者在适当的条件下被触发产生具有特殊功能的细胞。因此，它们可以作为许多不同细胞类型的多能前体。 在所有情况下，来自不同来源的细胞的生长需要一个人工但受控的环境，在这种环境中，有时需要高度专业化的培养基、补充剂和生长因子以确保适当的细胞生长。一种细胞类型可以生长附着（附着在表面），需要一个分离剂进行传代，或者可以自由悬浮。附着细胞可以进一步分为具有长形状的成纤维细胞样细胞和具有多边形形状的上皮样细胞。同样，每种细胞培养在形态、活性、倍增时间和遗传稳定性方面都有独特的属性，它们的处理和维护可能需要不同的培养基、培养条件和添加剂或处理剂，包括抗生素、分离溶液或细胞附着的表面涂层。非附着或悬浮细胞要么作为单个细胞生长，要么作为自由悬浮的团块在液体培养基中生长，这些细胞在传代过程中不需要酶促或机械分离。然而，在某些情况下，这些细胞需要摇晃或搅拌以进行适当的气体交换和适当的生长。非附着细胞的典型例子是来自血液、脾脏或骨髓的造血细胞系，它们在不附着在基质上的情况下增殖。尽管如此，一些附着细胞系也可以适应悬浮生长，这允许在特殊应用中以更大的规模和更高的产量进行更易于管理的细胞培养。此外，与附着细胞相比，悬浮培养的细胞通常更容易处理。例如，当需要通过分析流式细胞术或荧光激活细胞分选（FACS）分析附着细胞时，细胞必须首先从其基质上分离。然而，酶促消化或使用非酶细胞解离缓冲液可能导致表面蛋白的降解，这可能阻止它们在相应的协议中的后续识别和细胞分离。这使得使用流式细胞术对附着细胞进行表型和特征分析极为困难。例如，胰蛋白酶通常用于分离附着细胞。它依赖时间地降解大多数细胞表面蛋白，通过在不跟随脯氨酸的赖氨酸或精氨酸残基后切割肽键。这导致细胞解离过程中大多数表面蛋白的降解。类似地，其他酶如特异性胶原蛋白酶、丝氨酸蛋白酶弹性蛋白酶切割C末端中性、非芳香族氨基酸残基的肽键、肽酶Dispase水解非极性氨基酸残基的N末端肽键，以及许多其他分离剂引发蛋白质的显著降解。 因此，已经引入了几种较温和的酶混合物，如Accutase和Accumax，或非酶细胞解离试剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）和氨三乙酸（NTA）混合螯合二价金属阳离子，用于常规细胞传代和敏感细胞的操作。这些配方毒性较小，保留了大多数表位，以便后续流式细胞术分析。 最近，细胞在三维微环境中的培养已成为研究人员关注的焦点。这些3D细胞培养要么是通过在定义的支架内培养细胞产生的，如来自细胞外基质蛋白或琼脂糖或聚合物材料的水凝胶，要么是作为自组装系统，在这些系统中细胞以团簇或球状体生长。人们普遍认为，这些体外细胞模型提供了在封闭系统中研究细胞反应的可能性，这种系统比依赖于二维的细胞培养技术更接近生理情况。因此，这些模型对于那些研究细胞间相互作用、肿瘤形成、药物发现、干细胞研究和代谢相互作用的人来说特别有趣。与2D系统相比，3D模型有潜力彻底改变药物效力测试、疾病建模、干细胞研究和组织工程研究的方式。最后，这些系统将大幅减少某些研究领域对实验动物的使用，这是3R原则的一个关键方面。 3.培养基  适当的细胞培养基对维持和促进细胞培养的生长以及确保实验结果的可重复性至关重要。一些细胞还需要非必需氨基酸（丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸）以有效生长并减轻细胞的代谢负担。用于保存和维持广泛哺乳动物细胞类型的最常见标准培养基，例如，Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）和Roswell Park纪念研究所（RPMI）培养基。通常，这些培养基包含碳水化合物、氨基酸、维生素、盐和pH缓冲系统（表1）。常见的培养基如DMEM可提供现成的液体形式，或者以粉末形式出售，以便于储存和延长保质期。此外，许多培养基可以提供不同葡萄糖浓度（低或高葡萄糖）以及有无L-谷氨酰胺或稳定的谷氨酰胺的配方。最后，它们可以带或不带pH指示剂如酚红出售。重要的是，基础培养基通常不含蛋白质、脂质、激素或生长因子。因此，这些培养基需要添加胎牛血清（FBS），通常称为小牛血清（FCS），通常浓度为5-20%（体积/体积）。