Hepatitis B vaccine(GlaxoSmithKline Plc)

摘要：疫苗是公共卫生的重要工具，在减轻人群中传染病负担方面发挥着重要作用。新出现的传染病和疫情对疫苗开发提出了新的挑战，这要求在有限的资源下迅速设计和生产出安全有效的疫苗。在这里，我们关注从传统的预防性疫苗到针对慢性疾病和癌症的治疗性疫苗的广泛领域的疫苗开发，提供了八种不同疫苗形式（减毒活疫苗、灭活疫苗、多糖和多糖结合疫苗、重组亚单位疫苗、病毒样颗粒和纳米颗粒疫苗、多肽疫苗、DNA疫苗和mRNA疫苗）以及针对五种实体瘤（肺癌、乳腺癌、结直肠癌、肝癌和胃癌）、三种传染病（人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒和人乳头瘤病毒引起的疾病）和三种常见慢性疾病（高血压、糖尿病和血脂异常）的治疗性疫苗的最新进展的全面概述。我们旨在提供有关疫苗技术、平台、应用和潜在下一代预防性和治疗性疫苗技术的新的见解，为未来疫苗设计铺平道路。 1.引言 疫苗接种是保护易感人群和控制传染病最经济有效的手段。因此，疫苗被认为是20世纪十大公共卫生成就之一。疫苗的使用使人类能够在全世界范围内根除天花，消除大多数国家的脊髓灰质炎，并控制白喉、百日咳、破伤风、腮腺炎、麻疹、风疹、流感嗜血杆菌B型等传染病，在世界部分地区显著降低了发病率和死亡率。然而，由SARS-CoV-2引起的当前COVID-19大流行已导致超过5亿确诊病例和超过600万人死亡。新出现的传染病和疫情对疫苗开发提出了新的挑战，这要求在有限资源下迅速开发安全有效的疫苗。此外，包括人类免疫缺陷病毒（HIV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、巨细胞病毒（CMV）、单纯疱疹病毒（HSV）和Epstein-Barr病毒（EBV）在内的几种由传染性病原体引起的严重疾病尚未开发出疫苗，需要新的疫苗开发策略。总的来说，疫苗使人们能够过上更健康、更长寿的生活。然而，随着预期寿命的增加，非传染性疾病（NCDs）的负担，如癌症、自身免疫疾病、高血压、动脉粥样硬化和糖尿病等，已经增加。NCDs，也称为慢性疾病，是由遗传疾病以及生理、环境和生活方式因素的组合引起的，并且可以持续很长时间。根据世界卫生组织报告，每年有4100万人死于NCDs，占全球死亡人数的71%。这种疾病负担的转变加剧了治疗NCDs的疗法的迫切需求。传统的预防性疫苗通过向健康个体接种抗原来预防疾病，从而建立特异性免疫，这主要发生在传染病上。治疗性疫苗用作暴露后治疗，以增强免疫系统对抗诸如慢性感染、癌前病变或癌症等先前存在的疾病。治疗性疫苗旨在调节人体免疫系统，并诱导细胞介导的免疫反应，以针对与NCDs相关的细胞或分子，而不是病原体或病原体感染的细胞。治疗性疫苗与预防性疫苗在一些重要方面有所不同。由于预防性疫苗通常给予健康人，这些人对不良事件的容忍度很低。相比之下，治疗性疫苗通常是暴露后治疗，并且患者高度耐受。成熟的传统疫苗和快速增长的新型疫苗技术促进了全球预防性和治疗性疫苗的开发。近年来，免疫学、分子生物学和基因组学的进步导致了更有效的疫苗成功。mRNA疫苗（Comirnaty、Spikevax、AWcorna）和病毒载体疫苗（Convidecia、AZD1222、Ad26.COV2.S）针对COVID-19大流行，是有史以来开发最快的疫苗。肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗（Prevnar13、Prevnar 20）基于蛋白结合疫苗技术。人乳头瘤病毒（HPV）疫苗（Gardasil、Gardasil 9、Cervarix、Cecolin和Wozehui），基于基因工程技术设计，通过表达病毒样颗粒（VLP）预防与HPV相关的癌症。脑膜炎球菌B型疫苗（Trumenba、Bexsero）代表了从基因组到疫苗的“反向疫苗学”策略。最后，新型佐剂重组带状疱疹疫苗，Shingrix，扩大了免疫功能低下人群的免疫力。疫苗的不断发展提高了我们对免疫学和免疫基础的理解，针对NCDs的疫苗成为研究的新“热点”。目前，有前列腺癌疫苗（Provenge）、膀胱癌疫苗（TheraCys）、结肠癌疫苗（OncoVAX）、黑色素瘤疫苗（M-VAX和Melacine）、肾细胞癌疫苗（Oncophage）、肺癌疫苗（Racotumomab和CIMAvaxEGF）等。此外，治疗性疫苗在高血压、慢性乙型肝炎等疾病领域也取得了巨大进展。本综述旨在提供我们对最新疫苗技术、平台、应用和潜在下一代疫苗技术的当前进展和理解的概述。本综述将讨论预防性疫苗和治疗性疫苗。根据疫苗的成分，预防性疫苗可分为减毒活疫苗、灭活疫苗、多糖和多糖结合疫苗、重组亚单位疫苗、多肽疫苗、DNA和mRNA疫苗。此外，根据疾病分类，治疗性疫苗可分为针对肿瘤的疫苗、针对传染病的疫苗和针对慢性疾病的疫苗。我们相信，本综述将为疫苗技术和开发提供见解。 2.预防性疫苗开发的进展 2.1.减毒活疫苗 减毒活疫苗是通过保留抗原性但通过化学或其他方法遗传工程改造或减毒（减弱）的有机体创建的。通常，这些疫苗能够诱导具有长期持久性的体液和细胞免疫反应；然而，仍然存在毒力逆转的风险，这使得疫苗不适合对抗高度致病性变体。此外，减毒疫苗的有效期较短，热稳定性差，对储存和运输有严格的要求；这在大流行情况下会导致响应缓慢。由于减毒疫苗可能恢复到有毒形式，它们也可能在免疫功能低下的人中引起严重疾病。尽管存在这些问题，并且因为好处大于风险，减毒活疫苗仍然是疫苗开发中一个宝贵的平台。目前许可的减毒疫苗列表包括天花（牛痘）（ACAM2000）、麻疹、腮腺炎和风疹病毒（M-M-RII）、结核病（卡介苗（BCG））、霍乱（Vaxchora）、流感（FluMist）、登革热（Dengvaxia；四价）、轮状病毒（Rotarix）、水痘病毒、伤寒（Vivotif）、黄热病（YF-Vax）等等（表1）。 表1 中国目前许可的疫苗类型 根据世界卫生组织发布的一份文件（https://www.who.int/publications/m/item/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines），有两种减毒活COVID-19疫苗正在进行临床试验：由Codaenixin与印度血清研究所合作开发的COVI-VAC，以及由Meissa Vaccines，Inc.开发的MV-014-212。正在进行研究以提高减毒活疫苗的安全性并进一步减少其毒力；这通过增加复制保真度、通过密码子去优化以及通过病毒基因组的工程改造进行了测试。Vignuzzi等人试图利用通过增加复制保真度限制病毒种群多样性的观察，这可以显著降低组织嗜性和病毒致病性。结果表明，在动物感染模型中，具有减少遗传多样性的脊髓灰质炎病毒变种激发了保护性免疫反应。这种限制病毒准种群多样性为RNA病毒的稳定减毒疫苗工程提供了一种新方法。密码子对去优化（CPD）是另一种有效的病毒减毒策略，它利用次优密码子对来减毒重编码病毒。Groenke等人通过改变同步密码子的位置，在重编码基因组中增加了次优密码子对和CpG二核苷酸的数量。他们在流感A病毒上的研究显示，次优密码子对引起了减毒，而CpG二核苷酸比例的增加没有效果。此外，他们表明次优密码子对可以降低去优化密码子对mRNA的稳定性和翻译效率。因此，蛋白质产量的减少直接导致病毒减毒。最近，Trimpert等人构建了一个COVID-19候选减毒活疫苗，名为sCPD9，通过大规模编码SARS-CoV-2基因组（通过CPD方法修改），并在罗布罗夫斯基矮仓鼠中评估了疫苗的免疫原性和保护效果。作者表明，sCPD9的单次鼻内接种激发了针对当前四个SARS-CoV-2变体的交叉中和抗体反应：B.1.1.7（阿尔法）、B.1.351（贝塔）、B.1.1.28.1（伽马）和B.1.617.2（德尔塔），保护免受类似COVID-19的疾病。一种减毒活COVID-19疫苗，COVI-VAC，通过使用同义次优密码子对编码病毒刺突蛋白的一部分而开发。作者发现，该疫苗在仓鼠模型中刺激了高水平的中和抗体，高度减毒的COVI-VAC在单次鼻内剂量下具有保护性。该疫苗现在正在进行III期临床试验（ISRCTN15779782）。安伯（amb）突变是使减毒活疫苗更安全、更有效的一种新策略。这种方法通过将遗传密码扩展到流感病毒基因组中，显示出在产生活体但复制无能力的病毒疫苗方面的前景。研究人员通过含有正交翻译机制的转基因细胞系扩展了流感A病毒基因组的遗传密码。这种方法在转基因细胞系中创建了早终止密码子（PTCs）——携带病毒足够具有感染力但在常规细胞中无法复制，同时在转基因细胞系中产生高繁殖力和遗传稳定的后代病毒。在小鼠、雪貂和豚鼠模型中，这种活疫苗激发了对亲本和抗原性不同的菌株的强大免疫反应。另一种有前景的基因工程减毒病毒的方法是工程化病毒基因组。研究人员报告了一种脊髓灰质炎病毒2型疫苗株（nOPV2）的开发，他们在其中引入了对Sabin2基因组的50个非翻译区域的修改，以稳定减毒决定因素。在这种方法中，2C编码区域防止重组，3D聚合酶限制了病毒的适应性。这种菌株在遗传上比原始的Sabin2菌株更稳定，不太可能恢复毒力。在临床前和临床研究中，nOPV2具有免疫原性，并可能导致脊髓灰质炎病毒的完全根除。另一组合理设计了一种减毒水痘疫苗候选物，v7D，其中删除了毒力因子ORF7。该病毒在MRC-5成纤维细胞和人类PBMC（VZV传播载体）中的复制类似于野生型病毒，但在感染人类皮肤和神经细胞时严重受损。然而，v7D在体外和各种小动物中具有与vOka相当的免疫原性。最后，v7D在非人类灵长类动物中耐受性良好且具有免疫原性。这种疫苗目前正在中国进行II期试验（ChiCTR1900022284）。未来减毒疫苗的开发应该专注于选择更稳定的病毒株，并采用基因编辑策略来稳定减毒因素。 2.2.灭活疫苗 灭活疫苗是从病原体（如病毒或细菌）的灭活形式中提取的，这些病原体经过培养后，通过物理或化学方法灭活，使其不再具有传染性或毒性。灭活疫苗包括全灭活疫苗或部分灭活疫苗（Toxoid疫苗）。Toxoid疫苗使用细菌产生的灭活毒素，这些毒素的毒性已被抑制，但保留了免疫原性。与减毒疫苗和基因工程疫苗相比，灭活疫苗具有开发周期短、生产工艺相对成熟、非传染性、高安全性等优点。灭活疫苗的生产成本通常较低，并且由于它们耐温，可以长时间储存。灭活疫苗通常诱导体液免疫反应，而细胞免疫较弱。通常需要多次接种才能产生保护性免疫，从而降低疫苗依从性。在灭活过程中，病毒抗原可能在结构上受损，导致抗原性降低，疫苗的免疫原性降低。有许多批准的灭活疫苗：代表性的例子包括甲型肝炎病毒疫苗（HAVRIX和VAQTA）、脊髓灰质炎病毒疫苗（IPOL）、日本脑炎病毒（IXIARO）疫苗、白喉和破伤风类毒素和无细胞百日咳（INFANRIX）疫苗、白喉和破伤风类毒素和无细胞百日咳吸附和灭活脊髓灰质炎病毒疫苗（KINRIX）疫苗、白喉和破伤风类毒素和无细胞百日咳疫苗吸附（DAPTACEL）疫苗、流感疫苗（Fluarix四价）、人类狂犬病疫苗（RabAvert和Imovax）、肠道病毒71型（Inlive）、肾综合征出血热疫苗、蜱传脑炎疫苗（FSME-Immun），以及COVID-19疫苗（CoronaVac、WIBP-CorV、BBIBP-Cor）（表1）。在撰写本文时，全球已有11种针对COVID-19疾病的灭活疫苗获得有条件或紧急使用批准（包括中国5种疫苗）。从其他病原体研究中，已开发出一种寨卡病毒灭活疫苗候选物（PIZV）。在两次免疫剂量后，含铝佐剂的候选PIZV在CD-1和AG129小鼠中显示出高度免疫原性，从而支持PIZV候选物进入临床开发（NCT03343626）。历史上，手足口病（HFMD）的爆发主要由肠道病毒71和柯萨奇病毒A16引起。最近，柯萨奇病毒A6和A10与全球散发HFMD病例和爆发的增加有关。在一项研究中，柯萨奇病毒A6、A10和A16（CA6、CA10和CA16）在不同条件下通过甲醛或b-丙内酯（BPL）灭活，并检查了免疫效果。作者发现，CA10和CA16在BPL灭活（BI）后的免疫效果优于甲醛处理。此外，双三价治疗诱导了足够的中和抗体和细胞介导的免疫反应，表明BI-CA6、CA10和CA16作为潜在的多价疫苗候选物。灭活疫苗平台相对成熟，高度安全，可用于快速应对新出现的病原体，因此对于应对爆发至关重要。 2.3.多糖和多糖-蛋白结合疫苗 多糖疫苗是由基于碳水化合物的聚合物制成的，如来自细菌病原体的荚膜结构的壁酸或肽聚糖。一些针对细菌荚膜多糖的疫苗，例如脑膜炎球菌A/C/Y/W-135疫苗（Meningune-A/C/Y/W-135）、肺炎球菌疫苗（Pneumovax 23）和伤寒Vi多糖疫苗（Typhim Vi）（表1），已被批准用于预防侵袭性脑膜炎和伤寒疾病。然而，由于多糖不像蛋白质那样在主要组织相容性复合体（MHC）分子上被处理和展示，多糖疫苗通常显示出较弱的免疫原性、持久性差，并且只产生T细胞非依赖性免疫反应。没有T细胞的参与，这些疫苗不会引起记忆免疫反应或亲和力成熟，并且诱导的抗体——主要是IgM和IgG2——不适合激活补体，导致免疫保护无效且短暂。 多糖结合疫苗可以克服多糖疫苗的缺点。多糖结合疫苗是通过将病原体的荚膜多糖共价连接到蛋白载体上制备的，例如白喉类毒素（DT）、破伤风类毒素（TT）、改良的白喉毒素称为CRM197、脑膜炎球菌外膜蛋白复合物（OMPC）或H. influenzae蛋白D HiD。蛋白载体和多糖同时出现在MHC-II上，导致T细胞受体（TCR）识别并激活Th反应。Th与B细胞之间的相互作用将改善和塑造抗体的滴度和质量以及B细胞记忆反应。共价结合方法包括标准化学交联和生物结合技术。目前批准的多糖结合疫苗通常是通过化学方法生产的，包括肺炎球菌13价、15价和20价结合疫苗（Prevnar 13, Vaxneuvance, Prevnar 20）、B型流感嗜血杆菌结合疫苗（Liquid PedvaxHIB, HIBERIX, ActHIB）和两种脑膜炎球菌结合疫苗（A, C, Y, W, MenQuadfi；A, C, Y和W-135, MENVEO, Menactra）（表1），等等。最近，Enotarpi等人报告了使用MenA，一种稳定的糖模拟结合疫苗，诱导针对A群脑膜炎奈瑟菌的保护性抗体。该团队生成了一系列未乙酰化的carbaMenA寡聚体，这些寡聚体被证明比荚膜多糖（CPS）更稳定，并表明八聚体（DP8）的随机O-乙酰化改善了抗MenA CPS抗体结合的抑制，并在与CRM197结合后诱导了抗MenA保护性小鼠抗体。这种方法可用于生成稳定的新糖结合疫苗。 生物结合技术允许多糖和载体蛋白在微生物内生物合成，通常是大肠杆菌。然后通过来自N-连接蛋白糖基化系统的特定寡糖转移酶在体内偶联蛋白质。近年来，生物合成因其经济性、快速性和效率而受到青睐。由这项技术生产的第一种多糖结合疫苗候选物是志贺氏菌多糖结合疫苗（GVXN SD133），由瑞士GlycoVaxyn AG开发，已完成I期临床试验（NCT01069471）。研究证明了GVXN SD133疫苗的良好安全性，所有测试剂量均能引起对志贺氏菌O1多糖的显著体液反应。蛋白载体也产生了功能性抗体，证明了这种新技术在保持碳水化合物和结合蛋白表位方面的优势。另一种针对志贺氏菌flexneri 2a（Flexyn2a）的生物结合疫苗在I期研究（NCT02388009）的所有时间点和所有组别中，接种后均引起了统计学上显著的S. flexneri 2a脂多糖（LPS）特异性体液反应。结果表明Flexyn2a具有令人满意的安全性，产生了强大的体液反应。这种疫苗目前正在进行IIb期（NCT02646371）。总体而言，多糖结合疫苗平台比其他平台显示出更多的潜力，并提供了解决细菌疫苗紧迫问题和挑战的解决方案，通过逐步使用生物合成技术。 2.4.重组亚单位疫苗 重组亚单位疫苗采用基因工程方法，在合适的宿主细胞中表达病原体特异性基因，如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞等。重组亚单位疫苗通常具有良好的安全性和稳定性。然而，由于外源蛋白通常显示MHC II类反应，通常不会产生强烈的T细胞反应，因此需要佐剂刺激和多次接种以增强免疫原性，这可能不适用于呼吸道黏膜免疫。目前批准的人类重组亚单位蛋白疫苗包括流感疫苗（FluBlok）、带状疱疹疫苗（Shingrix）、脑膜炎球菌B群疫苗（Trumenba、Bexsero）和COVID-19疫苗（ZF2001、Nuvaxovid）（表1）。近年来，随着反向疫苗学、结构生物学、基因组学和蛋白质组学理论和技术的进步，重组亚单位疫苗免疫原逐渐进入理性设计的新时代。反向疫苗学的过程是利用自下而上的方法从基因组到疫苗开发疫苗。2013年批准的Bexsero脑膜炎B群疫苗是反向疫苗学的经典案例。它基于对致病微生物的关键保护或毒力抗原的全基因组预测和筛选，然后开发新疫苗；这样的例子包括三个抗原：淋病奈瑟菌肝素结合抗原（NHBA）、因子H结合蛋白（fHbp）和淋病奈瑟菌粘附素A（NadA）。Shingrix是葛兰素史克开发的重组亚单位佐剂疫苗，由水痘-带状疱疹病毒的糖蛋白gE重组蛋白组成，并补充了新的佐剂AS01B。对带状疱疹的整体疫苗效力在老年人（≥50岁）中为97.2%。Shingrix的成功强调了佐剂在疫苗开发中的关键作用。NVXCoV2373（Nuvaxovid）是一种含有昆虫细胞表达的S-三聚体和Matrix-M佐剂的重组蛋白疫苗。最近的临床结果显示，该疫苗对任何关注或感兴趣的变体的疫苗效力为92.6%。结核病亚单位疫苗M72/AS01E（葛兰素史克）包含两个M72重组融合免疫原（MTB32A和MTB39A）与佐剂系统AS01E结合，并为M. tuberculosis感染、HIV阴性成年人提供约50%的疾病进展到活动性肺结核的保护约3年。