GlaxoSmithKline Biologicals SA

摘要：流感仍然是主要的公共卫生问题之一，因为它每年都会流行，并有可能引发全球大流行。包括疫苗和抗病毒治疗在内的多种对策正在用于对抗季节性流感感染；然而，由于抗病毒药物的持续抗药性以及与其他疫苗相比流感疫苗相对较低且不可预测的效率，它们的有效性一直受到讨论。对疫苗作为预防和控制流感的有前途方法的兴趣日益增加，可能会提供具有潜在提高效率的替代疫苗开发选项。除了市场上现有的灭活、减毒活和重组流感疫苗外，目前正在探索诸如病毒样颗粒（VLPs）和纳米颗粒等新型平台，以及新的疫苗配方。这些平台提供了设计具有改进属性的流感疫苗的机会，以最大化质量和安全性。流感疫苗的生产过程也在向前发展，涉及基于鸡蛋和细胞的生产、纯化过程，以及对物理化学属性和疫苗降解途径的研究。这些将有助于设计更稳定、优化的疫苗配方，指导当代分析测试方法和通过实施该领域最新进展的实现。 1.流感病毒及其亚型 流感病毒是正黏液病毒科的一种包膜病毒。感染脊椎动物的流感病毒有四个属：A型、B型、C型和D型，它们根据基质蛋白和核蛋白的抗原差异进行区分。A型是迄今为止最有毒的病毒，可导致严重的呼吸道疾病或死亡。它甚至可能导致新的流感流行病和全球大流行。B型流感病毒也会导致人类的季节性流感流行。有两种流行的B型流感病毒谱系，即B/Yamagata和B/Victoria，它们包含在季节性流感疫苗中。与此同时，C型流感病毒通常引起轻微症状，并不已知引起流行病，而D型流感病毒已被确认感染猪、牛和羊，并未被识别为在人类中引起疾病。病毒携带一个负义、单链RNA(ssRNA)基因组，分为八个（A型、B型）或七个（C型、D型）独立的片段。在透射电子显微镜(TEM)下，A型和B型流感病毒在形态上无法区分（图1）。 图1.(A) 流感病毒的透射电子显微镜图像，主要呈球形，粒径约为100-150纳米；(B) 流感A型病毒的示意图，表示病毒组分，包括表面糖蛋白HA和NA，M1和M2蛋白，非结构蛋白和核蛋白。 它们具有直径约100纳米的球形或丝状形态，球形结构的直径通常超过300纳米，丝状形态的长度通常超过300纳米。A型流感病毒颗粒表面覆盖有病毒表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。每个平均大小为120纳米的病毒颗粒在其脂质膜上有大约300-400个HA和40-50个NA，尽管不同亚型之间的每种蛋白的数量各不相同。这两种糖蛋白成为进一步细分A型流感病毒的基础。迄今为止，已鉴定出18种HA亚型和11种NA亚型。H1-3和N1,2株（例如A/H1N1和A/H3N2）主要感染人类，目前作为季节性流感株在人类中流行。也有记录显示，其他亚型如高致病性H5N1也会导致家禽爆发和人类感染。 病毒膜上存在少量的基质离子通道蛋白(M2)，其比例大约是每10-100个HA分子一个M2。脂质包膜及其三种蛋白(HA、NA和M2)包裹着称为M1的基质蛋白，它环绕着病毒核心。病毒内部含有非结构蛋白2(NS2)和核糖核蛋白(RNP)复合体，该复合体由RNA片段和核蛋白(NP)层叠构成，RNA依赖的RNA聚合酶由两个聚合酶基础亚基(PB1和PB2)和一个聚合酶酸性蛋白(PA)亚基组成。 流感B型病毒的结构配置几乎与四种膜蛋白相同：HA、NA，以及代替M2的NB和BM2在B型病毒中发现。流感C型和D型病毒在结构上与A型和B型病毒明显不同，它们只有一种主要的表面糖蛋白，即HA酯酶融合糖蛋白，其功能类似于A型和B型病毒的HA和NA。流感C型和D型病毒颗粒有多种形态：它们呈椭圆形或球形，直径为80-120纳米，或呈丝状，直径相似，但长度在微米范围内。2.流感病毒生命周期 流感病毒的复制周期经历了几个阶段，如图2所示，如下：(1)病毒附着在唾液酸受体上，(2)病毒进入宿主细胞，(3)病毒颗粒的融合和解壳，(4)vRNPs进入细胞核，随后病毒RNA基因组的转录和复制，然后vRNPs从细胞核中导出，(5)病毒组分的组装和在宿主细胞膜上的出芽，最后(6)新病毒颗粒从宿主细胞中释放。 图2.