FBS是从健康的产前牛的胎儿血液中获得的。最终的血清通过离心凝固的血液去除细胞、纤维蛋白和凝血因子。值得注意的是，不同来源的FBS在生长因子和激素谱、病毒含量、内毒素负荷、渗透压、总蛋白和金属含量、糖类以及最终处理（例如，过滤、检测潜在污染）方面可能有所不同。因此，大多数科学家更喜欢购买可追溯的FBS批次，以获得可靠的批次间一致性，以在实验期间获得可重复的结果。此外，新生儿小牛血清（NBCS）来自20天以内的小牛，小牛血清（CBS）来自3至12个月大的小牛，以及从12个月以上的成年牛中分离的成年牛血清（ABS）经常用于补充细胞培养基。一些研究人员常规地在56℃下加热灭活血清15-30分钟，以灭活补体并破坏潜在的细菌污染物。然而，在大多数情况下，这不是必要的，应该省略，因为热灭活也会降低生长因子的浓度或生物活性，而这些生长因子是细胞正常生长所必需的。 然而，值得注意的是，含血清的培养基有许多缺点。血清是复杂的，具有不确定的成分，导致批次间变化，增加了污染的风险，并且使用血清通常与避免胎儿和动物痛苦的伦理问题有关。因此，血清免费培养基（SFM）的开发已成为过去几十年的研究热点。原则上，SFM可分为五种类型，即（i）普通SFM，（ii）含有人类来源但无动物成分的异种免费培养基，（iii）无动物培养基，（iv）无蛋白质培养基，以及（v）化学定义培养基。所有这些培养基都含有关键成分（例如，能源、维生素、氨基酸、脂质、微量元素和无机盐离子），并经常添加特殊补充剂，如抗剪切保护剂、核酸和其他需要改善某些细胞类型或应用的培养性能的成分。不幸的是，某些SFM的公司和供应商经常提供不完整或根本没有关于其培养基成分的信息。因此，研究人员十年前就开始建立一个在线无血清数据库，用于交流有关SFM的信息和经验。 通过向细胞培养基中添加抗生素和抗真菌剂，可以更好地预防由细菌、酵母、真菌和支原体引起的生物污染。它们中的大多数通过抑制细胞壁合成（例如，青霉素）、干扰膜通透性（例如，两性霉素B）或通过阻止细菌起始复合体在mRNA和细菌核糖体之间的组装来抑制蛋白质合成（例如，链霉素）。然而，常规使用抗生素可能会发展缓慢生长的持久/耐药细菌污染物，这可能导致细胞分化和行为的微妙变化。 此外，青霉素、链霉素和庆大霉素等抗生素可以显著改变基因表达和调控，可能会修改聚焦于药物反应、细胞调控和分化研究的结果。例如，最近的一项简洁回顾强调了众多出版物显示的抗生素和抗真菌剂如青霉素/链霉素、庆大霉素和两性霉素B对体外细胞特性（包括增殖、分化、存活和遗传稳定性）的影响。同样，一项全面的文献搜索发现了由不同抗生素引起的许多报告的副作用，再次支持在可能的情况下推荐使用无抗生素培养基，以确保细胞培养发现的可靠性和可重复性。因此，研究人员应避免在细胞培养中永久使用抗生素，并应更好地尝试实施严格的无菌工作条件，以防止细胞培养中的细菌污染。4.酚红 酚红，也称为苯磺酞，是细胞培养中最常用的pH指示剂。这种水溶性染料在低pH值时呈黄色两性离子，而在更碱性的条件下则变为红色阴离子或紫红色双阴离子（图1）。因此，这种染料被用作许多组织培养基中的惰性pH指示剂，用于检测pH变化、死亡细胞的废物产物，或通常会导致培养基酸化的污染物的过度生长。然而，由于其结构与某些非甾体雌激素相似，它具有与雌激素受体结合的能力，亲和力为雌二醇的0.001%，从而刺激雌激素受体阳性细胞的增殖。因此，在与雌激素反应性细胞系统工作时，建议在实验过程中避免使用酚红。 图1. 通过酚红监测细胞培养中的pH变化。酚红（Phenolsulfonphthalein）是一种三苯甲烷染料，用于细胞培养中监测pH变化。随着pH值的升高，其颜色逐渐从黄色过渡到红色和紫红色。 5.细胞污染  生物和化学因素都可能导致细胞培养中的污染（表2）。在大多数情况下，细胞生长缓慢、形态变化、培养基pH值快速变化以及培养中死亡或漂浮细胞数量增加是污染的后果。因此，应常规筛查细胞培养中可能的污染物，以防止结果不一致和其他严重后果。下表讨论了最重要的污染物。 5.1.支原体污染 支原体是细菌类摩洛哥菌纲中最小的自复制生物。它们由脂蛋白质膜、核糖体和一个由大小从580到2200 kb的环状双链DNA分子组成的基因组组成（图2A）。