4-Phenylbutyrate

编者按： 从 PLP1 错误折叠到少突胶质细胞变性：以蛋白稳态为核心的佩梅病框架 李天怡1，黄浩2，李晓斌1，冷润林1，刘彬彬1，杨国华1,* 1 武汉大学基础医学院医学遗传学系，武汉 430071，中国 2 武汉科技大学 湖北省职业危害识别与防控重点实验室，武汉 430065，中国 * 通讯作者：杨国华 武汉大学副教授 邮箱：ghyang@whu.edu.cn    专家简介：https://wbm.whu.edu.cn/info/1350/5988.htm 收稿日期：2026年6月21日；修回日期：2026年7月19日；接受日期：2026年7月22日；发布日期：2026年7月23日 版权：© 2026 作者所有。许可方 MDPI（瑞士巴塞尔）。本文为MDPI旗下《cells》 期刊开放获取文章，依据知识共享署名（CC BY）许可协议条款分发。 佩梅病（PMD）专题综述亮点总结： 1.主要发现有哪些？ •中枢神经系统髓鞘核心组分蛋白脂质蛋白1（PLP1 ）的错误折叠引发一系列蛋白稳态缺陷，涉及内质网（ER）滞留、异常寡聚化以及蛋白降解通路失调。   • 慢性内质网应激、适应不良的未折叠蛋白反应（UPR）激活以及氧化还原（redox）稳态崩溃，直接促成佩梅病（PMD）中少突胶质细胞功能障碍与髓鞘缺失。 2.这些主要发现的临床意义是什么？ • 以蛋白稳态为核心的模型，将突变 PLP1 的分子缺陷与 PMD 各表型的细胞病理及临床异质性联系起来。 • 恢复蛋白稳态与内质网稳态，可能为 PMD 及相关脑白质营养不良提供疾病修饰的治疗机会。摘要 少突胶质细胞（OL）是中枢神经系统（译者注：主要对应脑和脊髓）中的髓鞘形成细胞。PLP1 基因主要在 OL 中表达，编码蛋白脂质蛋白（PLP），后者是中枢神经髓鞘的主要结构成分，同时调控少突胶质前体细胞（OPC）的增殖、分化与成熟。佩梅病（PMD）是一种由 PLP1 突变引起的罕见 X 连锁脑白质营养不良，以髓鞘形成缺陷为特征。其临床表现从严重的先天型 PMD，到经典型 PMD，再到较轻的痉挛性截瘫 2 型（SPG2），呈现出显著的表型异质性。除破坏髓鞘结构外，PLP1 突变还损害少突胶质细胞的发育与功能。越来越多的证据表明，PMD 本质上是一种蛋白稳态紊乱性疾病：错误折叠的 PLP 在内质网（ER）内累积，超出 ER 质量控制机制的负荷，并触发慢性未折叠蛋白反应（UPR）激活。持续的内质网应激与适应不良的 UPR 信号传导，最终促进少突胶质细胞功能障碍与变性。本综述以 PMD 为代表模型，总结 PLP1 突变与疾病表型之间的关系，并讨论内质网应激与 UPR 信号如何促成少突胶质细胞病理的机制。 关键词：佩梅病（Pelizaeus-Merzbacher disease）；少突胶质细胞（oligodendrocyte）；蛋白脂质蛋白 1（PLP1）；未折叠蛋白反应（unfolded protein response）；蛋白稳态（proteostasis）；内质网氧化还原酶 1 alpha（ERO1α）1. 引言 1885 年，德国医生 Friedrich Pelizaeus 首次描述了一类以眼球震颤、发育迟缓、痉挛性截瘫与共济失调为主要特征的家族性疾病[1]。随后，1910 年 Ludwig Merzbacher 证实了该病的 X 连锁隐性遗传模式[2]，该病后来被命名为佩梅病（Pelizaeus--Merzbacher disease, PMD）。 在本综述中，我们首先总结调控 PLP 生物合成、转运与髓鞘组装的分子调节因子，继而讨论不同的 PLP1 突变如何破坏 ER 蛋白稳态并激活适应不良的 UPR 信号，最终导致少突胶质细胞（OL）功能障碍与脱髓鞘。最后，我们重点介绍针对恢复蛋白稳态与调节内质网应激的新兴治疗策略。1.1. PMD 的病理特征 PMD 的神经病理特征主要表现为中枢神经系统内广泛的髓鞘形成不足（hypomyelination）与白质萎缩，伴随星形胶质细胞增生与皮质下轴突变性，存活的轴突常出现球形肿胀[3]。宏观上，脑萎缩以胼胝体变薄最为明显，但端脑与小脑也常受累。显微镜下可见多个脑区出现神经元丢失，尤以小脑为著，海马、黑质-纹状体与丘脑也常受累。整体而言，受累白质中含有形态异质的"髓鞘岛"，其分布与疾病严重程度相关：重症患者脑白质几乎完全无髓鞘化，而轻症患者中央白质呈现特征性的"虎斑样"（tigroid-like）改变[3]。组织化学染色进一步显示，星形胶质细胞胞质中弥散分布着大量中性脂滴，提示 PMD 可能伴随髓鞘脂蛋白或相关脂质代谢异常。在脊髓，丘脑-小脑束与前脊髓小脑束受累相对较轻，而皮质脊髓束、背侧束、背外侧束与背侧脊髓小脑束则可见明显的髓鞘异常[4]。 1.2. PMD 的表型：临床特征 PMD 的临床起病与表现因基因型而异，差异显著。多数患者表现为眼球震颤、运动功能障碍（通常从肌张力低下进展为痉挛性截瘫）、共济失调、肌张力障碍与认知损害。合并严重运动功能障碍相关呼吸并发症的患者可在幼年期死亡。先天型 PMD 是该病最严重的类型，通常在 20 岁前致死；而经典型 PMD 相对较轻，患者常可存活至三四十岁至七八十岁。PMD 的轻症形式常表现为痉挛性截瘫 2 型（SPG2）或早髓鞘化结构髓鞘形成不足（HEMS）。 PMD 的临床谱系高度异质，涵盖婴幼儿期或儿童早期出现的眼震、肌张力低下、精神运动迟缓（常伴智力障碍）、共济失调、癫痫以及痉挛性截瘫[5]。即便是同一家族中的患病人群，也可出现显著的表型差异。神经系统症状通常遵循特征性的进展模式：眼球震颤常在出生后第一年内出现，部分患者在神经系统成熟过程中继而出现喉鸣与癫痫[6]。疾病严重程度差异很大，从致死性婴儿型到进展缓慢、不显著缩短寿命的表型均有。精神运动迟缓通常在 2 岁前出现，运动损害通常比认知功能障碍更严重[7]。 肌张力障碍与共济失调在 6 月龄至 2 岁间逐渐出现，腱反射亢进通常在 1 岁后发生，痉挛期通常出现在 2 至 4 岁，而共济失调症状可能持续至约 8 岁[7]。值得注意的是，近期研究表明 PMD 也可能累及外周神经系统，表现为腱反射减弱或消失、神经传导速度异常、明显肌萎缩与四肢发冷，从而挑战了 PMD 仅局限于中枢神经系统的传统观点[8]。此外，视神经萎缩是常见但异质的并发症，通常在约 6 岁时确诊。电生理检查常显示视觉诱发电位（VEP）波幅降低、潜伏期延长及波形畸变[9]；部分患者还出现听觉脑干反应（ABR）异常与前庭功能障碍[10]。作为一种代表性的遗传性白质营养不良（HLD），PMD 在放射学上以 T2 加权磁共振成像（MRI-T2WI）上脑白质弥漫性高信号、灰质几乎不受累为特征，反映髓鞘形成受损[11-13]。 Cailloux 及其同事建立了 PLP1 相关疾病（Form 0--4）的连续分类系统，该系统遵循严格的层级递进关系[7]（图 1）。 图 1. PMD 谱系内的不同表型分类、相应的连续分类系统，以及各亚型所对应的 PLP 突变类型。Form 0 代表最严重表型，患者终身完全丧失运动功能；Form 1 患者仅保留头部控制能力；Form 2 患者可独立端坐；Form 3 患者可在扶持下站立；Form 4 对应最轻亚型痉挛性截瘫 2 型（SPG2），患者保留独立行走能力。2. PMD 发病的分子决定因素2.1. 髓鞘组装与稳定的分子调节因子2.1.1. PLP 与 DM20 的作用 PLP1 基因在细胞核内转录，产生主要蛋白产物 PLP 及其可变剪接异构体 DM20。DM20 在胚胎早期髓鞘形成启动前即已表达，主要存在于少突胶质前体细胞（OPC）中，是 OL 谱系的早期标志物，除参与髓鞘形成外，还参与神经元迁移与胶质分化[14]。 临近出生时，DM20 逐渐在髓鞘中累积，而 PLP 最初滞留于未成熟 OL 的晚期内体/溶酶体中。随着 OL 成熟，PLP 迅速从晚期内体/溶酶体转运至质膜，伴随内吞减少与外排增强[15]。在围产期与活跃髓鞘形成期，DM20 表达相对稳定，而 PLP 表达显著升高并最终超过 DM20，成为成熟髓鞘中的主要蛋白。DM20/PLP 之比在发育过程中受到严格调控。髓鞘形成完成后，PLP 在成熟 OL 中持续表达以维持髓鞘完整性。发育过程中，DM20 也表达于外周神经系统的施万细胞（Schwann cells）。 围产期由 DM20 向 PLP 的剪接比例转换，由 OL 成熟程序与发育调控的 PLP1 前体 mRNA 可变剪接协调完成。反式作用剪接因子 hnRNP H/F 表达的发育性下降，通过减少 DM20 剪接异构体、促进增加 PLP 剪接异构体，驱动由 DM20 向 PLP 的发育转换[16,17]。 PLP1 在髓鞘组装与稳定中的首要作用，是通过其胞外环介导相邻髓鞘膜外表面的黏附，从而稳定周期线（intraperiod line，IPL）并使髓鞘层致密化[18]。其次是代谢性保护轴突：缺失 PLP1 会导致轴突进行性肿胀与变性[19]。各类 PLP1 突变引起程度不同的 OL 功能障碍与死亡，从而阻断髓鞘组装。相比之下，DM20 的主要作用是调控 OL 成熟[20]。在 jimpy 小鼠中，仅表达 PLP 转基因无法使 PLP 整合入髓鞘膜（下节讨论）；部分髓鞘形成需要 PLP 与 DM20 的共同表达[21]。DM20 可支持基本的髓鞘致密化与周期线（IPL）组装，但缺乏 PLP 的胆固醇结合、线粒体代谢调控及长期轴突支持能力[22]。 在中枢神经系统（CNS）髓鞘中，PLP/DM20 是最丰富的蛋白成分，其次为髓鞘碱性蛋白（MBP）、2′,3′-环核苷酸 3′-磷酸二酯酶（CNPase）与少突胶质细胞特异性蛋白（OSP）/Claudin-11。OSP/Claudin-11 与 PLP 在维持 CNS 髓鞘结构中发挥关键且部分冗余的结构与功能作用。在单敲除模型中，互补蛋白表达上调（PLP 上调 48%，OSP 上调 43%），部分补偿缺陷，导致相对较轻的表型。相反，双敲除小鼠出现髓鞘致密化受损、放射状成分紧密连接与轴突-髓鞘相互作用严重破坏、正常髓鞘化轴突缺失以及轴突直径显著减小，表明这些发现凸显了适当的髓鞘致密化在轴突发育与轴突口径长期维持中的重要性[23]。这些发现或可解释为何女性杂合携带者常表现为轻度甚至无症状表型。2.1.2. 髓鞘形成中的其他必需因子 在髓鞘形成过程中，Sirtuin 2（SIRT2）与 Quaking（QKI）均发挥关键的调控作用：QKI 通过结合 MBP mRNA 的 3′ 非翻译区（3′UTR），维持其在细胞质中的稳定性并促进其定位于髓鞘，QKI 功能缺陷导致 MBP mRNA 表达显著降低[24]。SIRT2 主要定位于髓鞘的非致密部分及少突胶质细胞突起，尤其位于结旁与近结终端环。SIRT2 通过使 α-微管蛋白去乙酰化，负向调控 OL 分化，在髓鞘形成中充当分子"刹车"[25]。有趣的是，QKI 还通过 PLP 间接调控 SIRT2 蛋白丰度及其向髓鞘的转运。缺失 QKI6 导致 PLP mRNA 显著降低，而 DM20 表达基本不变[26]。 在髓鞘形成之前，PLP 的缺失不影响 SIRT2 表达或少突胶质细胞的形态分化，表明 PLP 主要在成熟髓鞘中而非 OL 发育早期调控 SIRT2[26]。 Sema6A 通过其胞质域介导的细胞内信号，作为 OL 分化与髓鞘形成的正调控因子。