流感A型病毒的生命周期：(1) 病毒通过HA附着在唾液酸受体上；(2) 病毒通过内吞作用进入宿主细胞；(3) 病毒颗粒的融合和解壳；(4) vRNPs进入细胞核，随后病毒RNA基因组的转录和复制，然后vRNPs从细胞核中导出；(5) 病毒组分的组装和在宿主细胞膜上的出芽；(6) 新病毒颗粒从宿主细胞中释放。 (1) 病毒附着在唾液酸受体上：病毒感染的第一阶段是HA附着在宿主细胞膜表面的唾液酸上。唾液酸通过糖苷键与HA的碳水化合物相连。有两种连接对于HA的特异性至关重要；(i) a(2, 3)连接在禽类的消化道或人类、猴、马的支气管组织中丰富，以及猪的上呼吸道肺上皮，(ii) a(2, 6)连接在人类上呼吸道细胞表面以及蝙蝠和猪的气管中发现。 (2) 病毒进入宿主细胞：病毒结合后发生受体介导的内吞作用，病毒以内体形式进入宿主细胞。 (3) 病毒颗粒的融合和解壳：内体的酸性pH值（pH 5-6）导致病毒和内体膜融合，并打开M2离子通道蛋白，使核酸酸化，从而允许vRNP从M1中释放出来，进入宿主细胞的细胞质，然后进入细胞核。 (4) vRNPs进入细胞核后的转录和复制：构成vRNP（NP、PA、PB1和PB2）的病毒蛋白检测到可以附着在细胞核输入机制上的核定位信号，因此进入细胞核进行转录和复制过程。负义RNA首先被转化为正义RNA，并作为生成病毒RNA的模板，随后由病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）启动内部RNA合成。通过其C末端结构域，RdRp与RNA聚合酶II（Pol II）的大亚基相关联，继续转录以产生成熟的mRNA。然后vRNPs通过核孔从病毒核心中导出。 (5) 病毒组分的组装和出芽：病毒的蛋白组分，即HA、NA和M2，被运输到膜的顶部区域，病毒颗粒从极性上皮细胞中出芽。 (6) 新病毒颗粒从宿主细胞中释放：在形成病毒颗粒后，由NA切割糖蛋白和糖脂上的唾液酸残基，使新合成的病毒颗粒能够从宿主膜上释放并传播到附近的细胞。3.流感病毒的HA和NA HA和NA是主要的跨膜糖蛋白，HA大约占病毒表面的80%。这两种糖蛋白识别宿主细胞的同一分子，即唾液酸(SA)。除了病毒的感染力和传播力外，这两种蛋白还与病毒的毒力特性、宿主特异性和对抗病毒治疗的抗性有关。HA和NA结构的带状图示于图3中展示。 图3.1918年人类HA（蛋白质数据银行(PDB) ID: 1RUZ）和2009年H1N1 NA与奥司他韦(PDB ID: 3TI6)复合物的带状图，其受体结合位点以蓝色圆圈显示。(A) HA单体；(B) NA单体；(C) 三聚体HA和(D) 四聚体NA从顶部显示。 HA由三个不可区分的亚基（同源三聚体）组成，附着在病毒脂膜上，每个单体都拥有一个包含受体结合域的球形头部，以及一个杆状区域（图3A）。这种蛋白负责病毒与其目标细胞的初次接触，这些细胞含有末端唾液酸残基。此外，HA通过内吞作用促进病毒进入宿主细胞，从而将核蛋白送入细胞质。HA作为流感病毒上的主要抗原，成为抗体中和的主要靶标。 NA（图3B）是一种四聚体蛋白，由四个相同的多肽组成，包括一个球形头部、一个细胞质尾部、一个跨膜域和一个杆状区域。它是一种酶，通过催化从一系列糖缀合物（如糖蛋白和糖脂）中切割末端α-(2,3或2,6)-酮苷键唾液酸，破坏HA所识别的受体，因此在病毒复制周期中发挥着至关重要的作用。NA作为一种生物学剪刀，切割HA和细胞表面糖苷的唾液酸残基，促进病毒进入期间病毒的运动，以及从新合成的病毒颗粒的表面糖蛋白上切割，从而允许病毒从宿主细胞中释放并继续感染其他细胞。 流感病毒完全依赖于HA和NA的平衡作用来建立有效的感染。在初次感染期间，受体结合亲和力的增加似乎也需要增加病毒NA的受体破坏活性。另一方面，在感染的后期，增强的受体结合是一个严重的不利因素，因为它会阻止新病毒颗粒从宿主细胞中释放。 4.HA和NA的糖基化 在流感病毒的复制周期中，由于复制过程的错误，病毒基因可能发生小的变化，这可能导致抗原漂移（病毒基因的小变化或突变，可能导致HA或NA的变化）。除了氨基酸序列的改变，抗原漂移通常还涉及病毒糖蛋白的糖基化模式的变化。HA和NA都具有N-糖基化潜在区域，通过N-糖苷键将寡糖链添加到存在于Asn-AA-Ser/Thr序列中的Asn残基上，其中AA可以代表除脯氨酸以外的所有氨基酸。