支原体的生物合成能力有限，需要进入适当的宿主，在其中繁殖并长时间存活。它们的微小尺寸（约0.1-0.2微米）使得在标准明场显微镜下无法识别，这也是它们在许多实验室中经常未被检测到的原因。它们缺乏细胞壁，对许多在细胞培养中使用的常见抗生素（如青霉素或链霉素）具有抗性。最重要的是，支原体污染不会产生其他细菌或真菌污染所特有的浑浊度。 图 2. 在细胞培养上清中检测支原体。(A) 支原体是最小的自复制细菌，没有细胞壁。它们由脂蛋白质膜、核糖体和一个由圆形双链DNA分子组成的基因组组成。(B) 一个被支原体污染的大鼠细胞系单层用DAPI染色，并在荧光显微镜下用适当的紫外线滤光片包(340/380 nm 激发)在400倍放大下进行分析。请注意那些非常小的明亮的细胞外核点，这是支原体的典型特征（由箭头标记）。比例尺代表50μm。(C) 在描述的分析中，2μL正常对照培养基（Medium(-)）和2μL从支原体感染的细胞系中取出的培养基（Medium(+)）使用Venor®GeM OneStep试剂盒（#11-8050, Minerva biolabs GmbH, Berlin, Germany）根据制造商的说明进行支原体感染测试。作为阳性对照，试剂盒系统内包含的2μL阳性对照也被共同扩增。每个样本中的内部控制在PCR反应中产生191 bp大小的扩增子，证明了PCR反应的功能，而265-278 bp大小的扩增子表明有支原体污染。PCR产物在含有乙二胺四乙酸的2%标准琼脂糖凝胶上分离，并通过标准凝胶成像仪可视化扩增子。 系统性研究已经确定了支原体进入细胞培养的典型方式。这些方式包括从其他研究实验室或商业供应商那里获得的受感染培养物、培养基、血清或试剂的交叉污染。此外，使用非无菌用品、实验室人员作为支原体携带者的感染、孵化器或生物安全柜中支原体的扩散、液氮罐中细胞培养的污染、通过空气传播的颗粒和气溶胶、过度使用抗生素以及培养皿密封不当也是有利于支原体污染的来源。 尽管支原体与宿主细胞竞争生物合成前体和营养物质，但受影响的细胞培养中观察到的生长速率变化通常很小，这就是为什么相应的污染不容易被检测到的原因。然而，支原体可以广泛影响宿主的DNA、RNA和蛋白质代谢，影响细胞内氨基酸和可用ATP水平，改变细胞表面抗原，并可能引起DNA断裂和其他重大染色体变化。因此，定期检测和快速识别这些污染物对于防止研究结果失真、误导性出版物和研究资金浪费至关重要。为了实现这一点，开发了许多敏感和特定的测试方法，这些方法允许检测相应的感染，通常不考虑来源或物种。在检测支原体污染的金标准中，首先将培养上清样本添加到支原体培养的液体培养基中，并在肉汤、琼脂或指示细胞上孵育几天。然而，这种方法耗时且其他更快的检测方法已经被引入。它们包括，除其他外，使用40,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）或Hoechst 33342（图2B）等荧光染料进行特异性DNA染色、酶联免疫吸附试验（ELISA）、用支原体特异性核糖体探针标记RNA、酶法程序、流式细胞术方法、比色法或基于条带的支原体检测试验、检测细菌16S rRNA的敏感PCR基础检测和复杂的傅里叶变换红外（FITR）显微光谱法。荧光染料染色相当非特异性，而大多数其他检测具有高分析灵敏度（即测试识别污染物的能力）和特异性（即测量支原体而不是密切相关的非支原体物种的能力）。特别是，依赖于常规（或终点）PCR的商业化试剂盒通常具有同时检测70-90种支原体的能力，因为这些试剂盒中包含的引物集通常设计为专门针对并扩增支原体基因组中高度保守的16S rRNA编码区域（图2C）。 支原体可以在受感染的培养物中产生几乎无限多的效果。因此，开发了广泛的消除相应污染物的代理和方法。有不同物理、化学、免疫和化疗治疗方法可用于消除支原体污染物。然而，许多这些方法不切实际，因为它们要么耗时，需要特殊设备，只捕获有限数量的支原体物种，或者总体效率低。最初，引入了几种抑制支原体生长的抗生素，但它们大多数效果一般，对真核细胞有害，或者由于对相应药物产生抗性而效果有限。