bn03

引言 生物医学作为当今世界最重要的基础学科之一，正随着科技的日新月异迅速发展。其中，对各种生物分子之间相互作用的探究一直是科学家们最关注的焦点之一。 目前，可以对生物分子相互作用进行分析的技术有很多，例如核磁共振波谱（NMR）、圆二色光谱（CD）、表面等离子共振技术（SPR）、等温滴定量热法（ITC）等。虽然这些分析技术各有优势，但近年来，一种新兴的分子相互作用检测技术的出现，依然凭借其独特的优势打破了现有格局，它就是生物膜干涉技术（Bio-Layer Interferometry，BLI）！ 相比于NMR、SPR等，BLI 技术有着自己的特点和优势： 一、无标记检测，BLI 技术无需任何分子标记，不破坏生物分子的原始状态，保证实验数据的准确性； 二、实时监测，整个实验过程实时监测，实时分析实验数据，可以快速对实验方案进行调整，节省实验时间； 三、浸入即读，生物传感器直接浸入样品孔直接读取数据，实验设备没有复杂的流路系统，也没有泵和进样系统，减少样品的损失，实验后还可将剩余样品进行回收。 凭借着诸多优势，BLI技术在生物分子相互作用检测领域逐渐崭露头角！ 生物膜干涉技术的基本原理 作为一种无标记（Label-free）光学生物传感技术，BLI常用于实时监测分析生物分子相互作用（例如抗原-抗体相互作用），并对其结合强度和动力学进行量化分析。与SPR技术不同的是，BLI技术中不使用金属芯片，而是利用生物传感器，将配体偶联在传感器的末端，浸入样品中来捕获分析物。 BLI技术基于光干涉的原理（图1），在其配套使用的生物传感器探头顶端表面，包覆有一层薄薄的具生物分子相容性的光纤膜层。当可见光通过传感器光纤膜时，会在膜层里两个表面分别发生反射，所产生两束反射光线进一步发生干涉现象，形成原始干涉图谱。当有配体通过不同的作用力偶联到膜层上时，膜层厚度发生一定变化，可见光通过时会形成新的干涉图谱。相较于之前的图谱，新图谱产生的位移即反映了膜层厚度的变化。此时，利用BLI仪器就可以实时监测相对位移变化，并将其转化为系统特有参数和图谱呈现出来，包括结合常数（ka或kon）和解离常数（kd或koff），以及起始结合速率，并通过拟合计算分析得到亲和力（KD）和浓度信息。 图1 BLI的基本构造原理 应用实例 作为新兴的光学生物传感检测技术，BLI 技术的应用其实并不“宽泛”，主要集中在生物医药相关领域，尤其是检测生物分子之间（主要指蛋白质）是否存在特异性结合，例如蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸、蛋白质与小分子、抗原与抗体等。鉴于此，笔者总结了近期涉及BLI技术的部分实例，希望籍此带领大家走进新兴的BLI检测技术！ 实例1：可吸入的双特异性抗体用于中和SARS-CoV-2变体 原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867422002690 自新冠疫情爆发以来，一系列流行的新冠变异株迭次出现。奥密克戎是传播力极强的变异株，该变异株的刺突蛋白（Spike）发生了超过30个位点突变，其中在RBD区（受体结合域）就发生了15个突变。目前陆续发现的很多具有良好中和活性的新冠抗体对其几乎完全失效，新冠疫苗的保护效果也被削弱。此外，市面上大多单抗药物都是通过静脉或皮下注射给药，而新冠病毒的感染往往集中在呼吸道和肺部，血液中病毒很少，使得抗体难以有效发挥阻断作用。这些因素给新冠广谱疫苗和药物的研发带来了巨大的挑战。 有鉴于此，复旦大学应天雷、孙蕾和吴艳玲等人基于首创的全人源纳米抗体快速筛选平台技术得到了一系列针对RBD不同表位的全人源纳米抗体，利用抗体的组合筛选，最终开发出了一个性质好，产量高，且广谱的全人源纳米双抗bn03。该双抗由靶向RBD的两个非ACE2竞争全人源纳米抗体组成，其中一端靶向三聚体内部高度保守的隐藏表位（n3130v），另一端靶向RBD的外侧面（n3113v），通过连接子将两个抗体串联形成双抗（图2）。基于BLI技术的研究结果表明，该双抗具有优良的理化性质，能有效雾化成可吸入的液滴，在新冠感染的小鼠中显示出了显著抗病毒效果（图3）。目前该双抗已进入中试生产阶段，正在加快向临床试验推进。同时，本文还揭示了一个高度保守的位于三聚体内部的隐藏表位，为广谱抗体和疫苗的设计提供了参考依据。 