这种附加是在内质网（ER）中存在的糖基转移酶和寡糖转移酶酶的帮助下发生的，随后在通过ER和高尔基体转移过程中，通过甘露糖苷酶和糖苷酶对寡糖进行结构改变。这种翻译后修饰对流感病毒生命周期至关重要，它影响生物合成、结构稳定性和糖蛋白功能。 HA的糖基化位点位于杆状区域，有助于HA的分子稳定性、其受体结合和宿主的免疫反应。先前的研究还表明，HA球形头部的糖基化可能暴露或保护抗原位点，使病毒能够逃避中和抗体。自1977年以来，四种季节性人类流感病毒株，两个A型亚型（A/H1N1和A/H3N2）和两个B型谱系（B/Victoria和B/Yamagata）已在全球范围内传播。图4展示了A/H1N1和A/H3N2株从1918年到2018年的糖基化模式的演变，即它们首次引入人类和当前流行的模式。1918年大流行A/H1N1和1968年A/H3N2流感病毒的HA杆状区域的糖基化已知是高度保守的。1918年A/H1N1在残基27、28、40、304、498和557处拥有六个保守的N-糖基化（NLG）位点（图4A），而1968年A/H3N2在残基24、38、54、301和499处有五个糖基化位点（图4B）。另一方面，HA的球形头部多年来经历了随后的糖苷增加和丢失。A/H3N2 HA球形头部的NLG位点数量从1968年最初的两个（位于残基97和181）增加到2018年季节性株的八个（位于残基79、138、142、149、160、174、181和262），在1975年左右97位点消失后。同样，1918年A/H1N1在其消失于1957年之前获得了越来越多的糖苷，并在1977年重新出现直到2009年A/H1N1株取代它之前具有相同的糖基化剖面。目前流行的A/H1N1株是猪系病毒的重组结果，糖基化与非常早期的人类A/H1N1相似。与此同时，自1983年Victoria和Yamagata谱系分裂以来，流感B病毒的NLG位点一直保持在大约10-12个位点相对稳定。 图4. 1918年HA（A）和1968年HA（B）的一些NLG位点。这些NLG位点是最初确定的，而红色、绿色和黄色的NLG位点是后来获得的。粉红色圆圈代表NLG位点的演变。1918年A/H1N1最初拥有六个NLG位点，并在1977年获得了两个NLG位点，但失去了两个，而2009年A/H1N1获得了三个。当前流行的2018年A/H1N1株又失去了五个NLG位点。与此同时，1968年A/H3N2 HA球形头部的NLG位点从1968年最初的两个增加到当前2018年株的八个（随着时间的推移，NLG位点的数量和位置发生了变化）。 HA中的糖基化位点和糖苷剖面的变化影响病毒与宿主免疫系统的相互作用。逃避中和抗体的识别使病毒能够继续在人类群体中传播。因此，需要更多的研究来研究病毒糖蛋白的糖基化模式，以设计更好的针对流感病毒的疫苗。虽然已知HA的NLG有助于免疫逃逸和流感病毒的毒力，但NA的NLG如何影响其功能仍然不清楚。先前发表的研究表明，N8 NA蛋白的糖基化对正确的四聚体化是必要的。此外，NA蛋白头部结构域的糖基化对正确的成熟是必需的。在最近的一项研究中，Bao等人探讨了A/1933/WSN/H1N1（WSN）病毒NA蛋白中NLG修饰的功能。结果表明，NA蛋白的NLG修饰对其出芽至关重要。在转染细胞中，非糖基化NA蛋白失去了出芽能力。此外，NLG修饰的缺失显著降低了突变病毒的出芽和复制。在小鼠模型中，NLG在219位点的缺失显著减弱了WSN病毒。有建议称，在细胞中过表达非糖基化NA蛋白诱导了未折叠蛋白反应（UPR），这可能会影响NA蛋白的出芽能力，从而减弱突变病毒的毒力。 5.流感流行病与大流行  流感病毒可以通过感染呼吸道引起严重的传染病，可能导致住院甚至死亡。据预测，每年的季节性流感大约有300万至500万例严重疾病和29万至65万例相关呼吸道死亡。东南亚和撒哈拉以南非洲的死亡率最高，75岁及以上的老年人、五岁以下儿童以及患有长期疾病使他们更容易感染流感或其并发症的个体，是严重后果和死亡的高风险群体。 新的A型流感病毒株每2至5年不定期出现，持续3至6个月，具体取决于地区。