尽管如此，现在有几种更具选择性和有效的抗支原体药物可用，这些药物通常允许在一轮治疗中就消除支原体感染（表3）。在大多数情况下，这些去除剂含有大环内酯类、四环素类、喹诺酮类或这些药物的组合。 常见的化合物Baytril®、Ciprobay®和Zagam®中包含的不同喹诺酮具有相似的化学结构（图3）。它们通过阻断细菌核酸合成来发挥抑制活性，通过破坏细菌拓扑异构酶II，抑制拓扑异构酶IV和DNA旋转酶的催化活性，并导致细菌染色体断裂。BM-Cyclin中包含的大环内酯类Tiamulin通过靶向细菌核糖体的50S亚基来抑制蛋白质合成，并进一步是肽酰转移酶的强抑制剂。它对支原体的活性通过四环素显著增强。其他现成的去除剂包含抗生素和抗菌作用肽的组合或属于不同抗生素家族的三种不同杀菌成分的组合。 图 3. 用于去除或预防支原体污染的选定化合物。(A) 贝尼尔（CAS号：93106-60-6），(B) 环丙沙星（CAS号：85721-33-1），(C) 扎加姆（CAS号：110871-86-8），以及 (D) 含有盐酸米诺环素（CAS号：13614-98-7）和富马酸替米考星（CAS号：55297-96-6）的BM-Cyclin是强大的抗支原体剂，用于消除或预防支原体污染。有关所描绘化合物的生物活性，请参考表3。 不同的杀菌成分在消除支原体感染方面具有高效性。通常，这些物质在施用两到三周后对所有常见的支原体菌株都有效。例如，图4展示了通过电子显微镜评估的大鼠细胞系中支原体的完全根除。 图 4. 通过电子显微镜评估大鼠细胞培养中支原体污染的清除情况。一个受污染的细胞培养物用Plasmocin处理了2周。展示的是处理前（A-C）和处理后（D）细胞的代表性电子显微镜图像，这些图像显示了广谱抗支原体试剂成功地从培养物中清除了支原体。图像的原始放大倍数为4646倍至27800倍。请注意（A）中支原体膜与宿主细胞质膜的特征性融合。 然而，使用这些产品治疗或预防支原体感染可能会引起显著的细胞毒性和遗传毒性效应。例如，米诺环素被证明能诱导Bcl-2的表达，Bcl-2在线粒体中积累，并与包括Bax、Bak和Bid在内的促死亡分子相互作用，从而保护细胞免于死亡。同样，替米考星通过阻断催化嘌呤5'单核苷酸转化为核苷的5'-核苷酸酶（CD73）的活性，抑制了人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和小鼠乳腺癌细胞系4T1的生长和转移。因此，用于去除支原体感染的化合物的应用是实验研究结果的一部分。 5.2.病毒污染 与支原体感染相比，细胞培养中的病毒污染物构成了更严重的威胁，因为检测它们的困难和缺乏治疗受影响细胞培养的方法。此外，一些病毒有能力将其基因组整合到宿主细胞中，这在某些情况下会导致新病毒颗粒的永久性产生。这对操作员来说是一个潜在的健康风险，并且可能是水平病毒传播到其他细胞系的源头。因此，这对受感染细胞系的生物安全分类有直接影响。不幸的是，用于系统评估病毒污染物的通用测试相当复杂且无针对性。没有对病毒真实性的确切了解，这些检测方法仅限于电子显微镜和逆转录病毒逆转录酶的测定。特别是，当怀疑有传染性病毒因子时，电子显微镜的多功能性是一种有效、通用且无偏见的手段。这种技术适用于获取高分辨率图像，从而提供细胞感染状态和病毒形状的即时概览。观察到的形态和大小进一步允许对病毒类型进行即时初步分类。例如，成熟的逆转录病毒通常是球形包膜颗粒，平均直径在100到200纳米之间，显示出与六个逆转录病毒属不同的独特形态。特别是，透射电子显微镜（TEM）适用于在不需要事先对传染性因子进行假设的情况下直接观察生物样本中的病毒。例如，广泛用于肝病研究的连续生长的小鼠肝星状细胞系GRX的逆转录病毒负荷首次通过TEM得到证实。经过这么多年，这个细胞系仍然能够大量产生逆转录病毒颗粒（图5）。 图 5. 小鼠细胞系GRX中的逆转录病毒污染。(A) 逆转录病毒的一般结构。逆转录病毒是直径约100纳米的包膜颗粒。由env基因编码的包膜由糖蛋白组成，这些糖蛋白在出芽过程中从宿主细胞的质膜中获得脂质的包裹。逆转录病毒基因组进一步由两个长度为7-9 kb的相同单链RNA分子组成。病毒衣壳的主要组成部分是群特异性抗原（gag），而逆转录酶（pol）对合成病毒DNA是必需的。