图2 双特异性抗体的工作机理 图3 bn03抗体对小鼠SARS-CoV-2病毒的治疗特性 实例2：纳米粒子软蛋白冠的原位分析和动态演化 原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-33044-y 在纳米颗粒/纳米药物与生物体作用过程中，生物微环境的蛋白质将通过与纳米颗粒表面作用及蛋白质-蛋白质作用，形成多层“纳米蛋白冠”。多层蛋白冠尤其是外层软蛋白冠直接参与调控纳米颗粒跨屏障过程、体内生物识别、输运与代谢及生物学效应，因此多层蛋白冠的结构与成分分析非常关键。如何动态地表征蛋白冠的形成与演化过程以及如何原位表征多层蛋白冠和软蛋白冠的组成和结构，一直是纳米生物医学研究面临的重大方法学挑战之一。 有鉴于此，中科院陈春英、王黎明、周云龙等人利用BLI技术与生物质谱等技术，建立了纳米颗粒表面多层蛋白冠的原位、动态分析方法（图4）。该方法可实时监测蛋白冠的形成、交换和解离过程，通过原位、快速地洗脱多层蛋白冠的组分，实现了软、硬蛋白冠的高效分离（SC、HC）、鉴定及时间分辨的动态研究，突破了软蛋白冠分析的技术瓶颈。基于此方法，研究发现纳米颗粒表面配体手性影响软、硬蛋白冠的组分进而产生不同的血液清除速率，即D-型比L-型纳米颗粒的软蛋白冠富集更多的调理素蛋白，导致D-型纳米颗粒血液循环时间更短、网状内皮系统清除更快（图5）。该原位分析方法还适用于超小、低密度纳米颗粒及软物质的表面蛋白冠研究。该研究提出的多层蛋白冠的分析新策略将为探究纳米颗粒与生物体相互作用，以及纳米药物的理性设计提供创新分析方法。 图4 基于时间和表面特性的蛋白冠演化示意图 图5 HC和SC蛋白的结合亲和力 实例3：选择性光亲和探针用于监测培养细胞中法尼醇X受体的表达 原文链接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.analchem.2c01206 法尼醇X受体（FXR）是核受体超家族的一员，是一种重要的配体激活转录因子，主要在肝脏，肠道以及肾上腺中高度表达。在结合配体后，FXR会进入细胞核与靶基因的启动子结合，从而调节它们的转录。其表达水平受到许多因素的影响，比如饮食与昼夜节律。同时FXR还与胰岛素抵抗，炎症，细胞凋亡等生物学现象有关，因此这些特征也使其成为了诸如胆管炎，肥胖，非酒精性脂肪肝等疾病治疗的重要靶点。但是目前没有一种可以在体内实时监测FXR的方法，因此严重限制了人们对FXR生理与病理学功能的研究。 有鉴于此，中国药科大学郝海平、王红团队开发了一个特异性结合FXR的具有光反应性的可点击化学探针，成功实现了对细胞中FXR表达的监测与原位标记（图6）。作者选择了奥贝胆酸（OCA）这种高选择性FXR激动剂作为探针合成的底物以实现特异性结合的FXR受体。其次对其修饰上双吖丙啶以及炔基，利用双吖丙啶实现光交联，炔基实现点击化学反应。基于这一思路，作者先后合成了OL2探针以及通过点击化学对OL2引入荧光基团后得到的OLNCA探针。BLI测试结果表明探针与重组蛋白的结合能具有较高的Kd值，这表明其具有较高的结合能力（图7）。此外，基于荧光成像测试，作者成功做到了FXR的原位成像以及亚细胞定位。这一方法不仅有利于FXR药物研发，同时也可以应用于其他核受体的研究。 图6 FXR受体的原位检测策略 图7 探针的光学性质及与重组蛋白结合的结合力 实例4：具有高亲和力的肽结合剂用于识别SARS-CoV-2刺突受体 原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.2c03707 由新型冠状病毒SARS-CoV-2引起的新冠肺炎已在全球累积造成超过5亿的确诊病例，累计死亡人数超过600万，成为国际关注的公共卫生事件。实现新冠病毒的快速检测是预防病毒大规模传染的重要前提之一。目前，基于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）的检测是监测SARS-CoV-2感染的黄金标准。然而此类技术通常耗时长久且需要专业技术人员和专业仪器，严重阻碍了检测工作的迅速开展。 有鉴于此，中国医学科学院基础医学研究所王晨轩、许海燕等人报道了一种能够识别新冠病毒受体结合结构域（RBD）蛋白的亲和肽。