Sema6A 缺陷小鼠在体与离体均表现出 OL 分化显著延迟，以 PLP、髓鞘相关糖蛋白（MAG）与 MBP 阳性细胞数量减少及成熟受损为特征，但这些缺陷在成年后逐渐恢复，提示存在代偿机制。此外，在铜腙（cuprizone）诱导的脱髓鞘模型中，Sema6A 在病变区 Olig2 阳性的 OL 谱系细胞中显著上调，进一步支持其促进 OPC 分化为成熟 OL、增强突起延伸与轴突成鞘、并促进内源性再髓鞘化的作用[27]。 髓鞘与淋巴细胞蛋白（MAL）是 MAL 蛋白家族成员，是一种含四个跨膜结构域的高度疏水性整合膜蛋白。MAL 主要调控 PLP 在特定膜微区中的膜分布与侧向组织[28]。MAL 在髓鞘形成晚期与髓鞘维持过程中，稳定特殊膜微区中的 PLP，从而促进 PLP 整合入不断扩展的髓鞘，而不依赖复杂的囊泡转运通路。值得注意的是，MAL 缺陷同样产生类似 PMD 的病理特征[29]。 综上，这些调节因子协调 OL 成熟、膜转运与髓鞘稳定的多个阶段。这些观察提示，PLP 相关的脑白质营养不良在结构上以致密髓鞘形成受损为特征，在细胞水平上以少突胶质细胞稳态的广泛破坏为特征，后者促成髓鞘组装与致密化缺陷。2.2. PMD 中的基因型-表型相关性 在 PMD 研究的早期阶段，通过广泛研究鉴定出若干具有严重先天表型的小鼠模型，包括点突变模型 jimpy 与 jimpy-msd（以下简称 msd）[30,31]。后续研究显示，jimpy 与 msd 突变代表不同的突变类型；尽管如此，二者均导致 OL 加速死亡、成熟少突胶质细胞大量丢失与严重髓鞘形成不足[32,33]。一致地，另一个点突变模型 SPG-2（对应于 jimpy-rsh（rsh）小鼠模型）表现出相对较轻的表型[34,35]。 PLP1 基因的突变谱包括基因重复、点突变以及小的插入或缺失。流行病学研究显示，基因重复是最常见的突变类型，约占病例的 60--70%。PLP1 重复片段的大小与 PMD 患者的疾病严重程度密切相关，因为剂量依赖性的 PLP 过表达破坏细胞内转运与脂筏组装，最终导致 OL 功能障碍[36]。位于重复区域内的其他剂量敏感性基因也参与了疾病发病[37]。然而，五倍重复并未产生比三倍重复更严重的表型，提示存在剂量上限阈值[38]。点突变是第二常见的突变类型，约占 25--30%。这些突变包括错义、无义、移码、剪接位点与内含子突变，并与从相对轻微的 SPG2 型到最严重先天表型广泛的表型谱相关[39]。小的插入或缺失相对少见，占病例不足 5%。值得注意的是，携带某些功能缺失（loss-of-function）突变（包括无义、移码、剪接位点或缺失突变）的患者常表现为相对轻度的 SPG2 表型[40,41]。 改变 PLP/DM20 表达比的剪接位点突变或剪接调控元件突变，也可导致严重程度各异的疾病表型[42]。一致地，PLP1 外显子 3B 与内含子 3 的突变破坏外显子剪接沉默子（ESS），改变 RNA 二级结构，并干扰长程内含子相互作用（LDI）。这些异常显著降低 PLP1/DM20 之比，最终导致 HEMS 表型[43]。PLP-ISEdel（内含子剪接增强子缺失）突变模型通过删除 PLP1 基因内含子 3 中的一个内含子剪接增强子（ISE）序列而产生，导致正常剪接异构体比反转，以 PLP 表达降低、DM20 表达升高为特征。该模型再现了人类轻度 PMD 相关的遗传学改变。突变小鼠在 2 月龄时即表现出行为学表现受损，但在 2 至 4 月龄间未观察到显著恶化。然而，4 月龄后，轴突运输缺陷逐渐加重，并伴星形胶质细胞（GFAP）与小胶质细胞（IBA1、CD68 与 MHCII）显著激活以及进行性胶质增生。这些发现提示，神经炎症独立于少突胶质细胞髓鞘缺陷参与 PMD 病理，因而可能成为一个治疗靶点[44]。 OL凋亡在PMD重症中起贡献作用，但髓鞘形成不足与OL死亡部分解耦，它们是可分离的病理过程。首先，重症 PMD 导致 OL 凋亡，在 msd 小鼠中 OL 细胞死亡增加 2 至 3 倍，并以凋亡方式发生。关键的是，在 OL 死亡时，它们已经分化、伸出接触轴突的突起，并表达髓鞘结构蛋白—意味着这些细胞已足够成熟以进行髓鞘化，但在完成髓鞘化前即死亡[45,46]。其次，轻度 PMD 表现为髓鞘形成不足但不伴异常凋亡；轻症标志是髓鞘形成不足，即 OL 正常分化，但合成适当厚度髓鞘鞘的效率低下[46,47]。令人惊讶的是，增加 OL 存活并不能恢复后续的髓鞘化，揭示出第二个病理阶段—一个相对独立于 OL 存活的髓鞘化失败阶段[48]。这是因为天然髓鞘化不仅需要少突胶质细胞存活，还需要 PLP 与 DM20 的适当表达与功能。 重要的是，相同的突变在不同遗传背景下可产生显著不同的表型，凸显了遗传背景对疾病严重程度的决定性影响[49]。3. PLP 的生物合成与功能3.1. PLP 的修饰与加工 PLP1 基因由七个外显子组成，编码序列跨越 834 bp，编码一个 277 个氨基酸的蛋白。该基因位于 X 染色体 Xq21.1，跨度约 17 kb，编码一个含四个跨膜结构域的髓鞘蛋白。外显子 3 内的可变剪接通过删除该外显子后段生成 DM20 异构体。因此，PLP 含有一个额外的高度保守的 35 个氨基酸胞内环区，该区域在 DM20 中缺失（图 2）。尽管 DM20 在成熟髓鞘中是次要异构体，但它是 OPC 与髓鞘前少突胶质细胞（pre-OL）发育阶段的主要转录本。 图 2. PMD 相关 PLP1 突变沿 PLP（Uniprot ID: P60201）蛋白结构的分布。示意图展示人蛋白脂质蛋白 1（PLP1）的拓扑结构，PLP1 是中枢神经系统髓鞘的主要组成成分，突出显示了疾病相关突变的位置。PLP1 含有四个跨膜结构域（TMR1--TMR4，标注 1--4）、胞外与胞质环，以及以紫色显示的 PLP 特异性胞内区。突变按临床严重程度分类：轻度（蓝色）、中度（橙色）、重度（红色）。保守二硫键以绿色标记并与红色实线结合显示，外显子连接处以箭头表示。膜内嵌入的黑色锯齿线代表 PLP 的棕榈酰化位点，这是一种对膜结合与髓鞘稳定重要的翻译后修饰。致病变异分布于蛋白各处，但在跨膜段与胞外域内尤为富集,这些区域对正确折叠、转运与膜整合至关重要。重度突变在这些结构重要区域的聚集，支持 PLP1 错误折叠与蛋白稳态破坏是 OL 功能障碍及 PMD 表型谱关键致病机制的观念。 PLP 是一个定位于髓鞘膜的四个跨膜结构域蛋白，是髓鞘鞘中最丰富的蛋白之一。作为一种整合膜蛋白，PLP 由与 ER 结合的核糖体合成。新生 PLP 多肽在翻译中共转运至粗面 ER，并在合成过程中进入 ER 腔。其四个高度疏水的跨膜结构域依次插入 ER 膜，N 端与 C 端均朝向胞质，而两个胞外环（EC1 与 EC2）朝向 ER 腔[50,51]。PLP 经历脂化（S-棕榈酰化）与二硫键形成，以在髓鞘膜内维持其结构完整性与功能稳定性[52--54]（图 2）。与许多膜蛋白不同，PLP 不发生酶促糖基化[55]。然而，病理条件可能诱导 PLP 的非酶促糖基化[56]。棕榈酰化与 PLP 的固有构象促进其进入富含胆固醇与鞘脂的脂筏微区，这一过程对髓鞘组装与稳定至关重要。突变型 PLP 与 PLP 过表达均破坏细胞内转运并损害 PLP 与脂筏的整合[40,57,58]。 PLP 的拓扑组织高度依赖于二硫键形成，主要位于第二胞外环（EC2）。通常形成两对主要二硫键：Cys200--Cys219 与 Cys183--Cys227。胞质区的 Cys108 尤为重要，除发生棕榈酰化外，它还通过一种保守的结构机制调控 PLP 构象[59]。这一构象变化暴露 Cys108 并促进 PLP 分子间二硫键形成，从而促进寡聚化[60]。相应地，TM1 内的三个自由半胱氨酸残基对 PLP 的正确组装至关重要，其突变会导致蛋白错误折叠、ER 滞留与构象表位丢失。 由于 PLP 不发生酶促糖基化，经典的钙连蛋白（CNX）介导的质量控制机制（通过识别单葡萄糖基化 N-聚糖来监控糖蛋白折叠）无法运作[61]。尽管如此，CNX 能够通过不依赖糖基的机制识别错误折叠的 PLP，与突变 PLP 形成稳定复合物，而其可溶性同源物钙网蛋白（calreticulin）则不与 PLP 发生相互作用[55]。CNX 能够将多跨膜膜蛋白中未组装的跨膜结构域识别为错误折叠状态，其与突变 PLP 的相互作用显著延迟 PLP 的转换。与糖蛋白质量控制中甘露糖修剪作为底物释放与降解的"开关"不同，CNX 与非糖基化蛋白的相互作用似乎更稳定而持久[55]。这在一定程度上解释了错误折叠 PLP 的 ER 滞留与降解减缓。 鉴于 PLP 复杂的折叠需求与膜插入，即便是细微的突变也能显著增加 ER 蛋白稳态系统的负荷，使少突胶质细胞尤其易受错误折叠蛋白累积的侵害。 这些观察将 ER 质量控制失败置于 UPR 激活的上游，并提示缺陷的蛋白稳态是少突胶质细胞病理的原发性驱动因素，而非继发性后果。 3.2. PLP 在髓鞘组装与维持中的作用 首先，OL 经历广泛的质膜特化以生成螺旋延伸的膜结构。该结构紧密包绕轴突，形成作为绝缘鞘的多层膜结构（图 3a）。由于单个 OL 同时髓鞘化多条轴突，此过程中的一大挑战是精确协调髓鞘膜合成与转运，以维持膜域组织并指导新生髓鞘鞘的定向延伸[62,63]。包括 PLP 在内的多种髓鞘蛋白，在质膜重塑过程中经历严格调控的内吞分选与再循环[64]。 PLP 寡聚化是致密髓鞘形成的关键决定因素。首先，PLP 通过棕榈酰化依赖的相互作用，稳定地锚定在 OL 膜富含胆固醇与鞘脂的脂筏微区中[65]。其次，PLP 在膜表面形成 SDS 抗性寡聚体，主要为二聚体。一层膜中的 PLP 二聚体通过其胞外结构域与相对膜层中的二聚体相互作用，从而形成跨膜的"拉链式"结构，使相邻膜层紧密并列（图 3a）。缺失 PLP 与 DM20 两者会导致周期致密线（intraperiod dense line）消失[66,67]。PLP 在中枢神经系统（CNS）髓鞘中的主要作用是结构稳定而非髓鞘组装，因为缺失 PLP 与 DM20 两者的少突胶质细胞（OL）仍能够正常分化、存活并形成髓鞘鞘[68]。然而，髓鞘周期线（IPL）表现出异常的致密化与显著下降的机械稳定性，最终导致患者迟发性、缓慢进展的轴突病，常伴脱髓鞘性周围神经病变[18,69]。值得注意的是，携带选择性影响 PLP 表达而保留 DM20 的 PLP1 突变的患者，其周围神经功能与电生理特征完全正常，表明在外周神经系统中，DM20 而非 PLP 是维持结构与功能完整性所需的关键异构体[70]。 图 3. (a) CNS 致密髓鞘排列示意图。周期线处的连接对应于冷冻电镜（cryo-EM）图像中所见。PLP（浅粉）与 DM20（青色）推测在髓鞘膜上形成顺式二聚体。MBP（绿色）在胞质小叶之间形成主致密线（major dense line）。引自 Ruskamo 等人 2022，依据知识共享署名 4.0 国际许可协议。(b) DM20/neo 小鼠（29 日龄）视神经横截面电镜图。(A，左) 野生型（XY）。本显微图中仅可见髓鞘化轴突；髓鞘鞘呈现规则的致密化，可见主致密线与周期致密线。(B，中) 杂合突变体（XX）。由随机 X 染色体失活导致的正常髓鞘化与松散包绕 OL 的镶嵌分布。