此外，另一种重组亚单位结核病疫苗（GamTBvac）被证明由两个结核分枝杆菌抗原融合（Ag85A和ESAT6-CFP10）组成，与明胶结合域固定在明胶上，并与由DEAE-明胶核心和CpG寡脱氧核苷酸（TLR9激动剂）组成的佐剂混合。II期的结果显示出有希望的安全性和耐受性，诱导了抗原特异性干扰素-γ反应、表达Th1细胞因子的CD4+ T细胞和IgG反应。结构生物学也有助于疫苗的理性设计。RSV表面融合（F）蛋白存在于两种构象中：前融合（pre-F）和后融合（post-F）构象。基于前F和抗体的高分辨率复合物结构，F蛋白被修改以在前融合状态下稳定（DS-Cav1）。I期临床显示，针对前融合特异性表面RSV F的血清抗体的中和活性增加了10倍以上。其他人设计并获得了一种基于结构探究的稳定RBD-sc-dimer疫苗分子。RBD的C末端的N602残基与另一个RBD的N末端串联设计，提高了RBD二聚体的稳定性和中和抗体反应。根据官方报告，疫苗的III期临床数据显示，该疫苗对18岁及以上人群的任何严重程度的COVID-19的保护效力为81.43%（NCT04646590）。这些结果代表了基于结构的疫苗设计的临床证据，预示着精准疫苗学的新时代的曙光。重组亚单位疫苗平台具有技术优势，如安全性和效率，以及良好的稳定性和成熟的产业。然而，安全有效的佐剂对提高疫苗效力至关重要。结构生物学、反向疫苗学和新型佐剂的新技术将促进重组蛋白疫苗的设计。 2.5.病毒样颗粒和纳米颗粒疫苗 病毒样颗粒（VLPs）是由病毒结构蛋白自组装形成的纳米尺寸（20-200纳米）颗粒，它们的结构和免疫原性与天然病毒相似。VLPs不包含病毒遗传物质，因此可以模拟病毒抗原性而不具致病性。VLPs具有高度重复的抗原表位阵列，有利于被树突状细胞（DCs）吞噬并呈现给MHC I类和II类分子。它们可以激活身体，诱导强烈的细胞和体液免疫反应，使其成为疫苗开发的理想平台。目前批准的VLPs疫苗包括乙型肝炎疫苗（Hepavax-B、Engerix-B、Recombivax HB、HBVaxPro、Heplisav-B、Fendrix、Hepavax-Gene）、HPV疫苗（Cervarix、Gardasil、Gardasil 9、Cecolin和Wozehui）、乙型肝炎E疫苗（Hecolin）、疟疾疫苗（Mosquirix）和COVID-19疫苗（Covifenz）（表1）。此外，多种基于VLPs的预防性疫苗已进入临床试验阶段，主要针对诺如病毒、轮状病毒、BK多瘤病毒、狂犬病、RSV、HIV、流感病毒等。疟疾疫苗的研发仍然是一个巨大的挑战。GSK的科学家使用截短的环孢子蛋白（CSP）结合乙型肝炎表面抗原（HBsAg）生成名为RTS的蛋白质。然后，RTS与另一个游离的HBsAg在酵母细胞中共表达，生成RTS,S VLPs。然而，尽管RTS,S/AS01的三剂疫苗最初对临床疟疾具有一定的保护作用，但疫苗的效力随时间减弱，在高于平均水平的疟疾寄生虫暴露中效果较差。然而，RTS,S疫苗的开发大大提高了我们实现开发有效安全疟疾疫苗的长期目标的机会。最近，提出了VLPs的嵌合设计，以保护免受多型病原体的侵害。作者用系统发育上密切相关的环区域替换了HPV L1环区域。HPV33/58/52 VLPs的三型嵌合体在小鼠和非人灵长类动物中诱导的中和滴度与三种野生型VLPs混合物相当。作者目前正在开发基于这一策略的七种交叉疫苗，针对20种HPV变体。Medicago Inc.开发的一种基于植物的VLPs COVID-19疫苗最近在加拿大获得授权使用。该疫苗含有SARS-CoV-2刺突（S）蛋白（原始菌株）的VLPs以及AS03佐剂，显示出71%的效力，保护18至64岁的试验参与者（https://www.canada.ca/en/health-canada/services/drugs-health-products/covid19-industry/drugs-vaccines-treatments/vaccines/medicago.html）。 纳米颗粒疫苗（NPVs）使用纳米材料作为载体、链接器或免疫调节剂，通过物理或化学方法将特定抗原和佐剂连接起来。这种基于纳米载体的传递系统可以保护疫苗免于过早降解，提高其稳定性，并促进免疫原传递到抗原呈递细胞（APCs），特别是DCs。此外，纳米颗粒提供了合适的疫苗给药途径，并增强了具有缓慢释放特性的抗原摄取，从而产生强烈的体液、细胞和粘膜免疫反应。纳米颗粒可以来自脂质体、VLPs以及金属或非金属无机、聚合物和脂质。但与其他疫苗候选物一样，NPVs的生产充满了许多困难和挑战。例如，一些NPVs可能会引发系统性或局部炎症反应，而一些纳米材料会在细胞中积累，导致其在体内长期保留，可能导致血管血栓形成。此外，在生产和储存成本方面仍存在一些限制。 自组装蛋白支架也在疫苗开发中得到广泛应用；例如I53-50、铁蛋白、mi3和IMX313颗粒。I53-50是通过计算工程设计的双组分蛋白，可自组装成二十面体纳米颗粒。该系统已用于RSV、流感病毒和HIV疫苗的开发，这些I53-50疫苗候选物在动物模型中诱导了强烈的抗体反应。在COVID-19疫苗开发中，一种多价SARS-CoV-2刺突受体结合域纳米颗粒（RBD-NP）疫苗在小鼠中显示出保护作用，仅需一次免疫。这种RBD-NP疫苗在非人灵长类动物中引发了多样化的多克隆抗体反应，目前正在进行临床试验（NCT04742738，NCT05007951）。另一项研究展示了一种疫苗，该疫苗显示了SARS-CoV-2刺突蛋白的多个副本，以诱导强烈的中和抗体反应，从而提供对高剂量SARS-CoV-2挑战的保护。铁蛋白是一种天然蛋白笼，由24聚体结构组成，具有八个三重轴，可用于展示三聚体抗原，如流感血凝素（HA）或HIV Env蛋白。一种基于铁蛋白的疫苗候选物目前正在进行针对EBV（传染性单核细胞增多症、各种癌症和自身免疫疾病的原因）的I期临床试验（NCT04645147）。一些COVID-19疫苗也被设计为使用铁蛋白来展示RBD或刺突三聚体，形成纳米颗粒，这两种疫苗候选物在临床前研究中都显示出了提高的抗体反应。最后，mi3 NP是理性设计的i301纳米笼的突变形式，显示出比原始形式更高的产量、均匀性和稳定性。基于RBD的mi3疫苗可以诱导针对SARS-CoV-2变体和SARS-CoV的中和抗体。mi3已被用于开发流感、典型猪瘟和疟疾疫苗。通过遗传融合、标签/捕手组装或化学交联可以实现抗原到支架的展示。与基于蛋白质的纳米颗粒疫苗相关的主要挑战是在融合到或展示在支架上时保持抗原的结构构象。纳米颗粒疫苗是一个激动人心的平台，用于灵活的抗原展示，在疫苗开发中具有巨大的潜力。 2.6.病毒载体疫苗 病毒载体疫苗使用减毒病毒疫苗株或非复制病毒作为载体，有效地将抗原基因代码传递到宿主细胞核中以诱导免疫反应。病毒基因组可以稳定地接受大基因片段的插入并表达特定抗原，从而可以使用病毒载体技术开发多种疫苗。抗原可以精确合成、修改并针对宿主中的特定细胞。病毒载体诱导的身体反应类似于对自然感染的反应，导致强烈的体液和细胞免疫反应。病毒基础疫苗的主要关注点是针对载体的预先存在的免疫力，这削弱了疫苗引起的抗体诱导和T细胞反应。目前，许多病毒载体，如人类和黑猩猩腺病毒（Ad和ChAd）、水泡性口炎病毒（VSV）、改良的安卡拉牛痘病毒（MVA）、麻疹病毒（MV）、痘病毒、新城疫病毒（NDV）和其他病毒已被用作疫苗开发的载体。批准的病毒载体疫苗包括埃博拉病毒疫苗和COVID-19疫苗。由CanSino Biotechnology, Inc.开发的首个获得许可的埃博拉病毒疫苗基于腺病毒（Ad5）载体，已获得国家药品监督管理局（NMPA）的批准（表1）。其他包括由Merck开发并由食品药品监督管理局（FDA）批准的复制能力VSV基础埃博拉疫苗ERVEBO；由Janssen Cilag International N.V.（Janssen）开发的编码扎伊尔埃博拉病毒糖蛋白的腺病毒Ad26，Zabdeno；Mvabea，一种MVA，编码扎伊尔埃博拉病毒、苏丹埃博拉病毒和马尔堡病毒的糖蛋白，以及由Janssen开发的Tai Forest埃博拉病毒的核蛋白。迄今为止，已有五种批准的病毒载体COVID-19疫苗：由CanSino开发的基于腺病毒载体的Ad5；基于重组ChAdOx1腺病毒载体（ChAd）平台的AZD1222（Vaxzevria），由AstraZeneca开发；由印度血清研究所有限公司开发的Covishield（ChAdOx1_nCoV-19）；由Janssen开发的Ad26.CoV2.S疫苗；以及基于Ad26和Ad5载体的Sputnik V，由俄罗斯加马利亚研究所开发。 中国疾病预防控制中心（中国疾控中心）已开发出一种基于DNA疫苗与复制能力天坛牛痘（rTV）疫苗结合的HIV疫苗（DNA/rTV），该疫苗包含gag、pol和env基因。这种疫苗在恒河猴中对同源和异源挑战后的病毒获取具有保护作用。DNA/rTV疫苗在I期（ChiCTR-PRC-10001287）中安全并诱导免疫反应。2021年11月，使用DNA/rTV疫苗的II期临床试验（ChiCTR1900021422）已完成。研究人员还构建了一种包含刺突蛋白的复制能力重组病毒（rVSV-SARS-CoV-2）的COVID-19疫苗。结果显示，通过鼻内（i.n.）给药的rVSV-SARS-CoV-2疫苗在猕猴中诱发的中和抗体水平是肌肉注射（i.m.）途径的8倍。同样，基于NS1-del基础的减毒流感病毒载体的结核病疫苗也已进入I期临床试验（NCT03017378）。厦门大学、香港大学和北京万泰生物药业开发了一种基于减毒流感病毒的COVID-19疫苗，DelNS1-2019-nCoVRBD-OPT1（鼻内流感基础-RBD），目前正在进行III期临床试验（ChiCTR2100051391）。 由于其制造平台的多功能性和在流行病或大流行期间的响应时间，病毒载体疫苗越来越多地用于预防性疫苗的生产。然而，罕见的风险事件仍然是一个需要解决的重要问题，以充分利用这一平台在未来的潜力，这在传染病和癌症中具有重要意义。 2.7.肽疫苗 免疫系统对抗原作出反应，通常集中在少数氨基酸（aa）或肽段上，主要是B细胞和T细胞表位。肽疫苗旨在识别病原体上的肽序列，这些序列能够诱导保护性免疫反应，然后使用这些肽序列来全合成疫苗物质。由于它们是合成的，没有突变或逆转的风险，肽抗原可以快速修改以产生特定的反应。然而，这种方法在实践和理论上仍然存在困难。肽疫苗本身通常免疫原性不足，需要多次免疫才能有效。免疫原性可以通过将表位肽与载体蛋白融合、将表位肽与载体蛋白化学链接或人工合成相关肽的重复序列来增强。表位通常不是简单的氨基酸序列；然而，结构表位——具有精确构象——有时可能是抗体结合所必需和充分的。因此，以构象依赖的方式呈现肽是肽疫苗设计的重要考虑因素。先进的肽疫苗目前正在临床试验中，包括针对流感病毒、丙型肝炎病毒、HIV-1、疟疾和阿尔茨海默病的疫苗。 最近，图宾根大学医院开发了一种基于肽的COVID-19疫苗候选物，名为CoVac-1，由来自SARS-CoV-2的多个病毒蛋白（刺突、核衣壳、膜、包膜和开放阅读框8（ORF8））的T细胞表位组成。这与Toll样受体1/2激动剂XS15结合，在Montanide ISA51 VG中乳化。在I期，开放标签试验（NCT04546841）中，CoVac-1显示出有利的安全性，并且在所有参与者中诱导了针对多种疫苗肽的SARS-CoV-2特异性T细胞反应，由多功能Th1 CD4+和CD8+ T细胞介导。这些发现表明CoVac-1诱导了一种广泛、强大且与关注变体无关的T细胞反应。 一种疟疾疫苗PEV3B含有来自恶性疟原虫顶端膜抗原1（AMA-1）和环孢子蛋白（CSP）的两个多肽。临床试验Ia（NCT00400101）和Ib（NCT00513669）阶段证明了病毒体配方的PEV3B的安全性和免疫原性。事实上，在大多数时间点上，AMA-1和CSP肽抗原特异性IgG滴度显著高于对照组。这些发现为进一步开发针对疟疾的多价病毒肽疫苗提供了坚实的基础。 一种新型通用流感疫苗Multimeric-001（M-001），由BiondVax Pharmaceuticals Ltd.开发，包含来自A型和B型流感病毒的HA、NP和M1蛋白的保守表位，旨在保护免受多株和多季节流感病毒株的侵害。七个已完成的临床试验表明，该疫苗安全、耐受性好，并对广泛的流感毒株具有免疫原性。然而，在2020年10月，M-001的III期临床试验（NCT03450915）并未显示安慰剂组和接种组在减少流感疾病方面有显著差异。在HIV疫苗研究中，一种融合肽（FP）共价链接到关键孔虫血蓝蛋白（KLH）的赖氨酸残基上，命名为FP-KLH，被设计为在Env三聚体初次免疫后作为增强剂。这种组合免疫方案在小鼠中诱发了单克隆抗体，中和了高达31%的208种HIV-1跨亚型菌株。对豚鼠和猕猴的免疫诱导了类似的广泛的融合肽导向的中和反应，表明HIV-1融合肽是疫苗诱导广泛中和抗体的靶标。 肽疫苗的开发作为一种方法吸引了各种治疗领域的关注，包括癌症、阿尔茨海默病和丙型肝炎病毒。尽管如此，肽疫苗仍然存在挑战，包括较弱的免疫原性和不一致的免疫反应，这应该通过表位设计、载体优化和新佐剂的结合进一步改进和发展。 2.8.DNA和mRNA疫苗 核酸疫苗由DNA疫苗和mRNA疫苗组成。DNA疫苗使用编码蛋白质的细菌质粒，在哺乳动物启动子下，然后驱动宿主细胞中的抗原表达。DNA疫苗可以诱导体液和细胞免疫，具有长期免疫反应，并且易于制造和扩大规模。针对流感、乙型肝炎、HIV、疟疾、SARS-CoV-2和癌症等传染性和非传染性疾病的DNA疫苗已在数百项人类临床试验中进行了测试。最近，印度在2022年批准了第一种用于人类紧急使用的DNA疫苗。由Zydus Cadila开发的ZyCoV-D疫苗采用了非复制和非整合的质粒DNA，携带SARS-CoV-2的基因。ZyCoV-D使用无针系统，将免疫以狭窄的流体流形式传递到皮肤中，显著减少了副作用。在III期临床试验的中期报告中，ZyCoV-D疫苗的有效性达到了约66.6%。治疗组中诱发的不良事件的发生相似。总的来说，ZyCoV-D疫苗在III期试验中被验证为有效、安全和具有免疫原性。然而，许多DNA疫苗的免疫原性低于其他疫苗平台，并且与在其他哺乳动物中看到的临床结果相比，临床结果令人失望。此外，安全性问题，如质粒DNA整合到基因组DNA中。过去对DNA疫苗整合进行了广泛研究，但没有证据表明发生了整合。DNA疫苗受到其较弱的免疫原性的限制，需要施用更大的剂量。此外，它们有效的递送仍然是未来研究的问题。 mRNA疫苗通过将与病原体特定蛋白相对应的信使RNA（mRNA）引入宿主细胞而发挥作用。mRNA疫苗主要包括传统的非复制型mRNA和自复制mRNA（SAM）。获得许可的COVID-19疫苗BNT162b2和mRNA-1273都是非复制型mRNA疫苗。自复制RNA（SAM）具有编码RNA复制因子的完整基因。与传统mRNA相比，SAM具有更持久和更高水平的抗原表达。SAM疫苗所需的剂量也远低于传统mRNA疫苗。非复制型和SAM疫苗在引入细胞质时表达高水平的异源基因。mRNA疫苗可以激活先天免疫系统并发挥固有的佐剂效应。mRNA疫苗具有免疫原性；被模式识别受体（PRRs）如TLR3和TLR7/8识别；在接种部位产生细胞因子；并招募和驱动先天免疫细胞（如树突状细胞和巨噬细胞）的激活和成熟。对于适应性免疫，mRNA的翻译过程在细胞质中完成以产生目标抗原，然后被有效加工成多肽并呈现给MHC-I分子，引发细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。翻译后的抗原随后被分泌并在MHC-II蛋白上呈现给辅助T细胞（Th），以引发CD4+ T细胞反应，这通过炎症细胞因子刺激B细胞产生中和抗体并激活吞噬细胞。与传统疫苗类似，为了克服脂质双层并将mRNA疫苗转移到细胞质中，已开发了各种mRNA疫苗的递送方法，包括基因枪、电穿孔、脂质纳米颗粒（LNPs）等。 COVID-19 mRNA疫苗Comirnaty（BioNTech/Pfizer）是FDA于2021年8月首次批准用于人类的mRNA药物；Spikevax（Moderna）疫苗也于2022年1月在美国获得授权，并随后在其他国家使用（表1）。Comirnaty和SpikeVax是LNP配方的、修饰核苷的mRNA疫苗，编码SARS-CoV-2的S蛋白的前融合稳定形式。在一项涉及43,548名参与者的研究中，接种两剂疫苗后BNT162b2预防COVID-19的有效性为95%。严重不良事件的发生率很低，疫苗组和安慰剂组之间相似。在涉及30,420名志愿者的III期临床试验中，mRNA-1273疫苗预防COVID-19的有效性为94.1%，同样，严重不良事件很少见。另一种mRNA疫苗（CVnCoV），由CureVac开发，已进入IIb/III期临床试验。然而，CVnCoV对有症状的COVID-19的有效性为48.2%，随着SARS-CoV-2变种的出现，该试验被暂停。另一种mRNA疫苗ARCoV，由中国的Walvax Biotechnology开发，已于2022年9月获得印尼药品机构的紧急使用授权。ARCoV热稳定，可在室温下至少存放一周。ARCoV在I期临床研究中被证明是安全且耐受性良好，并能诱导强大的体液和细胞免疫反应，支持进一步的大规模临床研究和人类使用。 目前，有超过25种针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗候选物正在进行临床试验。