流感流行病通常被称为流感季节，可能与天气和气候有关。病毒表面糖蛋白HA和NA内的特定突变使得病毒能够逃避宿主免疫系统，导致自然感染或接种疫苗后都无法对病毒产生持久免疫力。流感病毒抗原性的微小变化被称为抗原漂移，这是流感流行病频繁发生的基础，使得每年都有必要根据世界卫生组织的建议更新流感疫苗以匹配当前流行的毒株。 另一方面，流感大流行是由病毒抗原性的显著变化引起的，大约每10至40年发生一次；然而，它可能在任何时候发生。历史上记载，20世纪至少发生了三次大流行：1918-1919年的西班牙流感、1957-1958年的亚洲流感和1968-1969年的香港流感，各自的死亡率从毁灭性到温和不等。这些大流行病毒通过不同流感病毒株的RNA片段重组获得了新的亚型。这种遗传变化，被称为抗原转变（由两种病毒株的基因组重组引起的病毒抗原性的突然变化），允许病毒株从一个动物物种跳到另一个物种，从动物跳到人类。 1918年的大流行，也称为西班牙流感，是有史以来第一次也是最严重的流感大流行。据估计，该病毒通过感染全球约25-30%的人口，杀死了大约5000万个体，约占世界人口的2.7%。2018年Spreeuwenberg等人的更近期分析表明，早期估计过高。他们自己的估计将死亡人数定为1740万，占世界人口的0.95%。1918年大流行是由A/H1N1亚型流感病毒引起的，被认为是几乎所有人类A型流感病例的共同祖先。这不仅包括1918年H1N1病毒的抗原“漂移”后代，还包括1957年（H2N2）、1968年（H3N2）和2009年（H1N1）出现的遗传重组大流行病毒。1957年2月在中国湖南省出现的H2N2亚型流感A病毒，被认为在临床上比导致1918年大流行的H1N1病毒更温和，全球死亡率为110万。该病毒在全球传播，直到1968年H3N2出现，引起了另一次大流行。它首先在中国出现，然后迅速传播到香港。1968年大流行，也称为香港流感，相比之下是一次较温和的大流行，死亡人数约为100万。21世纪的流感大流行始于2009年初，当时一种新的猪源性流感病毒出现并取代了以前的季节性流感H1N1。最初在墨西哥发现的病毒迅速在全球传播，并在74个国家报告感染后，世卫组织于2009年6月宣布为大流行。该病毒，也称为“2009 H1N1”，是两种已存在的猪流感病毒—北美H1N2和欧亚H1N1—之间的重组产物。 过去二十年，直接从鸟类到人类的禽流感病毒传播的报告有所增加，导致禽流感A/H5N1在家禽中的持续爆发和相关的人类感染。1997年，首次在香港检测到人类感染H5N1的致命病例。六年后的2003年，该病毒作为一种高致病性禽流感病毒重新出现，在当地家禽中引起了毁灭性的爆发，引发了对潜在流感大流行的担忧。这些爆发在几个国家已成为地方病，埃及、印度尼西亚和越南的病例数量最多。2007年，有证据表明中国有限的人传人H5N1。此外，世卫组织报告称，2006年和2007年在印度尼西亚和巴基斯坦分别观察到有限的、非持续的人传人H5N1病例。2014年1月8日，加拿大报告了美洲首例H5N1感染病例，是一名从中国返回的旅行者。尽管人类感染这种病毒并不常见，但大约60%的病例导致死亡。2019年11月，世卫组织宣布自2003年以来共有861例经核实的人类禽流感A(H5N1)病例，导致455例死亡，最后一例于2019年4月30日在尼泊尔报告。 6.针对流感流行病和大流行的疫苗  有几种疫苗用于对抗流感流行病和大流行。流感疫苗每年根据当前流行株的全球监测进行重新配制。因此，每年接种疫苗仍然是预防季节性流行性感冒的最有效方法。 目前，全球使用三种类型的疫苗：灭活流感疫苗(IIV)、减毒活流感疫苗(LAIV)和重组HA疫苗（表1）。每种疫苗都有其优点和缺点。疫苗可以诱导免疫效应分子，包括体液效应分子（B淋巴细胞产生的抗体），能够特异性结合病毒抗原，以及细胞效应分子（细胞毒性CD8+ T淋巴细胞），通过杀死感染细胞来限制病毒在体内的传播。所有流感疫苗都需要每年更新，因为免疫持续时间很短，并且要匹配流行病毒的抗原性。因此，世卫组织和其他利益相关者每年两次会面，根据全球流通病毒的抗原和遗传特性以及不同国家的流行病学信息，选择最合适的流感病毒。