(C，右) 半合子突变体（XY）。大直径轴突周围为非致密化、严重扭曲的髓鞘鞘；小直径轴突保持未髓鞘化。引自 Boison 与 Stoffel, Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91: 11709--11713。版权 © 1994 美国国家科学院[67,75]。 主致密线（MDL）的形成主要依赖 MBP，轴突-OL 相互作用诱导 MBP 的局部翻译[71]，这对髓鞘包绕的启动至关重要[72,73]。相比之下，IPL 的形成主要依赖 PLP。PLP 在膜内主要以二聚体形式存在，其胞外结构域（EC1 与 EC2）直接介导相邻膜层间的黏附，从而促进膜紧密堆叠[50]。通过稳定脂质双分子层，PLP 维持髓鞘鞘的高电阻、低电容特性，这对神经冲动的有效跳跃式传导至关重要[74,75]（图 3b）。 这些发现强调，PLP 的主要作用超越结构支持，PLP 组装与转运的扰动可对蛋白稳态与 OL 存活产生深远影响。4. 突变 PLP 的蛋白稳态控制4.1. 突变 PLP 的寡聚化与 ER 滞留 PLP 合成速率相对较快，翻译后约 30 分钟内即可在髓鞘鞘中检测到[76]。OL 的 ER 与分泌通路对细胞应激与扰动表现出显著的敏感性[77]。然而，突变 PLP 大量滞留于 ER 内[78]，阻止其向质膜的转运，最终导致 OL 凋亡[45]。在潜在致病机制中，错误折叠 PLP 在 ER 内的过早寡聚化被视为关键因素[79]。重症通常与错义突变或蛋白截短突变相关，而非 PLP 与 DM20 的完全缺失------因为缺失二者小鼠可正常寿命存活且不出现早死。这些发现表明，重症主要源于错误折叠 PLP 蛋白的毒性功能获得（toxic gain-of-function）效应。从机制上看，在 PMD 中，慢性蛋白毒性应激而非 PLP1 功能的简单缺失，被认为是少突胶质细胞变性的主要驱动因素，因为错误折叠 PLP 的持续累积压倒 ER 蛋白稳态并诱导适应不良的 UPR 激活。 总体而言，突变 PLP 的显性负效应（dominant-negative effects）是选择性的而非普遍性的。尽管突变 PLP 并不完全阻止野生型 PLP 或其他髓鞘蛋白（如 MAG 与髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG））向髓鞘鞘的正常转运与定位，但它确实破坏了特定基因与蛋白的正常表达模式与细胞内转运通路[57,80,81]。既往研究表明，PLP1 突变的严重程度与 PLP 在 ER 内的滞留程度以及 PLP 寡聚化的速率和程度正相关[79]。 疏水跨膜结构域（TM1--TM4）内突变诱导的过早寡聚化，并非主要由突变 PLP 胞外结构域内异常的二硫交联引起，尽管适当的胞外二硫键形成对 PLP 正确构象折叠仍必不可少[82]。相反，PLP 的四个疏水跨膜结构域是野生型蛋白正常寡聚化与组装的内在所需。在天然 PLP 单体中，TM4 相互作用界面被正确蛋白折叠所掩蔽。然而，msd 模型中鉴定的 A242V 突变破坏单体构象，暴露出涉及 Val242 的高亲和力疏水相互作用表面。这一构象改变驱动 PLP 异常的过早寡聚化，导致 ER 滞留与疾病发病。该机制解释了单个氨基酸替换如何产生严重的神经系统疾病[83]。类似地，TM1--TM3 区域也参与正常 PLP 二聚化，这些区域内的突变导致异常的二聚体形成[84]。 PLP 的 EC2 结构域内的致病突变诱导未配对半胱氨酸残基（包括 Cys200--Cys219、Cys183--Cys227 与 Cys108）之间的异常分子间交联，生成无功能的蛋白二聚体，在 ER 内累积并激活 UPR，最终导致 OL 死亡[85,86]。这些研究进一步表明，既往提出的胞质环内七氨基酸肽序列并非核心 ER 滞留信号[87]。位于膜近端的 Cys183 与 Cys227 之间的分子内二硫键对 ER 质量控制（ERQC）尤为关键，影响该区域的突变导致严重 ER 滞留。值得注意的是，替换 EC2-突变 PLP 中的 Cys200 与 Cys219 可部分逆转 ER 滞留[82]。 在 msd 模型中，涉及 EC2 胞外结构域四个关键半胱氨酸残基的突变仍导致显著的 ER 滞留与 SDS 抗性寡聚体的有效形成，表明 PLP 寡聚体稳定性主要依赖非共价相互作用[79]。更重要的是，突变 PLP 的过早寡聚化（而非单纯的 ER 滞留）似乎是重症表型的主要驱动因素。相应地，通过过早寡聚化生成的聚合物与 ER 质量控制蛋白（包括钙连蛋白（CNX））的相互作用，强于孤立的突变 PLP 寡聚体[79]。 综上，这些发现表明，突变 PLP 的过早寡聚化与 ER 滞留代表了启动少突胶质细胞蛋白稳态崩溃的核心致病事件。 4.2. PLP 的细胞内转运与降解4.2.1. 脂筏转运 在 OL 内，胆固醇与糖脂在 ER 与反式高尔基体网络（TGN）中发生相分离，形成称为"脂筏"的膜微区，PLP 经此整合入质膜[88,89]。在生理条件下，错误折叠蛋白被内质网质量控制（ERQC）系统识别、重折叠或降解，从而维持 ER 稳态。然而，PLP 突变或 PLP 过表达导致显著的 ER 滞留。进入 ER 的新生 PLP 立即与分子伴侣结合，包括 BiP、钙连蛋白以及蛋白二硫异构酶（PDI）家族成员，它们促进正确的蛋白折叠与二硫键形成[55,82,90]。未能正确折叠的蛋白被这些伴侣滞留于 ER 内，使正确折叠的蛋白在被转运至高尔基体（GA）并随后递送至质膜之前，获得额外的重折叠机会。 转运至高尔基体后，部分 PLP 直接分选入运输囊泡/管状中间体， destined for 再循环内体（REs），后者作为通过 VAMP3--Stx4 通路与胞体"顶表面样"质膜融合前的中间分选站[91,92]。正确形成"基底外侧表面样"髓鞘鞘需要 VAMP2 与 VAMP3 的协调作用；单独缺失任一者均不损害髓鞘形成（可能由于代偿机制），而同时缺失两者则导致严重髓鞘形成不足[93,94]。另一部分 PLP 可能通过非被膜囊泡或管状载体从反式高尔基体网络（TGN）直接转运至质膜，绕过再循环内体[95]。4.2.2. 内体再循环 递送至质膜后，部分 PLP 池被内吞进入内体系统，并通过 VAMP7--Stx3 依赖的通路转运至晚期内体/溶酶体（LE/Lys），在此被降解或储存至信号依赖的释放。PLP 的重新分布受涉及可溶性 Rho-GTP 酶失活的神经元信号通路调控，二丁酰-cAMP（db-cAMP）处理模拟神经元刺激并促进 PLP 向质膜转位[15,96,97]。总体而言，VAMP7--Stx3 通路对 PLP 高效整合入髓鞘鞘至关重要，因为抑制 Stx3 会导致 PLP 在细胞内累积。 由脑硫脂（sulfatide）通过脑硫脂磺基转移酶（CST）对半乳糖基神经酰胺（GalC）的硫酸化而生成，可触发 PLP 在质膜的构象与微区转换，使 PLP 从 TX-100 不溶性膜区转换为 CHAPS 抗性/不溶性区，促进随后的内吞与转运。脑硫脂还改变 PLP 表面构象，暴露 O10 表位。O10 表位的出现标志着 PLP 构象转换（ET3 → O10）的完成，使 PLP 准备好进入转向髓鞘鞘的穿胞转运通路。值得注意的是，在脑发育晚期，MAL 抑制这一构象转换，从而允许 PLP 从质膜侧向扩散直接进入髓鞘膜[28]。缺乏脑硫脂时，PLP 滞留于细胞表面，损害向髓鞘鞘的有效转运，从而破坏正常的髓鞘组装[98]。GalC 由神经酰胺半乳糖基转移酶（CGT）合成，在 OL 髓鞘膜中高度富集。GalC 缺失导致 PLP 转运与分选异常[88]。4.2.3. 溶酶体降解与 ERAD 介导的 UPS 野生型 PLP 主要通过溶酶体通路降解，而突变 PLP 主要通过蛋白酶体依赖性降解清除。更严重的突变与更慢的降解动力学及突变 PLP 在 ER 内更大累积相关[99]。当蛋白折叠反复失败或固有缺陷时，错误折叠 PLP 被导向 ER 关联降解（ERAD）通路[57,100]。由于 PLP 缺乏酶促糖基化修饰，突变 PLP 无法通过经典的 CNX/CRT 循环或 EDEM 介导的通路被有效识别[101]。错误折叠 PLP 随后通过逆向转位复合物（如 Derlin 复合物或 Sec61 通道）逆向转位穿过 ER 膜，并经泛素-蛋白酶体系统（UPS）降解。某些较轻的突变允许正常的 ER 与 GA 输出，但导致向溶酶体降解的过度误靶向，从而降低 PLP 的膜定位[102]。重复突变引起的 PLP 过表达导致 PLP 在晚期内体/溶酶体内累积，而无法有效转运至质膜[103]。其他突变（如 W162L）导致 PLP 异常定位于核膜（NE）周围，这与相对较轻的临床表型相关[104]。 有趣的是，Rab27b 通过控制晚期内体/溶酶体向质膜的外排来调节 PLP 转运，从而在 CNS 中贡献 OL 髓鞘化[105]。Rab7b 是另一个 Rab 家族 GTP 酶，介导从晚期内体/溶酶体向反式高尔基体网络（TGN）的逆向转运[106]。在 msd 模型中，Rab7b 敲低显著恢复细胞形态分化、上调 OL 分化标志物并减轻 ER 应激，因为 Rab7b 缺失促进突变 PLP 向晚期内体/溶酶体的转运并加速其降解[107]。这些转运缺陷不仅是 PLP 错误折叠的继发性后果，还通过改变 PLP 在内膜系统中的分布、降解与累积，主动促成蛋白稳态失衡。4.2.4. 自噬与 NMD 细胞可通过 ER-自噬（ER-phagy）消除受损的 ER 片段及相关的底物蛋白，ER 片段被吞噬并递送至溶酶体降解，从而维持细胞稳态[108--110]。然而，目前尚无直接实验证据表明 PLP 或 DM20 通过 ER-自噬通路降解。在 OL 中，巨自噬通过 amphisome 介导的更新降解包括 PLP 在内的髓鞘蛋白，其破坏导致细胞内 PLP 累积与细胞毒性[111,112]。一致地，自噬在 OL 谱系中受到动态调控，在不同发育阶段发挥不同作用[113--115]。 值得注意的是，当突变发生于非末端编码外显子并诱导产生提前终止密码子（PTC）的移码时，突变转录本通常通过无义介导的 mRNA 降解（NMD）被降解，常导致相对较轻的表型[116]。相比之下，发生于最终外显子的突变可逃避免 NMD，导致更严重的表型[117]。 因此，受损的转运与降解通路进一步加剧蛋白毒性应激，形成 PLP 累积与 ER 功能障碍的恶性循环。4.3. PLP 折叠与质量控制中的分子伴侣 由于突变 PLP 频繁逃避有效折叠并在 ER 内累积，分子伴侣系统对决定突变蛋白是重折叠、ER 滞留还是降解变得至关重要。 二硫键异构酶（PDI），在哺乳动物中主要由 ERp57、ERp44 与 ERp72 代表，不仅作为氧化还原酶，还作为分子伴侣发挥作用[118,119]。这些蛋白通过其疏水结构域结合部分折叠或错误折叠的底物，从而稳定折叠中间体、防止蛋白聚集，并为二硫键重排提供适当的微环境与时间窗口[120]。然而，当 PLP1 突变------尤其影响 EC2 结构域者------改变 PLP 的空间构象时，PLP 同源物之间在 Cys108、Cys183、Cys200、Cys219 与 Cys227 残基处发生异常二硫交联，从而阻止 PDI 介导的蛋白折叠纠正。 