此外，还有许多针对其他传染病的mRNA疫苗的临床试验，包括寨卡病毒（NCT04064905）、流感病毒（NCT03345043, NCT03345043）、巨细胞病毒（NCT04232280, NCT03382405, NCT03382405）、RSV（NCT04528719）、基孔肯雅病毒（NCT03829384, NCT03325075）和狂犬病（NCT02241135, NCT04062669）。 环状mRNA（circRNA）是一种非编码单链RNA，通过添加内部核糖体进入位点（IRES）和/或通过在5′UTR中纳入特定的核苷修饰，可以实现蛋白表达。这一新平台已被证明由于转录本的延长半衰期，在真核细胞中产生强大且稳定的翻译。最近，Qu等人报告了一种SARS-CoV-2 Omicron circRNA疫苗，该疫苗在小鼠和猴子中诱导了强大的体液和细胞免疫反应，并有效抵抗SARS-CoV-2。 与传统疫苗相比，mRNA疫苗具有类似活病毒的免疫反应机制，没有感染或整合到宿主基因组的风险，更稳定，能够有效表达抗原蛋白，并且通过快速且成本效益高的大型生产过程生产。从理论上讲，mRNA疫苗的开发只需要在成熟的技术平台上替换抗原序列；因此，在预防和控制新出现的传染病方面提供了相当大的优势。然而，mRNA疫苗在翻译效率和稳定性方面仍然存在一些挑战。此外，了解安全性和抗体反应的持续时间需要更长期的数据。总体而言，mRNA技术为疫苗、治疗以及更多领域提供了一个令人兴奋和有希望的途径。 2.9.当前和未来的中国预防性疫苗市场 中国是目前少数几个能够通过其工业基础设施提供足够疫苗供应能力的国家之一。近年来，中国在疫苗研发方面做出了巨大努力，并取得了显著进展，其疫苗市场正逐渐繁荣起来。根据NMPA批准的药品信息，中国市场上有94种预防性疫苗，可以预防38种疾病（表2）。其中，80种疫苗是国内生产的，11种来自国外；国产疫苗作为市场的主力，而一些战略性疫苗的供应，如白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎和b型流感嗜血杆菌联合疫苗（DTwP/Hib）、五价轮状病毒疫苗、四价和九价HPV疫苗以及带状疱疹疫苗仍然依赖外部制造商。最近，国产HPV疫苗和肺炎球菌疫苗的批准展示了中国在疫苗开发和制造领域的巨大潜力。中国还开发了手足口病疫苗（EV71）、戊型肝炎疫苗和埃博拉疫苗等新型疫苗。这些成就为SARS-CoV-2出现后多技术疫苗突破的快速部署奠定了坚实的基础。目前中国市场上的传染病疫苗包括流感、水痘、脑膜炎球菌性脑膜炎、甲型肝炎、乙型肝炎、戊型肝炎、狂犬病、白喉、百日咳、破伤风、b型流感嗜血杆菌、脊髓灰质炎、结核病、霍乱、轮状病毒、脓疱疮、气管炎、手足口病、破伤风、伤寒、副伤寒、黄热病、钩端螺旋体病、蜱传脑炎、日本脑炎、麻疹、腮腺炎、风疹、鼠疫、肺炎球菌肺炎、炭疽、布鲁氏菌病、COVID-19、宫颈癌、细菌性痢疾、埃博拉出血热、肾综合征出血热、带状疱疹。然而，与全球市场相比，中国仍然缺乏一些疾病的疫苗，如登革热、B群脑膜炎球菌和疟疾。同时，值得注意的是，中国大多数疫苗目前基于传统疫苗平台，如灭活或减毒活疫苗、基因工程疫苗。第三代疫苗技术如病毒载体和核酸疫苗的开发才刚刚开始，中国市场上还没有核酸疫苗。 表2 中国当前许可的疫苗市场 对于重要疾病，如HIV、RSV、寨卡病毒和巨细胞病毒疫苗，尚未在全球成功开发和上市。此外，主要传染病病原体的其他亚型或突变逃逸株也在不断演变。因此，带来了许多挑战，如现有疫苗覆盖不足，如COVID-19、流感、结核病等疫苗。此外，一些现有的传染病疫苗对某些特定类型预防效果较差，如B群脑膜炎球菌疫苗、人类乳头瘤病毒疫苗、肠道病毒EVD68、超级细菌疫苗等。此外，中国无法独立满足高风险或特殊人群的疫苗需求，如老年人的带状疱疹疫苗。最后，联合疫苗是一线可以预防多种疾病并让人们通过较少的注射获得保护的疫苗。未来，应加强新一代疫苗技术的开发，如病毒载体疫苗和核酸疫苗。 3.治疗性疫苗的发展进展 与预防性疫苗不同，治疗性疫苗是指在已经感染病原体或患有特定疾病的患者中诱导特异性或非特异性免疫反应以治疗疾病进展的生物制品。因此，治疗性疫苗的主要目标是诱导肿瘤消退、根除微小残留病、建立持久的抗肿瘤记忆以及避免非特异性或不良反应。治疗性疫苗主要分为四类：基于肽/蛋白的疫苗、基于细胞的疫苗、基于DNA或RNA的疫苗和基于病毒载体的疫苗。根据疾病分类，治疗性疫苗可以分为针对肿瘤的疫苗、针对传染病的疫苗和针对慢性病的疫苗。首个获得FDA批准的癌症疫苗，Sipuleucel-T（Provenge，由Dendreon公司商业化），目前用于治疗转移性去势抵抗性前列腺癌。Provenge是一种自体的、基于树突状细胞的疫苗，装载有与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）融合的前列腺酸性磷酸酶（PAP）抗原；这种疫苗首次实现了利用患者的自身免疫细胞攻击癌细胞的理念。迄今为止，已有超过30,000名男性患者接受了Provenge治疗，临床上已证明可以延长晚期疾病男性患者的生命。Provenge的批准在治疗性疫苗领域内具有重要意义，并强调了抗癌疫苗可以发挥作用的事实，从而为进一步投资癌症疫苗开发提供了动力。 3.1.治疗性疫苗在癌症方面的应用 3.1.1.治疗性疫苗在肺癌方面的应用 肺癌（LC）是最常被诊断出的癌症，也是导致癌症相关死亡的主要原因，由于预后不佳和临床结果差，给全球公共卫生带来了沉重负担，5年生存率为19%；实际上，肺癌占癌症总病例的11.4%，占全球癌症总死亡人数的18.0%。LC分为两个主要组织类型：小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）。传统的抗癌疗法（手术、放疗和化疗）在遏制进展方面的有效性有限，因此，全球范围内正在积极开展针对LC的治疗性疫苗设计研究（表3）。2008年，古巴开发了世界上第一个有效的治疗性疫苗CIMAvax EGF用于NSCLC，后来在古巴、秘鲁和委内瑞拉批准用于一线化疗后的晚期（IIIB和IV期）NSCLC治疗。CIMAvax EGF由人重组表皮生长因子（EGF）与脑膜炎奈瑟菌重组P64K蛋白共价结合而成。EGF调节细胞生长和分裂，NSCLC患者中EGF的过度表达与细胞生长和分裂失控有关。CIMAvax EGF通过刺激免疫系统产生特异性针对EGF的抗体，抑制其与癌细胞上的相应受体结合，从而减缓癌细胞的无控制生长。II期和III期临床试验表明，CIMAvax EGF耐受性良好，并延长患者生存期，特别是60岁以下患者的中位总生存期（OS）分别为18.53个月和7.55个月。另一种疫苗Vaxira是一种免疫治疗剂，由小鼠γ型抗异型单克隆抗体Racotumomab和氢氧化铝组成。Racotumomab特异性诱导针对在多种实体瘤中过度表达的Neu-糖基化GM3神经节苷脂（NeuGcGM3）的抗体反应。目前正在评估多种癌症适应症，包括黑色素瘤、乳腺癌和肺癌。Vaxira治疗NSCLC的临床试验结果显示，中位生存时间为8.23个月，略高于对照组的6.8个月；Vaxira治疗组的中位无进展生存时间为5.33个月，对照组为3.9个月，证明了Vaxira优于安慰剂。基于II/III期研究的有希望的结果，Racotumomab于2013年在古巴和阿根廷推出，作为晚期NSCLC患者的皮下注射治疗。Tedopi是一种基于新表位的疫苗，具有针对HLA-A2+的限制性修饰新表位，针对肺癌中经常表达的五种肿瘤相关抗原：CEA、HER2、MAGE2、MAGE3和P53。在II期试验中，Tedopi在预处理的晚期NSCLC患者中显示出17.3个月的OS，并具有可管理的安全性。ATALANTE-1——一项随机、开放标签、两步、III期研究——比较了Tedopi与标准治疗（SoC）在HLA-A2+ NSCLC患者中的疗效，这些患者在ICI治疗后疾病进展的第二或第三线治疗。Tedopi通过刺激杀手T细胞，使它们能够发现并消除癌细胞，这是治疗疾病的关键过程。结果显示，在63名Tedopi组患者中，有29名患者至少存活了12个月，12个月生存率为46%，远高于预定的25%。一名54岁的晚期LC患者，在接受了五次Tedopi注射后，肿瘤迅速缩小（从39毫米缩小到23毫米）。在本报告发布时，患者的生存期已超过20.6个月，仍在观察中。现在，由于其出色的临床数据，Tedopi已获得美国FDA的孤儿药指定，用于治疗HLA-A2阳性NSCLC。 表3 市场上或处于临床开发阶段的针对不同疾病的治疗性疫苗 3.1.2.治疗性疫苗在乳腺癌方面的应用 乳腺癌（BC）是全球第二常见的恶性肿瘤，每年有超过226万例新病例。它也是女性癌症相关死亡的主要原因。迄今为止，截至2021年6月23日，共有44项正在进行的（即活跃的、不招募；招募；尚未招募）临床试验正在研究BC的治疗性疫苗。就疫苗平台而言，大多数BC疫苗是基于肽的（N=20，45.5%），而大约有10项（22.7%）的临床试验正在测试基于细胞的BC疫苗；新技术开发的病毒载体疫苗占6项（13.6%），而基于基因的BC疫苗正在8项（18.2%）临床试验中进行评估。 人表皮生长因子受体-2（HER2）是乳腺癌疫苗的理想靶点，是一种细胞表面受体蛋白，具有酪氨酸激酶活性，在高达75%的BC中表达。HER2在细胞生长、存活和分化中发挥着极其重要的作用。针对HER2的基于肽的疫苗能够诱导持久的特异性细胞和体液免疫反应，以抑制HER2阳性肿瘤细胞的生长，显示出高免疫原性、强特异性和良好的安全性。在II期临床试验（NCT00524277）中，HER2衍生的肽疫苗GP2，即HER2跨膜域（TMD）的亚优势表位，与GM-CSF（一种FDA批准的免疫佐剂）结合使用。这种组合刺激了抗原呈递细胞（如DC等）的增殖，并进一步诱导CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）识别和摧毁表达HER2/neu的癌细胞。此外，GP2疫苗耐受性良好，没有严重的不良反应，接受GP2疫苗治疗的BC患者在手术后以及Herceptin治疗后5年的无病生存率达到100%。此外，与单独接受GM-CSF治疗的患者相比，BC复发率为0%，而后者为89.4%。基于E75（HER2/neu 369-377，KIFGS LAFL）的疫苗是治疗BC患者最广泛研究的策略。然而，目前的结果表明，E75疫苗仅对三阴性BC患者并且在治疗与曲妥珠单抗联合使用时对表达HLA-A24的患者提供了显著的临床益处；需要进一步评估这些效果。其他基于肽的疫苗也在临床试验中（表3）：AE37（HER2/Neu 776-790，GVGSPYVSRLLGICL；II期临床试验中），TPIV100（一种使用sargramostim作为佐剂的多表位疫苗，针对HER2；II期临床试验中），MVFHER-2（aa597-626；I期临床试验中）和MVF-HER-2（aa266-296；I期临床试验中）（MVF-HER2是两种嵌合型曲妥珠单抗样（MVF-HER2，aa597-626）和小扰素样（MVF-HER2，aa266-296）HER2 B细胞肽基疫苗的组合）。此外，基于细胞的治疗性疫苗是患者特定的，需要一种安全的方法进行个性化疫苗开发（Arab等人，2020年）。目前有多种针对HER2的基于细胞的疫苗正在开发中（表3）：DC细胞（NCT02061423，NCT04348747），PBMC细胞（APC8024），以及同种异体细胞（NCT00847171）已被用作免疫原进行免疫。初步结果表明，这些疫苗耐受性良好，并提供了特异性抗HER2细胞免疫反应。目前，正在考虑用于提高BC治疗性疫苗效果的各种方法：包括选择合适的细胞亚群、佐剂的选择以及不同的工程方法（如基于VLP或基于基因的疫苗）。然而，这些优化的临床益处仍有待验证。 3.1.3.治疗性疫苗在结直肠癌方面的应用 结直肠癌（CRC）是世界上第三常见的癌症，仅次于LC和BC，发病率为10.0%，死亡率为9.4%。CRC的标准治疗是手术、化疗和放疗，这些治疗可能结合使用。然而，这些治疗有许多副作用，许多患者在一系列治疗后仍然会复发。因此，为这一患者群体开发替代的有效治疗方法至关重要。尽管，目前还没有FDA批准的CRC疫苗，但已评估了多种疫苗用于治疗CRC，包括自体、DC、肽和基于病毒载体的疫苗。OncoVAX是一种自体结肠癌疫苗，与活的卡介苗（BCG）混合，用作CRC切除术后患者的辅助治疗。III期临床试验（NCT02448173）结果表明，OncoVAX对III期结肠癌患者没有显著影响，但在平均5.8年的随访期间。OncoVAX显著延长了II期结直肠癌患者的无复发期，并降低了总体复发风险和死亡风险。作为一种主动特异性免疫治疗（ASI），OncoVAX在免疫调节佐剂（BCG）的帮助下增强了患者肿瘤细胞的免疫原性，以刺激患者对自体（患者特定）肿瘤细胞的免疫反应。基于ASI的治疗程序通常假定患者肿瘤细胞上存在不同的肿瘤抗原，并且这些抗原在正常细胞中不存在或浓度较低。 最近的研究报告了一种基于腺病毒的疫苗，用于治疗结直肠癌（CRC），并在I期临床试验（NCT01972737）中取得了积极结果。研究发现，CRC抗原鸟苷酸环化酶C（GUCY2C）能够在小鼠中引发针对肿瘤的抗原特异性CD8+ T细胞反应，而不是CD4+ T细胞，从而在不引起自身免疫的情况下提供抗肿瘤免疫。由人类5型腺病毒（Ad5）（作为载体）、PADRE（在大多数人类HLA分子背景下活跃的CD4+ T细胞表位）和GUCY2C组成的Ad5-GUCY2C-PADRE疫苗也经过了测试：在I/II期临床试验中，10名CRC患者接受了疫苗接种，并在6个月内进行了随访。作者发现Ad5-GUCY2C-PADRE安全地产生了针对抗原的细胞毒性CD8+细胞，但没有产生自身免疫性CD4+ T细胞，且没有严重的不良反应。 在2020年美国临床肿瘤学会（ASCO）大会上，梅奥诊所报告了一种新的治疗方法疫苗PolyPEPI1018，专门为MSS型CRC设计，可以有效延缓肿瘤进展。PolyPEPI1018是一种多肽疫苗，由六种合成肽组成。这些肽段包括来自7种保守的癌症睾丸抗原（CTAs）（TSP50、EpCAM、Survivin、CAGE1、SPAG9、MAGE-A8、FBXO39）的12个独特的免疫原性表位，这些抗原在mCRC中经常表达。这种疫苗经过优化，以诱导持久的CRC特异性T细胞反应。在OBERTO临床I/II期试验（NCT03391232）中，共有11名患者接受了PolyPEPI1018疫苗接种：3名患者进一步肿瘤进展，5名患者病情稳定，3名患者部分肿瘤缓解，2名患者的肿瘤缩小到可以接受手术的程度。值得注意的是，在手术后原发肿瘤中没有发现存活的肿瘤细胞，表明肿瘤细胞被杀死了。因此，这些初步发现表明PolyPEPI1018对MSS mCRC肿瘤具有早期临床活性，可以有效延缓肿瘤进展。因此，需要进一步研究以调查PolyPEPI1018的疗效。此外，还有多项旨在寻找正确的抗原刺激物的试验正在进行中。 3.1.4.治疗性疫苗在肝癌方面的应用 肝癌是全球最常见的癌症之一，发病率为4.7%，死亡率为8.3%。肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌类型，通常发生在由酗酒、代谢综合征或乙型肝炎（HBV）或丙型肝炎（HCV）病毒感染引起的慢性肝病背景下。事实上，HBV和HCV感染被认为是HCC的主要风险因素。尽管HCC有各种治疗方法，包括预防性疫苗，包括HBV疫苗，已被报告可以降低HCC的发病率；尽管如此，患者总体生存率的变化仍然远未令人满意，对于更有效的治疗方法存在巨大的未满足需求。癌胚抗原糖蛋白-3（GPC3）在80%的HCC中特异性高表达，但不在正常组织中表达，因此被认为是抗原特异性免疫治疗的理想靶点。事实上，Nobuhiro等人已经发现GPC3肽可以在小鼠中诱导免疫反应，产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和抗肿瘤活性，而不会引发自身免疫现象。因此，大多数基于肽的HCC疫苗主要针对GPC3抗原。 在一项II期临床病例对照研究（UMIN-CTR，UMIN000002614）中，比较了接种和未接种GPC3肽疫苗的患者的无病生存（DFS）、总生存（OS）和CTL诱导。研究证实，无论是否接种GPC3肽疫苗，80%的患者都会复发。然而，术后辅助疫苗接种可能会使1年复发率降低约15%，5年和8年生存率分别提高约10%和30%。此外，GPC3 IHC染色阳性的患者更有可能诱导CTLs，60%的患者生存超过5年。另外两种肽鸡尾酒疫苗（ONO-7268MX1 [JapicCTI-121933]和ONO-7268MX2 [JapicCTI-142477]），包含GPC3、在HCC中上调的含有WD重复的蛋白（WDRPUH）和类似内切核酸酶VIII的三个表位（NEIL3），在两项I期研究中评估了晚期HCC。除了GPC3，WDRPUH和NEIL3也被确定为HCC中的潜在免疫治疗靶点。其中，WDRPUH具有促进生长的活性，抑制WDRPUH可以延缓癌细胞的生长，而NEIL3作为一种肿瘤抗原，其编码基因在HCC中表现出高频的杂合性丧失，表明它可能是一个潜在的肿瘤抑制基因，在DNA修复中发挥作用。接种ONO-7268MX1和ONO-7268MX2的HCC患者显示出良好的耐受性，并诱导了CTL反应。一些患者还表现出长期疾病控制，ONO-7268MX1和ONO-7268MX2的疾病控制率分别为52.9%和35.7%，报告了9名和5名患者的病情稳定。这些结果暗示了这些疫苗在治疗HCC方面的潜在用途。 IMA970A是一种由16种新发现的在HCC患者肿瘤组织中过度表达的肿瘤相关肽（TUMAPs）组成的基于肽的HCC疫苗。