其中一次流感疫苗组成会议针对北半球，另一次针对南半球。 多年来，含有两种流感A（H1N1和H3N2）和一种流感B病毒系的三价疫苗被配制出来，以提供对三种不同流感病毒的保护，尽管存在两种不同的B病毒系。因此，为了更广泛地保护当前流行的病毒，将第二种B病毒系添加到配方中，制成四价流感疫苗。目前批准的流感疫苗在HA数量或抗原性方面进行了定量标准化，但并非在中和抗体（NA）方面。因此，疫苗的NA含量和NA免疫原性可能差异很大。 6.1.灭活流感疫苗(IIV) 灭活病毒疫苗是全球最常用的方法，因为它的高安全性和相对较低的生产成本。因此，它在全球流感疫苗市场中占有最高的百分比。IIV适用于六个月以上的儿童，如Afluria Quadrivalent、Fluarix Quadrivalent、FluLaval Quadrivalent和Fluzone Quadrivalent；然而，一些IIV仅适用于65岁及以上的个体，如Fluad和Fluzone High-dose Quadrivalent（表1）。这种类型的疫苗通常在鸡胚或哺乳动物细胞培养中培养病毒（图5）。已经证明IIV可以诱导局部和全身免疫，尽管可能需要加强疫苗接种以维持抗体滴度。IIV有三种类型：全病毒灭活疫苗、裂解病毒灭活疫苗和亚单位灭活疫苗。 图5.流感疫苗制造过程。基于鸡蛋和基于细胞的疫苗制造都是从在鸡蛋或细胞中培养的候选疫苗病毒（CVV）开始的（步骤1）。在收获、分离、过滤和纯化之后（步骤2），病毒通常使用甲醛进行化学灭活，以制造灭活流感疫苗，或者通过化学表面活性剂破坏，以准备分裂病毒疫苗或亚单位疫苗（步骤3）。最后一步涉及填充-完成过程和包装，在冷链条件下交付和储存产品（步骤4）。重组流感疫苗不需要整个病毒的生长；只需获得HA抗原的遗传信息，并与杆状病毒结合，以便于将遗传信息（DNA）传递到宿主细胞中表达HA抗原。然后生产、收获、过滤、纯化抗原，接着制备疫苗。 6.1.1.全病毒灭活疫苗(WIV) 全病毒疫苗是最早使用的流感疫苗。然而，在接种后报告了若干系统性和局部副作用。这些不良反应可能源于疫苗中的杂质，如鸡蛋蛋白。不过，疫苗生产技术的改进已经使得疫苗更安全，杂质更少，副作用更少。在WIV中，在鸡胚中孵化和生长后，病毒颗粒主要用甲醛或β-丙内酯化学灭活，然后进行纯化（图5）。尽管这种方法是流感病毒灭活最常用的方法，但也可以采用其他方法进行病毒灭活，包括加热和辐射。 由于市场上已经出现了其他类型的疫苗，如裂解病毒灭活疫苗，具有较少的反应原性效应，因此这种类型的流感疫苗的使用目前受到限制。疫苗3Fluart是由Fluart Innovative Vaccines Kft.生产的WIV，仅在欧洲使用。 6.1.2 裂解病毒灭活疫苗 目前使用的大多数流感疫苗是裂解病毒或亚单位疫苗，因为它们具有适当的免疫原性和生产便利性。然而，由于缺乏整个病毒结构，它们失去了一些固有的免疫原性，这与WIV不同。裂解病毒疫苗可以通过使用Triton-100或辛基葡萄糖苷等表面活性剂化学破坏病毒膜来制备。然后，通过切向流过滤去除表面活性剂。表1总结了美国（代表北半球）和澳大利亚（代表南半球）的季节性流感裂解病毒疫苗，包括其制造商和适用年龄组信息。 在澳大利亚，大多数季节性流感疫苗是裂解病毒灭活疫苗，市场上有五种疫苗：FluQuadri（由Sanofi, 美国宾夕法尼亚州生产）、Vaxigrip Tetra（由Sanofi-aventis, 新西兰奥克兰生产）、Fluarix Tetra（由GlaxoSmithKline Biologicals, 德国德累斯顿生产）、Afluria Quadrivalent（由Seqirus, 澳大利亚墨尔本生产）和Influvac Tetra（由Abbott, 荷兰霍夫多尔普生产）。在美国，裂解病毒灭活疫苗也占季节性流感疫苗的主要部分，有五种疫苗：Afluria Quadrivalent（由Seqirus, 澳大利亚墨尔本生产）、Fluarix Quadrivalent（由GlaxoSmithKline Biologicals, 德国德累斯顿生产）、FluLaval Quadrivalent（由ID Bio-medical, 加拿大魁北克省拉瓦尔生产）、Fluzone High-dose Quadrivalent（由Sanofi, 美国宾夕法尼亚州生产）和Fluzone Quadrivalent（由Sanofi, 法国巴黎生产）。 