许多 ER 驻留分子伴侣（包括 PDI 与 CNX）的活性高度依赖 ER 的氧化环境。这些伴侣通过自身构象变化促进新生多肽折叠并防止蛋白错误折叠与聚集[121]。特别是，其与二硫键形成和重排相关的功能需要适当的氧化还原电位。在生理条件下，ER 维持高度氧化的环境，很大程度上归因于其升高的氧化型谷胱甘肽（GSSG）浓度，这为伴侣介导的催化活性提供了必要的化学驱动力。 BiP（GRP78/HSPA5）是主要的 ER 驻留 Hsp70 伴侣，识别错误折叠 PLP 中暴露的疏水区域并防止异常聚集[122]。从机制上看，PLP1 突变改变 PLP 的氨基酸序列，导致异常的蛋白构象并破坏其天然折叠状态。因此，通常埋于蛋白核心或嵌入膜内的疏水残基被暴露。BiP 仅与新合成的野生型 PLP 短暂相互作用，而错误折叠的 msd-PLP 形成稳定而持久的 BiP 关联复合物，从而促成长时间 ER 滞留与未解决的蛋白稳态应激[55]。这种延长的相互作用是蛋白错误折叠的关键信号。 除作为 ER 蛋白折叠过程中的分子伴侣外，BiP 还参与 ERAD。BiP 与其辅伴侣 ERdj5 一起作用于底物蛋白，并与 ER 膜逆向转位复合物中的 Sel1L 相互作用，介导底物逆向转位[123--125]。然而，PLP 突变诱导过早寡聚化，导致被 ER 质量控制（ERQC）系统识别并滞留于 ER 内。寡聚化 PLP 分子尺寸的增加连同疏水核心的暴露，进一步促聚合，从而损害高效的 ERAD 介导清除并破坏 ER 稳态。总之，ERAD 关键组分 Sel1L 的敲除导致 CNS 髓鞘进行性变薄、运动功能障碍与早死[126]。5. PMD 中 UPR 介导的少突胶质细胞凋亡5.1. PLP 错误折叠与未折叠蛋白反应的激活 当过量的错误折叠 PLP 蛋白超出 ERAD 处理能力时，UPR 被激活。UPR 瞬时减弱全局蛋白合成，同时上调伴侣表达以增强 ER 修复能力[127]。ERAD 通路受损也可触发 ER 应激[126]。BiP 是 ER 应激（ERS）的关键传感器与调控因子（图 4）。在生理条件下，BiP 广泛结合三个 ER 跨膜应激传感器------IRE1、PERK 与 ATF6------的腔域，从而使其维持非激活状态。当 ER 腔内累积错误折叠蛋白时，BiP 从这些应激传感器解离，导致 IRE1/PERK/ATF6 信号通路激活并启动 UPR[128]。随后，细胞根据 ER 应激的严重程度与持续时间，启动适应性反应或发生凋亡[129]。这三条 UPR 分支的激活谱在不同细胞类型间以及针对不同 ER 应激诱导物（如二硫苏糖醇（DTT）、毒胡萝卜素（Tg，一种 SERCA Ca2+-ATP 酶抑制）、衣霉素（Tm，一种 N-糖基化抑制剂））时有所差异[130]。 图 4. ER 应激期间激活的 UPR 信号通路。基础条件下，ER 伴侣 BiP 结合并抑制三个主要 ER 应激传感器(PERK、IRE1α 与 ATF6α)。PLP 错误折叠蛋白在 ER 腔内的累积 sequestered BiP，导致这些信号分支激活。激活的 PERK 磷酸化 eIF2α，导致全局蛋白合成瞬时减弱，同时选择性促进 ATF4 翻译。ATF4 诱导自噬、氧化还原稳态、氨基酸代谢相关基因，并在持续应激下诱导促凋亡转录因子 CHOP。IRE1α 介导 XBP1 mRNA 的非经典剪接，生成活性转录因子 XBP1s，其上调 ERAD、分子伴侣、折叠酶与脂质生物合成通路。IRE1α 还激活 TRAF2--JNK 信号并促进选定的 mRNA 经调节的 IRE1 依赖的衰变（RIDD）。ER 应激时，ATF6α 转位至高尔基体，经 S1P 与 S2P 切割释放活性片段 c-ATF6α，其进入细胞核诱导 ERAD 组分、伴侣以及 ER 与高尔基体生物发生相关基因。总体上，这些通路协调适应性蛋白稳态反应，或在 ER 应激变为慢性或不可承受时触发凋亡。 有趣的是，在常染色体显性视网膜色素变性（RP）模型的慢性、未解决 ER 应激条件下，UPR 的三条分支并未呈现同步激活。IRE1 信号迅速下降（约 8 小时内），ATF6 信号随后较缓慢下降，而 PERK 信号持续保持活跃。IRE1 通路的衰减是 ER 应激诱导细胞死亡的关键事件。化学遗传学维持 IRE1 信号可显著改善慢性 ER 应激下 HEK293 细胞的存活，支持持续 IRE1 活性与细胞命运决定之间的因果关系[131]。一致地，在 jimpy 模型中，PERK 敲除增强 IRE1 与 ATF6 依赖的靶基因表达，恢复蛋白稳态并阻止 OL 凋亡[132]。 值得注意的是，PERK 与 ATF6 通路对维持成熟 OL 与成年髓鞘的功能和存活至关重要，但对发育中髓鞘化的 OL 影响极小[111]。重要的是，UPR 在髓鞘化疾病中发挥双重作用：在轻度或急性应激条件下，它通过降低蛋白合成负荷、增强蛋白折叠能力并促进 ERAD 发挥保护作用，从而支持髓鞘化细胞存活。相反，在持久或严重应激下，持续的 UPR 激活可能转向促凋亡信号，最终导致髓鞘化细胞死亡与脱髓鞘[133]。 在 PMD 中，由于错误折叠 PLP 的持续存在，这一适应性反应变为了适应不良，导致慢性 UPR 激活与蛋白稳态恢复失败。同时，UPR 激活先于先天和/或适应性免疫系统的激活[134]。 5.1.1. OL 凋亡中的 PERK 信号 PERK 通路在中枢神经系统的 OL 中发挥关键作用。ER 应激诱导 PERK 同源二聚化与激活，导致 eIF2α 磷酸化并产生 p-eIF2α。随后，p-eIF2α 抑制全局蛋白翻译[135]（图 4）。蛋白合成的瞬时抑制代表一种保护性细胞应激反应；然而，PMD 出生后发育期间的 PLP 突变诱导慢性 ER 应激，最终导致 OL 凋亡与髓鞘化受损[46,136]。 在全局翻译抑制条件下，ATF4 mRNA 表达反而增加[137]，这归因于 ATF4 mRNA 的 5′ 非翻译区中存在两个上游开放阅读框（uORF）调控元件[138,139]。ATF4 随后转位入核，调控下游 UPR 相关基因（包括 CHOP、TRIB3、GADD34 与 ATF3）的转录。尽管 ATF3 表达显著上调，ATF3 缺陷并未逆转重症 OL 病理中观察到的凋亡表型，表明 ATF3 并非凋亡的关键介质[140]。GADD34 作为负反馈调节因子，促进 p-eIF2α 去磷酸化，从而恢复全局蛋白翻译[141]。值得注意的是，在正常 OL 成熟过程中，UPR 的 IRE1 与 ATF6 分支在活跃髓鞘化期间被强烈激活，可能反映 OL 中高膜合成负荷。相比之下，PERK 通路激活大幅减弱，推测是为了避免过度抑制全局蛋白翻译[137]。 重要的是，ATF4 介导的 CHOP 诱导促进 CHOP 结合 ERO1α 与 GADD34 基因的启动子区，从而特异性增强其转录。既往研究表明，在 ER 应激下的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中，CHOP 直接结合 Ero1α 与 GADD34 的启动子区，表明它们是 CHOP 的直接转录靶标[142]。在 ER 应激条件下，ATF4 与 CHOP 还通过转录激活蛋白翻译机制的组分（而非直接诱导凋亡基因）促成细胞死亡。突变蛋白翻译的恢复加剧 ER 过载，通过 ERO1α 通路导致过量活性氧（ROS）产生与 ATP 耗竭，从而诱导氧化应激与能量耗竭，最终触发细胞死亡[143]。 研究显示，jimpy 模型小鼠中的突变 PLP 表现出强烈的线粒体共定位，伴随 ROS、超氧阴离子（O2−）与谷胱甘肽（GSH）水平升高，表明线粒体氧化还原稳态与活性异常。总体而言，jimpy 模型显示过氧化物酶体标志物（包括 ALDP 与 ACOX1）表达增加，Abcd2（ALDRP）基因基础表达显著升高，且线粒体较野生型 OL 中更小且不规则的线粒体表现为增大的杆状线粒体。这些形态异常与突变 PLP 表达相关[144]。重复性 PLP 突变也通过 Mia40/Erv1 依赖的线粒体导入通路表现出显著的线粒体定位，导致线粒体损伤、细胞色素 c 胞质释放以及作为凋亡执行标志的 PARP 切割增加。类似地，携带这些重复性突变的小鼠表现出胞质细胞色素 c 水平升高与核 AIF 累积增加，进一步支持线粒体功能障碍与凋亡之间的联系[145]。一致地，PLP 特异性 35 个氨基酸结构域（DM20 中缺失）内的半胱氨酸残基与结构特征，对线粒体靶向至关重要；因此，该区域的突变导致 PLP 滞留于 ER[145]。 然而，CHOP 的功能不限于促进凋亡。在 rsh 模型中，CHOP 缺陷反而显著加剧疾病严重程度并缩短寿命，提示 CHOP 在 OL 中可能发挥抗凋亡或促存活作用[127,146]。尽管如此，在 PMD 及其他实验性疾病模型中，CHOP 敲除部分挽救表型，表明 CHOP 在 OL 中兼具促存活与促凋亡功能。CHOP 的这种双重作用也在多种细胞类型与疾病背景中被报道[49,147,148]。值得注意的是，在包括 msd 与 jimpy 小鼠在内的重症疾病模型中，CHOP 敲除未能挽救广泛的 OL 丢失或早死[132]。尽管如此，OL 相关疾病中 CHOP 上调常与凋亡进展相关，而在脊髓损伤（SCI）中，CHOP 缺陷显著减弱损伤诱导的 UPR 激活并促进更好的恢复结果[149]。 尽管 Caspase12 在这些条件下被激活，但它似乎不直接参与凋亡，因为 Caspase12 缺陷未能减少细胞死亡，而 Caspase9 与 Caspase3 在突变小鼠中仍保持激活[150]。ATF3 也被诱导但与 OL 凋亡无直接关联[148]。 PERK 信号的情境依赖性作用仍未完全阐明。虽然瞬时翻译减弱在急性 ER 应激中似乎具有保护作用，但 prolonged PERK 激活可能通过抑制髓鞘蛋白合成与促进 CHOP 依赖的凋亡，加剧蛋白稳态崩溃。模型间的差异可能反映突变严重程度、发育阶段与 ER 应激持续时间的不同。因此，延长的 PERK 激活代表了蛋白稳态失败转化为 OL 功能障碍与凋亡的关键机制。5.1.2. ER 应激适应中的 IRE1 与 ATF6 信号 与 PERK 信号相比，IRE1 与 ATF6 通路主要支持适应性反应；然而，它们在慢性应激条件下激活不足或短暂，可能导致恢复蛋白稳态的失败。 IRE1α 通路由兼具蛋白激酶与内切核糖核酸酶（RNase）活性的 IRE1α 介导。基础条件下，IRE1α 通过其 N 端腔域（NLD）与 ER 驻留伴侣 BiP 的相互作用维持非激活状态。BiP 解离后，IRE1α 发生同源二聚化与自磷酸化，导致 NLD 二聚化并随后激活其胞质激酶与 RNase 结构域[151,152]（图 4）。激活的 IRE1α 特异性切除 X-box 结合蛋白 1（XBP1）mRNA 中一段 26 核苷酸的内含子，生成剪接形式的 XBP1（XBP1s），作为活性转录因子。NLD 内关键氨基酸残基的突变损害二聚化[153]。 值得注意的是，IRE1α 的激活不仅依赖未折叠蛋白诱导的 BiP 解离，还可通过其跨膜结构域（TMD）响应饱和脂肪酸棕榈酰化而被触发[154,155]。有趣的是，IRE1α 感知 ER 膜异常的能力不依赖于 TMD 的特定氨基酸序列；相反，一个功能性膜锚定结构域的存在足以检测膜扰动并启动激活[156]。