IMA970A与免疫刺激剂CV8102一起给药，可以诱导平衡的Th1/Th2免疫反应。在这些TUMAPs中，有7种限制在HLA-A02上，5种限制在HLA-A24上，4种限制在HLA-II类上。处于非常早期、早期和中期HCC的患者被纳入接受单次低剂量环磷酰胺的预疫苗输注，然后是9次皮内疫苗接种。初步结果显示疫苗具有良好的安全性，但免疫原性数据尚未公布（NCT03203005）。此外，甲胎蛋白（AFP）作为HCC最广泛使用的血清标志物，可以改善预后并用于监测治疗反应；AFP衍生肽疫苗的安全性和有效性也在临床试验中得到了验证。 另一种HCC的治疗性疫苗是基于个性化肽疫苗。2017年，一项I/II期研究评估了一种新的治疗方法对晚期HCC的疗效和安全性：基于个性化肽疫苗（PPV-DC-CTL）的细胞免疫治疗与放疗相结合。结果显示疫苗耐受性良好，未引起严重副作用，研究中的9名患者病情控制良好，有效率（RR）为33%，疾病控制率（DCR）为66%。治疗效果明显优于单独报告的经导管动脉化疗栓塞（TACE）、索拉非尼和化疗。另一种个性化肽疫苗是使用仅来自恶性肿瘤细胞的非同义突变表位肽作为抗原（称为新抗原）；这些肽与MHC一起在肿瘤中表达，因此被T细胞特异性识别，引发强烈的抗肿瘤免疫反应。最近，刘团队发现个性化新抗原疫苗策略在预防HCC术后复发方面安全、可行且有效，并且通过ctDNA中的相应新抗原突变监测HCC进展也很有用；实际上，这为HCC患者的个性化医疗提供了可靠信息。在一项I期临床试验（ChiCTR1900020990）中，10名有血管侵犯的HCC患者在接受HCC诊断后2个月内进行了根治性手术切除和预防性TACE。通过肿瘤和周围组织全外显子测序鉴定非同义体细胞单核苷酸变异。对于疫苗，使用了6-20个体细胞点突变或RNA编辑新抗原长肽（27aa），并与ploy:IC佐剂混合作为抗HCC复发治疗。结果显示没有明显的治疗相关不良事件：新抗原疫苗可以有效地诱导和激活HCC患者的特异性免疫反应，并相应地延长这些患者的无复发生存期。患者的中位RFS为7.4个月，证实了个性化新抗原疫苗预防HCC患者术后复发的安全性和可行性。总之，我们讨论了几个涵盖癌症治疗肽疫苗的积极结果的例子，表明在人类中诱导CTLs是有希望的。但到目前为止，还没有观察到完全和明确的康复病例。需要进一步设计和筛选具有高免疫原性的有效的肽序列，辅以高效佐剂，或与其他免疫疗法结合，以实现更好的肿瘤消退。 3.1.5.治疗性疫苗在胃癌方面的应用 人们一直在推动研究癌症疫苗在各种肿瘤组中的作用，包括胃肠道癌症。胃癌（GC）是世界第五大癌症，2020年的发病率为5.6%，死亡率为7.7%。大多数GC患者在晚期被发现，局部晚期疾病或转移性扩散导致的不可切除病变的5年OS率仅为5%至15%。近年来，在免疫检查点抑制剂的治疗下，GC取得了巨大进展，但GC的治疗性疫苗仍处于临床阶段（表3）。因此，许多研究正在探索将免疫检查点抑制剂与化疗和其他药物或疫苗结合使用的潜力。例如，在之前的一项研究中，晚期GC患者接受了人类白细胞抗原（HLA）-A24限制性的人类血管内皮生长因子受体1（VEGFR1）-1084和VEGFR2-169多肽疫苗与S-1加顺铂的组合治疗，中位生存时间达到14.2个月。另一种选择，胃泌素-17-白喉毒素免疫原（G17DT；Gastrimmune），一种抗胃泌素17免疫原，已确认可以提高针对胃泌素17的高亲和力中和抗体，可以阻断胃泌素刺激的生长并抑制胃泌素与CCK-2受体的相互作用。G17DT现在已经在许多肿瘤治疗中用于被动和主动免疫治疗，包括原发性和转移性疾病。实际上，作者证实，当与5-氟尿嘧啶加顺铂结合使用时，G17DT可以刺激体内的免疫反应，并且有免疫反应的患者生存时间更长。 如上所述，肿瘤特异性抗原是免疫治疗的潜在靶点。通过比较GC样本和正常组织之间的差异蛋白表达研究，已经鉴定出四种癌症特异性抗原——FOXM1、DEPDC1、KIF20A和URLC10；这四种抗原在肺癌、食管癌、膀胱癌和其他癌症中也上调。 血管生成是肿瘤进展的关键机制，血管内皮生长因子（VEGF）是已知最有效和特异性最强的血管生成促进因子，因此，它被用作许多疫苗的靶点。OTSGC-A24是一种针对FOXM1、DEPDC1、KIF20A、URLC10和VEGFR1的HLA-A24:02结合肽疫苗混合物。在I/Ib期临床试验（NCT01227772）中，观察到24名携带HLA-A24:02单倍型的晚期胃癌患者的显著CTL反应，患者的总生存期为5.7个月（Sundar等人，2018年）。 除了肿瘤抗原，新抗原或识别新抗原的T细胞存在于大多数癌症中，为个性化疫苗设计提供了特异性和高度免疫原性的目标。I/II期临床试验（NCT03480152）评估了一种名为mRNA-4650的mRNA疫苗，该疫苗由多达20种不同的mRNA组成，编码定义的新抗原、驱动基因的突变和HLA-I预测的表位。在转移性胃肠道癌症患者中，疫苗被证明是安全的，并诱导了针对预测新表位的突变特异性T细胞反应，这些反应在疫苗接种前未被检测到。然而，尚未观察到客观的临床反应，疫苗可能只与其他免疫疗法结合使用以增强治疗效果。 最近，Ursula Wiedermann团队开发了一种治疗性B细胞表位疫苗（IMU-131/HER-Vaxx），并在Ib期临床试验（NCT02795988）中验证了其在HER2/neu过度表达的胃食管腺癌（GEA）患者中的免疫原性和有效性。IMU-131/HER-Vaxx由来自HER2/neu细胞外域的三个融合B细胞表位（P4、P6和P7）组成，与CRM197偶联，并用Montanide佐剂。针对IMU-131肽的抗体通过结合HER2受体的三个不同区域并参与二聚体环，阻止两个HER2受体的二聚体化，从而抑制细胞内信号传导。这种阻断HER2信号通路被认为比单独使用曲妥珠单抗更有效。相比之下，CRM197（CRM；交联材料），一种酶失活的非类毒素白喉毒素形式，已被成功用作各种疫苗的伴侣，可以快速激活具有异质性Th1和Th2细胞因子谱的CD4+ T细胞，用于激活B细胞和调节诱导抗体的数量。在大多数14名接种GEA患者中，检测到针对HER2的特异性抗体和T细胞反应，IMU-131显示出良好的耐受性和安全性。 3.2.治疗性疫苗在病毒性传染病方面的应用 3.2.1.治疗性疫苗在乙型肝炎病毒方面的应用 乙型肝炎病毒（HBV）属于Hepadnaviridae家族，是一种部分双链的包膜DNA病毒。如上所述，HBV感染是导致HCC的重要因素之一，但并非所有HBV感染都会发展成癌症。相反，由HBV引起的慢性乙型肝炎（CHB）对公共卫生的影响更大。尽管经过数十年的积极疫苗接种，全球有20亿人的乙型肝炎血清学特征，其中2.5亿人患有慢性乙型肝炎。目前，只有两种批准用于CHB的药物：核苷类似物和聚乙二醇干扰素（IFN），这两种药物在抑制病毒复制方面有效，但无法清除病毒基因组或从感染肝细胞的血清中清除HBV表面抗原（HBsAg）。因此，迫切需要探索新的治疗途径。目前，有2种治疗性疫苗（NASVAC和YIC）已完成III期临床试验。此外，还有3种疫苗已完成II期临床试验，其中2种（GS-4774和HB02 VAC-ADN）未达到主要终点，1种（εPA-44）达到了治疗终点并进入III期临床试验。还有3种治疗性疫苗（CVI-HBV-002、VBI-2601和HepTcell）处于II期临床试验中，许多处于I期临床试验中（表3）。 乙型肝炎病毒（HBV）衣壳主要由乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎核心抗原（HBcAg）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）和HbxAg组成。目前，大多数HBV治疗性疫苗侧重于HBsAg和HBcAg作为主要免疫原。在一项III期临床试验中，对CHB的初治患者使用NASVAC进行治疗，NASVAC是一种包含HBsAg和HBcAg的治疗性疫苗。作者发现，在80名接受NASVAC疫苗接种的患者中，有85%的患者丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平升高，并清除了HBeAg。另一项III期临床试验评估了一种含铝佐剂的治疗性乙型肝炎疫苗（YIC），由抗原（HBsAg）-抗体（HBIG[乙型肝炎免疫球蛋白]）免疫复合物组成。本研究旨在通过改变患者体内HBV抗原的过程和存在来消除免疫耐受。不幸的是，疫苗的III期结果未能达到临床终点，即在患者中实现HBeAg血清转换。 一项II期试验（NCT02174276）评估了GS-4774疫苗的疗效，该疫苗由HBs、HBc和HBx融合抗原组成。结果显示，尽管GS-4774安全并对CD8+ T细胞有强烈的免疫刺激作用，但它未能降低患者体内的HBsAg水平。计划探索该药物与其他抗病毒药物联合使用的疗效。 最近的一项研究报告了HBxAg单独作为主要免疫原的潜力。HBxAg在携带HBV的小鼠中诱导了全身HBx特异性CD4+和CD8+ T细胞反应，并显示出明显的HBs和HBV-DNA耗竭，保护作用至少持续30天。尽管这项研究仅处于临床前阶段，疫苗展示的HBV清除效果使其未来的发展充满希望。另一种目前有前景的疫苗是基于脂质体的纳米脂肽疫苗εPA-44（NCT00869778）。在HLA-A2阳性的进展性CHB患者中，900微克的εPA-44有限浓度导致HBeAg血清转换率显著高于安慰剂组，并具有持续的停药后效果。正在进行一项III期临床试验（ChiCTR2100043708）。 基于病毒载体或基因组的其他CHB治疗性疫苗也在进行中。一项I期临床试验（NCT02431312）评估了INO-1800（编码HBsAg和HBcAg的DNA质粒）单独或与INO-9112（编码人类白细胞介素12的DNA质粒）疫苗联合使用的安全性、耐受性和免疫原性。初步免疫学数据显示，接受INO-1800治疗的患者可以产生识别HBV核心成分的T细胞，并通过干扰素γ释放的方式从肝脏清除HBV。此外，INO-1800可以激活和扩增CD8+杀手T细胞；尽管其他临床数据尚未公布（https://clinicaltrials.gov）。 在另一项I/II期临床试验中，一种名为ANRS HB02 VAC-AND的基于DNA的疫苗，编码HBsAg，在用NAs治疗的CHB患者中诱导了持久的HBV特异性CD4+ T细胞反应，但大多数患者在停用NAs后经历了病毒学反弹。 3.2.2.人乳头瘤病毒治疗性疫苗 宫颈癌是女性中第四常见的癌症，主要由持续感染高危人乳头瘤病毒（HR-HPV）引起。根据世界卫生组织的数据，2020年全球约有604,127名女性新诊断为宫颈癌，死亡341,831人。尽管有多种预防性疫苗可用，宫颈癌的发病率和死亡率仍然很高，没有批准的非手术治疗方法。因此，研究HPV治疗性疫苗是必要的。与专注于HPV L1蛋白的预防性疫苗不同，治疗性疫苗主要针对在肿瘤细胞中高度表达的HPV早期蛋白E5、E6和E7。基于E6/E7蛋白的疫苗有多种不同形式已进入临床试验（表3），数据显示具有良好的开发潜力。实际上，五种不同的DNA治疗性疫苗（GX-188E、VGX-3100、pNGVL4a-CRT/E7（解毒）、pNGVL4a-Sig/E7（解毒）/HSP70、MEDI0457）被证明耐受性良好且临床有效。其中，VGX-3100疫苗已进入III期临床试验。 VGX-3100是第一种针对与HPV相关的宫颈癌前病变的免疫疗法。它包含HPV16和18的E6和E7 DNA，并使用CELLECTRA 5PSP电穿孔技术进行肌肉注射。结果显示，VGX-3100可以引发全身免疫反应，在三剂疫苗接种者中有49.5%的组织病理学退行，HPV清除率为40.2%，高于安慰剂接种者（30.6%和15.4%）。目前正在进行一项III期试验（REVEAL），以确认VGX-3100在HPV16/18阳性高度鳞状病变（CIN2/3）女性中的疗效、安全性和耐受性。 考虑到与宫颈癌完全缓解相关的疫苗单药治疗结果有限，使用疫苗和免疫疗法药物的联合治疗可能提供更强大的免疫反应。另一种基于DNA的疫苗pgDE7h（编码与1型单纯疱疹病毒（HSV-1）糖蛋白D（gD）融合的HPV16 E7）被发现与吉西他滨（Gem）联合具有协同抗肿瘤效果，吉西他滨是一种在临床上用于多种肿瘤的核苷类似物。这种组合诱导了肿瘤特异性细胞毒性CD8+ T细胞并根除了现有肿瘤。此外，一项研究发现，pembrolizumab与GX-188E（一种设计用于表达HPV16和HPV18的E6和E7蛋白，与Flt3L的细胞外域和组织型纤溶酶原激活剂的信号序列融合的基于DNA的疫苗）联合使用为CIN3患者提供了一种新的可能方案。 蛋白基疫苗由抗原呈递细胞（APCs）处理，导致通过HLA I类和II类呈现抗原，用于产生无类型限制的CD8+和CD4+ T细胞反应。TVGV1是一种融合蛋白基疫苗，由两种抗原组成，铜绿假单胞菌外毒素和KDEL内质网保留信号，与HPV16 E7融合，并用CpG ODN或GPI-0100佐剂。这种疫苗已被证明可以诱导T细胞反应，并为HPV16转化的B6肿瘤提供强大的抑制。目前正在进行一项IIa期临床试验，针对高危HPV宫颈感染的女性（NCT02576561）。 还有几种基于多肽的疫苗使用非E6/E7蛋白作为免疫原。PDS0101是一种基于肿瘤相关抗原MUC1的非MHC限制性疫苗，该抗原在肿瘤中高度表达。这种疫苗使用R-1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷（R-DOTAP）（一种激活TLR7的脂质体载体）作为佐剂。在I期剂量递增试验（NCT02065973）中，发现PDS0101安全且耐受性良好。疫苗接种以非MHC限制性方式在所有患者中解决了CIN。已启动几项将PDS0101与其他免疫调节疗法结合使用的II期试验（表3）。 3.2.3.治疗性疫苗在人类免疫缺陷病毒方面的应用 自20世纪80年代初首次临床观察到艾滋病并随后分离出病因性逆转录病毒HIV以来，尽管进行了40年的深入研究，HIV/AIDS疫情仍然是对人类构成重大全球健康威胁的疾病。实际上，截至2020年，仍有3800万人感染HIV。目前的治疗策略包括使用抗逆转录病毒疗法（ART），这已帮助将艾滋病从一种危及生命的疾病转变为一种可管理的慢性病，并显著延长了HIV感染者的预期寿命。然而，由于存在由潜伏感染细胞形成的病毒库，患者需要接受终身维持治疗。在缺乏有效的HIV-1根除策略的情况下，HIV研究工作集中在开发治疗方法上。 SARS-CoV-2大流行向世界介绍了一种有效的基于mRNA的疫苗，该疫苗封装在脂质纳米颗粒（LNPs）中。ICVAX是一种基于PD1的HIV-1 DNA疫苗，编码由人类可溶性PD1结构域与两个马赛克Gag-p41抗原融合的重组抗原，可以诱导针对不同HIV-1亚型的广泛和多功能T细胞反应；这些发现突出了将基于PD1的DNA疫苗方法转化为临床使用的巨大潜力。一项II期临床试验（NCT01492985）评估了基于DNA的疫苗（GTU-MultiHIV B clade）与基于多肽的疫苗（HIV-LIPO-5）联合治疗的疗效，并发现DNA和LIPO-5疫苗的主要-增强免疫接种比单独疫苗诱导了更广泛的多功能T细胞，但在中断抗逆转录病毒治疗后未能控制病毒血症，表明将疫苗策略与其他基于免疫的干预措施结合的重要性。其他疫苗形式，如AGS-004，由成熟的自体树突状细胞和体外转录的自体HIV抗原编码RNA组成，正在IIb期临床试验中进行验证。与安慰剂组相比，AGS-004诱导了强烈和多功能的HIV特异性T细胞反应。然而，未检测到抗病毒效果。另一项研究将单核细胞衍生的树突状细胞（MD-DC）基疫苗（装载大量HIV-1热灭活自体抗原）与聚乙二醇化干扰素α-2a（IFNα-2a）结合使用，在慢性HIV-1患者中取得了次优结果。总的来说，开发针对HIV的疫苗还有很长的路要走。 3.3.治疗性疫苗在慢性病方面的应用 心血管疾病（CVD）是全球主要的慢性疾病死因，高血压、血脂异常和糖尿病是CVD的主要原因。高血压、血脂异常和糖尿病的疫苗研究已有60多年的历史。随着各种疫苗构建模型的逐步改进，目前许多治疗性疫苗正在进行临床试验，但由于治疗依从性差，还没有疫苗上市。 3.3.1.治疗性疫苗在高血压方面的应用 肾素-血管紧张素系统（RAS），包括肾素、血管紧张素I（Ang I）、血管紧张素II（Ang II）和AT1R，是高血压治疗性疫苗的主要靶点。最早的高血压疫苗针对肾素。然而，由于对肾脏的损害，它们最终被终止。随后，针对AngI的高血压疫苗的疗效，如PMD2850和PMD3117，也在许多临床试验中得到验证，但都以失败告终。Ang II是许多高血压疫苗的另一个主要靶点，如瑞士Cytos公司在2007年开发的CYT006-AngQb（由Ang II结合噬菌体Qβ（AngQb）VLP组成的疫苗）。该疫苗耐受性良好，并在所有受试者中诱导了抗Ang II抗体，半衰期约为4个月。同样基于Ang II，Koriyama等人构建了编码Ang II和HBcAg融合蛋白的Ang II DNA疫苗，可以有效降低血压至少6个月。2022年，进行了一项安慰剂对照剂量递增研究，以调查针对改良Ang II DNA疫苗（AGMG0201）的安全性、耐受性和免疫反应。结果显示AGMG0201耐受性良好，也可以诱导抗血管紧张素II抗体。 除了针对RAS的疫苗外，廖团队还开发了一种针对交感神经系统α1D-肾上腺素受体的降压疫苗（ADRQβ-004），在大鼠中显示出良好的降血压效果，并且能够有效预防高血压动物的血管结构重塑、心肌肥大和纤维化以及肾脏损伤。吴等人设计了来自人类L型钙通道（CaV 1.2）的表位CE12，并分别将其结合到Qβ VLPs和HBcAg VLPs上，以测试该表位在高血压动物中的疗效。