8a(Hangzhou Institute of Medicine, Chinese Academy of Sciences)

点击蓝字 ↑ 关注药研视角 PharmaView JMC速览 2025.11.05 近日，国科大杭高院杨财广/董泽团队在药物化学权威期刊《Journal of Medicinal Chemistry》上发表了一篇题为“基于结构设计的强效双竞争性FTO抑制剂用于靶向m6A去甲基化酶治疗急性髓系白血病的研究”的研究论文。该研究基于片段链接策略，成功设计并合成了一种新型双竞争性FTO抑制剂8a，能够同时占据FTO的底物结合位点和2-OG辅因子结合位点，表现出纳摩尔级别的抑制活性和良好的选择性。为进一步提升细胞渗透性，研究团队开发了其前药形式8a-1，在多种急性髓系白血病（AML）细胞系中展现出显著的抗白血病活性，并在小鼠异种移植模型中有效抑制肿瘤生长。该研究不仅深化了对FTO在AML中致病机制的理解，也为靶向RNA表观遗传修饰的抗肿瘤药物开发提供了新思路。【JMC】上海药物所杨财广团队：新型口服FTO抑制剂展现强效抗白血病活性Angew | 上海药物所柳红/杨财广发现新型ALKBH5共价抑制剂并开展作用机制研究【JMC】上海药物所柳红&杨财广团队发现具有强效抗白血病活性的酰腙骨架的新型RNA去甲基化酶FTO抑制剂【JMC】上海药物所杨财广报道新型ClpP激动剂ZY39：对抗耐药金黄色葡萄球菌的有力武器 1 min速览 研究背景 RNA 的 N6-甲基腺苷（m6A）修饰是真核生物最普遍的内部转录后修饰，其动态可逆，由“写入酶”（METTL3/14 等）与“擦除酶”（FTO、ALKBH5 等）共同调控。 FTO 作为首个被发现的 m6A 去甲基化酶，在急性髓系白血病（AML）等多种肿瘤中呈高表达，通过擦除 m6A、稳定 c-Myc 等致癌 mRNA，促进白血病干细胞自我更新和化疗耐药，成为新的治疗靶点。 目前已报道的 FTO 抑制剂多属 2-OG 竞争性化合物，存在选择性不足、细胞活性弱或体内药效差等问题；同时占据底物与辅因子位点的“双竞争性”抑制剂尚属空白。 重点内容 设计策略： 采用“片段链接”理念，将已报道的底物位点片段 meclofenamic acid（MA）与 2-OG 竞争性片段（延胡索酸等）通过柔性乙二胺 linker 连接，构建可同步占据双位点的分子。 化合物 8a 的优化与活性： 构效关系（SAR）显示：延胡索酸是最优 2-OG 模拟基团；乙二胺 linker 长度与柔性至关重要；B 环 3,5-二氯或氯-环丙基取代活性最佳。 8a 在无细胞体系中抑制 FTO 的 IC50 达 43.7 nM；对同源酶 ALKBH3/ALKBH5 在 50 μM 下无明显抑制，选择性 >1000 倍。 作用机制验证： 生化竞争实验、CETSA 热稳定实验及分子对接共同证明 8a 同时结合底物与 2-OG 口袋，呈典型双竞争抑制模式。 共晶结构（FTO/8j）揭示关键氢键与 CH-π 网络，解释了高活性与选择性的结构基础。 前药 8a-1 的细胞与体内药效： 双酯化前药 8a-1 细胞渗透性增强，在 7 种 AML 细胞系中 IC50 2.3–5.5 μM，显著上调整体 m6A 水平，抑制 c-Myc/CEBPA，激活 RARA/ASB2。 NB4 小鼠异种移植模型中，30/60 mg kg⁻¹ day⁻¹ i.p. 连续给药 9 天可剂量依赖性抑制肿瘤生长（>60%），未出现体重下降或主要器官毒性。 