(B) 通过电子显微镜分析评估的小鼠肝星状细胞系GRX中未指定逆转录病毒的发生。逆转录病毒颗粒可以在培养基和细胞质中找到。(C,D) 逆转录病毒的高倍图像显示了典型的球形结构。(E) 这幅电子显微镜图像显示了一个出芽过程，其中一个逆转录病毒颗粒通过扩散穿过宿主的质膜获得其包膜。放大倍数分别为10,000倍（B），100,000倍（C），27,800倍（D）和21,560倍（E）。 5.3.化学污染 任何在细胞培养中引起不良影响的非活性化合物都需要引起密切关注。即使是必需的营养物质，在浓度足够高时也可能产生毒性。杂质可能通过培养基、血清和水引入细胞培养。然而，塑料管道、细胞培养皿和储存瓶中的增塑剂，以及荧光或紫外线照射下在培养基中形成的自由基，或玻璃器皿和移液管上的沉积物，都可能导致污染。此外，CO2气流中的杂质以及用于消毒孵化器或生物安全柜的杀菌剂或杀虫剂残留物可能至关重要。最关键的是内毒素，它们来源于大多数革兰氏阴性细菌的外细胞膜。这些由相当稳定的脂多糖（LPS）组成，它们从细菌中脱落，并在细菌溶解过程中大量释放。因此，从玻璃器皿中去除热原需要在高温下进行广泛的加热，而这些物质对高压灭菌相当有抵抗力。因此，大多数市售的现成细胞培养基和补充剂都是以这种方式准备的，它们不含或含有非常低水平的内毒素。此外，可靠的细胞培养基和补充剂生产商会提供分析证书，表明相应溶液或化合物中的内毒素水平。 一些培养条件（例如，低血清浓度、高光照暴露）会促使形成高活性的自由基，可能导致DNA损伤、蛋白质交联、脂质过氧化物和诱导细胞凋亡。因此，通常向细胞培养基中添加具有自由基清除活性的抗氧化剂，如抗坏血酸、N-乙酰-L-半胱氨酸或维生素（维生素E、维生素A、维生素C），以防止氧化应激及其后果。或者，可以将微量元素硒作为抗氧化剂酶的辅因子，如谷胱甘肽过氧化物酶，添加到培养基中以消灭活性过氧化物。 此外，铅、镉和汞等重金属的高浓度对许多细胞类型是有毒的。因此，重要的是在准备培养基或补充剂之前，要对用于水和溶剂进行重金属测试。或者，如果实验室水不适合细胞培养，应使用提供分析证书的商业供应商的纯水。 5.4.种内和种间交叉污染 同一物种（种内污染）或另一物种（种间污染）的无关细胞污染细胞系是一个常见且反复出现的问题。特别是，当污染物是一种快速分裂的细胞系时，它会过度生长并取代原始培养物。如果污染未被检测到，这可能导致不可靠和不可复制的结果，从而歪曲生物医学文献。细胞系交叉污染的问题已经众所周知数十年，始于1960年代围绕HeLa细胞的争议。2010年发表的第一份综合分析引用了68个参考文献，列出了360个交叉污染的细胞系。随后，在2021年，旨在引起研究人员对这一问题关注的国际细胞系认证委员会（ICLAC）列出了来自不同物种的576个因交叉污染或其他方式而误认的细胞系（表4）。交叉污染的来源多种多样，包括通过气溶胶或未堵塞的移液管的不想要的传播，不同细胞系之间共享培养基和试剂，以及不注意使用条件培养基。 如今，有不同方法可用于确定细胞系交叉污染。种间交叉污染可以通过同工酶分析检测，该分析利用电泳结合模式检查物种间在一组细胞内酶的个别同工型结构和迁移性方面的微小差异。人类细胞的种内交叉污染可以通过人类淋巴细胞抗原（HLA）位点分型识别，这是一组位于第6染色体上的基因，编码参与免疫系统调节的高度多态性的细胞表面蛋白。此外，分子血清学方法、使用合成探针或引物的遗传测试以及基于直接DNA测序的序列分型可以区分不同的HLA基因型。 5.5.细胞误识别 类似于细胞交叉污染，细胞系的误识别导致数千篇误导性和错误的论文。在常规操作过程中由于注意力不集中、操作员工作量大或实验工作分心而引起的难以辨认的标签和细胞培养容器的误标记是误识别的最直接原因。可以理解的是，与更快速分裂的污染物细胞的污染可以迅速在几次传代中过度生长原始培养物，并在后续步骤中引起细胞系误识别。当使用同一移液管或同时进行多次培养的重新饲养操作和操作，作为不同细胞类型有意共同培养的结果，或在与饲养细胞工作时缺乏意识时，可能会导致这种过度生长。 6.短串联重复序列分析  如今，识别交叉污染和细胞误识别的最常用方法是短串联重复序列（STR）分析。