Qβ-CE12和HBcAg-CE12-CQ10疫苗都能有效地降低高血压啮齿动物的血压，HBcAg-CE12-CQ10还改善了L-NAME诱导的肾脏损伤。戴等人开发了一种针对内皮素-1（ET-1）类型A受体（ETAR）的疫苗ETRQβ-002，并证实该疫苗可以显著减少由单羧胺（MCT）和Sugen/低氧引起的大鼠肺动脉高压；它还改善了肺动脉的任何病理重塑。总之，针对RAS的Ang II和AT1R、SNS的α1DAR肾脏和LCaCd、ETAR的疫苗构成了一系列高血压治疗性疫苗的候选物，并为高血压疫苗的联合治疗奠定了基础。 3.3.2.治疗性疫苗在糖尿病方面的应用 糖尿病（DM）是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，是全球成人中高度流行的慢性疾病。全球估计有3.82亿人患有DM，预计到2035年这一数字将接近6亿。DM可以根据疾病的发病机制分为1型和2型。1型DM是一种自身免疫性疾病，自身免疫T细胞攻击产生胰岛素的β细胞。谷氨酸脱羧酶（GAD）是1型DM自身免疫反应的主要靶点；尽管几项基于GAD的疫苗临床试验产生了矛盾的结果。令人惊讶的是，卡介苗（BCG）疫苗被用于1型DM患者。一项为期8年的随访临床试验显示，BCG疫苗提供了长期效果：它被良好地耐受，并且在DM患者中导致血糖和Treg特征基因的表观遗传变化稳定减少。2017年，李等人设计的D41-IA2(5)-P2-1疫苗被认为是1型DM的一种有希望的治疗方法。D41-IA2(5)-P2-1由DPP4的肽段、胰岛素瘤抗原-2（IA-2）的抗糖尿病B表位和来自人类热休克蛋白60（HSP60）的P277肽的Th2表位（P2：IPALDSLTPANED）组成，可以显著控制高血糖。与D41-IA2(5)-P2-1类似，由李Z等人设计的U-IA-2(5)-P2-1（UIP-1）嵌合疫苗也能在免疫后成功增加小鼠的胰岛素水平并降低血糖水平。 尽管2型DM的病理机制尚不清楚，但已知有4个靶点：脂肪组织抗原、生长抑素、依赖葡萄糖的胰岛素变性多肽（GIP）和胃饥饿素。白细胞介素-1β（IL-1β）是2型DM发病机制中的主要促炎底物，有证据表明减少IL-1β活性可能成为2型DM的新治疗策略。由全长重组IL-1β与Qβ VLPs偶联组成的疫苗hIL1bQb，在2型DM患者的临床前和临床、随机、安慰剂对照、双盲研究中进行了测试。结果显示，针对IL-1β的Hil1bQb疫苗安全且耐受性良好，在这些患者中，接种6剂900微克剂量后可检测到中和IL-1β特异性抗体反应。目前，DM的发病机制和葡萄糖代谢的关键靶点仍然不清楚。在糖尿病疫苗领域的进一步探索预计将提供新的解决方案。 3.3.3.治疗性疫苗在血脂异常方面的应用 血脂异常是CVD的关键风险因素，通常以高低密度脂蛋白（LDL）胆固醇、低高密度脂蛋白（HDL）胆固醇或高甘油三酯血症为特征。前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/胰蛋白酶9型（PCSK9）通过受体内化和随后的溶酶体降解调节LDL受体表达，是已知的抗高脂血症药物或疫苗靶点。迄今为止，抑制PCSK9最先进的方法是单克隆抗体（mAbs），如众所周知的alirocumab和evolocumab，它们于2015年获得FDA批准，并为PCSK9疫苗的开发提供了坚实的临床证据。AT04A和AT06A是两种AFFITOPE肽疫苗候选物，通过诱导PCSK9特异性抗体治疗高胆固醇血症。I期临床试验（NCT02508896）的结果显示，AT04A和AT06都是安全和免疫原性的，但只有AT04A表现出显著的LDLc降低活性。还有其他针对PCSK9的疫苗；例如，基于Qβ VLP的疫苗PCSK9Qβ-003。这种疫苗可以显著降低Balb/c小鼠和LDLR+/−小鼠的总胆固醇和PCSK9表达，并上调肝脏LDLR、SREBP-2、肝细胞核因子-1α（HNF-1α）和HMG CoA还原酶水平。此外，由PCSK-9短肽与KLH融合组成的疫苗在男性载脂蛋白E（ApoE）缺乏小鼠中引起了针对PCSK9的显著长期抗体反应。一个免疫原性肽段，称为免疫原性融合PCSK9-破伤风（IFPT），使用DSPE-PEG-马来酰亚胺脂质（L-IFPT）结合到纳米脂质体表面，并吸附到Alhydrogel上（L-IFPTA+）；这种疫苗候选物在高胆固醇血症小鼠中诱导了针对PCSK9肽段的高IgG抗体反应，并降低了高达58.5%的血浆浓度。 最近，血管生成素样蛋白（ANGPTL）3作为降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和甘油三酯（TG）水平的新靶点受到了关注。针对ANGPTL3的抗体、反义寡核苷酸和小干扰RNA作为靶向ANGPTL3抑制剂已经开发出来，并正在进行临床试验（NCT03409744、NCT03452228、NCT03747224）。Fukami等人设计了3种针对ANGPTL3的表位肽基疫苗（E1-E3），其中E3（32EPKSRFAMLD41）肽段没有引起细胞毒性，并显著降低了ob/ob小鼠循环中的甘油三酯、LDL-C和小而密的LDL-C（sd-LDL-C）水平；它还减少了肥胖引起的脂肪肝病。除了PCSK9和ANGPTL3的靶点外，还需要研究其他与胆固醇和甘油三酯代谢相关的靶点疫苗，如ApoB-100，以加速推广有效抑制血脂异常的疫苗。 4.结论和未来展望 疫苗是公共卫生的重要工具，在减轻人群中传染病的负担方面发挥着重要作用。在过去20年中，可以有效预防的疾病类型持续增加到40多种。实际上，HPV疫苗对相关恶性肿瘤的预防效果的出现以及前列腺癌治疗性疫苗的推出，标志着疫苗的效用从传统的预防进一步扩展到治疗。然而，许多重大传染病的病原体因素和潜在干预措施仍然不明确，特别是那些由复杂病原体感染（如艾滋病和结核病）和以肿瘤和代谢性疾病为代表的慢性疾病引起的疾病。这些疾病的疫苗开发是世界级的。对于SARS-CoV-1和SARS-CoV-2等突发重大传染病，弱免疫反应或意外的免疫反应（如抗体介导的感染增强、ADE）是创新疫苗研究中难以解决的问题。 因此，新一代更有效疫苗的开发需要在以下四个方向上做出努力。 (i) 佐剂：与佐剂相关的有几个重要因素需要考虑。需要控制和改进佐剂的物理化学性质，优化生产流程，并深入研究分析佐剂的作用机制，以充分了解它们对免疫系统的影响。我们还需要继续探索佐剂和肿瘤抗原的最佳组合，以增强疫苗的免疫原性，并致力于设计针对不同病原体的亚单位抗原、蛋白质或肽的新复杂佐剂；这将得到化学和新材料合成技术的帮助，以增强抗原向免疫细胞的靶向传递（下一点），并克服肿瘤免疫抑制微环境对抗原呈递的抑制。这也可能有助于激活肿瘤特异性T细胞在免疫耗竭和衰老状态下，并促进记忆T细胞的形成。 (ii) 传递系统：药物/疫苗传递系统的最终目标是将货物传递到目标部位，并具有预定的释放动力学和作用持续时间。没有单一的工具适合所有形式的治疗，不同的疫苗形式各有优势和劣势，需要优化以实现传递和治疗。实际上，需要了解人与人之间、人与动物之间在药物吸收、分布、代谢和消除方面的差异，并探索不同疫苗抗原或药物与传递系统的最佳组合。COVID-19大流行提醒我们，未来是不确定的，我们需要不断发展新的传递系统，以适应多样化和精确疫苗发展的趋势。还应注意传递系统的效率和靶向性，更多关注传递系统本身的安全性和临床转化可行性。 (iii) 新抗原的发现和筛选：结合临床和实验室研究成果，全面运用和评估多组学数据和其他自动化高通量功能筛选工具，积极发展新的理论和技术，用于各个领域独特或通用疫苗靶点的筛选和发现。此外，通过下一代测序和生物信息技术，需要设计更有效的预测算法，提高发现有效的肿瘤抗原作为疫苗靶点的几率。 (iv) 联合治疗：由于肿瘤的异质性和复杂的免疫抑制微环境，单一免疫治疗往往无法提供良好的结果，通常导致低反应率或继发性耐药。因此，免疫治疗通常倾向于与不同的治疗方法联合使用。免疫疗法，如免疫检查点抑制剂（ICI）和过继细胞疗法（ACT），已经彻底改变了癌症治疗，特别是对于转移性癌症。实际上，这已经通过在设计肿瘤疫苗时结合多个肿瘤靶点，以及在补充使用免疫疗法来多样化肿瘤治疗中看到。的确，发挥这些优势并避免弱点可以显著改善癌症患者的治疗。 疫苗在历史上已经证明可以提供健康和福祉，新技术为应对传统方法失败的挑战提供了新的可能性。然而，关于新技术的安全性的数据有限，需要考虑疫苗生产和转化的可行性，以及人类免疫反应的复杂性。新技术和策略将有助于解决现在或未来人类面临的复杂或严重疾病，这些知识对于设计有效的疫苗将非常重要。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：佐剂是疫苗不可或缺的组成部分。尽管在疫苗中广泛使用，但其作用机制尚未完全清楚。随着对先天免疫反应如何控制抗原特异性反应机制的更深入了解，佐剂的作用机制开始被阐明。佐剂可分为免疫刺激剂和递送系统。免疫刺激剂是危险信号分子，通过靶向Toll样受体（TLRs）和其他模式识别受体（PRRs），促进抗原信号和共刺激信号的产生，从而增强适应性免疫反应，导致抗原呈递细胞（APCs）的成熟和激活。另一方面，递送系统是载体材料，通过延长装载抗原的生物可用性，以及将抗原靶向淋巴结或APCs，促进抗原呈递。本文综述的开头系统总结了佐剂的作用机制。随后介绍了经典疫苗佐剂的机制、特性和进展。此外，由于一些正在研究的佐剂显示出比经典佐剂更大的免疫激活潜力，这可能弥补经典佐剂的不足，因此随后总结了正在研究的佐剂平台。值得注意的是，我们强调了这些佐剂平台的不同作用机制和免疫学特性，这将为不同疫苗的合理设计提供广泛的选择。在此基础上，本综述指出了疫苗佐剂的发展前景和未来应注意的问题。 1.引言 佐剂被定义为与疫苗抗原联合使用时增强疫苗免疫原性的各种成分（图1）。佐剂可以是合成的小分子化合物，也可以是复杂的天然提取物和颗粒材料。佐剂的第一个证据出现在1926年，当时亚历山大·格伦尼发现将铝盐与抗原混合并注射到豚鼠体内比单独给予抗原诱导出更多的抗体（图2）。随后，在20世纪40年代，弗伦德及其同事开发了水包油乳液，导致了弗伦德佐剂的创建。然而，由于对人类有毒，弗伦德佐剂并未获准用于人类疫苗。与弗伦德佐剂类似，由于局部和系统性副作用，细菌脂多糖（LPS）佐剂在人类疫苗中的使用受到限制。实际上，从20世纪20年代到90年代，尽管努力开发新的人类疫苗佐剂，但只有铝佐剂获得了许可。直到1997年，水包油乳液MF59才作为流感疫苗的佐剂在欧洲获得许可。在接下来的20年里，另外四种佐剂（AS04、AS03、AS01和CpG ODN 1018）获准用于疫苗，改变了人类疫苗佐剂的单调性。此外，在此期间，许多其他不同类别的化合物作为佐剂进行了评估，包括矿物盐、微生物产品、乳液、皂苷、合成小分子激动剂、聚合物、纳米颗粒和脂质体。它们在临床前和临床研究中显示出增强免疫反应的强度、广度和持久性。 图1 佐剂增强疫苗的免疫原性。a 无佐剂的疫苗诱导产生适度的T辅助细胞极化细胞因子、抗体和活化T细胞。b 相比之下，含佐剂的疫苗促进更多APCs（抗原呈递细胞）的成熟，增加APCs与T细胞之间的相互作用，促进产生更多数量和更多类型的T辅助细胞极化细胞因子、多功能T细胞和抗体，从而导致广泛和持久的免疫力，以及剂量和抗原的节省。这张图是用BioRender（https://biorender.com/）创建的。 图2 疫苗佐剂研究历史中主要事件的时间线。这张图是用BioRender（https://biorender.com/）创建的。 尽管佐剂在疫苗中已广泛使用很长时间，但它们增强免疫反应的机制尚未得到很好的表征。直到揭示了先天免疫反应如何控制适应性免疫反应的机制，科学家们才开始理解佐剂的作用机制。佐剂通过靶向先天免疫细胞并激活模式识别受体（PRRs）信号通路，引导和增强特定的适应性免疫反应。随后，发现一些递送材料也可以通过模仿自然病原体的大小或空间结构，通过促进抗原呈递细胞（APCs）摄取和呈递抗原，作为佐剂通过增强适应性免疫反应发挥作用。尽管在佐剂开发方面取得了上述进展，但由于它们的定义广泛和机制复杂，对佐剂的作用机制缺乏系统的概括和总结。此外，由于缺乏对当前佐剂平台的机制、特性、免疫效果和应用场景的系统深入理解，很难为特定疫苗匹配和设计合适的佐剂。这导致当前疫苗在使用中逐渐显示出不足，例如无法提供长期保护性免疫、老年人群的免疫弱和无法提供有效的细胞免疫。因此，为了解决这些问题，本综述尝试首先总结佐剂的机制。然后，总结了具有潜在发展价值的经典佐剂平台和正在研究的佐剂平台的机制、特性和应用进展。在本文的最后一部分，讨论了佐剂可能的未来发展方向。本综述希望能为佐剂机制的进一步研究、现有佐剂的合理使用以及新佐剂的设计和开发提供有效的参考。 2.佐剂的作用机制 佐剂已广泛用于疫苗中，以促进疫苗接种的成功。佐剂通过激活先天免疫细胞增强疫苗的适应性免疫。核心概念是佐剂通过激活APCs促进抗原呈递信号（信号1）和共刺激信号（信号2）的产生（图3）。抗原呈递信号是抗原肽-主要组织相容性复合体（MHC），在抗原被摄取和处理后呈现在APCs表面。共刺激信号包括APCs表面表达的共刺激分子（例如CD40、CD80、CD86）和分泌的炎症细胞因子（例如IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α）。这两种信号的产生可以强烈诱导初始T细胞的激活，导致增强的适应性免疫反应。免疫刺激剂，如病原体相关分子模式（PAMPs）、损伤相关分子模式（DAMPs）和化学合成的TLRs小分子激动剂，可以通过APCs产生信号1和信号2。递送系统，如脂质纳米颗粒（LNPs）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）和笼状蛋白纳米颗粒，通过促进MHC分子上的抗原呈递（信号1）发挥作用。值得注意的是，一些研究表明，许多纳米颗粒递送系统可以直接靶向B细胞以诱导最佳有效的抗体反应。接下来，我们详细描述免疫刺激剂和递送系统发挥佐剂效力的具体机制。 图3 佐剂作用机制的核心。佐剂被分类为免疫刺激剂和递送系统。像PAMPs（病原体相关分子模式）、DAMPs（损伤相关分子模式）和化学合成的小分子激动剂这样的免疫刺激剂，提供危险信号（信号0），激活APCs（抗原呈递细胞）上的PRRs（模式识别受体），从而增强MHC分子上的抗原呈递（信号1）。此外，PRRs的激活导致细胞因子和共刺激分子表达上调，这导致共刺激信号增强（信号2）。像LNPs（脂质纳米颗粒）、PLGA（聚乳酸-羟基乙酸共聚物）和自组装蛋白纳米颗粒这样的递送系统，通过促进MHC分子上抗原的呈递（信号1）发挥作用。这张图是用BioRender（https://biorender.com/）创建的。 2.1.免疫刺激剂的作用机制 根据作用机制，佐剂可分为免疫刺激剂和递送系统。免疫刺激剂是危险信号分子，通过靶向APCs细胞上特定受体导致APCs的成熟和激活。具体来说，免疫刺激剂作为PAMPs、DAMPs或其模拟物，可以与APCs上的PRRs相互作用，触发先天免疫反应，导致APCs的激活和成熟。成熟的APCs终止其吞噬抗原活性，并增强其呈递抗原和表达高水平共刺激信号和细胞因子的能力。这导致适应性免疫反应的启动和增强。此外，值得注意的是，不同类型的免疫刺激剂将通过不同的PRRs发出信号，并导致不同的细胞因子分泌，这是适应性免疫反应的主要决定因素（图4）。 图4 免疫刺激剂通过激活模式识别受体(PRRs)调节适应性免疫反应的简化图。不同类型的免疫刺激剂通过不同的PRRs发送信号，导致不同细胞因子的分泌，从而诱导不同的适应性免疫反应。免疫刺激剂通过靶向和激活a TLRs；b cGAS-STING；c CLRs；d 其他PRRs来诱导和调节适应性免疫反应。这张图是用BioRender（https://biorender.com/）创建的。 靶向TLRs途径。最初发现，免疫刺激剂通过与APCs上的TLRs相互作用来发挥其作用（图4）。作为佐剂的TLRs激动剂通过激活TLRs，增强抗原呈递、上调共刺激信号和细胞因子表达，最终增强适应性免疫反应，显示出有希望的结果。值得注意的是，不同类型的免疫刺激剂通过与不同的TLRs信号传导，介导不同的适应性免疫反应。总体而言，由于TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6表达在细胞表面，它们主要识别微生物膜成分，如脂质、脂蛋白和蛋白质。因此，相应的免疫刺激剂激活APCs表面的TLRs通常会导致产生促炎细胞因子，如IL-1β、TNF-α和IL-6，并最终导致产生Th1或Th2型免疫反应。TLR3、TLR7、TLR8和TLR9是细胞内TLRs，它们在细胞内囊泡中表达并与核酸反应。这些细胞内TLRs被相应的免疫刺激剂激活通常会导致产生I型干扰素。I型干扰素可以促进Th1细胞的分化并调节其功能。此外，I型干扰素通过常规树突状细胞（DCs）促进抗原交叉呈递给CD8+ T细胞，并可能直接刺激CD8+ T细胞的增殖。免疫刺激剂通过TLRs发挥作用的具体机制如下：(1)与TLR2异源二聚体（TLR2/1或TLR2/6）结合的免疫刺激剂通过髓样分化初级反应88（MyD88）途径启动信号传导并激活NF-κB，从而诱导产生促炎细胞因子如IL12。IL-12参与将初始T细胞分化为Th1细胞。此外，靶向TLR2的免疫刺激剂还导致增强的细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）信号传导，结果增强c-Fos蛋白的表达，这将抑制IL-12表达并增强IL-10表达。这推动初始T细胞极化为Th2型细胞。因此，靶向TLR2的免疫刺激剂主要诱导Th2型适应性免疫反应。