研究总结 本研究基于结构生物学指导，开发出兼具“底物+辅因子”双竞争结合模式的高活性、高选择性 FTO 抑制剂 8a，并通过前药策略实现细胞及体内有效暴露。化合物 8a-1 在 AML 模型中完成靶点占位-表观重编程-肿瘤抑制的验证，为阐明 FTO 在白血病中的致病功能提供了优质化学探针，也为针对 RNA 表观遗传修饰的抗肿瘤药物研发奠定了新框架。 图片来源：ACS 详细阅读 01 INTRODUCTION 研究背景 在急性髓系白血病（AML）中，c-Myc 的异常高表达驱动疾病快速进展、复发及耐药，已成为临床极具挑战性的亚型。尽管已有 FLT3 或 BCL-2 抑制剂等靶向药物，但 c-Myc 驱动的白血病细胞可通过代谢重编程和免疫逃逸等机制产生适应性耐药。RNA N6-甲基腺苷（m6A）去甲基化酶 FTO 在此过程中的作用尤为关键：它通过擦除 c-Myc mRNA 上的 m6A 修饰，稳定并增强其翻译，从而维持白血病干细胞的自我更新和化疗耐受。此外，FTO 还通过调控 RARA/ASB2 和 CEBPA 等通路广泛影响致癌网络，使其成为 AML 适应性耐药的重要节点，亟需开发可同时阻断其催化与支架功能的小分子抑制剂。已有研究证实，FB23-2、CS1（Bisantrene）和 CS2（Brequinar）等 FTO 抑制剂可通过下调 c-Myc 表达抑制 AML 细胞分化与干性，并在小鼠模型中延长生存，提示 FTO 是 c-Myc 驱动型 AML 的有效靶点。除 AML 外，FTO 在弥漫大 B 细胞淋巴瘤和 T 细胞急性淋巴细胞白血病中也通过 m6A 依赖机制促进肿瘤发生，并可被 CS1 等抑制剂逆转，因此开发结构多样的 FTO 抑制剂对于应对不同血液肿瘤的耐药模式具有重要意义。基于片段链接、同时占据底物和 2-OG 结合口袋的双竞争策略，已在 Jumonji 组蛋白去甲基酶等 2-OG 依赖双加氧酶中取得成功，而在 FTO 亚家族中，通过结构导向优化已获得高选择性抑制剂 HZ 和 HZ-MA。然而，现有双竞争抑制剂在细胞通透性和体内药效方面仍存在不足，需通过前药策略或新化学类型加以改进。本研究开发的 8a 正是基于这一策略，在 AML 异种移植模型中实现了亚微摩尔体外活性和显著体内疗效，为靶向 RNA 修饰酶提供了新范式。 02 Drug Design ①双竞争 FTO 抑制剂的理性构建与结构优化 作者首先解析 FTO/MA 共晶结构（PDB:4QKN），发现 MA 占据的底物口袋与 2-OG 辅因子位点相邻，于是提出“片段链接”思路：在 MA 的芳胺对位引入羧酸把手，再通过不同长度和化学性质的 linker 将改造后的 MA 类似物与多种 2-OG 模拟片段（延胡索酸、吡啶二羧酸、天然氨基酸等）连接起来，实现同时占据两个位点的双竞争性结合。通过固定 MA 母核和乙二胺 linker 的系统 SAR 研究，发现含刚性反式双键的延胡索酸片段最能精准模拟 2-OG 与 Fe²⁺ 的螯合几何，而 linker 必须保持短且柔性；进一步对 MA 的 B 环进行卤素或环丙基等细微修饰，显著增强与通道残基的 CH–π 相互作用，最终获得纳摩尔级 IC₅₀、对 ALKBH3/5 选择性大于 1000 倍的候选物 8a。晶体学和分子对接共同证实，8a 的 MA 核心和延胡索酸尾端分别嵌入底物与 2-OG 口袋，形成多重氢键及水介导网络，从而阻断 FTO 对 m6A 的识别与催化，为后续细胞活性与体内药效奠定结构基础。 ②双竞争 FTO 抑制剂的构效关系解析 作者围绕 2-OG 模拟片段、连接臂（linker）和 MA 芳环（B-ring）三个关键变量系统探讨了结构-活性关系。首先固定 MA 骨架与乙二胺 linker，考察不同 2-OG 模拟物：含反式双键的延胡索酸（8a）表现出最佳活性（IC₅₀ 1.3 μM），其饱和类似物琥珀酸（8b）活性完全丧失，凸显刚性平面结构对 Fe²⁺ 螯合的重要性；2,4-吡啶二羧酸衍生物（8c）亦保持纳摩尔级效力，而氮原子位置或缺失羧基的类似物（8f、8h）活性显著下降，说明负电荷与螯合几何缺一不可。随后以延胡索酸为最优片段，优化 linker 长度与立体特征：乙二胺（8a）长度最合适，延长至丙二胺或丁二胺（17a–b）导致活性完全丧失；引入 α-甲基、环丙基或环己二胺（17c–f）均因空间位阻或刚性过强而大幅降低抑制力，表明短且柔性的连接臂是同时占据双口袋的关键。最后对 MA 的 B-ring 取代进行微调：3,5-二氯（8a）为最佳组合；单氟（8i）或三氟甲基（8l）等强吸电子基团削弱活性，而氯/乙基（8j）或氯/环丙基（8k）保持或提升活性（8k IC₅₀ 0.6 μM），显示中等供电子效应与适宜疏水体积最有利于与 Thr92 等残基形成 CH–π 相互作用。整体 SAR 揭示了 FTO 双口袋对配体几何、电子性质及空间体积的严格限制，为后续结构优化和体内药效研究提供了明确方向。 图片来源：ACS 03 RESULTS ①先导化合物 8a 的生化表征与机制验证 生化水平系统评价显示，8a 对 FTO 的去甲基化抑制活性达 IC₅₀ 43.7 ± 4.2 nM，比其母体 MA 片段（22 μM）提升约 500 倍，且对同源酶 ALKBH3/ALKBH5 在 50 μM 下仍无显著抑制，选择性 >1000 倍；差示扫描荧光（DSF）实验进一步证实 8a 能浓度依赖地稳定 FTO 热变性温度（ΔT_m 1.9 °C）。竞争抑制实验表明，8a 和类似物 8j 的抑制效果可被过量 2-OG 逆转，而 MA 片段本身不受影响，说明 8a 确实占据了 2-OG 辅因子位点；细胞热漂移（CETSA）也检测到 8a 能使内源性 FTO 热稳定，而对 ALKBH5 无作用，从而从结合、竞争到细胞靶点参与多层面验证了 8a 作为双竞争性 FTO 抑制剂的机制与选择性。 图片来源：ACS ②FTO/8j复合物晶体结构揭示的双位点结合模式 在2.3 Å分辨率下解析的FTO/8j共晶结构显示，抑制剂8j以伸展构象嵌入由底物口袋和延伸疏水通道共同形成的狭长裂隙：其A环羧酸与Ser229侧链形成氢键，B环酰胺NH向His232提供氢键，C环氯原子与Thr92主链羰基发生氯键相互作用，而延胡索酰片段的末端羧酸则接受His231的氢键并深入一个由Gln86等残基构成的邻近酸性腔；尽管该晶体构象中延胡索酸未占据经典2-OG位点，但DSF测定Gln86Ala突变体与野生型蛋白对8a的热稳定效应几乎相同，提示晶体堆积或缓冲条件可能诱导了替代结合姿态。分子对接进一步表明，8a可轻松调整构象使延胡索酸尾端准确落入2-OG辅因子位点，与Fe²⁺及Arg96、Asp233、Arg316、Ser318等形成理想的二齿螯合与氢键网络，同时MA核心保持与底物口袋的CH–π和氢键相互作用，从而在同一结合模型中实现“底物+辅因子”双位点同时占据，为8a的双竞争抑制机制提供了结构依据。 ③计算化学确证 8a 的双竞争结合机制 为了进一步验证 8a 确实同时占据底物与 2-OG 两个位点，作者利用 MOE 软件将 8a 对接到 FTO/MA 共晶结构（PDB:4QKN）中。