该方法可以比较不同样本在DNA中特定位点的等位基因重复次数。尽管这些重复的相应等位基因变异相当多态性，但等位基因的数量非常小。因此，为了使不同的STR配置文件对识别或区分目的具有高区分统计能力，通常在多重PCR检测中同时分析多个STR位点。 在STR分析中，从模板DNA获得的扩增的可变微卫星区域在遗传分析仪上分离，然后使用软件进行分析，该软件计算每个变体位点的重复次数。如今，为许多物种建立了有效和标准化的STR小组。在这方面，建立包含19个鼠STR标记的多重PCR检测的鼠细胞系认证联盟是开创性的。这种多重PCR为不同的小鼠细胞系，包括密切相关的细胞系，提供了独特的STR配置文件。图6展示了广泛使用的永生化小鼠细胞系AML12获得的四个STR标记的代表性色谱图。 图 6. 小鼠细胞系的典型短串联重复（STR）标记色谱图。使用CellCheckTM Mouse系统（IDEXX, Kornwestheim, Germany）对小鼠AML12细胞的基因组DNA进行STR分析，该系统扩增分布在17条染色体上的19个物种特异性STR标记。在这张图中，展示了来自第17、18、19号染色体和X染色体的四个代表性STR配置文件。有关该细胞系的完整STR配置文件，请参考表5。 重要的是，当比较三种不同的小鼠细胞系之间的19个鼠STR标记时，每个细胞系都有独特的组合，允许明确区分每个细胞系（表5）。 如今，已有数据库可供存取用于小鼠、猫、狗、牛、马、人类等STR测试设置的引物信息。此外，Cellosaurus资源提供了大量信息，并提供了诸如STR相似性搜索工具（使用STR进行细胞系认证，CLASTR）等程序，用于比较STR配置文件。 7.细胞系变化和过度传代  通常，实验室中培养的永生化细胞系会经过许多代。然而，高传代次数或长时间培养的细胞系可能会出现染色体复制或重排、突变和表观遗传变化。这种现象通常被称为遗传漂变。因此，细胞的形态、增殖率、代谢能力或总体健康状况可能会发生显著变化，影响实验结果。因此，在进行实验时，记录细胞系传代次数（反映细胞被亚培养到新容器的次数）是一个重要考虑因素。 也有报道指出，传代次数的增加可能会增加病毒污染的风险。此外，过度传代的细胞会选择生长速度更快的细胞，这些细胞在某些情况下表现出降低的分泌率、介导转运和细胞旁通透性，而细胞通透性则增加。因此，当传代次数相差数百代时，不同实验室进行的类似或相同研究可能会得出完全不同的实验结果。尽管没有关于最佳传代范围的具体指南，但通常的做法是在使用20至30代后不再使用细胞。不幸的是，尤其是当细胞来自细胞库以外的来源时，通常无法准确知道传代次数，因为细胞库通常会提供细胞传代次数的数据。 在某些情况下，研究人员认为即使传代次数也不准确，因为不同实验室在传代过程中可能使用不同的初始细胞种植密度或分裂率，这会影响细胞在培养中的分裂次数。因此，引入了一个用于计算精确的人口倍增水平（PDL）的公式，该公式与细胞代时间同义，特别用于原代细胞。在相应的公式中，PDL是自体外初次分离以来细胞群中细胞翻倍的总次数，计算如下：PDL = 3.32 (log Xe − log Xb) + S，其中Xb是孵化时间开始时种植的细胞数，Xe是孵化时间结束时的细胞数，S是分裂前的起始PDL。 8.使用细胞工作的生物安全方面 细胞培养可能对人类健康和环境造成伤害，需要被指定到一个考虑多种因素的生物安全级别。在使用细胞系之前，必须准确了解这些风险，考虑到其内在属性、（遗传）操作类型，以及由于污染病原体而可能显著增加的相应细胞系的生物危害。尽管这些估计必须逐个案例进行，但有一些一般指南需要遵循。首先，被研究细胞与人类的遗传关系越近，对人类的风险就越高，因为污染病原体通常具有特定的物种屏障。然而，应该注意，因为一些污染生物体有潜力跨越通常的物种屏障。其次，细胞系的肿瘤诱导潜力强烈依赖于其来源。例如，上皮细胞和成纤维细胞的肿瘤诱导潜力较低，而造血细胞则显著更高。第三，已经在许多实验室中使用多年的、得到良好表征的细胞系，比未表征的持续生长细胞系或原代细胞的风险总体较低。在识别和评估潜在风险后，通过遏制、限制人员和设备进出细胞培养实验室、按照标准操作程序（SOPs）工作、避免在工作期间形成气溶胶或飞溅、定期进行细胞培养培训、以及实施和遵循良好实验室规范（GLP）的一般指南来定义避免或最小化这些风险的方法是至关重要的。