(2)与TLR3结合的免疫刺激剂通过toll/白介素-1受体结构域包含的适配体诱导干扰素-β（TRIF）途径启动信号传导，激活干扰素调节因子3（IRF3）并刺激APCs产生I型干扰素。这最终导致Th1型反应和细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的产生。(3)与TLR4和TLR5结合的免疫刺激剂通过MyD88途径启动信号传导以激活NF-κB，这诱导促炎细胞因子分泌并推动初始T细胞向Th1型细胞极化。此外，值得注意的是，通过TLR4触发适应性免疫的免疫刺激剂也可以通过TRIF信号传导，导致IRF3的激活，从而产生少量I型干扰素。(4)靶向位于内质体的TLR7/8/9的免疫刺激剂通过MyD88途径激活NF-κB和干扰素调节因子7（IRF7），触发APCs产生促炎细胞因子和I型干扰素，并诱导强烈的Th1和CTLs反应。 靶向cGAS-STING途径。随着环鸟苷酸-腺苷酸合成酶-干扰素基因刺激因子（cGAS-STING）途径在协调先天和适应性免疫中独特作用的揭示，科学家们越来越有兴趣尝试将cGAS-STING途径的激动剂作为疫苗佐剂。cGAS是一种胞质DNA受体，可被双链DNA激活。cGAS激活后，将胞质腺苷酸和鸟苷酸环化成环鸟苷酸-腺苷酸（cGAMP）。随后，cGAMP锁定到STING二聚体的V形结合口袋中，引起构象变化、聚集和STING的激活。之后，NF-κB和IRF3将被激活，这反过来促进促炎细胞因子和I型干扰素的产生。I型干扰素如IFN-α/β可以诱导APCs的成熟，上调共刺激信号并增强其呈递或交叉呈递抗原的能力。因此，靶向cGAS-STING途径的免疫刺激剂不仅将初始T细胞极化为Th1型细胞，还促进CTLs的产生。靶向cGAS-STING的免疫刺激剂包括核苷酸小分子激动剂和非核苷酸小分子激动剂。其中，核苷酸小分子激动剂通常是基于环二核苷酸（CDNs）的天然配体分子，如环二鸟苷酸（c-di-GMP）、环二腺苷酸（c-di-AMP）、2’,3’-cGAMP和3’,3’-cGAMP。非核苷酸小分子激动剂的例子是DMXAA和CF501。此外，值得注意的是，胞质中的线粒体DNA（mtDNA）也可以被cGAS感知，从而激活STING途径。 靶向CLRs途径。C型凝集素受体（CLRs）是一个包括Dectin-1、Dectin-2、MINCLE、DC-SIGN、CD206、CD205等的超家族。CLRs主要定位在细胞膜上，作为抗原受体参与捕获和呈递抗原。具有碳水化合物结构的免疫刺激剂通常激活CLRs，随后诱导APCs启动内吞、处理和呈递抗原，以增强适应性免疫反应的发展。此外，一些免疫刺激剂可以激活CLRs，触发不同的信号传导途径，诱导特定细胞因子的表达，从而控制初始T细胞的极化方向。例如，β-葡聚糖通过Dectin-1的激活导致Syk激酶的磷酸化，进而激活NF-κB，导致制造促炎细胞因子IL12、IL-1β、IL6和IL23，从而诱导初始T细胞分化为Th1和Th17细胞。Th1型细胞诱导强烈的CTLs反应以及驱动B细胞中的免疫球蛋白转换为IgG2a。Th17效应细胞以产生IL-17、IL-17F和IL-22为特征，并通过招募中性粒细胞触发大规模炎症反应。免疫刺激剂激活Dectin-2和MINCLE以及DC-SIGN也可以导致NF-κB激活和促炎细胞因子的产生。然而，由于Dectin-2和MINCLE不具有免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAMs），它们需要与携带ITAM的FcRγ结合，才能发生信号传导。值得注意的是，多糖配体对DEC-205和CD206的刺激通常偏向于诱导增强的吞噬作用和抗原呈递，而不是细胞内信号传导。 靶向其他PRRs。在后续研究中，科学家发现免疫刺激剂也可以激活许多其他PRRs，如核苷酸结合寡聚化结构域1（NOD1）、核苷酸结合寡聚化结构域2（NOD2）、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）、视黄酸诱导基因I（RIG-I）和黑素瘤分化相关基因5（MDA5）。NOD1、NOD2和NLRP3是核苷酸结合寡聚化结构域样受体（NLRs）家族的成员。佐剂通过激活它们将导致APCs上调MHC II并有助于增强抗原呈递。此外，这些NLRs的激活将导致产生促炎细胞因子，如IL-1β和IL-18，驱动初始T细胞偏向极化为Th2型细胞。 Muramyl dipeptide (MDP) 或完全弗伦德佐剂 (CFA) 可以激活NOD1和NOD2，随后刺激NF-κB的转录激活，产生IL1、IL18和IL33的前体。随后，在激活的NLRP3炎症体复合体存在下，caspase1将这些因子切割成其活性形式。NLRP3炎症体复合体由NLRP3蛋白、凋亡相关斑点蛋白（ASC）、cardinal和caspase1蛋白组成。总的来说，NOD1、NOD2和NLRP3的激活将导致主要产生Th2型的免疫反应。RIG-I和MDA5是视黄酸诱导基因I样受体（RLRs）家族的成员，主要识别RNA。大多数TLR3激动剂，如polyI:C，也会在APCs中激活MDA5。RIG-I和MDA5的激活导致IRF3和IRF7的激活，进而诱导I型干扰素的表达。因此，靶向这两个受体的免疫刺激剂最终偏向于导致Th1细胞和CTLs的产生。 2.2.递送系统的作用机制 递送系统被定义为装载抗原的载体材料，并增加APCs对抗原的摄取和呈递。换句话说，递送系统的主要功能是促进抗原呈递。抗原呈递过程涉及APCs对抗原的识别、摄取和内吞，然后由MHC在APCs表面装载和呈递。递送系统可以通过一种或多种方式增加APCs表面呈递的抗原信号。 延长抗原的生物可用性。递送系统通过(1)允许抗原持续释放，(2)形成免疫微环境，和(3)为抗原提供货物保护来实现延长抗原的生物可用性。延长的抗原生物可用性将确保有足够的抗原可供APCs使用。因此，这将导致更多的MHC-抗原肽信号产生。 递送系统可以通过持续释放抗原来延长免疫系统中抗原的生物可用性。例如，纳米乳液递送系统（例如，MF59、AS03）的作用机制之一被认为是持续的抗原释放。最近，一些正在研究的递送系统也被发现具有缓慢释放抗原的能力，如可注射水凝胶。可注射水凝胶允许APCs通过缓慢释放持续呈递抗原，这有助于生发中心B细胞经历多轮亲和力选择，最终导致产生更大量和高亲和力的抗体。值得注意的是，通过调整水凝胶网格的大小，可以控制疫苗成分在水凝胶中持续释放的时间，从而调节释放时间窗口。此外，由生物可降解的PLGA或聚醚酸聚合物制成的固体聚合物颗粒可以包裹抗原，并在几天到几个月的时间内缓慢释放亚单位抗原。我们也注意到，具有大孔结构的自组装支架也具有缓慢释放抗原的能力。不仅如此，自组装支架除了抗原外，还可以通过装载免疫刺激剂来释放炎症信号，并增强血清抗体水平和CTLs水平。总之，使用持续释放技术来延长抗原和佐剂在免疫系统中的暴露时间和生物可用性，可以提高适应性免疫反应的效力、持久性和质量。 此外，一些递送系统可以通过在注射部位形成抗原库/免疫微环境来实现更高的免疫激活。以这种方式工作的递送系统不仅延长了抗原在免疫系统中的保留时间，还招募了更多的免疫细胞渗透到注射部位，这将增加抗原的摄取并提供局部炎症线索以激活随后的适应性免疫反应。已证明能够产生炎症免疫微环境的递送系统显著延长了抗原的生物可用性，增加了抗原的摄取，招募了免疫细胞，并增强了抗体滴度和细胞免疫反应。渗透到注射部位的先天免疫细胞的浸润使得形成微环境的递送材料比单独使用持续释放技术制备的递送材料具有更大的免疫激活能力。为了使免疫细胞渗透到递送系统中，可以将一些细胞因子并入递送系统并缓慢释放，从而增加细胞迁移。最常用的细胞因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。最近，Sun等人开发了一种可注射的聚（己内酯）-聚（乙二醇）-聚（己内酯）热敏水凝胶，包裹GM-CSF和卵清蛋白，增加了注射部位DCs的招募并提高了抗原的摄取效率。 此外，封装一些免疫刺激剂如TLR激动剂也可以促进先天免疫细胞的招募和渗透。研究发现，一些自佐剂递送材料也可以促进免疫细胞的渗透。例如，介孔硅棒是一种自佐剂递送材料，可以激活NLRP3先天免疫途径。当注射到小鼠体内时，它增加了先天免疫细胞对注射部位的渗透并增强了免疫反应。 此外，递送系统还可以通过保护抗原（特别是DNA和mRNA）免受体内酶的分解，从而维持其生物活性来延长抗原的生物可用性。例如，mRNA抗原容易受到细胞外血清中RNA酶的降解。因此，它们需要被包裹在密封的载体中以避免酶促水解，并确保mRNA顺利递送到目标细胞。LNPs是一种被证明有效的mRNA递送系统，其基本功能之一是包裹mRNA并保护其免受降解RNA酶的侵害。 值得注意的是，由于佐剂具有多种机制，延长抗原的生物可用性只是佐剂作用机制之一，它占所有作用机制的比例需要仔细研究。例如，通过形成“抗原库”来延长抗原的保留和生物可用性被认为是铝佐剂的关键作用机制。然而，随着研究的深入，一些研究人员发现，在铝佐剂给药后移除“抗原库”并没有显著减少抗原特异性T和B细胞反应的产生。这意味着形成抗原库以保留抗原的机制可能不是铝佐剂的关键作用机制，应该全面准确地理解佐剂的作用机制，以更合理地使用佐剂和开发新型佐剂。 APCs靶向。递送系统可以通过以下两种方法靶向APCs，并使APCs有效摄取抗原（图5）。增加抗原摄取量，反过来又增加了APCs表面呈递的MHC-抗原肽的数量，从而导致更强的适应性免疫反应。 图5 递送系统的的作用机制图。递送系统通过以下方式促进增强的抗原呈递或抗原交叉呈递，以增强适应性免疫反应：a 延长抗原的生物利用度；b 将抗原靶向到抗原呈递细胞(APCs)；c 直接将抗原运送到淋巴结；d 促进内质网逃逸。这张图是用BioRender（https://biorender.com/）创建的。 递送系统的第一种方法是通过模仿病原体的尺寸和空间结构来促进APCs对抗原的摄取。由于病毒和细菌是纳米到微米大小的颗粒，免疫系统已经演化出识别和响应颗粒性抗原的能力。微米或纳米材料已被用于递送抗原，增加了抗原的大小，从而在一定程度上改善了APCs的摄取。例如，与可溶性抗原相比，用脂质纳米颗粒封装抗原可以提高APCs对抗原的识别和内吞作用，从而增加抗原呈递并诱导产生更高幅度和更高亲和力的抗体。另一个例子是，装载H5N1流感抗原的新型水凝胶微粒递送系统可以改善体液反应并增强T细胞激活。这一现象的原因之一是水凝胶微粒增加了抗原的大小，进而提高了APCs对抗原的识别和摄取。此外，高度有序和重复的空间结构是病原体的固有特征，免疫系统已经演化出对这类结构高度敏感的识别和响应能力。自组装蛋白纳米颗粒和其他多价颗粒递送系统通过模仿病原体的高度有序和重复的空间结构，向APCs展示多价抗原，增加了APCs摄取抗原的概率。研究发现，即使在没有其他免疫刺激剂补充的情况下，这些递送系统也能引发强烈的体液和细胞免疫反应。值得注意的是，递送系统的有序和重复的空间结构非常有利于B细胞受体（BCRs）的共聚集，这可以导致B细胞的强烈激活，最终产生高亲和力抗体和记忆B细胞。 此外，递送系统通过直接靶向APCs上特定的受体（例如，Fc受体、CLRs）来促进更有效的抗原摄取。许多研究表明，靶向APCs上Fc受体的递送系统可以选择性地增强体外和体内的抗原摄取和细胞免疫。此外，CLRs是一类特定于DCs亚群的PRRs。这个家族的成员包括DEC-205、DC-SIGN和甘露糖受体等。使用CLRs配体（通常是碳水化合物）来修饰递送系统将导致抗原更直接地靶向特定的DCs，从而增强抗原摄取。例如，甘露糖修饰的聚合物用于递送黑色素瘤抗原肽，在黑色素瘤模型中强烈诱导预防性和治疗性抗肿瘤免疫反应。另一个例子是CDX-1401，它是一种疫苗，由特异性结合DEC-205的单克隆抗体与全长肿瘤抗原NY-ESO-1融合而成。研究表明，这种疫苗通过特异性靶向DEC-205受体的DCs，增加了抗原的摄取和呈递，从而增强了抗肿瘤效果。它在与其他药物联合使用时也显示出了有希望的临床价值。 考虑到与淋巴结相关的不同亚群的DCs可能在诱导不同类型的T细胞反应中具有不同的功能，递送系统的靶向免疫细胞群体（尤其是纳米颗粒）是疫苗递送系统开发中的关键考虑因素。从上述对APCs靶向的描述中可以看出，纳米颗粒递送系统的表面可以被特异性修饰以主动靶向特定的细胞群体。首先，纳米颗粒可以通过与功能化配体的耦合来靶向特定的细胞群体。例如，通过将针对CD169的抗体耦合到纳米颗粒的表面，纳米颗粒可以靶向至被膜下窦巨噬细胞。其次，调整纳米颗粒的大小也是靶向特定细胞群体的策略。当纳米颗粒被设计为保持在50-100纳米时，它们将优先靶向滤泡树突状细胞（FDCs）并被保留在FDCs中。这对于产生高亲和力和持久的抗体免疫反应很重要。此外，增加纳米颗粒的抗原价和纳米颗粒的糖基化修饰也将使纳米颗粒优先靶向FDCs。纳米颗粒还可以被设计为展示多价抗原蛋白以靶向和激活B细胞。总之，这些方法允许纳米颗粒主动靶向不同的细胞群体。 淋巴结迁移。大量的先天免疫细胞和淋巴细胞在淋巴结中积累，淋巴结是初始免疫反应的场所。因此，淋巴结是递送系统的关键靶标。一些递送系统可以直接促进抗原迁移到淋巴结，从而增加抗原在淋巴结中遇到APCs的机会，导致APCs摄取和呈递更多的抗原，增加抗原呈递信号。递送系统以两种方式直接将抗原运输到淋巴结。第一种方法是，递送系统通过被动扩散直接运输到淋巴结。具有适当尺寸和表面特性（如电荷和疏水性）的递送系统可以通过被动扩散进入传入淋巴管，随后进入淋巴结。研究表明，最佳尺寸在5到100纳米之间。如果递送系统的尺寸太小，它倾向于进入毛细血管。然而，如果递送载体佐剂的尺寸太大，它可能无法通过传入淋巴管内皮细胞之间的间隙，因此无法进入传入淋巴管。此外，在这种方法中，递送系统最好带净负电荷，而不是净正电荷，因为传入淋巴管的间质基质主要由胶原纤维和带负电荷的糖胺聚糖组成。此外，递送系统的亲水性影响其在传入淋巴管之间运输疫苗的效率。例如，与非PEG修饰颗粒相比，PEG修饰的50纳米聚合物在大鼠皮下注射后在大鼠淋巴结中的颗粒积累更多。 第二种方法是所谓的白蛋白搭车。由于内源性白蛋白在淋巴系统中循环，如果抗原能够与内源性白蛋白结合，它们就可以通过搭乘白蛋白列车被运输到淋巴结。目前，我们知道白蛋白是脂肪酸分子的转运蛋白，可以捕获并结合一些脂质分子。利用这一机制，研究人员设计了一种带有亲脂尾部的肿瘤肽疫苗。实验结果表明，疫苗与白蛋白结合，并在淋巴结中大量积累，导致T细胞产生增加30倍，并在小鼠注射后显著增强抗肿瘤效果。另一个例子是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DSPE），它已被证明可以与内源性白蛋白高效结合，具有高亲和力。秦等人构建了一个基于DSPE的递送系统，装载OVA抗原肽和聚I:C，使疫苗成分能够直接靶向淋巴结，并在淋巴结中大量积累，导致体内产生强烈的CD8+ T细胞反应，从而在小鼠中实现更有效的治疗和延长中位生存时间。此外，内源性白蛋白还可以与一些染料结合，如Evans蓝染料。利用这一特性，朱等人使用临床安全的Evans蓝衍生物与抗原耦合，发现疫苗有效地与白蛋白结合，并随白蛋白的回流被输送到淋巴结。通过体内实验发现，疫苗显著抑制了小鼠原发性或转移性肿瘤的生长。 促进抗原交叉呈递。抗原交叉呈递是外源性抗原通过MHC I分子呈递给CD8+ T细胞的过程。这对于针对病毒感染疫苗和癌症疫苗的接种至关重要。然而，在正常情况下，外源性抗原通常只被APCs内吞并由MHC II分子呈递给CD4+ T细胞，而不会发生任何交叉呈递。已经开发了几种递送系统，通过促进抗原从内体或溶酶体逃逸，然后由MHC I分子装载，从而实现抗原交叉呈递。这些递送系统主要通过三种方式实现这一目标。 第一种是质子海绵效应。当一些带有可质子化的胺基的阳离子聚合物或脂质递送系统被APCs内吞时，它们会吸收大量质子以缓冲APCs内体或溶酶体的酸性环境。这导致大量氯离子和水分从细胞质流入内体或溶酶体，引起内体膨胀和破裂。这一过程导致抗原释放到细胞质中，促进了MHC I分子的抗原交叉呈递。例如，在内体酸性条件下，聚乙烯亚胺（PEI）通过其可质子化的氨基吸收质子，导致内体膨胀和破裂。有研究报告称，用PEI修饰的氢氧化铝纳米颗粒显著增加了抗原交叉呈递。今天，其他阳离子聚合物和阳离子脂质体也被发现可以通过质子海绵效应增加抗原交叉呈递。 第二种，一些递送系统通过与内体/溶酶体膜融合或结合来破坏膜的稳定性，从而将抗原释放到细胞质中。通过Pickering乳液（PAPE）颗粒的阳离子颗粒铝佐剂在传递SARS-CoV-2 RBD疫苗抗原时，与铝佐剂组相比，诱导了3倍多的IFN-γ+ T细胞。这表明这种颗粒具有强大的激活细胞免疫反应的能力。这部分是因为它能够与内体/溶酶体膜结合，破坏内体/溶酶体膜的稳定性，导致抗原释放到细胞质中，并呈递给CD8+ T细胞。 第三种方法是光化学内化释放技术。这种技术提供了一种新兴的技术，通过使用光敏剂基于光诱导破坏内体膜，将内吞物质路由到细胞质中。具体来说，光敏剂被纳入递送系统中与抗原一起递送，随后光敏剂在暴露于特定光源后被激发形成单线态氧，这导致脂质过氧化和内体膜的破坏，从而将抗原释放到细胞质中。在一项研究中，Ji等人使用基于精氨酸和苯丙氨酸的聚酯酰胺作为原料制备阳离子纳米颗粒，这些纳米颗粒随后被进一步用于与光敏剂AlPcS2a形成静电复合物并递送抗原。当在660纳米光源下应用时，它显著促进了抗原从内体/溶酶体逃逸到细胞质，并增强了CD8+ T细胞介导的免疫反应。 3.经典佐剂平台 氢氧化铝佐剂、MF59、AS01、AS03、AS04和CpG ODN 1018是人类疫苗的经典佐剂。它们已被广泛批准用于多种疫苗，并用于增加疫苗抗体滴度和增强细胞免疫反应。 