然而，TMD 内的残基 W457 与 S450 对稳定二聚化界面至关重要，这些位点的突变破坏 IRE1α 二聚化[157]。XBP1s 在上调 ER 膜相关蛋白与分子伴侣中起关键作用，从而增强蛋白折叠、分泌与 ERAD 相关基因表达。此外，XBP1s 通过调节的 RIDD 减轻 mRNA 负荷，并促进磷脂合成以扩展 ER 膜表面积，共同促成 ER 应激的减弱。尽管如此，IRE1 通路的持续激活也可促进凋亡[158]。 在 ATF6 通路中，激活的 ATF6α 转位至 GA，在此经位点特异性蛋白酶切割释放其胞质片段 ATF6α-p50。该片段随后转位入核并诱导分子伴侣与 ERAD 相关组分的表达（图 4）。然而，msd 小鼠模型中 ATF6 表达水平与野生型对照相比差异极小，提示该模型中 OL 的 UPR 激活未能有效募集 ATF6 分支[89]。尽管 ATF6α 缺陷在生理条件下不影响正常发育、OL 存活、髓鞘化或髓鞘超微结构，但它在炎症应激下显著增加 OL 对细胞死亡与髓鞘损伤的易感性[159]。 有趣的是，既往研究表明，在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的 ER 应激条件下，ATF6α 与 XBP1 形成异二聚体，其对未折叠蛋白反应元件（UPRE）的结合亲和力高于 XBP1 同源二聚体[160]。ATF6α 与 XBP1 还表现出协同相互作用，因为激活的 ATF6 在核转位后增强 XBP1 mRNA 转录[161]。 ATF6α 与 XBP1 显示部分功能冗余，因为 ATF6α 缺陷并未显著改变下游 UPR 靶基因的表达[162]。值得注意的是，IRE1 信号通过激酶--JNK 通路发生自我放大，而 ATF6 似乎作为负调控因子，在 ER 应激后期抑制过度而持续的 IRE1 激活，从而防止信号失调[163]。近期研究进一步揭示，XBP1s 诱导 TMED9 等分子的表达，其稳定 ATF6 并防止其降解，从而在长期 ER 应激期间维持 ATF6 介导的促存活信号[164]。5.2. ER 氧化还原稳态与氧化应激 msd-PLP 诱导携带 C 端 KDEL 回收信号的关键 ER 分子伴侣（包括 PDI、CALR 与 GRP78）耗竭，导致其从 ER 重新分布至胞质。值得注意的是，msd-PLP 引起 ER Ca2+ 耗竭并促进 GA 碎裂。PLP 突变还损害粗面 ER 出口位点（ERES）处的 COPII 囊泡组装与转运，这可能进而破坏 GA 至 ER 的 COPI 介导逆向转运。这些细胞内病理改变（包括分子伴侣耗竭、囊泡运输缺陷与高尔基体碎裂）的严重程度，在轻度与重度 PLP 突变体之间存在差异，并与各突变相关的临床严重程度相关[165,166]（图 5）。恢复 ER 钙稳态，例如通过 SERCA 激活剂 CDN1163、IP3R 抑制剂 2-APB 或 RyR 抑制剂丹曲林（dantrolene）可部分挽救 COPII 组装与囊泡转运缺陷。 图 5. PLP 错误折叠、蛋白稳态破坏、PMD 中 OL 变性以及野生型 PLP 转运之间联系机制示意图。突变 PLP 蛋白无法达到其天然构象，并在少突胶质细胞的 ER 内累积，被 BiP 与 PDI 等分子伴侣滞留。错误折叠 PLP 的持续累积通过 PERK、IRE1 与 ATF6 通路激活 UPR，导致 eIF2α 磷酸化、ATF4 诱导、XBP1 剪接、JNK 激活与 ATF6 加工。持续 ER 应激促进 CHOP-、ERO1α- 与 GADD34-依赖的适应不良信号，破坏 ER 氧化还原稳态并增强 ROS 产生。线粒体相关 ER 膜（MAM）处 ERO1α 活性升高刺激 IP3R 介导的 Ca2+ 释放，导致线粒体 Ca2+ 过载、细胞色素 c 释放，并通过 Bim 与 Bax/Bak 激活内源性凋亡通路。同时，COPII 介导的 ER 输出与 COPI 依赖的逆向转运缺陷损害 PLP 经高尔基体的转运，进一步加剧蛋白稳态崩溃。死亡受体信号（包括 DR5）的上调放大凋亡反应。总体上，这些相互关联的通路驱动 PMD 中的 OL 功能障碍、变性与髓鞘丢失。 如前所述，ER 氧化还原稳态对正确蛋白折叠至关重要，因为 PDI 介导的折叠依赖于底物蛋白内的动态构象变化[121,167]。这些过程受 ER 氧化还原相关分子与蛋白（尤其 GSSG/GSH 系统与 ERO1α）严格调控[168]。在胞质中，GSH 浓度远高于 GSSG，比值约在 30:1 至超过 100:1 之间。这一高度还原的环境使 GSH 能够还原二硫键并维持蛋白巯基（--SH）处于还原态。相比之下，ER 内 GSSG 水平显著升高，导致 GSH/GSSG 比值明显降低。ER 内相对氧化的环境在热力学上有利于二硫键形成[169,170]（图 5）。 ERO1α 直接氧化 PDI，将其转化为氧化的二硫形式（--S--S--）[171]。在此过程中，ERO1α 催化中心的第一对半胱氨酸被还原为硫醇形式（--SH）。随后，第二对半胱氨酸重新氧化被还原的第一对半胱氨酸，使其恢复二硫状态。同时，第二对半胱氨酸将两个电子转移给结合于 ERO1α 的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）辅因子，生成还原型 FADH2。FADH2 随后将电子转移给分子氧，产生 H2O2，从而完成电子转导级联[172]。 氧化的 PDI 随后与新生底物蛋白相互作用，并通过硫醇-二硫交换反应催化二硫键形成，在此过程中 PDI 自身被还原为硫醇态（--SH）。还原型 PDI 随后识别并还原底物蛋白内错误配对的二硫键，通过额外的硫醇-二硫交换反应将其转回游离硫基，而 PDI 被重新氧化为二硫态（--S--S--）。若错误二硫键持续存在，氧化的 PDI 反复催化重排反应，直至底物蛋白达到其天然二硫键构型。GSH 随后将氧化的 PDI 还原回还原型，使错误配对的二硫键得以持续纠正。每次催化重排需从 GSH 转移两个电子以维持 PDI 活性[173]。持续产生的错误折叠 PLP 蛋白驱动 PDI 活性持续，并迅速耗竭 ER 谷胱甘肽（GSH）储备。由于 GSH 是主要的 ER 抗氧化剂，其耗竭损害 ROS 清除能力并破坏 ER 氧化还原稳态。结果，即便是低水平 ROS 也无法被有效清除，导致 ROS 快速累积。相应地，GSH 耗竭进一步提高 GSSG/GSH 比值，破坏 ER 氧化还原稳态。 重要的是，ER 应激期间激活的 UPR 初衷在于增强蛋白折叠能力并促进错误折叠蛋白降解。然而，PERK 通路通过 CHOP 上调也诱导 ERO1α 表达增加[142]。ERO1α 通过解除 ERp44 对 IP3R 的抑制来促进 IP3 诱导的钙释放（IICR），从而促进 ER Ca2+ 耗竭并触发凋亡[174]。ERO1α 以 redox 依赖的方式定位于 MAM，并调控 ER 与线粒体间的钙信号。还原环境促进其从 MAM 解离进入分泌通路[175]（图 5）。过量的胞质钙随后激活多条促凋亡信号通路，而线粒体钙过载导致线粒体膜去极化与细胞色素 c 释放，从而不可逆地启动凋亡级联。 除 UPR 外，氧化应激构成 PMD 发病中第二条相互交织的应激轴。疾病相关的 PLP1 突变导致 PLP 在 ER 内过早寡聚化，这一事件与疾病严重程度相关，并可能破坏线粒体相关膜（MAM）处的 ER-线粒体通讯[79]。在 PLP-tg 66/66 小鼠模型（PLP1 过表达/重复）中，Ruiz 等人记录了包括糖酵解酶与 OXPHOS 组分在内的 21 种蛋白的氧化损伤、ATP 下降、线粒体动力学缺陷（分裂停滞）以及抗氧化反应缺陷[176]。患者来源成纤维细胞显示线粒体 ROS 升高、膜去极化与呼吸能力降低均可被抗氧化剂 N-乙酰半胱氨酸挽救[176]。 从机制上看，这反映一个恶性循环：ER 应激在氧化蛋白折叠过程中促进 ERO1 介导的 H2O2 产生（被 CHOP 驱动的 ERO1 上调放大）；H2O2 激活 IP3R 介导的 ER Ca2+ 释放，刺激线粒体代谢并进一步产生 ROS；线粒体 ROS 漏回 ER，加剧蛋白错误折叠与 UPR 激活[177]。稳定结合突变 PLP 的钙连蛋白[166]定位于 MAM，可能将 ER 应激与线粒体功能障碍偶联[176]。值得注意的是，这一恶性循环似乎依赖突变类型：既往工作在错义突变小鼠（rsh、msd）中发现抗氧化通路调控紊乱很小，提示在这些模型中 UPR 与氧化应激部分可分离[134]，而过表达/重复模型则显示明确的氧化应激[176]。这一区别具有治疗意义:抗氧化策略可能特别适用于 PLP1 重复型 PMD，而错义突变型可能需要与 UPR 调节剂联合使用。 这些发现提示，氧化还原失衡并非孤立事件，而是与蛋白稳态失败紧密耦合，进一步放大 ER 应激并促进 OL 凋亡。因此，我们假设 UPR 信号的主要功能是减轻 ER 内错误折叠蛋白的负荷。在 PMD 条件下，OL 中 PERK 介导的 ERO1α 上调最初可能旨在增强 PDI 氧化、维持最佳蛋白折叠效率并维持 ER 氧化还原稳态。然而，突变 PLP 的持续表达似乎使 ERO1α 活性失调，导致 GSH 过度消耗、H2O2 产生增加与持续 ER Ca2+ 泄漏，共同促成 OL 凋亡。 目前，绝大多数 ERO1α 研究仍聚焦于癌症领域，而在神经系统中的系统研究仅于近年才起步[178]。ERO1α 在包括 PMD、多发性硬化（MS）与 vanishing white matter（VWM）在内的白质疾病中的作用可能被大幅低估，ERO1α 可能代表慢性神经退行性的重要驱动因素。未来研究将致力于阐明这一机制。6. PMD 的治疗与预后 先天型 PMD 是最严重的类型，通常在第二个十年生命前致死；而经典型 PMD 相对中等，存活可延至三四十岁至七八十岁。PLP1 无效突变（null mutations）产生最轻表型，以主要的长度依赖性轴突变性、无明显髓鞘发育不良为特征。多数患者表现为眼球震颤、从肌张力低下进展为痉挛性截瘫、共济失调与认知功能障碍；死亡常源于与运动障碍相关的呼吸并发症[179]。 当前治疗策略可大致归为三类：(i) 耐受异常或过量 PLP：增强突变 PLP 折叠、改善 ER 至膜的转运，或调节 UPR 以降低蛋白毒性应激；(ii) 恢复正常 PLP 水平：通过基因纠正或剪接调节，在生理水平产生野生型 PLP；(iii) 将异常或过量 PLP 降低至无效样状态：通过 ASO、RNAi 或 CRISPR-Cas9 抑制突变或过表达的 PLP1，利用 PLP1 功能缺失表型比毒性功能获得突变所致表型更轻的观察。其中，PLP1 抑制是最接近临床转化的策略：Ionis Pharmaceuticals 于 2024 年启动了靶向 PLP1 的 ASO ION356（NCT06150716）的 1b 期试验，这是 PLP1 抑制疗法的首个人体试验。去铁酮（deferiprone）铁螯合与胶质祖细胞移植（Sana Biotechnologies 的 SC379）也在推进临床评估[179]。 鉴于蛋白稳态崩溃是 PMD 的核心致病机制，旨在恢复 ER 稳态并降低蛋白毒性应激的治疗策略已成为有前景的方向。 