此外，建议在与原代人类细胞培养工作时接种乙型肝炎病毒疫苗。然而，不同国家之间的生物安全和生物安全全球规范和国际标准往往差异很大，开始工作前应注意。 9.来自患者的细胞系、类器官、异种移植模型和条件重编程 如前所述，已建立的细胞系在长期传代后可能会发生遗传漂变或表型变化。因此，它们可能不再忠实地代表它们最初来源的细胞类型所特有的所有分子特征。因此，科学家们已经开发了允许从健康供体或患有特定疾病的受试者的组织或血液中建立原代细胞的技术。对人类而言，这些来自患者的细胞系具有高度的临床转化相关性。 然而，自发永生化通常是一个罕见的事件，过去通常通过用病毒癌蛋白转化部分解除细胞周期调控或通过过表达TERT替换在细胞复制过程中丢失的短DNA片段（这些片段参与控制细胞衰老）来建立相应细胞。同样，CRISPR-Cas9介导的靶向癌基因，可以用于体外永生化细胞，已被确定为建立永生化细胞系的有效工具。 然而，应批判性地指出，这些操作可能会产生转录和细胞周期效应，此外，相应代理通过抑制DNA损伤信号通路导致突变的积累。最近，条件重编程（CR）已成为建立原代细胞长期培养的强大工具。CR技术最初于2012年建立，允许许多组织的正常和肿瘤上皮细胞无限期地在体外增殖。在这项技术中，可以通过与辐照成纤维细胞饲养层细胞和Rho激酶抑制剂Y-27632共同培养，使细胞条件性重编程。这项技术现在被广泛用于建立来自正常和病变细胞的患者源性细胞培养。在这个过程中，上皮细胞被重编程以获得成人干细胞特性，通过将细胞从标准培养基转移到CR培养基，逆转它们的分化状态，并允许大量产生用于患者衍生模型的细胞。因此，CR在精准医疗、再生医疗、药物测试、基因表达分析、异种移植研究以及确定从正常细胞表型向肿瘤细胞表型转变过程中发生的遗传、表观遗传和代谢变化方面提供了激动人心的可能性。重要的是，现在有复杂的协议进一步允许使用CR快速高效地扩展非上皮细胞，包括来自神经、神经内分泌、内分泌和间充质起源的细胞，这些细胞可以在条件下长期生长。 在个性化医疗中，类器官——通常源自多能性胎儿或成人干细胞的自组织3D组织——已引起了极大的兴趣。它们是器官的微型化和简化版本，形成于包含一组生长因子的选择性3D培养基中。特别是，来自患者的类器官(PDOs)已在癌症研究中被广泛引入。它们重现了原发肿瘤的基本特征，包括组织学的复杂性和遗传特征，因此理想地用于预测对抗癌药物的敏感性或肿瘤进展的方面。 同样，来自患者的异种移植(PDX)模型是动态实体，在其中可以实验性地监测癌症的演变。PDXs是通过在合适的动物宿主中植入并培养患者的肿瘤细胞而建立的癌症模型。在大多数情况下，接受者是植入了人类免疫系统的免疫缺陷小鼠。这些模型已成为研究人类免疫与癌细胞之间分子相互作用的有用实验工具。特别是，这些模型在基础研究中变得非常吸引人，以了解癌症进展和转移的方面。此外，PDXs经常用于临床前癌症研究，以识别新的预测性癌症生物标志物，测试癌症药物的效力，调查肿瘤内异质性和克隆动态，评估个性化治疗选择，并测试一般的转化假设。 所有这些更紧密地模拟细胞微环境的先进细胞培养技术如今已成为基础和临床研究的一个组成部分。然而，使用这些来自患者的模型(PDMs)需要广泛的专业知识、培训和质量控制。为了促进相应模型的发展，已建立了几个国际财团，旨在生成具有相关基因组和临床数据的新型人类肿瘤衍生的培养模型。国家癌症研究所(NCI)和人类癌症模型倡议(HCMI)已启动代表性倡议。 10.清洁和消毒  生物安全取决于实验室的清洁度。一般指南是严格遵循所有可能的安全规则。忽视或未能遵守任何安全规定可能导致与实验室相关的感染和环境污染。因此，需要通过对在实验室操作中使用的生物制剂进行消毒来降低生物风险。 在适当的废物管理中，应尽可能适当验证灭活方法。原则上，消毒有四个主要类别，即(i)通过热量进行消毒，(ii)用液体消毒，(iii)通过蒸汽和气体消毒，以及(iv)暴露于紫外线辐射。 高压蒸汽灭菌是消毒实验室材料和灭活或消毒生物制剂的最有效和可靠方法。这是一种使用高压水蒸汽进行消毒的方法，是培养基、玻璃器皿和移液管尖端消毒的首选方法。