6.1.3.亚单位灭活疫苗 通常，亚单位疫苗只包含病毒的抗原部分：HA和NA。这些蛋白质是通过使用表面活性剂裂解病毒后从流感病毒中纯化的（见图5）。这种类型的流感疫苗通常需要佐剂来诱导足够的免疫原性，特别是在老年人中。Seqirus生产的Fluad和Fluad Quadrivalent是可用于65岁及以上人群的亚单位流感疫苗。另一个疫苗，由Mylan Health生产的Influvac Tetra，适用于三岁以上人群（见表1）。由于它们的免疫原性相当且反应原性低，所需的疫苗剂量大和高生产成本，所有这些都需要进一步改进。自20世纪70年代以来，裂解病毒比亚单位病毒疫苗更常用。 6.2.减毒活流感疫苗（LAIV） LAIV的开发是为了模仿自然感染和免疫，而不引起严重疾病，从而诱导体液和细胞免疫。LAIV最早在20世纪60年代提出，方法是在鸡蛋中在非最佳条件下培养流感病毒。这些减毒病毒对温度敏感，只在25°C（冷适应）下生长。冷适应供体病毒经过几次传代，温度逐渐降低，在孵化的鸡蛋中进行。因此，当LAIV通过鼻内给药时，它可以在与鼻咽粘膜表面相同的温度范围内生长。LAIV比IIV有一些优势，因为它主要诱导局部粘膜免疫和局部免疫球蛋白A（IgA）的产生以及IgG，而IIV只有系统性IgA和IgG抗体。然而，由于使用活病毒进行免疫的风险，LAIV不推荐用于免疫功能低下的个体（免疫受损）或与他们密切接触的人。 由MedImmune生产的FluMist Quadrivalent（见表1）是一种经美国批准的鼻内LAIV季节性流感疫苗，可安全用于2至49岁的儿童和成人，包含四种流感毒株（两种流感A和两种流感B）。由AstraZeneca生产的Fluenz Tetra在欧洲获批，是另一种用于2至17岁儿童的LAIV。截至2021年，澳大利亚尚未批准任何LAIV。 6.3.重组HA疫苗 重组HA疫苗可以通过昆虫细胞和杆状病毒的重组蛋白表达技术生产，因为它们产量高且成本效益好（见图5）。昆虫细胞是用于重组蛋白表达的典型细胞系，Gibco Sf9细胞系是最常用于人类或兽医医学中重组蛋白表达的细胞系。 重组HA疫苗比基于鸡蛋的流感疫苗有优势：没有来自鸡蛋适应的不需要的突变（见表1）。此外，重组HA疫苗是鸡蛋过敏者的合适选择。尽管重组HA疫苗和IIV的作用机制相似，但重组HA疫苗的免疫原性较低，因此需要比IIV多三倍的HA才能诱导出与IIV相同的抗体滴度。重组HA疫苗的另一个优势是它适合流感大流行，因为它可能需要更短的制造时间，并且由于缺乏高致病性病毒，它比其他流感疫苗更安全。然而，由于在儿童中缺乏效力，重组HA疫苗仅限于成人。由赛诺菲巴斯德生产的Flublok Quadrivalent是第一种重组HA疫苗（见表1）。 7.流感疫苗制造过程 目前，流感疫苗可以通过三种不同的方法生产：传统的基于鸡蛋的疫苗（传统方法）、基于细胞的疫苗和重组HA疫苗。这些方法在图5中总结。基于鸡蛋和基于细胞的疫苗制造都是从在鸡蛋或细胞中培养的候选疫苗病毒（CVV）开始的（步骤1）。在收获、分离、过滤和纯化之后（步骤2），病毒通常使用甲醛进行化学灭活，以制造灭活流感疫苗，或者通过化学表面活性剂破坏，以准备分裂病毒疫苗或亚单位疫苗（步骤3）。重组流感疫苗不需要整个病毒的生长；只需获得HA抗原的遗传信息，并与杆状病毒结合，以便于将遗传信息（DNA）传递到宿主细胞中表达HA抗原。最后一步涉及填充-完成过程和包装，在冷链条件下交付和储存产品（步骤4）。 7.1.基于鸡蛋的疫苗 自20世纪40年代以来，基于鸡蛋的疫苗一直是每年生产数百万流感疫苗的最常见方法。无论疫苗株如何，都需要大量的鸡蛋供应来在鸡蛋中培养目标病毒。这种方法从选择预测的循环病毒株开始，然后是HA和NA的遗传片段在鸡蛋中可以大量生长且具有良好安全特性的鸡蛋适应病毒中的重组，如A/Puerto Rico/8/1934。