选取SARS-CoV-2上的RBD蛋白作为靶蛋白，通过噬菌体展示技术筛选出了靶向RBD的亲和肽R1（图8）。R1亲和肽与靶点RBD有高亲和力，平衡解离常数（KD）在1 nM以下。另外，作者通过BLI技术研究了ACE2蛋白和RBD之间相互作用强弱，测得其KD为（5.8 ± 0.2）×10-9 M，是R1-RBD 相互作用KD值的8倍，表明R1与RBD之间具有更强的亲和力。此外，作者还研究了R1亲和肽与Gamma、Lambda、Delta和Omicron变异株的RBD之间的亲和力，发现KD值均在nM量级，即R1对四种突变体的RBD保持了较强的亲和力（图9）。本文设计的R1亲和肽修饰的金纳米颗粒对RBD展示出特异且灵敏的光谱响应，有望应用于新型冠状病毒的胶体金检测。 图8 靶向RBD亲和肽R1的选择示意图 图9 R1亲和肽对变异株的RBD亲和力 参考文献 [1] Cheng Li, Wuqiang Zhan, Zhenlin Yang, Chao Tu, Gaowei Hu, Xiang Zhang, Wenping Song, Shujuan Du, Yuanfei Zhu, Keke Huang, Yu Kong, Meng Zhang, Qiyu Mao, Xiaodan Gu, Yi Zhang, YouhuaXie, QiangDeng, Yuanlin Song, Zhenguo Chen, LuLu, Shibo Jiang, Yanling Wu, Lei Sun, Tianlei Ying. Broad neutralization of SARS-CoV-2 variants by an inhalable bispecific single-domain antibody. Cell 185, 1389-1401, 2022. DOI: 10.1016/j.cell.2022.03.009. [2] Didar Baimanov, JingWang, Jun Zhang, Ke Liu, Yalin Cong, Xiaomeng Shi, Xiaohui Zhang, Yufeng Li, Xiumin Li, Rongrong Qiao, Yuliang Zhao, Yunlong Zhou, Liming Wang, Chunying Chen. In situ analysis of nanoparticle soft corona and dynamic evolution. Nat Commun 13, 5389 (2022). DOI: 10.1038/s41467-022-33044-y. [3] Xiao-Wei Xu, Ya Zhu, Jiang-Zhou Song, Gui-Qing Zou, Zhou Zhao, Qiu-Ling Zheng, Li-Juan Cao, Guang-Ji Wang, Hong Wang, and Hai-Ping Hao. Selective Photoaffinity Probe for Monitoring Farnesoid X Receptor Expression in Cultured Cells. Analytical Chemistry 2022 94 (30), 10722-10729. DOI: 10.1021/acs.analchem.2c01206. [4] Lanlan Yu, Ruonan Wang, Tao Wen, Lei Liu, Tao Wang, Shuli Liu, Haiyan Xu, and Chenxuan Wang. Peptide Binder with High-Affinity for the SARS-CoV-2 Spike Receptor-Binding Domain. ACS Applied Materials & Interfaces 2022 14 (25), 28527-28536. DOI: 10.1021/acsami.2c03707. 免责声明：本公众号致力于分享最新科研资讯、干货资料，相关内容仅供参考学习，所有转载内容，均不代表【科学10分钟】赞同其观点，不能完全保证其真实性。如若本公众号无意侵犯媒体或个人知识产权，请联系【科学10分钟】小编：18384128522，我们将立即予以删除，谢谢。 · · ·