Rosuvastatin Zinc

● 前 言 乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）是ATP结合盒（ATP binding cassette, ABC）转运蛋白家族G亚家族中的重要成员，在人体肠、肝和脑等重要器官中均有表达[1]，对小分子药物具有“药泵”作用，改变药物的吸收、分布和排泄，进而影响药效及安全性[1]。药物（包括BCRP的底物和抑制剂）与BCRP作用，可能导致药物相互作用（drug‑drug interaction，DDI），也会影响药效或产生毒副作用。鉴于体外与临床DDI的相关性，美国食品和药物管理局（FDA）、欧洲药品管理局（EMA）以及中国国家药品监督管理局（NMPA）等监管机构及国际人用药品注册技术协调会（ICH）均在指导原则中推荐，通过体外模型评估在研药物是否为BCRP的底物[2-5]。本文将介绍药明康德DMPK开发的一种基于Caco‑2细胞模型的新颖的BCRP底物评估方法，该方法不仅克服了传统方法的局限性，更提高了测试的灵敏度及准确性。 基于Caco-2细胞的传统BCRP底物评估模型 工业界广泛采用细胞双向渗透模型评估在研药物是否为BCRP的底物，Caco‑2细胞为常用模型之一[2-5]。Caco-2细胞是一种人的结肠癌细胞，经特定培养，细胞间会紧密连接并分化为与人小肠细胞形态和功能极为相似的细胞，表达多种转运体，如P-糖蛋白（P‑gp）和BCRP等。 在BCRP底物评估实验中，Caco-2细胞接种于Transwell®细胞板中，经21-28天培养后用于实验。根据传统方法（图1），在含有或不含BCRP抑制剂时，将在研药物添加到单层细胞的顶端（apical，A）或基底端（basolateral，B），孵育一段时间后，检测被转运至接收端的药量。根据A-B（吸收）和B-A（流出）两个方向上的表观渗透率（apparent permeability，Papp），计算在研药物的外排率ER（efflux ratio）用于底物评估。 图1. 基于Caco-2细胞的传统BCRP底物评估方法的模型示例 同时满足以下两个条件，则表明在研药物可能为BCRP的底物： 1.不含抑制剂的外排率（ERa）≥2； 2.含有抑制剂的外排率（ERi）相较ERa下降50%及以上，即ERa/ERi>2。 Caco-2细胞可表达多种转运体，根据指导原则的建议[2-5]，开展在研药物BCRP底物评估时，需使用两种或更多已知的BCRP抑制剂来确证研究结果。由于Caco‑2细胞高表达P‑gp[6]，对既是BCRP底物又是P-gp底物的在研药物，当采用传统方法开展BCRP底物评估时，即使采用两种抑制剂进行BCRP底物评估，也可能会出现假阴性结果。比如拓扑替康（topotecan），一种喜树碱类抗癌药，文献报告其为P-gp和BCRP的双底物[7]，但在Caco-2细胞中采用传统方法进行BCRP底物评估时，却出现了假阴性结果：在含有及不含BCRP抑制剂新生霉素、柳氮磺胺吡啶时的ERa/ERi值均小于2（表1）。 表1. 在Caco-2细胞模型中采用传统方法对拓扑替康进行BCRP底物评估的结果 BCRP底物评估方法的优化 在Caco-2细胞中，拓扑替康受到BCRP及P-gp共同介导的外排转运作用。根据表1的数据，含有BCRP抑制剂新生霉素、柳氮磺胺吡啶时，拓扑替康的ERi值分别为38.1和44.8，超过不含抑制剂时ERa值的50%，这表明P-gp对拓扑替康外排转运的贡献大于BCRP。在这种情况下，P‑gp转运体可能会影响BCRP底物的评估，表现出假阴性结果。针对这种情况，我们对传统方法进行了优化，在实验体系中添加P-gp的抑制剂，抑制P-gp的转运活性，降低其对BCRP底物评估的影响（图2）。该方法已提交中国专利申请，申请号为202311673349.7。 图2. 传统方法与优化方法的实验原理对比 采用优化方法对拓扑替康进行BCRP底物评估实验，结果见表2，通过P-gp抑制剂唑喹达抑制P-gp，在含有及不含BCRP抑制剂新生霉素、柳氮磺胺吡啶时，拓扑替康的ERa和ERa/ERi的值均大于2，因此，在优化的Caco-2细胞模型中，拓扑替康能够被正确评估为BCRP的底物。 表2. 在Caco-2细胞模型中采用优化方法对拓扑替康进行BCRP底物评估的结果 传统方法与优化方法的对比 结合文献报道[3,7,8,9]，我们选择了2种BCRP底物，以及9种BCRP/P-gp双底物，在Caco‑2细胞中分别采用传统及优化方法进行BCRP底物评估，如表3所示，出现了三种情况。 表3. 模型化合物的验证结果 以雌酮3-硫酸盐（estrone-3-sulfate）为例，该化合物是BCRP的底物，但不是P-gp的底物，因此，在进行BCRP底物评估时，不受P-gp影响。采用传统方法和优化方法均能得到雌酮3‑硫酸盐是BCRP底物的结论（表4）。 表4. 雌酮3-硫酸盐的BCRP底物评估实验结果 以瑞舒伐他汀（rosuvastatin）为例，该化合物是BCRP/P-gp的双底物,但P-gp对其外排转运的贡献小于BCRP（在传统方法中，含有BCRP抑制剂时，瑞舒伐他汀的ERi值低于其不含抑制剂时ERa值的50%），因此，P-gp对瑞舒伐他汀BCRP底物评估影响相对小，采用传统方法和优化方法均能得到其是BCRP底物的结论，但在优化方法得到的ERa/ERi值更大，表明优化方法比传统方法的测试灵敏度高（表5）。 表5. 瑞舒伐他汀的BCRP底物评估实验结果 以SN38为例，该化合物是BCRP/P-gp的双底物，但P-gp对其外排转运的贡献大于BCRP（在传统方法中，含有BCRP抑制剂时，SN38的ERi值高于其不含抑制剂时ERa值的50%）。在Caco-2细胞中，采用传统方法得到SN38不是BCRP底物的假阴性结论，而采用优化方法则能准确地将其评估为BCRP的底物，表明优化方法比传统方法的测试准确性好（表6）。 表6. SN38的BCRP底物评估实验结果  小 结 相较于传统方法，优化的BCRP底物评估方法通过在实验体系中添加P-gp的抑制剂，可降低P-gp转运体对BCRP底物评估的影响，提高基于Caco-2细胞模型的BCRP底物评估的灵敏度和准确性，减少假阴性结果。 结 语 药明康德DMPK在转运体介导的药物相互作用研究领域积累了丰富的经验。