在这些重组病毒产生后，它们被注入孵化的鸡蛋中生长，然后进行测序确认以收集候选病毒。经批准的病毒随后由世界卫生组织全球流感监测和响应系统（GISRS）的附属中心交付给私营制造商。制造商在孵化的鸡蛋中大量生产病毒，然后纯化重组病毒。然后，使用甲醛或β-丙内酯化学灭活纯化的病毒，并标准化HA含量，去除非病毒蛋白的污染物。HA蛋白是诱导针对流感病毒的抗体的关键因素，因此是流感疫苗开发的重点。 尽管基于鸡蛋的制造方法有许多好处，例如通常获得高滴度的流感病毒和大规模生产的重要经验，但有几个缺点可能影响其效率。首先，重组病毒在鸡蛋中的适应性和筛选分离病毒的抗原性延迟了为下一个流感季节生产流感疫苗所需的时间，因此，必须在即将到来的流感季节之前很久就开始生产流感疫苗。然而，一些流感株（如H3N2病毒）在鸡蛋中生长不佳。因此，使用这些株的流感疫苗生产需要很长时间，并因影响标准生产时间框架而延迟疫苗的交付。在基于鸡蛋的制造过程中，病毒没有被监测并且会发生突变。这种鸡蛋适应性可能导致生产与循环株不匹配的病毒，从而导致疫苗效力下降。此外，由于潜在的禽流感病毒在鸡舍中的暴露风险，还存在生物安全问题。 7.2.基于细胞的疫苗 美国食品药品监督管理局（FDA）在2012年批准了Flucelvax，这是美国首个获批的基于细胞的流感疫苗。使用Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞来培养病毒。基于细胞的方法可以类似于基于鸡蛋的方法，使用选定毒株的HA和NA进行病毒的重组。与基于鸡蛋的方法相比，基于细胞的方法具有一些优势。首先，使用细胞可以克服鸡蛋短缺的限制，并由于依赖生物反应器的容量，提供了更灵活的疫苗生产方法。因此，与基于鸡蛋的疫苗相比，基于细胞的疫苗可以在更短的时间内生产。此外，在鸡蛋中培养病毒时可以观察到HA蛋白更异质的糖基化谱。一些研究调查了使用哺乳动物细胞作为基质可以增强疫苗免疫原性相对于禽类细胞的理论。 此外，基于细胞的疫苗是曾经经历过鸡蛋过敏的人的合适选择，因为它们的产品不含鸡蛋蛋白。有趣的是，基于细胞方法最重要的优势之一是缺乏由于鸡蛋适应而引起的HA突变。因此，在2016年，FDA批准了使用基于细胞的病毒，以防止由鸡蛋适应引起的进一步突变。 尽管基于细胞的方法存在优势，但仍然存在一些缺点。与基于鸡蛋的疫苗相比，大规模生产基于细胞的疫苗的经验仍然较少。此外，根据美国疾病控制中心（CDC），Flucelvax的成本比基于鸡蛋的疫苗高出40%。尽管程度较小，但在细胞培养中由于连续传代，HA和NA蛋白仍然可能发生突变。 8.流感疫苗配方和成分  疫苗必须含有确认对人类安全的成分。此外，每种疫苗成分都具有特定的目的，即增加抗原的免疫原性并保持疫苗配方稳定。 8.1.活性成分 病毒抗原，活性药物成分（API）作为免疫原性成分，是疫苗最关键的部分。每个流感季节，世界卫生组织（WHO）都推荐在四价疫苗中包含四种流感病毒，在三价疫苗中包含三种毒株。因此，四价流感疫苗包含四种流感毒株（两种流感A型毒株和两种流感B型毒株），三价流感疫苗包含三种流感毒株（两种流感A型毒株和一种流感B型毒株）。 8.2.佐剂 佐剂是改善疫苗免疫反应的化合物。其中包括如氢氧化铝（Panflu）、磷酸铝和硫酸铝钾等铝盐。佐剂被认为通过使抗原靠近注射部位，使免疫系统细胞容易接触到它们，从而增加免疫反应。疫苗中使用铝佐剂通常意味着每剂疫苗的抗原较少，在某些情况下，需要较少的疫苗剂量。疫苗中佐剂的使用通常与接种后注射部位的局部反应有关。其他佐剂也可以用于流感疫苗，如病毒体或油包水乳液（MF59、AS03、AF03）。Fluad Quad是澳大利亚唯一的含佐剂（MF59）流感疫苗。 8.3.稳定剂 稳定剂用于保持疫苗效力，通过在储存期间保持抗原和其他疫苗成分完整。稳定剂还防止疫苗成分粘附在疫苗瓶的侧面。稳定剂的例子包括糖（乳糖和蔗糖）和氨基酸（甘氨酸和谷氨酸钠）。 8.4.防腐剂 防腐剂用于某些疫苗配方中，以消除疫苗中的真菌和/或细菌感染。防腐剂最初是为了避免多剂量瓶中的细菌污染（不用于单剂量瓶疫苗）。硫柳汞、苯氧乙醇和苯酚是所使用的防腐剂之一。