计算结果显示，8a 的 MA 核心稳稳落入底物口袋，与 Ser229、Thr92、Leu109 等形成氢键和 CH–π 相互作用；延胡索酸尾端则伸入 2-OG 辅因子位点，羧酸氧原子与 Fe²⁺ 及 Arg96、Asp233、Arg316、Ser318 等残基建立多重直接或水介导的氢键网络。与 MA 和 2-OG 晶体姿态的叠加比较可见，8a 在同一结合事件中重现了两者各自的关键接触，从而在同一分子内实现“底物+辅因子”双位点同步占据；这与生化竞争实验中 2-OG 可逆转 8a 抑制、而 MA 片段无此现象的结果高度一致，从计算化学角度确证了 8a 的双竞争抑制机制。 图片来源：ACS ④前药8a-1在AML细胞系中的抗白血病活性与机制 为克服二羧酸母核8a膜通透性差的问题，作者将其制成系列酯化前药，其中双乙酯7a与甲乙酯8a-1在七种AML细胞系中均表现出2–6 μM的抗增殖活性，且呈时间依赖性抑制集落形成并诱导Annexin V阳性凋亡；机制层面，8a-1处理24 h即可显著升高整体RNA m6A水平，下调c-Myc与CEBPA蛋白，上调RARA与ASB2，其转录水平变化与蛋白表达一致，证实通过靶向抑制FTO重塑m6A表观转录组，从而对多种AML细胞产生广泛而快速的抗白血病效应。 图片来源：ACS ⑤前药8a-1在NB4裸鼠移植瘤模型中的体内抗白血病功效 在NB4裸鼠皮下移植瘤模型中，每日腹腔注射30或60 mg kg⁻¹的8a-1连续9天，可剂量依赖性地抑制肿瘤生长，高剂量组终点瘤重降低逾六成，且小鼠体重及心、肝、脾、肺、肾等主要脏器重量与组织学均无显著异常，显示出良好的耐受性；Western blot与斑点杂交分析显示，治疗组肿瘤内c-Myc、CEBPA表达下调，RARA、ASB2上调，整体m6A水平显著升高，与细胞水平机制一致，证明8a-1通过有效阻断FTO去甲基化活性，在动物体内实现表观转录重编程并发挥显著抗AML疗效。 CONCLUSIONS 本研究通过结构导向的片段链接策略，获得兼具“底物+2-OG”双竞争结合模式的高活性、高选择性FTO抑制剂8a，其前药8a-1在多种AML模型中实现m6A水平显著上调、c-Myc等致癌基因下调及肿瘤生长抑制，且未出现明显毒性，为靶向RNA表观遗传的抗肿瘤治疗提供了概念验证；尽管晶体结构提示化合物存在结合姿态的晶体环境依赖性，但生化竞争、CETSA和分子动力学一致支持双位点占据机制，后续需进一步通过突变体或冷冻电镜解析动态构象，并开展系统药代动力学、不同基因型AML及联合用药研究，以推动该化学骨架向临床转化，同时为开发新一代双机制表观转录调控疗法树立范式。 文献详细全面信息请跳转原文阅读： https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.5c01738  喜欢此内容的人还喜欢 JMC速览|药物化学杂志10月部分国内团队成果（1） 药研视角 【JMC】沈阳药科大学王钝：新型iRGD修饰的PROTAC纳米粒用于增强肿瘤穿透和PD-L1降解 药研视角 中国药科大学胡庆华/周梦泽&苏州大学李环球/田盛：新型P2Y14R抑制剂靶向肝星状细胞，为肝纤维化治疗破局！ 药研视角 JMC速览|药物化学杂志10月部分国内团队成果（2） 药研视角 说    明 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