目前已成功建立了7种ABC转运体（P-gp、BCRP、BSEP、MRP1/2/3/4）以及12种SLC转运体（OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1、OAT1、OAT3、OCT1、OCT2、MATE1、MATE2-K、PEPT1、PEPT2和NTCP）的评价模型，覆盖了各大监管机构推荐的所有与药物可能会发生相互作用的转运体类型，不仅可以进行底物与抑制的评价，也可以开展转运体底物Km和Vmax及转运体抑制剂Ki的测定，为药物相互作用评估提供了更准确的临床前依据，助力客户新药研发项目。 参考文献： [1] Morrissey KM, Wen CC, Johns SJ, Zhang L, Huang SM, Giacomini KM, "The UCSF-FDA TransPortal: A Public Drug Transporter Database", Clinical Pharmacology and Therapeutics (2012) 92(5):545-6. [2] National Medical Products Administration (NMPA). 药物相互作用研究技术指导原则 Published 2021. [3] U.S. Food and Drug Administration (FDA). Guidance for Industry: In Vitro Drug Interaction Studies —Cytochrome P450 Enzyme- and Transporter-Mediated Drug Interactions Published 2020. [4] European Medicines Agency (EMA). Guideline on the Investigation of Drug Interactions Published 2013. [5] International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH). DRUG INTERACTION STUDIES M12 Published 2024. [6] Nathalie Maubon, Marc Le Vee, Analysis of drug transporter expression in human intestinal Caco-2 cells by real-time PCR, Fundamental & Clinical Pharmacology 21 (2007) 659–663 [7] Béatrice Marquez and Françoise Van Bambeke, ABC Multidrug Transporters: Target for Modulation of Drug Pharmacokinetics and Drug-Drug Interactions, Current Drug Targets, 2011, 12, 600-620 [8] Jin H, Di L. Permeability--in vitro assays for assessing drug transporter activity. Curr Drug Metab. 2008 Nov;9(9):911-20. doi: 10.2174/138920008786485056. PMID: 18991588. [9] Yoko,Nagai,Masataka,et al.Comprehensive preclinical pharmacokinetic evaluations of trastuzumab deruxtecan (DS-8201a), a HER2-targeting antibody-drug conjugate, in cynomolgus monkeys[J].Xenobiotica; the fate of foreign compounds in biological systems, 49(9):1086-1096[2024-01-13].DOI:10.1080/00498254.2018.1531158.  （下滑查看更多） 作者：陈全，王丽君，熊涛，陈根富 编辑：富罗娜·克里木，钱卉娟 设计：倪德伟，张莹莹 推荐阅读 药明康德DMPK  依托在中国（上海、苏州、南京和南通）和美国（新泽西）的研发中心，提供从早期筛选、临床前开发、到临床研究阶段的综合型药代动力学服务，助力您快速推进药物研发流程。拥有上千人的研发团队，服务超1600家全球客户，具有超过十五年的新药申报经验，已成功支持超过1500个新药临床研究申请（IND）。  免责声明：药明康德DMPK团队专注于分享药物代谢与药代动力学相关领域进展和研究经验总结。本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表药明康德立场，亦不代表药明康德支持或反对文中观点。本文也不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。 版权说明：本文来自药明康德DMPK团队，欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。转载授权请在「药明康德DMPK」微信公众号回复“转载”，获取转载须知。 往期链接 “小小疫苗”养成记 | 医药公司管线盘点  人人学懂免疫学 | 人人学懂免疫学（语音版）    综述文章解读 | 文献略读 | 医学科普 | 医药前沿笔记 PROTAC技术 | 抗体药物 | 抗体药物偶联-ADC 核酸疫苗 | CAR技术 | 化学生物学 温馨提示 医药速览公众号目前已经有近12个交流群（好学，有趣且奔波于医药圈人才聚集于此）。进群加作者微信（yiyaoxueshu666）或者扫描公众号二维码添加作者，备注“姓名/昵称-企业/高校-具体研究领域/专业”，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。 简单操作即可星标⭐️医药速览，第一时间收到我们的推送 ①点击标题下方“医药速览”   ②至右上角“...”  ③点击“设为星标