3.1.氢氧化铝佐剂 氢氧化铝佐剂是第一个被批准用于人类疫苗的佐剂。在许可疫苗中常用的两种基于铝的佐剂是氢氧化铝和磷酸铝。氢氧化铝佐剂通过促进Th2细胞反应增强IgG1和IgE抗体的产生。然而，氢氧化铝佐剂的作用机制复杂，学术界仍存在持续的争论。目前有两个方面得到了广泛认可。首先，氢氧化铝佐剂作为递送系统与抗原紧密结合并持续释放抗原，从而延长抗原的生物可用性并增加抗原呈递。其次，氢氧化铝佐剂也可以作为免疫刺激剂，诱导DAMPs的产生，从而激活先天免疫途径的PRRs，导致产生IL-1β等细胞因子和Th2型免疫反应。近年来，一些研究表明，由注射部位的氢氧化铝佐剂诱导的宿主细胞死亡释放的宿主DNA或尿酸可作为内源性危险信号。这些内源性危险信号可以作为DAMPs诱导先天免疫途径的激活。关于氢氧化铝佐剂靶向的PRR，一些科学家认为是NLRP3，而一些人持怀疑态度。然而，这并不妨碍氢氧化铝佐剂成为疫苗行业的佐剂首选，因为其公认的安全性和可靠性。含铝佐剂广泛用于预防和治疗各种疾病，包括白喉、破伤风、脑膜炎和乙型肝炎病毒（HBV）疫苗，已获食品药品监督管理局（FDA）批准。此外，铝也是新临床开发疫苗的候选佐剂，如SARS-CoV-2疫苗。然而，氢氧化铝佐剂也有一些缺点，包括难以诱导强烈的细胞免疫反应和可能的不良反应（红斑、过敏反应）。出于这些原因，通过改进配方或将其制备为纳米铝佐剂，可以使氢氧化铝佐剂更有效。 3.2.乳液佐剂 MF59和AS03都是经典的水包油乳液佐剂。MF59由角鲨烯、Tween 80和Span 85组成。MF59作为流感疫苗的佐剂于1997年获得许可，成为第一个被批准用于人类疫苗的非铝佐剂。MF59乳液具有抗原递送和免疫刺激的双重功能。MF59可以作为乳液递送系统，与抗原共递送时，它可以延长抗原与免疫系统的相互作用时间，并通过在淋巴结中缓慢释放抗原来增加抗原呈递。这导致APCs表面呈递更多的抗原信号，因此，身体对抗原产生更强的特异性免疫反应。此外，MF59还作为免疫刺激剂。MF59可以靶向特定的PRRs并通过诱导产生内源性危险信号来激活先天免疫细胞。MF59在肌肉中的给药激活了巨噬细胞和DCs等先天免疫细胞，并促进了CCL2、CCL4、CCL5和CXCL8等趋化因子的产生。这些趋化因子反过来招募更多的先天免疫细胞到注射部位以进一步放大免疫反应，并促进这些招募的先天免疫细胞迁移到引流淋巴结以激活B细胞和T细胞。然而，值得注意的是，MF59的确切靶向PRR仍然不清楚，除了MF59可能通过NLRP3独立的ASC激活途径和TLR独立的MyD88激活途径发挥作用。（图6） 图6 经典佐剂主要信号通路的简化图。这张图是用BioRender（https://biorender.com/）创建的。 总之，使用MF59佐剂的疫苗接种会导致体内偏向于Th2的免疫反应，并弱化Th1反应的诱导。目前，MF59已被广泛用于多种人类疫苗，并显示出良好的安全性和有效性。AS03是另一种水包油乳液佐剂，由α-生育酚、角鲨烯和Tween 80组成。AS03和MF59的佐剂效果相似。首先，它作为抗原递送系统，通过缓慢释放来增强APCs表面的抗原信号呈递。其次，AS03也具有免疫刺激作用，因为它也含有角鲨烯。和MF59一样，AS03通过NLRP3非依赖性ASC激活途径和TLR非依赖性MyD88激活途径发挥免疫刺激作用。此外，AS03还包含α-生育酚作为额外的免疫刺激成分。研究表明，α-生育酚参与调节某些趋化因子和细胞因子的表达，如CCL2、CCL3、白细胞介素6和CXCL1，这些因子增强APCs对抗原的摄取，并增加引流淋巴结处募集的先天免疫细胞数量。像MF59一样，AS03通常主要诱导偏向于Th2的免疫反应，对Th1反应的诱导较弱。AS03在2009年H1N1大流行期间被欧盟许可用于流感疫苗（Pandemrix, TM,GSK）。随后，在2013年，AS03被美国FDA许可用于H5N1禽流感疫苗，并显示出令人满意的安全性、反应原性和免疫原性。AS03主要用于各种流感疫苗，以增加抗体的滴度和持久性。最近，AS03在COVID-19疫苗（NCT04450004, NCT04405908）的开发中也显示出良好的临床效益。 3.3.基于TLR激动剂分子的佐剂 AS04和CpG ODN 1018都是经典的基于TLR激动剂分子的佐剂。AS04是通过氢氧化铝吸附TLR4激动剂分子制备的。由于AS04包含氢氧化铝佐剂，它也具有免疫刺激和递送抗原的功能。然而，AS04的免疫刺激功能比氢氧化铝佐剂更强。这是因为AS04包含一种更强效的免疫刺激分子，称为单磷酸脂质A（MPLA）。MPLA是从LPS中分离出的低毒性衍生物，可以特异性激活APCs上的TLR4，导致NK-κB激活和促炎细胞因子的表达，从而产生更强的Th1细胞反应。此外，当比较补充AS04的疫苗与仅补充氢氧化铝佐剂的疫苗时，发现补充AS04的疫苗诱导了更高水平的抗体。这证明TLR4激动剂MPLA在AS04中发挥重要作用。总的来说，AS04比氢氧化铝佐剂产生更强的抗体反应和Th1细胞反应，并诱导更平衡的Th1/Th2免疫反应。AS04目前主要用于人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗（Cervarix）和乙型肝炎病毒（HBV）疫苗（Fendrix），以增加抗体产生和激活抗原特异性T细胞。 CpG ODN 1018是一种合成的单链DNA分子，已被广泛研究作为TLR激动剂。CpG ODN 1018特异性激活TLR9，导致TRF7激活，进而导致促炎细胞因子和I型干扰素的产生，最终导致强烈的Th1型细胞反应和细胞毒性T细胞的产生。这使得它比氢氧化铝佐剂产生更好的细胞免疫反应。CpG ODN 1018最初被批准用于乙型肝炎病毒（HBV）疫苗。CpG ODN 1018目前正在临床试验中作为COVID-19疫苗的潜在佐剂进行评估。最近，一种用CpG ODN 1018佐剂的COVID-19疫苗（SCB-2019）已被评估用于紧急使用。 3.4.颗粒佐剂系统 AS01是一种经典的颗粒佐剂系统，是一种含有免疫刺激剂MPLA和从Quillaja Saponaria树皮中提取的活性成分QS-21的脂质体佐剂。AS01具有抗原呈递和免疫刺激的双重功能。AS01的抗原呈递功能由脂质体执行。脂质体是一种中空的磷脂双层人工膜，可用于封装和递送抗原。脂质体可以保护抗原免受降解并延长其生物可用性，从而使APCs能够捕获更多的抗原信号。AS01的免疫刺激功能由MPLA和QS-21贡献。MPLA通过TLR4激活先天免疫系统，导致Th1型反应增加。QS-21激活APCs中的NLRP3，随后激活caspase 1以促进细胞因子IL1β、IL18和IL33的活性形式的产生。此外，QS-21还被发现可以促进内体逃逸并促进交叉呈递。总的来说，这两种免疫刺激成分协同作用，使AS01诱导以Th1为主的免疫反应，并促进CTLs的产生。AS01是已许可的疟疾和带状疱疹疫苗的一部分，促进抗原特异性抗体产生并增强细胞免疫反应。最近，AS01也已应用于新型结核肽疫苗（M72/AS01E）的开发，并已显示出对健康成年人的安全性、有效性和预防结核病的前景。 总之，佐剂是疫苗的重要组成部分。经典佐剂为其他新疫苗的开发提供了相对可翻译的平台。这些佐剂可以优先选择用于新疫苗的临床试验，以便快速获得市场批准。然而，这些佐剂也揭示了一些问题。例如，它们增强疫苗免疫的能力较弱，不提供长期保护性免疫，并且在老年人群中效果较差。此外，大多数这些批准的佐剂只能诱导抗体反应，并且诱导CD8+ T细胞介导的细胞免疫的能力较弱，这对于针对病毒感染性疾病和癌症疫苗至关重要。最后，大多数许可的佐剂的作用机制仍然不清楚，这可能导致这些佐剂的不当使用和不可控制的副作用。因此，需要新型佐剂来解决这些问题。 4.正在研究的佐剂平台 由于佐剂在疫苗中的突出作用，近年来佐剂科学经历了快速发展。一些正在研究的免疫刺激剂和递送系统显示出良好的佐剂效果。接下来，我们将总结和描述它们。 4.1.正在研究的免疫刺激剂平台 近年来，随着对佐剂的深入研究，一些正在研究的免疫刺激剂显示出良好的佐剂效果。在本节中，我们将总结和描述这些正在研究的免疫刺激剂的作用机制、特性和应用进展。 合成双链RNA（dsRNAs）。合成双链RNA（dsRNAs）能够靶向并激活APCs上的TLR3和MDA5，导致产生IL-12等促炎细胞因子和I型干扰素，促进产生强烈的偏向Th1的免疫反应和CTLs。Poly-I:C及其改良变体Poly-ICLC是最研究的合成dsRNA免疫刺激剂。体外研究表明，poly-I:C和poly-ICLC诱导人外周血单核细胞衍生的DCs成熟，导致分泌IFN-β和促炎细胞因子IL-6和IL-12，从而促进外源性抗原与CD8+ T细胞的交叉呈递，并触发偏向Th1的免疫反应。临床前和临床研究均表明，poly-I:C和poly-ICLC是增强抗体产生和CD8+ T细胞免疫反应的有前景的佐剂。在人类的一项测试显示，将poly-ICLC与靶向DC的疫苗结合使用，诱导了与活病毒疫苗相似的先天免疫反应，进一步强调了poly-I:C/poly-ICLC作为疫苗佐剂的有效性。此外，我们注意到poly-I:C和poly-ICLC在临床上用于肽疫苗、DC疫苗和全细胞疫苗，主要用于各种癌症疫苗。将poly-I:C或poly-ICLC添加到癌症疫苗中，增强了疫苗诱导的抗肿瘤T细胞和NK细胞反应，从而有助于肿瘤的消退或根除。然而，值得注意的是，poly-I:C/poly-ICLC可能会有剂量依赖性全身发热和凝血异常等副作用，除了其触发强大免疫反应的功能外。因此，应考虑合理的递送系统来保护它免受降解，并将更多的poly-I:C/poly-ICLC靶向到APCs，以确保尽可能低的剂量激活APCs并减少副作用。 GLA及其衍生物。葡萄糖基脂质A（GLA）是一种合成的LPS模拟物，是MPLA的替代品。GLA可以通过激活APCs上的TLR4在体内诱导Th1型免疫反应。为了增强GLA的免疫效果，通常将其制备成制剂使用。GLA通常被制备成葡萄糖基脂质A-水性纳米悬浮液（GLA-AF）、葡萄糖基脂质A-稳定乳液（GLA-SE）、葡萄糖基脂质A-脂质体（GLA-LS）和葡萄糖基脂质A-氢氧化铝（GLA-alum）。其中，GLA-SE在临床前和临床研究中研究最多。当Clegg等人使用GLA-SE作为H5N1亚单位疫苗的佐剂时，他们发现它诱导产生了抗原特异性Th1型CD4+ T细胞和更高滴度的Th1型抗体，并保护小鼠和雪貂免受H5N1病毒挑战。在非人灵长类动物中，GLA-SE作为流感疫苗佐剂使用时诱导产生更多的Th1型细胞因子，并诱导产生针对多种流感病毒变种的中和抗体，大大提高了疫苗的保护性免疫效果。除了改善疫苗的体液免疫反应外，在一项II期临床试验中，当使用GLA-SE作为H5N1流感疫苗的佐剂时，显示出剂量节省效应，这在大流行性流感情况下特别有益。在几项临床试验中，当GLA-SE作为TB疫苗的佐剂并针对ID93重组蛋白进行测试时，疫苗被发现诱导产生高滴度的抗原特异性抗体产生和CD4+ T细胞反应，在接种人群中展现出良好的安全性和免疫原性。此外，GLA-SE已在临床上作为疟疾疫苗、肿瘤疫苗、HIV疫苗、内脏利什曼病疫苗和血吸虫病疫苗的疫苗佐剂进行评估。这些临床试验似乎表明，GLA-SE是一种有效且安全的疫苗佐剂，有潜力成为下一代疫苗佐剂。GLA-AF是GLA家族中另一个研究得很好的产品。GLA-AF也已在临床前和临床测试中作为几种疫苗的佐剂候选进行了评估。 咪唑喹啉类。咪唑喹啉类能够激活TLR 7/8，导致NF-κB和IRF7激活，促进产生促炎细胞因子和I型干扰素，这将导致强烈的Th1细胞和CTLs产生。伊马克莫德（R837）、雷西莫德（R848）和3M-052（也称为特拉托利莫德）是作为佐剂在临床前和临床环境中研究最多的咪唑喹啉类。大量证据表明，R837在黑色素瘤、HPV、乳腺癌和T细胞淋巴瘤疫苗中表现出强大的佐剂作用。与R848结合的病毒疫苗和肿瘤疫苗显示出更强的体液反应和CD8+ T细胞免疫反应。 3M-052是一种结构类似于R848的咪唑喹啉化合物。3M-052的18-C脂肪酸链赋予了化合物增强的疏水性，从而提高了免疫部位的生物利用度并降低了系统传播的可能性。此外，这种脂化使3M-052更容易纳入基于脂质的制剂中，如乳液或脂质体。用PLGA纳米颗粒或氢氧化铝包裹的3M-052配制的HIV疫苗已被证明能诱导高水平和持续的抗体反应和T细胞反应。基于氢氧化铝-3M-052佐剂的HIV疫苗已在人类I期临床试验中进行了研究。此外，3M-052也用于灭活SARS-CoV-2疫苗。印度III期临床试验的中期结果显示，该疫苗总体估计有效率为77.8%，表明该疫苗耐受性良好。COVAXIN目前已被世界卫生组织（WHO）批准紧急使用。 这些咪唑喹啉类作为疫苗佐剂的使用增强了免疫效果，但也存在一些不足。具体来说，它们经常从注射部位系统扩散，从而远离抗原，降低效果，并诱导系统性副作用。因此，这些咪唑喹啉需要与合成聚合物支架、纳米凝胶、基于脂质的纳米颗粒或其他递送材料结合，以增强其免疫效果并减少副作用。 CpG ODNs。CpG ODNs是合成的单链DNA分子，作为TLR9激动剂已得到广泛研究。其中，最常用作疫苗佐剂的是CpG ODN 1018、CpG ODN 7909和IC31。它们可以导致TRF7的转录激活，进而导致细胞因子IL-12和I型干扰素的产生，最终诱导强烈的Th1型细胞反应和CTLs产生。CpG ODN 1018是在临床前和临床试验中研究最多的CpG ODN，并在前一节中有所描述。除了CpG ODN 1018，CpG ODN 7909是研究最多的CpG ODN。当CpG ODN 7909添加到HBV疫苗中时，CpG ODN 7909在健康人群中诱导出更显著和快速的HBsAg特异性体液反应。CpG ODN 7909还可以改善HIV阳性患者对疫苗的反应率，展示了与CpG ODN 7909配制的疫苗在提高免疫受损个体疫苗反应率方面的潜力。一项随机、双盲对照试验测试了CpG ODN 7909作为HBV疫苗（Engerix-B）佐剂的免疫刺激效果。试验结果表明，添加CpG ODN 7909实现了快速、更高和持续的血清保护，并增加了与单独Engerix-B相比的HBV特异性Th反应。除了与HBV的使用外，CpG ODN 7909(表1, NCT00889616)还用于疟疾疫苗。一项基于蛋白质的疟疾疫苗BSAM2的I期临床试验显示，添加CpG ODN 7909的剂量节省效应。这一特性在资源匮乏的环境中特别有价值。 IC31是TLR9的另一种激动剂，它包含CpG ODN和带正电的抗菌肽成分。它通过TLR9/MyD88依赖途径信号细胞和体液免疫反应。此外，IC31的两个组分之间通过离子和疏水相互作用形成的稳定复合物可以在注射部位形成抗原库，提供抗原的缓慢释放并延长抗原的生物可用性。IC31可以增加APCs的抗原呈递，并显著提高CpG ODN的免疫效果。基于小鼠的研究表明，IC31有助于诱导强大的抗原特异性CTLs和强烈的抗原特异性体液反应。IC31已作为各种亚单位疫苗的候选佐剂在临床前和临床试验中得到广泛评估。结果表明，IC31是一种有效的疫苗佐剂，具有临床转化的潜力。 环二核苷酸（CDNs）。CDNs能够靶向并激活cGAS-STING途径，导致IRF3和NF-κB的激活，诱导产生I型干扰素和促炎细胞因子。I型干扰素选择性刺激抗原交叉呈递并动员CD8+ T细胞。因此，CDNs产生强烈的Th1型细胞反应和CTLs反应。CDNs包括天然CDNs和合成CDNs。天然CDNs包括2',3'-cGAMP、3',3'-cGAMP、c-di-GMP和c-di-AMP，它们是细菌和哺乳动物的第二信使，具有强大的免疫调节功能。基于天然CDNs的佐剂已在多种疫苗中得到评估，并显示出有希望的结果。例如，当2',3'-cGAMP被包裹在肺表面活性剂模拟脂质体中时，它增强了H1N1流感疫苗诱导的体液和CD8+ T细胞反应，并在小鼠和雪貂中诱导了对异型病毒的长期交叉保护免疫反应。Junkins等人将3'3'-cGAMP包裹在酸敏感的乙醛缩聚右旋糖（Ace-DEX）聚合物颗粒中，并与流感疫苗一起给小鼠注射。测试结果表明，与常规氢氧化铝疫苗组相比，抗体滴度高出60至600倍，并且未观察到明显的毒性效应。Lin等人将c-di-GMP包裹在PLGA中，并将MERS疫苗抗原外部耦合形成纳米疫苗。这种疫苗不仅触发了有效的中和抗体和抗原特异性T细胞反应，而且还优先靶向引流淋巴结，产生局部免疫并减少系统反应。当Ebensen将c-di-AMP作为H5N1流感疫苗的粘膜佐剂时，发现它能有效诱导小鼠对H5N1流感的保护性免疫。c-di-AMP作为HPV疫苗佐剂的I期临床试验目前正在进行中。 由于天然CDNs的半衰期短和APCs的摄取效率低，一些具有化学修饰的合成CDNs应运而生，以增强其免疫效果，如ADU S100、MK-1454、BMS-986301、SB-11285、IMSA-101。然而，这些合成CDNs作为疫苗佐剂的具体应用实例尚无。值得注意的是，由于这些合成CDNs在临床前和临床试验中显示出显著增强机体免疫反应的能力，我们相信使用这些合成CDNs作为疫苗佐剂的愿望很快就会实现。 此外，值得注意的是，随着纳米技术的出现，基于纳米颗粒的递送系统，如脂质体、乳液、类病毒颗粒（VLPs）和可生物降解聚合物，已受到显著关注。它们可以持续释放货物并改善货物的生物可用性。因此，使用纳米颗粒包裹CDNs被视为提高体内CDNs利用效率的策略。 代谢佐剂。近年来，一些靶向代谢途径的小分子调节剂被发现是新型疫苗佐剂。甲羟戊酸途径是各种细胞过程的核心代谢途径，包括胆固醇生物合成和蛋白质翻译后香叶基化。