目前，尚无高度靶向的疗法成功转化为 PMD 患者的临床治疗。尽管如此，基于当前研究进展，抑制突变蛋白产生与调节 UPR 信号似乎是最有前景的治疗策略。鉴于 PMD 基因型与表型间的复杂关系，可能需要精准靶向方法以实现最佳治疗效果[180]。 若干潜在治疗策略已被研究。靶向细胞内信号通路是一种有前景的方法。使用 U0126 或 PD98059 等化合物抑制 MEK/ERK 通路，可改善 PLP1 过表达诱导的 OL 分化与髓鞘化缺陷[181]。代谢干预也显示出治疗潜力；值得注意的是，高胆固醇饮食改善了 PMD 小鼠模型的病理表现与症状，支持饮食调节作为一种可能的辅助疗法。总体而言，包括神经干细胞或造血祖细胞移植在内的细胞替代策略，已在动物模型与早期临床研究中生成成髓鞘的 OL，凸显了一种有前景的再生途径[182,183]。靶向 UPR 信号的疗法也显示出良好效果，若干小分子（包括 Salubrinal、Guanabenz 与 Sephin1）在实验模型中改善了髓鞘保留、再髓鞘化与功能恢复[179,184]。 抑制突变 PLP1 表达也已成为一种有前景的治疗策略[179]。通过反义寡核苷酸（ASO）、RNA 干扰（RNAi）或 CRISPR-Cas9 介导的基因编辑降低毒性或过量的 PLP1 表达，在多个小鼠模型中显著延长了存活、恢复了髓鞘化并改善了运动功能。去铁酮铁螯合在选定的细胞与动物研究中显示出治疗益处。此外，4-苯基丁酸（4-PBA）在细胞水平改善了细胞活力并降低了 ER 应激相关标志物[185]。基于腺相关病毒（AAV）的疗法也有效抑制了突变或重复的 PLP 表达，为 PMD 体内基因治疗的可行性提供了重要的临床前证据[186]。 口服姜黄素（curcumin）使 msd 小鼠寿命显著延长约 25%，并显著减少了 CNS 白质区域内凋亡 OL 的数量。然而，姜黄素治疗未改善这些小鼠的运动表现、神经表型或髓鞘化。治疗后 MBP 表达与髓鞘超微结构均未显著恢复。据推测，姜黄素通过其抗炎与抗氧化联合活性发挥作用，这可能在较轻表型患者中提供更大获益[187,188]。 吡拉西坦（Piracetam）是一种促智药（nootropic agent），其主要药理作用是通过与磷脂极性头基相互作用恢复细胞膜流动性，经药物筛选被鉴定为可改善突变 PLP 转运的先导化合物[189]。在表达 msd 突变的 MO3.13 OL 来源细胞中，吡拉西坦作为药理伴侣（pharmacological chaperone）：它显著增加了突变 PLP1 总蛋白水平，促进其从 ER 向细胞膜的重新定位，降低 ER 应激标志物，并在微阵列分析中逆转了 msd 突变诱导的基因表达改变[189]。这些效应与吡拉西坦已知的稳定膜结构机制一致，该机制促进跨膜蛋白的正确折叠与转运。然而，尽管在体外有益，吡拉西坦治疗未能显著延长 msd 小鼠的存活或改善其体重增长，提示对突变 PLP 转运的部分伴侣挽救不足以克服体内的蛋白毒性负荷[189]。有必要将该药与其他治疗方法联用以更好发挥其效应。 类似地，氯喹（CQ）通过一种不同机制降低 PMD 中的 ER 应激：而非改善蛋白折叠，CQ 增强了真核起始因子 2 alpha（eIF2α）的磷酸化，从而减弱全局性帽依赖翻译并减少新合成的错误折叠 PLP1 进入 ER[190]。在表达 msd 突变的 HeLa 细胞中，CQ 降低了 ER 驻留突变蛋白的量并改善了 ER 应激。CQ 还减轻了 msd 小鼠原代少突胶质细胞的 ER 应激。在体，CQ 穿过血脑屏障，抑制脊髓中的 ER 应激标志物，并上调成熟 OL 标志物基因表达[190]。值得注意的是，CQ 的疗效特异于由错误折叠新生蛋白诱导的 ER 应激：它减弱了 Tm 而非 Tg 引起的应激，确认其机制靶向进入 ER 的新生未折叠蛋白负荷即错义突变型 PMD 的精确致病机制[190]。因此，CQ 与 guanabenz 和 salubrinal 同属一类机制，即通过增加 eIF2α 磷酸化来降低蛋白毒性负荷[179]。尽管如此，尽管 CQ 在细胞水平减弱了 ER 应激并促进了 OL 分化标志物，它并未完全阻止凋亡或显著延长 msd 小鼠寿命，表明单纯的翻译减弱不足以挽救疾病[190]。同样有必要与其他治疗方法联用以更好发挥效应，并需根据具体病情对症施治。 综上，这些治疗方法汇聚于恢复蛋白稳态的共同目标，进一步支持 PMD 本质上是一种蛋白稳态驱动疾病的概念。7. 结论 PLP1 相关的脑白质营养不良代表一类遗传与临床高度异质的髓鞘疾病，其中少突胶质细胞尤其易受 ER 蛋白稳态紊乱的影响。累积证据表明，突变 PLP1 蛋白诱导慢性 ER 应激，破坏蛋白质量控制系统，并触发适应不良的未折叠蛋白反应信号，最终导致 OL 功能障碍与髓鞘变性。近期进展显著增进了我们对连接 PLP1 突变与少突胶质细胞病理的分子机制的理解，尤其是 ER 伴侣、ER 关联降解与 UPR 通路的作用。尽管如此，表型异质性与选择性 OL 易感性的精确决定因素仍不完全清楚。未来整合分子、细胞与转化方法的研究，对于确定有效的靶向疗法并推进 PLP1 相关脑白质营养不良的精准医学至关重要。致谢 谨向为推进该领域发展做出奉献的所有学界前辈致以诚挚谢意。缩略语 本综述文章中使用以下缩略语： 缩略语： ABR     Auditory Brainstem Response（听觉脑干反应） AIF      Apoptosis-Inducing Factor（凋亡诱导因子） ASO     Antisense oligonucleotide（反义寡核苷酸） ATF3    Activating Transcription Factor 3（激活转录因子 3） ATF4    Activating Transcription Factor 4（激活转录因子 4） ATF6    Activating Transcription Factor 6（激活转录因子 6） Bax      BCL2-associated X protein（BCL2 关联 X 蛋白） Bak      BCL2 antagonist/killer（BCL2 拮抗/杀伤蛋白） BiP       Binding immunoglobulin protein（亦作 GRP78，免疫球蛋白结合蛋白） Bim      BCL2-interacting mediator of cell death（BCL2 相互作用的细胞死亡介质） CALR    Calreticulin（钙网蛋白） CHOP    C/EBP homologous protein（C/EBP 同源蛋白） CNS      Central nervous system（中枢神经系统） CNX      Calnexin（钙连蛋白） COPI     Coat protein complex I（包被蛋白复合体 I） COPII    Coat protein complex II（包被蛋白复合体 II） CST       Cerebroside sulfotransferase（脑硫脂磺基转移酶） DM20    DM20 isoform of proteolipid protein 1（蛋白脂质蛋白1的 DM20异构体） EC1       Extracellular loop 1（胞外环 1） EC2       Extracellular loop 2（胞外环 2） EDEM    ER degradation-enhancing α-mannosidase-like protein（ER 降解增强型 α-甘露糖苷酶样蛋白） eIF2α    Eukaryotic translation initiation factor 2 alpha（真核翻译起始因子 2 alpha） ER         Endoplasmic reticulum（内质网） ERAD     Endoplasmic reticulum-associated degradation（内质网关联降解） ERES      Endoplasmic reticulum exit site（内质网出口位点） ERO1α    Endoplasmic reticulum oxidoreductin 1 alpha（内质网氧化还原酶 1 alpha） ERQC     Endoplasmic reticulum quality control(内质网质量控制) ERS        Endoplasmic reticulum stress（内质网应激） ESS        Exonic splicing silencer（外显子剪接沉默子） GA          Golgi apparatus（高尔基体） GalC       Galactosylceramide（半乳糖基神经酰胺） GADD34  Growth arrest and DNA damage-inducible protein 34（生长停滞与 DNA 损伤诱导蛋白 34） GFAP       Glial fibrillary acidic protein（胶质纤维酸性蛋白） GRP78     Glucose-regulated protein 78（葡萄糖调节蛋白 78） GSH         Reduced glutathione（还原型谷胱甘肽） GSSG       Oxidized glutathione（氧化型谷胱甘肽） HEMS       Hypomyelination of early myelinating structures（早髓鞘化结构髓鞘形成不足） HLD         Hereditary leukodystrophy（遗传性白质营养不良） IBA1         Ionized calcium-binding adapter molecule 1（离子钙结合适配分子 1） IICR         IP3-induced calcium release（IP3 诱导的钙释放） IPL           Intraperiod line（周期线） IP3R         Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor（肌醇 1,4,5-三磷酸受体） IRE1         Inositol-requiring enzyme 1（需肌醇酶 1） ISE           Intronic splicing enhancer（内含子剪接增强子） JNK          c-Jun N-terminal kinase（c-Jun N 端激酶） KDEL        Lys-Asp-Glu-Leu endoplasmic reticulum retrieval motif（Lys-Asp-Glu-Leu 内质网回收基序） LE/Lys      Late endosome/lysosome（晚期内体/溶酶体） MAG         Myelin-associated glycoprotein（髓鞘相关糖蛋白） MAL         Myelin and lymphocyte protein（髓鞘与淋巴细胞蛋白） MAM        