然而，必须保持足够的高温和压力一段时间，这也保证了孢子的灭活。通常，在121°C下高压蒸汽灭菌60-90分钟足以实现废物温度至少115°C持续20分钟。此外，只有受过培训的个人才能操作和维护高压蒸汽灭菌器，并且应定期通过生物指示剂检查高压蒸汽灭菌的成功。重要的是，接受高压蒸汽灭菌的废物或材料应放置在容器或密封的高压蒸汽灭菌袋中，以允许良好的热量穿透[98]。不应将危险化学品或放射性废物进行高压蒸汽灭菌。在防穿刺容器中收集受污染的解剖刀片、皮下注射针头、刀具和碎玻璃，并盖上盖子。在卫生水处理前，应先对大量液体废物和受污染的培养基进行消毒。 化学消毒通常是表面和家具消毒的首选方法。为了获得消毒剂的最佳效果，必须考虑几个因素。首先，消毒剂应对要去除的生物制剂具有特异性。第二，消毒剂应适合应用领域，因为当应用于表面或液体时可能会有显著的活动差异。最后，消毒剂在一般应用条件（例如，所需的接触时间、工作浓度）以及在其他影响因素（例如，酸、有机负荷）存在时的有效性可能会有所不同。 在封闭系统中应用的类似蒸汽和气体可以提供出色的消毒效果。一些实验室使用过氧化氢、二氧化氯、戊二醛、对甲醛、环氧乙烷和过氧乙酸的气溶胶来消毒生物安全柜或孵化器。然而，所有这些化学品都是危险的，使用这些物质进行消毒应只有经验丰富的受过培训的人员进行。 最后，暴露于紫外线(UV)辐射可以有效地破坏大多数微生物。特别是，UV-C光（光谱范围：100-280纳米），被大气吸收，对广泛范围的微生物具有最大的破坏力。因此，这个UV区域通常用于生物安全柜中，以减少表面污染。然而，暴露于UV可能导致操作员的眼睛和皮肤灼伤，因此应谨慎使用。因此，对于细胞培养初学者来说，在开始使用UV-C辐射设备进行清洁和消毒之前，建议接受专家的理论和实践培训。 11.结论  细胞培养在生物医学研究中扮演着重要角色。然而，细胞误识别、种内和种间交叉污染以及细菌感染、真菌、酵母或病毒的污染可能导致致命后果和科学文献的污染。因此，在每个使用细胞培养的实验室中，应强制进行定期污染检测和细胞鉴定测试。通过多种具有杀菌或杀菌作用的组分，可以有效地去除细菌、霉菌和酵母的生物污染。ICLAC错误识别细胞系的登记册和相关的Cellosaurus知识资源是极其重要的知识资源，并提供了诸如CLASTR等有用的搜索工具，用于比较STR配置文件。此外，实施良好的细胞培养实践和无菌技术对于提高细胞培养安全性、促进可复制的科学数据的产生以及促进不同实验室建立的结果的可比性至关重要。此外，适当的员工培训和标准化文档记录和报告细胞培养程序是进一步提高细胞培养实验室工作质量和安全的有效手段。最近，在生成更具生理相关性的PDMs，如PDOs和PDXs方面的进展已经彻底改变了常见的细胞培养方法，并帮助更好地理解人类生物学和病理生理学。在这方面，CR是一种有吸引力的技术，可以用于快速高效地建立来自患者的细胞培养，用于基础和临床研究，并进一步显著替代基于动物的研究。然而，应该记住，设计得最好、工程最精良的细胞培养实验室也只和其中最不胜任的工作者一样好。 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 时间：2024年10月16-17日 地点：上海张江（酒店定向通知） 规模：600-800人 主办单位：生物制品圈、抗体圈 演讲支持：Entegris、瑞孚迪、AS ONE CORPORATION 会议费用：免费FREE!（仅收取100元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），先到先得，报完即止！ 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！ 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 日程安排 更多嘉宾正在邀请中 第一届精彩回顾 第二届精彩回顾 第三届精彩回顾 第四届精彩回顾 第五届精彩回顾 第六届精彩回顾 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。