研究人员发现，亲脂性他汀类药物和合理设计的双膦酸盐可以通过靶向甲羟戊酸途径中的酶抑制下游代谢产物香叶基焦磷酸（GGPP）的形成。这一结果导致APCs中小型GTPases（例如Rab5）的香叶基化受阻，减缓了抗原从内体到溶酶体的运输并防止了抗原的快速降解。这延长了抗原保留时间，从而增强了抗原呈递。这些靶向甲羟戊酸途径的小分子抑制剂在增加抗体滴度和增强小鼠和猕猴的细胞免疫反应中显示出佐剂效果。 此外，最近的研究发现，雷帕霉素（mTOR）复合体，作为中心代谢调节因子，在调节免疫细胞中起着重要作用。首先，mTOR复合体可以调节浆细胞样DCs中I型干扰素的分泌。抑制mTOR复合体会严重减少产生的干扰素α。此外，mTOR复合体是效应T细胞扩增和生发中心B细胞反应产生的必需调节因子。除了mTOR，氨基酸传感器一般控制非压抑性2（GCN2）也在调节DCs等免疫细胞中发挥作用。研究表明，GCN2的激活导致DCs的自噬增强，从而增强了抗原呈递。这些结果表明，细胞代谢途径的酶或调节剂可能是设计和开发新型佐剂的潜在靶标。 锰佐剂及其衍生物。最近，锰（Mn）及其衍生物被发现具有潜在的佐剂活性。它们作为cGAS的激活剂，直接激活cGAS并诱导非规范的催化合成2'3'-cGAMP。通过这种方式，锰激活cGAS-STING先天免疫途径，诱导产生I型干扰素，增强抗原呈递和交叉呈递，促进抗体产生并增加CD8+ T细胞免疫反应的产生。据报道，Mn2+诱导的小鼠骨髓来源的DCs产生大量IFNβ和IFNα，并在体外实验中导致共刺激分子（例如CD80和CD86）和趋化因子（例如CCL2和CCL3）的显著上调。这表明Mn2+具有诱导DCs成熟和增强抗原呈递的佐剂活性。为了进一步验证其佐剂活性，研究人员将含有Mn2+的溶液与抗原一起注射到小鼠体内，发现它导致抗体滴度增加。为了防止Mn2+在溶液中聚集并失去佐剂活性，研究人员开发了一系列基于Mn2+的纳米佐剂来稳定Mn2+的佐剂活性。 例如，纳米级锰果冻（MnJ），它不仅具有作为免疫刺激剂激活cGAS-STING途径并诱导产生I型干扰素的能力，而且还作为递送系统携带抗原，从而产生强烈的体液和细胞反应。当通过鼻腔给药时，MnJ还作为粘膜佐剂诱导高水平的IgA抗体。王等人开发了另一种名为MnARK的锰佐剂。他们发现，即使在抗原剂量低5倍且注射次数减少的情况下，用含有MnARK佐剂的RBD疫苗接种的小鼠与用含有氢氧化铝佐剂的RBD疫苗接种的小鼠相比，显示出更大的中和假病毒（约270倍）和活冠状病毒（8倍）的感染能力。孙等人使用化学工程策略制造了一种基于Mn2+的纳米锰佐剂，称为nanoMn。以nanoMn为佐剂的冠状病毒疫苗在体内诱导了强烈的CD8+ T细胞免疫反应，并显示出良好的安全性。此外，一些其他基于Mn2+的纳米佐剂也显示出激活cGAS-STING途径和改善疫苗免疫反应的效果。这些结果表明，锰作为新型疫苗佐剂的开发具有巨大潜力。 许多具有不同特性的免疫刺激剂已在临床前和临床试验中得到评估。总体而言，靶向TLRs的免疫刺激剂在临床前和临床研究中仍然是最受欢迎的。另一方面，将多种PRRs激动剂结合起来，并将其配制成水包油乳液或使用其他递送系统进行装载，以增强其靶向APCs(NCT02126579, NCT01585350, NCT01008527, NCT02126579)的趋势日益增加。 4.2.正在调查的交付系统平台 近年来，随着工程材料科学的发展，基于工程材料的多种疫苗递送系统已经被开发出来。新型水包油纳米乳液、脂质纳米颗粒(LNPs)、聚合物纳米颗粒、类病毒颗粒(VLPs)、笼状蛋白纳米颗粒和无机纳米载体是一些重要的递送系统平台。不同类型的递送系统具有不同的机制和物理化学特性，相应地影响疫苗接种的效果。在这里，我们总结并描述了这些递送系统平台的机制、特性和应用。 新型水包油纳米乳液。Montanide ISA 51和Montanide ISA 720是两种在临床试验中测试的新型水包油乳液递送系统。Montanide ISA 51是用矿物油和甘露单油酸酯乳化的，而Montanide ISA 720是用非矿物油和甘露单油酸酯乳化的。此外，它们具有不同的油水比。这两种佐剂的作用机制是形成抗原库和缓慢释放抗原，以延长抗原的生物利用度。临床前和临床测试结果表明，Montanide ISA 51和Montanide ISA 720佐剂增强了血清抗体的产生和细胞毒性T细胞(CTLs)的产生。目前，Montanide ISA 51和Montanide ISA 720正在作为流感、疟疾、黑色素瘤和其他癌症疫苗的佐剂在临床试验中进行评估。此外，Montanide ISA 51在古巴获得了治疗性肺癌疫苗的许可。我们注意到，Montanide ISA 51和Montanide ISA 720通常用作乳化免疫刺激佐剂，以增强免疫刺激剂的效力。 脂质纳米颗粒(LNPs)。LNPs是一种多功能、非病毒性的纳米级脂质囊泡递送系统，由离子化脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇修饰的脂质组成。离子化脂质是LNPs的主要成分。磷脂和胆固醇有助于LNPs的结构完整性，而聚乙二醇修饰有助于维持LNPs的稳定性。LNPs的作用机制主要包括(1)为抗原提供有效的货物保护并延长其生物利用度；(2)增加抗原的粒径以针对抗原呈递细胞(APCs)并促进其被APCs摄取；(3)通过膜融合促进抗原从内质网逃逸，从而引发CD8+ T细胞免疫反应。经过多年的研究，LNPs已被用于各种疫苗的递送，并显示出强烈增强体液和细胞免疫反应的能力。Alameh及其同事发现，LNPs通过诱导强大的T滤泡辅助细胞、生发中心B细胞、长寿命浆细胞和记忆B细胞的增殖，增强了对mRNA和蛋白质亚单位疫苗的体液免疫反应。Oberli及其同事在使用LNPs递送mRNA疫苗治疗B16F10黑色素瘤时，激活了CD8+ T细胞，导致肿瘤缩小并延长了小鼠的总体存活率。近年来，LNPs作为有前景的mRNA疫苗递送系统，在COVID-19疫苗、肿瘤疫苗、流感疫苗等的临床试验中得到了广泛测试。2020年，辉瑞的BNT162b2疫苗(商品名为Comirnaty)和Moderna的mRNA-1273疫苗(商品名为Spikevax)，这两种使用LNPs递送mRNA抗原的疫苗，获得了紧急上市许可。这两种mRNA疫苗在抗击COVID-19方面做出了重要贡献。 聚合物颗粒。聚合物颗粒通常分为天然聚合物和合成聚合物颗粒。它们通常通过缓慢释放抗原来发挥作用。疫苗递送中最常用的天然聚合物是壳聚糖。壳聚糖具有高阳离子电荷和生物粘附特性。因此，壳聚糖可以通过静电相互作用与阴离子核酸形成紧密复合物。此外，壳聚糖的生物粘附特性使其能够长时间保持与粘膜表面的接触，促使抗原持续刺激免疫细胞。这表明壳聚糖可能是核酸疫苗和粘膜疫苗的一个有前景的递送系统。Sawaengsak等人通过将壳聚糖与三聚磷酸钠交联来封装灭活的流感病毒抗原，制备了一种纳米颗粒疫苗，并发现通过鼻内接种两剂这种疫苗的小鼠能够产生更多的抗原特异性抗体和IFNγ+ T细胞。这导致接种疫苗的小鼠100%抵御流感病毒攻击。最近，壳聚糖也被测试为Neocrown DNA疫苗的递送系统。鼻内免疫后，在小鼠体内检测到高水平的中和抗体，并且各种冠状病毒及其突变假病毒被有效中和。此外，壳聚糖最近还被发现通过激活DNA感受器cGAS-STING途径诱导I型干扰素的产生，以促进CD8+ T细胞免疫。 合成聚合物颗粒通常具有比天然聚合物更高的可重复性和更可控的缓慢释放速率。PLGA，一种合成聚合物颗粒材料，现在被广泛用作疫苗递送的载体。在临床前研究中，Kim等人将疫苗成分(包括抗原和免疫刺激剂)封装在PLGA中，以增加DCs对抗原的摄取和呈递，这使得免疫刺激剂能够针对淋巴结中的DCs，而不是系统性传播。Koerner等人设计了一种封装抗原和dsRNA佐剂的PLGA颗粒。这种颗粒疫苗被发现显示出理想的释放曲线，增加了目标淋巴结的数量，并被DCs有效吞噬和呈递。最终产生了有效且持久的抗癌免疫反应。PLGA也被用来递送其他癌症疫苗和HBV疫苗，并增强它们的免疫治疗效果。目前，PLGA颗粒已作为癌症疫苗的递送系统在临床上进行了测试。值得注意的是，PLGA已被FDA批准用于药物递送。因此，我们相信基于PLGA的疫苗递送系统将在未来不久被批准用于人类。 类病毒颗粒(VLPs)。VLPs是由病毒衣壳蛋白的外套蛋白通过蛋白单体的自组装形成的具有固定形状的聚合物颗粒。VLPs的优异粒径和几何形状使其成为递送疫苗抗原的有效平台。VLPs通常直径在20到100纳米之间，因此容易进入淋巴管并靶向淋巴结，由专门的APCs摄取。此外，由于它们高度重复和刚性的结构，VLPs可以在其表面展示多价抗原表位，因此可以广泛交联BCRs，从而刺激B细胞并诱导强烈且持久的抗体反应。目前，基于VLPs的疫苗已经成功并已经广泛上市，如用于HPV的Cervarix®和Gardasil®，用于肝炎病毒的Sci-B-Vac™，以及RTS, S VLP疫苗。VLPs不仅可以递送内源性病毒抗原，还可以递送通过化学偶联或基因融合修饰在VLPs上的异源抗原。例如，一种将HER2抗原表位附着在30纳米二十面体豇豆花叶病毒(CPMV)上的乳腺癌VLP疫苗，能够有效诱导抗原特异性反应和肿瘤保护。此外，肿瘤相关糖抗原MUC1可以共价连接到Qβ，这是一种自组装的二十面体壳VLP，直径为25纳米。这种MUC1 VLP疫苗诱导产生更高水平的特异性抗体，并延长了荷瘤小鼠的存活时间。几种基于VLPs的疫苗已成功进入临床试验，包括基孔肯雅疫苗、流感疫苗、Neocon疫苗、癌症、脑炎等疫苗。值得注意的是，由于VLPs的高度有序和重复的空间结构，非常有利于交联BCRs，即使在没有T辅助(Th)细胞的情况下，VLPs疫苗也能强烈激活B细胞。(表2) 笼状蛋白纳米颗粒。笼状蛋白纳米颗粒通常由一系列重复的图案组成，这些图案允许将抗原表位或抗原并入它们的亚单位结构中，使得这些并入的抗原表位或抗原在组装好的颗粒表面展示出来。与类病毒颗粒类似，笼状蛋白纳米颗粒具有高度有序和重复的空间结构以及适合淋巴结转运的最优尺寸。然而，与类病毒颗粒不同，笼状蛋白纳米颗粒是非病毒来源的。如热休克蛋白、蛋白金库和铁蛋白等笼状蛋白纳米颗粒已被广泛研究作为疫苗的递送平台。在上述蛋白纳米颗粒中，铁蛋白是最常应用的。铁蛋白是由24个亚单位自组装形成的具有八面体对称结构的蛋白，每个亚单位由四个α螺旋束组成。Kanekiyo等人通过将H1N1流感病毒的血凝素抗原与幽门螺杆菌来源的铁蛋白进行遗传融合，并将血凝素抗原插入铁蛋白亚单位并在其表面展示，构建了一种抗体滴度超过许可灭活疫苗10倍以上的纳米流感疫苗。这一设计的有希望的结果帮助开发了三种针对其他流感亚型的疫苗，这些疫苗现在正处于1期临床试验中。在上述三个1期临床试验中，NCT03186781试验已完成。结果显示，无论作为单独还是加强方案，流感疫苗H2HA-铁蛋白都是安全且耐受性良好的，并且可以产生广泛的中和抗体反应。最近，张和他的同事开发了一种基于铁蛋白的SARS-CoV-2纳米颗粒疫苗，该疫苗引发了有效的保护性免疫反应。此外，基于铁蛋白纳米颗粒的乙型肝炎疫苗可以递送乙型肝炎病毒抗原preS1到特定的抗原呈递细胞，激活强烈的免疫反应，并诱导高水平的持续抗体反应。此外，铁蛋白纳米颗粒可以有效递送肿瘤特异性抗原到淋巴结，导致特定的细胞毒性CD8+ T细胞反应和显著抑制肿瘤生长。值得注意的是，一种基于计算机设计的新型笼状蛋白纳米颗粒I53-50最近作为展示多价抗原的强大且多功能平台显示出令人兴奋的结果。基于I53-50的SARS-CoV-2疫苗展示了60个SARS-CoV-2刺突受体结合域在高度免疫原性图案中，产生了比对照疫苗高10倍的中和抗体滴度。同样，一种基于I53-50的纳米颗粒疫苗可以展示20个呼吸道合胞病毒DS-Cav1三聚体抗原，诱导的中和抗体反应比单独的DS-Cav1三聚体抗原高出约10倍。 无机纳米材料。金纳米颗粒是常用的无机纳米材料递送系统之一。由于金纳米颗粒的组成、尺寸、形态、疏水性、表面电荷、均质性和分布等物理化学特性可以通过材料合成和表面化学修饰精确调节以形成特定的免疫类型，因此近年来金纳米颗粒作为有前景的抗原递送系统被研究。金纳米颗粒通过(1)保护抗原免于降解和(2)形成合理粒径的纳米疫苗以促进直接将抗原运送到淋巴结来促进抗原呈递并增强适应性免疫反应。此外，Zhu等人报告称，金纳米颗粒可以通过激活NLRP3炎症体并促进Th2型细胞因子的产生来增强抗原特异性抗体的产生。当金纳米颗粒用作SARS-CoV-2蛋白疫苗的佐剂时，也发现它们可以促进抗原特异性IgG的产生，但未能诱导足够的细胞免疫反应来对抗病毒感染。因此，为了扩大金纳米颗粒的使用，它们通常与其他免疫刺激剂联合使用或表面修饰，以增强它们的T细胞免疫反应。Xu等人制备了修饰有PEI的金纳米颗粒，发现这些纳米颗粒通过激活抗原呈递细胞显著促进了T细胞的增殖。Wang等人将重组流感病毒血凝素与金纳米颗粒偶联，然后将其与TLR5激动剂鞭毛蛋白偶联作为颗粒佐剂系统。用这种疫苗通过鼻内接种小鼠，发现它增加了抗原特异性IgA和IgG水平，并增加了细胞因子IFN-γ的分泌和CD8+ T细胞的激活。在临床上，使用金纳米颗粒作为佐剂的登革热和SARS-CoV-2疫苗正在测试中。 与金纳米颗粒类似，介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNs)也具有强大的装载能力和易于表面修饰的特点。修饰后的MSNs已被研究作为有效的疫苗递送系统。Lee等人通过将MSNs与氧化铁纳米颗粒组装，形成了具有超大介孔的空心MSNs。然后使用PEI进行表面修饰，使得修饰后的MSNs内部的空隙允许有效装载不同大小的各种模型蛋白，并能增强抗原呈递和交叉呈递。当用作癌症疫苗递送系统时，它增加了抗原特异性CTLs的产生，抑制了小鼠的肿瘤生长，并提高了荷瘤小鼠的存活率。Li等人报告了一种以结核菌素纯化蛋白衍生物为佐剂的介孔二氧化硅/钙磷酸盐复合纳米颗粒的例子。结果表明，复合颗粒能够显著抑制肿瘤的生长。MSNs基材料也已在其他抗原的递送系统中进行了测试。值得注意的是，MSNs作为其他药物的载体已慢慢开始临床试验。由于MSNs在临床前研究中已显示出作为疫苗递送系统的效力，我们相信基于MSNs作为递送系统的疫苗也将在未来不久获得临床试验许可。 随着材料科学的发展，基于材料的递送系统迅速发展。现在可以通过递送系统保护疫苗成分并将其靶向到抗原呈递细胞或特定淋巴组织来增强疫苗接种的适应性免疫反应。然而，与免疫刺激剂相比，相对较少的递送系统进入了临床测试。这可能部分是由于递送系统的安全性问题尚未解决。因此，递送系统与宿主免疫细胞或器官之间的具体相互作用机制仍需要进一步研究以阐明其有效性和副作用，以便更好地平衡和控制两者之间的关系。 5.结论与展望 近年来，新型冠状病毒的出现和传播给全球公共卫生在疾病预防控制方面带来了巨大挑战，这再次凸显了疫苗开发的重要性。疫苗开发中不可忽视的一个话题是佐剂，因为它们能显著增强疫苗的适应性免疫反应。在综述的开头，我们总结了佐剂的作用机制，并对其进行了描述。根据作用机制，佐剂可分为免疫刺激剂和递送系统。免疫刺激剂通过靶向特定的模式识别受体(PRRs)激活抗原呈递细胞(APCs)，从而增强抗原呈递和共刺激信号，导致适应性免疫增强。递送系统通过延长抗原的生物利用度，将抗原靶向到APCs或淋巴结，增强APCs对抗原的摄取和呈递，从而增强适应性免疫反应。随后，本综述详细阐述了经典佐剂平台以及正在研究中的佐剂平台，希望为开发特定疫苗时合理选择佐剂提供信息。为了促进佐剂领域的更好发展，我们认为以下几点可能需要关注。 首先，选择正确的佐剂以协助抗原并改善免疫反应是新疫苗开发中的一个重要问题。然而，这个问题复杂且具有挑战性。这是因为免疫系统对给定疫苗和佐剂的反应高度依赖于具体情况，没有任何一种佐剂适用于所有情况下的抗原。结合本综述中对佐剂的描述，我们在此提出，在为新疫苗开发选择佐剂时，需要考虑以下因素。例如，给药途径（如肌肉内、粘膜、腹膜内）、所需免疫反应的类型（抗体偏向或CD8+ T细胞偏向，或两者兼有）、病原体类型、抗原类型（亚单位抗原或mRNA抗原）以及疾病阶段。此外，疫苗接种者的生物学特征也可能很重要，包括物种、种族、年龄、医疗史和遗传组成等。此外，佐剂的安全性和经济性也需要考虑。所有这些因素都可能影响疫苗佐剂的有效性。 此外，考虑到目前免疫刺激剂（主要是PRRs激动剂）和递送系统（尤其是纳米颗粒递送系统）的结合用于佐剂开发，以实现更高的免疫激活。在这里，需要仔细考虑一些问题。首先，通过我们对黄热病病毒疫苗的了解，我们知道同时激活多个先天受体比激活单个受体更有效。因此，非常需要阐明不同PRRs之间的信号交互作用，以更好地筛选更有效的PRRs组合。此外，鉴于抗原和PRR激动剂之间以及不同PRR激动剂之间的物理化学特性差异，递送系统需要更合理地设计，以足够灵活和兼容，同时递送多种疫苗成分。 最后，我们也想提及一点关于经典佐剂的问题。经典佐剂在历史使用中已显示出良好的生物安全性。此外，成熟的研发技术和完善的制造条件和设备为新疫苗的开发转化提供了相对容易的平台。然而，经典佐剂的缺点是它们的免疫刺激能力有限。鉴于此，迫切需要新佐剂来弥补经典佐剂的不足。然而，临床前开发和临床试验的成本和时间限制了新佐剂的转化。因此，我们认为，在促进新佐剂的开发和转化的同时，对经典佐剂进行一些性能优化和配方改进，如表面修饰、颗粒化，以及与其他提高其免疫效力的佐剂结合，可能是具有临床价值的研究课题。 在本综述中，我们系统总结了佐剂的作用机制，并根据其机制介绍和讨论了不同类型佐剂的特点和应用场景。我们期望这篇综述能为佐剂作用机制的进一步研究、现有佐剂的合理使用以及新佐剂的设计与开发提供参考价值。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。