Mitochondria-associated membrane（线粒体相关膜） MBP         Myelin basic protein（髓鞘碱性蛋白） MDL         Major dense line（主致密线） MHC II     Major histocompatibility complex class II（主要组织相容性复合体 II 类） MOG         Myelin oligodendrocyte glycoprotein（髓鞘少突胶质细胞糖蛋白） MRI          Magnetic resonance imaging（磁共振成像） MRI-T2WI T2-weighted magnetic resonance imaging（T2 加权磁共振成像） NE            Nuclear envelope（核膜） NLD          N-terminal luminal domain（N 端腔域） NMD Nonsense-mediated mRNA decay（无义介导的 mRNA 降解） OL            Oligodendrocyte（少突胶质细胞） OPC          Oligodendrocyte precursor cell（少突胶质前体细胞） OSP          Oligodendrocyte-specific protein (Claudin-11)（少突胶质细胞特异性蛋白 / Claudin-11） PARP        Poly(ADP-ribose) polymerase（聚 ADP-核糖聚合酶） PDI           Protein disulfide isomerase（蛋白二硫异构酶） PERK        PKR-like endoplasmic reticulum kinase（PKR 样内质网激酶） PLP          Proteolipid protein（蛋白脂质蛋白） PLP1        Proteolipid protein 1（蛋白脂质蛋白 1） PMD        Pelizaeus--Merzbacher disease（佩梅病） PTC         Premature termination codon（提前终止密码子） QKI          Quaking（Quaking RNA 结合蛋白） RE            Recycling endosome（再循环内体） RIDD        Regulated IRE1-dependent decay（调节的 IRE1 依赖的衰变） RNase      Ribonuclease（核糖核酸酶） ROS         Reactive oxygen species（活性氧） SCI          Spinal cord injury（脊髓损伤） SDS          Sodium dodecyl sulfate（十二烷基硫酸钠） SERCA     Sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase（肌/内质网 Ca2+-ATP 酶） SIRT2       Sirtuin 2（Sirtuin 2 去乙酰化酶） SNARE     Soluble NSF attachment protein receptor（可溶性 NSF 附着蛋白受体） SPG2        Spastic paraplegia type 2（痉挛性截瘫 2 型） TGN          Trans-Golgi network（反式高尔基体网络） TMD          Transmembrane domain（跨膜结构域） TRAF2       TNF receptor-associated factor 2（TNF 受体关联因子 2） TRIB3        Tribbles pseudokinase 3（Tribbles 假激酶 3） UPR           Unfolded protein response（未折叠蛋白反应） UPRE         Unfolded protein response element（未折叠蛋白反应元件） UPS           Ubiquitin--proteasome system（泛素-蛋白酶体系统） VAMP   Vesicle-associated membrane protein（囊泡相关膜蛋白） VEP           Visual evoked potential（视觉诱发电位） XBP1          X-box binding protein 1（X-box 结合蛋白 1） 参考文献 参考文献： 1. 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Med. 2014, 239, 489–501. 扫码加入“佩梅病暨少突胶质细胞病”专题ima知识库，查询更多专业文献和科研专家 欢迎关注，凝聚微光，伴您同行，让罕见病被看见，让遗传病被理解，让孤儿药不孤单 罕见病科研公益基金推介 汇聚社会爱心 搭建科研与公益的桥梁 2025年2月28日，在深圳市民政局的指导下，深圳市慈善会联合深圳湾实验室科技基金会、深圳医学科学院－深圳湾实验室（SMART-SZBL）罕见病研究中心共同发起“微光同行”公益计划，依托科研单位的专业优势，集中力量攻坚遗传性神经发育罕见病，致力于改善部分罕见病无药可治的现状，通过搭建公益平台、链接多方资源，引导更多社会力量参与推动罕见病科研与公益慈善事业的协同发展。 据悉，2025年度“微光同行”公益计划通过腾讯公益平台等线上线下渠道共募集公众善款约70万元。这笔资金作为“种子资金”，已部分用于资助深圳医学科学院－深圳湾实验室罕见病研究中心的科研项目，重点投向项目启动、早期验证、关键技术突破及合作网络建设等环节，并与深圳医学科学院-深圳湾实验室罕见病研究中心自有经费协同发力，在四大领域实现罕见病系统性推进与关键突破。其余资金正严格按照去年既定的支持科研计划，稳步、有序地执行与落地，确保持续为科研创新注入动能。 科研攻坚多点突破 四大领域迎来曙光 在深圳市慈善会的资源链接与推动下，依托深圳医学科学院与深圳湾实验室的科研优势，“微光同行”公益计划在神经疾病、代谢疾病、罕见肿瘤、肌肉疾病四大领域取得系统性进展与关键突破。 神经疾病领域 项目推动渐冻人症（ALS）个性化药物研发进入临床前评估阶段，并成功诊断疑难儿童神经系统病例，探索“老药新用”策略加速治疗可及。 代谢疾病领域 针对我国高发的苯丙酮尿症（PKU），项目成功研发两代口服酶候选药物，动物实验疗效显著，致力于打破我国该领域长期无药可用的困局。 罕见肿瘤领域 针对腹膜假黏液瘤（PMP）的新药PX完成全部临床前研究，并于2025年底成功实现2例患者给药，完成从实验室到临床的关键跨越。 肌肉疾病领域 国际首个工程化细胞外囊泡（EV）递送mRNA治疗杜氏肌营养不良症（DMD）平台进入临床试验，开创安全、可重复的基因治疗新路径。 拓展罕见病关爱新边界 让微光照亮更多角落 站在公益计划启动一周年的新起点上，深圳市慈善会联合深圳湾实验室科技基金会、深圳医学科学院－深圳湾实验室罕见病研究中心，将继续携手各方力量，让罕见病关爱之光照得更远。2026年，项目将进一步拓展公益边界：计划启动“罕见病诊断下县乡”试点，联合地方政府与合作医院，将罕见病精准诊断能力向基层延伸，帮助更多偏远地区的患儿缩短确诊之路；并诚邀知名人士、科研学者、临床专家、患者代表共同担任“微光使者”，以公众倡导、科普传播、政策建言等方式，推动罕见病议题进入更广泛的公共视野。 此外，项目正探索构建更为紧密的“医－患－研”交流机制。计划自2026年春季起，在深圳湾实验室不定期举办小范围的“走进实验室”开放日活动，邀请部分捐赠人、患者代表、临床医生，与实验室及医科院的科学家们面对面交流，倾听病历之外的生活，分享实验室里正在发生的希望。 以上信息来源于深圳市慈善会官方微信公众号文章：《“科技+公益”的深圳样本：“微光同行”罕见病计划取得关键突破》（2026年2月28日） 播放上方视频，了解“孤儿药创汇”，点击下方标签，关注我们，伴您同行

本研究聚焦天然二萜类化合物冬凌草甲素（Oridonin）抗肾细胞癌（RCC）的作用机制，首次通过化学蛋白质组学技术鉴定出过氧化物还原酶 1（Peroxiredoxin 1, PRDX1）是冬凌草甲素的直接共价作用靶点，系统阐明了 “冬凌草甲素 - PRDX1 抑制 - ROS 累积 - 内质网应激 - 凋亡激活 / 保护性自噬” 的完整调控轴，并在体内验证了联合自噬抑制剂的增效策略，为肾癌靶向药物研发与天然产物机制解析提供了重要依据。 一、研究背景与立题依据 肾细胞癌是泌尿系统高发恶性肿瘤，临床以手术切除联合靶向、免疫治疗为主，但转移性患者仍面临耐药率高、化疗毒副作用强等困境，亟需开发新型治疗靶点与药物。天然产物是抗肿瘤药物的重要来源，冬凌草甲素作为中药冬凌草的核心活性二萜成分，已被证实对肺癌、胰腺癌、乳腺癌等多种肿瘤具有抑制作用，其多个衍生物已进入临床试验阶段。然而既往研究多聚焦于冬凌草甲素对 NF-κB、JNK、c-Myc 等通路的间接调控，其直接作用蛋白靶点，尤其是在肾癌中的特异性靶点与分子机制尚未明确。 活性氧（ROS）是细胞氧化代谢的副产物，肿瘤细胞通过高表达抗氧化系统维持氧化还原稳态，其中 PRDX 家族是清除过氧化氢、调控 ROS 水平的关键酶系，在多种肿瘤中高表达并与不良预后相关。ROS 过量累积可触发内质网应激（ER stress），适度内质网应激发挥细胞保护作用，持续过度应激则启动内源性凋亡程序；同时内质网应激也是自噬的重要诱导因素，而自噬在肿瘤中可发挥 “促生存” 或 “促死亡” 的双重调控作用。本研究旨在明确冬凌草甲素抗肾癌的效应特征，鉴定其直接蛋白靶点，并解析 ROS - 内质网应激 - 凋亡 / 自噬通路在其中的调控关系，为冬凌草甲素的临床转化与肾癌靶向治疗提供理论支撑。 二、实验材料与方法 1.细胞与动物模型 研究采用人肾癌细胞系 786-O、OSRC-2，正常肾小管上皮细胞 HK-2 及人胚肾 293T 细胞；体内实验使用 BALB/c 裸鼠构建 OSRC-2 皮下异种移植瘤模型。 2.技术方法 细胞表型检测：CCK-8 法检测细胞活力、克隆形成实验评估增殖能力、Annexin V-FITC/PI 流式细胞术检测凋亡率、DCFH-DA 探针检测胞内 ROS 水平、JC-1 染色检测线粒体膜电位。 分子生物学检测：Western blot 检测凋亡、内质网应激、自噬相关蛋白表达；GFP-LC3 与 mRFP-GFP-LC3 荧光系统分别检测自噬小体形成与自噬流。 化学蛋白质组学与靶点验证：基于活性的蛋白质谱（ABPP）技术，以 IAA-yne 半胱氨酸反应探针进行竞争标记，结合点击化学、Pull-down 与 LC-MS/MS 鉴定靶点蛋白；通过细胞热位移分析（CETSA）、重组蛋白突变体（C173S）、过氧化物酶活性实验验证结合位点与功能效应；辅以分子对接模拟结合模式。 功能回补实验：构建 PRDX1 稳定敲低与过表达细胞系，验证靶点在冬凌草甲素诱导的 ROS 累积、内质网应激、自噬与凋亡中的作用。 体内药效实验：设置对照组、冬凌草甲素单药组、羟氯喹（HCQ）单药组与联合给药组，监测肿瘤体积与小鼠体重，评估药效与安全性。 三、实验结果 1.冬凌草甲素选择性抑制肾癌细胞增殖并诱导凋亡 研究首先明确了冬凌草甲素的抗肿瘤细胞表型与选择性（图 1）。CCK-8 结果显示，冬凌草甲素对肾癌细胞的增殖抑制呈剂量与时间依赖性：处理 24 h 时 786-O 与 OSRC-2 的 IC₅₀分别为 10.6 μM 与 10.53 μM，48 h 时降至 7.75 μM 与 8.1 μM；而正常肾细胞 HK-2 与 293T 的 IC₅₀显著更高，提示其对肿瘤细胞具有选择性毒性（图 1B-C）。克隆形成实验进一步证实，冬凌草甲素可剂量依赖性抑制 786-O 细胞的长期克隆形成能力（图 1D-E）。 凋亡检测结果显示，随给药浓度升高，786-O 细胞凋亡率显著上升；凋亡相关蛋白检测发现，Bax/Bcl-2 比值增大，剪切型 caspase-3 表达上调，表明冬凌草甲素通过内源性通路诱导肾癌细胞凋亡（图 1F-J）。为初步探索机制，研究对冬凌草甲素处理后的 786-O 细胞进行定量蛋白质组学分析，共鉴定出 2962 个差异表达蛋白，其中 1550 个上调、1412 个下调；KEGG 富集分析显示，差异蛋白显著富集于氧化应激、内质网应激、自噬与内源性凋亡相关通路，为后续机制研究指明了方向（图 1K-L）。 图1 冬凌草甲素抑制肾癌细胞增殖并诱导其凋亡 2. ROS 累积是冬凌草甲素诱导凋亡的上游关键事件 基于蛋白质组学提示的氧化应激通路富集，研究验证了 ROS 在冬凌草甲素诱导凋亡中的核心作用（图 2）。DCFH-DA 探针检测显示，冬凌草甲素可剂量依赖性升高 786-O 细胞内 ROS 水平，而 ROS 清除剂 N - 乙酰半胱氨酸（NAC）可显著逆转 ROS 累积（图 2A-B）。功能实验证实，NAC 共处理可有效恢复冬凌草甲素抑制的细胞活力，降低凋亡率，并逆转线粒体膜电位下降，说明 ROS 是触发凋亡的上游信号（图 2C-E）。 进一步检测下游通路发现，冬凌草甲素可诱导 JNK 磷酸化水平升高，而 NAC 处理可消除 JNK 激活，同时逆转 Bax、剪切型 caspase-3 的上调与 Bcl-2 的下调；在 OSRC-2 细胞中验证得到一致结果（图 2F-L）。上述结果共同表明，冬凌草甲素通过诱导胞内 ROS 累积，激活线粒体凋亡通路与 JNK 应激通路，最终导致肾癌细胞凋亡。 图2 活性氧累积介导冬凌草甲素诱导的细胞凋亡 3. PRDX1 是冬凌草甲素的直接共价作用靶点 为阐明冬凌草甲素诱导 ROS 累积的分子根源，研究利用 ABPP 化学蛋白质组学策略鉴定其直接作用靶点（图 3）。冬凌草甲素结构中的 α- 亚甲基环戊酮为迈克尔受体，可与蛋白半胱氨酸巯基发生共价结合；基于这一特性，研究采用半胱氨酸反应探针 IAA-yne 进行竞争标记实验，发现冬凌草甲素可剂量依赖性竞争探针与细胞内蛋白的结合（图 3A-B）。对竞争后的蛋白样品进行 LC-MS/MS 鉴定与定量分析，发现抗氧化酶 PRDX1 的探针富集量受冬凌草甲素显著抑制，成为核心候选靶点（图 3C）。 后续多维度验证了二者的直接相互作用：Pull-down 实验证实，冬凌草甲素可减少 IAA-yne 探针富集的 PRDX1 蛋白（图 3D）；纯化重组人 PRDX1 蛋白的体外竞争实验显示，冬凌草甲素可直接抑制探针对重组 PRDX1 的标记（图 3E）；CETSA 实验发现，冬凌草甲素处理后 PRDX1 的热稳定性显著提升，支持二者在细胞内存在直接结合（图 3F-G）。 结合位点鉴定方面，LC-MS/MS 分析显示，冬凌草甲素处理后 PRDX1 的 Cys173 位点肽段出现特征性质量偏移；将 Cys173 突变为丝氨酸（C173S）后，冬凌草甲素丧失了与重组 PRDX1 的竞争结合能力（图 3H-I）。功能层面，冬凌草甲素处理不影响 PRDX1 的蛋白表达水平，但可剂量依赖性抑制其过氧化物酶活性（图 3J-K）。综上，冬凌草甲素通过共价结合 PRDX1 的 Cys173 位点，直接抑制其抗氧化酶活性，进而导致胞内 ROS 累积。 图3 冬凌草甲素直接结合抗氧化酶 PRDX1 4. ROS 介导的内质网应激参与凋亡调控 蛋白质组学提示的内质网应激通路，与 ROS - 凋亡轴的调控关系得到进一步验证（图 4）。Western blot 结果显示，冬凌草甲素处理后，786-O 与 OSRC-2 细胞中内质网应激标志蛋白 GRP78/Bip、p-EIF2α、ATF4、CHOP 的表达均呈剂量依赖性上调，证实内质网应激被激活（图 4A-B）。 为明确 ROS 与内质网应激的上下游关系，研究分别采用 ROS 清除剂 NAC 与内质网应激抑制剂 4-PBA 进行干预。结果显示，NAC 可显著逆转冬凌草甲素诱导的内质网应激蛋白上调，说明 ROS 是内质网应激的上游触发因素（图 4C、E）；而 4-PBA 不仅能降低内质网应激标志物水平，还可显著减少冬凌草甲素诱导的细胞凋亡（图 4D、F-H）。此外，JNK 抑制剂 SP600125 可同时缓解冬凌草甲素诱导的 ROS 累积、内质网应激激活与细胞凋亡，提示 JNK 在 ROS - 内质网应激 - 凋亡轴中发挥正反馈调控作用。上述结果共同证明，冬凌草甲素通过 ROS 累积激活内质网应激通路，最终介导肾癌细胞凋亡。 图4 冬凌草甲素通过活性氧介导的内质网应激激活细胞凋亡 5.内质网应激诱导保护性自噬，负向调控细胞凋亡 针对蛋白质组学富集的自噬通路，研究进一步解析了自噬在冬凌草甲素处理中的功能与调控关系（图 5）。Western blot 显示，冬凌草甲素可剂量依赖性升高 LC3-II 蛋白水平；联合溶酶体抑制剂氯喹（CQ）后，LC3-II 水平进一步升高，说明冬凌草甲素促进自噬小体形成，增强自噬流（图 5A-B、K）。GFP-LC3 荧光实验观察到给药后自噬小体斑点数量显著增加，mRFP-GFP-LC3 双荧光系统显示红色单独斑点增多，进一步证实自噬流增强（图 5C-F、J）。 调控关系验证表明，ROS 清除剂 NAC 与内质网应激抑制剂 4-PBA 均可抑制冬凌草甲素诱导的 LC3-II 上调，说明自噬由 ROS - 内质网应激轴介导（图 5G-H、N）。功能获得与缺失实验显示，自噬激活剂 Torin1 可减轻冬凌草甲素诱导的凋亡，而自噬抑制剂 CQ 则显著升高凋亡率；同时 CQ 联合处理可进一步提升胞内 ROS 水平，提示自噬通过清除氧化损伤成分发挥细胞保护作用（图 5I、L-M）。综上，冬凌草甲素诱导的自噬属于保护性自噬，抑制自噬可增强其抗肿瘤活性。 图5 冬凌草甲素诱导内质网应激依赖性保护性自噬 6. PRDX1 是调控 ROS - 内质网应激 - 凋亡 / 自噬轴的核心靶点 为确认 PRDX1 的功能必要性，研究通过基因操作回补验证了靶点的核心地位（图 6）。构建 PRDX1 稳定敲低与过表达的 786-O 细胞系后发现：PRDX1 敲低可显著增强冬凌草甲素对细胞活力的抑制作用，促进 ROS 累积与细胞凋亡；反之，PRDX1 过表达则能削弱冬凌草甲素的细胞毒性，减少 ROS 生成与凋亡发生（图 6A-I）。 分子层面验证显示，PRDX1 过表达可显著逆转冬凌草甲素诱导的内质网应激标志蛋白（GRP78、ATF4、CHOP、p-eIF2α）上调；同时，mRFP-GFP-LC3 实验证实 PRDX1 过表达可抑制冬凌草甲素诱导的自噬流增强（图 6J-K）。上述结果充分证明，PRDX1 是冬凌草甲素发挥抗肿瘤作用的关键直接靶点，其功能抑制是触发 ROS - 内质网应激 - 凋亡 / 自噬通路的起始事件。 图6 PRDX1 是冬凌草甲素诱导细胞凋亡的关键分子 7.体内联合自噬抑制剂可增强抗肿瘤疗效 为验证临床转化价值，研究在裸鼠皮下移植瘤模型中评估了冬凌草甲素单药及联合自噬抑制剂羟氯喹（HCQ）的药效（图 7）。结果显示，冬凌草甲素单药可显著抑制 OSRC-2 移植瘤的生长，联合 HCQ 后抑瘤效果进一步增强；给药期间小鼠体重无显著下降，肝肾组织 H&E 染色未发现明显病理损伤，提示给药方案具有良好的安全性（图 7A-D）。 图7 冬凌草甲素的抗肾癌作用及其分子机制 四、讨论与研究意义 本研究的核心创新在于首次鉴定 PRDX1 为冬凌草甲素的直接共价靶点，填补了冬凌草甲素在肾癌中直接作用蛋白的研究空白。PRDX1 在肾癌组织中高表达，且与肿瘤分期、转移风险及不良预后正相关，是极具潜力的肾癌治疗靶点；冬凌草甲素通过共价修饰抑制 PRDX1 功能，为开发 PRDX1 选择性抑制剂提供了天然先导化合物。研究同时解析了 PRDX1 下游的 ASK1-JNK 调控潜能 ——PRDX1 通常与 ASK1 结合维持其失活状态，冬凌草甲素修饰 PRDX1 后可能破坏二者复合物，释放并激活 ASK1，进而磷酸化激活 JNK，这为后续通路深度解析提供了方向。 在治疗策略层面，本研究明确了自噬在冬凌草甲素抗肾癌中的保护性作用，体内实验证实联合羟氯喹可显著增效，为 “天然产物 + 自噬抑制剂” 的联合用药方案提供了实验依据。同时研究也指出冬凌草甲素的成药性局限，包括溶解度低、生物利用度不足、PRDX1 广谱表达可能带来的脱靶风险等，后续可通过结构修饰开发高选择性衍生物，或采用纳米制剂、脂质体等递送系统提升肿瘤靶向性。 当然研究也存在一定局限：表面等离子体共振（SPR）未能直接检测二者结合，需更多生物物理技术补充验证；PRDX1 并非冬凌草甲素的唯一靶点，多靶点协同效应仍待解析；体内实验样本量有限，且未在更接近临床的模型中验证联合方案。总体而言，该研究不仅系统阐明了冬凌草甲素抗肾癌的分子机制，也为天然产物靶点鉴定与氧化应激靶向抗肿瘤研究提供了可借鉴的技术范式，具有重要的基础研究价值与临床转化启示。 冬凌草甲素进入肾癌细胞后，共价结合 PRDX1 的 Cys173 位点并抑制其过氧化物酶活性，导致胞内 ROS 清除受阻、水平升高；过量 ROS 一方面激活 JNK 通路与线粒体凋亡通路，另一方面触发内质网应激，通过 CHOP 等效应分子诱导细胞凋亡；同时，ROS - 内质网应激轴还会启动保护性自噬以缓解细胞损伤，抑制自噬可放大冬凌草甲素的抗肿瘤效应。 参考文献： Ding Z, Wang S, Chen J, Song Y, Zhu Z, Tong H, Iyaswamy A, Chen P, Wei X, Zhang W, Wang J, Yang C, Feng Y. Oridonin targets PRDX1 to promote apoptosis by inducing ROS-mediated ER stress and modulating autophagy.International Journal of Biological Sciences 2026; 22(12):6363-6380. doi:10.7150/ijbs.110208                                                                        . https://www.ijbs.com/v22p6363.htm