尽管全球范围内与使用防腐剂相关的重大有害效应相对较少，如过敏，但防腐剂已在众多疫苗接种中使用。 8.5.痕量成分 疫苗中的痕量成分是在生产初期使用的微量化学物质或物质，或从容器中浸出的，例如。根据生产程序，细胞培养液、鸡蛋蛋白、抗生素或灭活剂的痕量可能存在。在某些情况下，最终疫苗成分中只发现这些化合物的少量。 抗生素有时会在加工阶段使用，以确保不发生细菌污染。一些流感疫苗含有如新霉素、多黏菌素B和/或庆大霉素等抗生素。此外，预充疫苗注射器可能含有用作预充疫苗注射器润滑剂的硅油的痕迹。在WIV和分裂病毒灭活疫苗的开发过程中，使用灭活剂，最终疫苗含有相对较少的这些灭活化学物质或分裂剂，如甲醛、戊二醛或表面活性剂。 9.新型流感疫苗平台  9.1.类病毒颗粒（VLP）疫苗  VLP由表面病毒糖蛋白组成，它们自组装形成看起来像病毒的非复制颗粒。这些颗粒模仿原生病毒结构，但缺乏遗传物质，不能引起感染。VLP已成功开发为疫苗，并已用于对抗包括乙型肝炎病毒（Heptavax-B（由默克公司，新泽西州怀特豪斯）、Engerix-B（由葛兰素史克生物制品，比利时里克斯萨尔特）、H-B-VaxII（由默克公司，怀特豪斯，美国）和Hepavax-Gene（由杨森疫苗公司，韩国仁川））、人乳头瘤病毒（Gardasil（由默克公司，怀特豪斯，美国）、Cervarix（由葛兰素史克生物制品，比利时里克斯萨尔特）、Cecolin（由中国北京万泰生物制药）、Gardasil-9（由默克公司，怀特豪斯，美国））和戊型肝炎病毒HEV（Hecolin，由中国北京万泰生物制药）。因此，VLP平台已被证明是生产疫苗的良好策略，包括流感疫苗。 VLP已与乙型肝炎病毒核心（HBc）结合，并含有三个串联副本的M2蛋白（3M2e）以及核蛋白（NP）表位，以克服流感快速演变的挑战。VLP可以直接激活先天免疫，或通过刺激抗原呈递巨噬细胞或树突细胞，从而有效诱导病毒特异性T细胞和B细胞反应。此外，流感VLP疫苗可以包含几种不同的病毒蛋白（HA、NA、M1或M2e）在单个VLP上单独或组合，为更广泛的保护提供一定的灵活性。将纯病毒神经氨酸酶添加到传统流感疫苗中，可产生平衡且广泛的免疫反应。此外，由于蛋白质的保守性，M2e是通用疫苗开发的潜在靶标。由M1和NA组成的VLP复合物诱导了对同源和异源A亚型的反应性抗体反应和显著的保护水平。一些VLP流感疫苗候选物已进入临床试验（见表2）。Novavax公司的一种重组A（H1N1）2009流感VLP疫苗（HA）在2012年进行了2期临床试验，以评估其安全性和免疫原性。这种VLP流感疫苗在单次接种后显示出强大的免疫反应，仅有轻微的不良事件。此外，Medicago公司的一种基于植物的QVLP（HA）在2019年完成了2期临床试验。基于植物的VLP流感疫苗能够诱导强大的抗体反应和抗原特异性CD4+ T细胞。这些VLP疫苗候选物能够产生体液和/或细胞反应。它还通过诱导对四种不同流感毒株（两种流感A型和两种流感B型）的抗体，显示出交叉保护。 9.2.抗原呈递细胞（APC）诱导型疫苗 CD11c+ 树突状细胞（DCs）在病毒感染期间通过积累和转化病毒抗原为肽段，并通过主要组织相容性复合体（MHC）在二级淋巴器官向T细胞呈递，从而显著促进适应性抗病毒免疫反应。一些临床前工作已经进行，以通过诱导抗原呈递细胞来加强针对流感病毒的T细胞反应。例如，Fonteneau及其同事研究了流感病毒感染对纯化的血液DCs的影响及其向CD8+和CD4+ T细胞呈递病毒抗原的能力。他们证明，暴露于流感病毒可以诱导抗流感病毒的TH1型CD4+ T细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的扩增。这些发现表明DCs在产生抗病毒T细胞反应中具有新功能，暗示这些DCs在适应性免疫反应中扮演重要角色。另一种方法表明，将alpha-Gal表位嫁接到HA上可以增强APCs对流感疫苗病毒的摄取。因此，通过有效地针对APCs进行疫苗接种，可以增强流感病毒疫苗的免疫原性。此外，可以使用融合DNA疫苗将流感HA靶向到APCs，这些疫苗编码的蛋白能够双价地结合到流感HA上，将其靶向到APCs的不同表面分子上。这种靶向能够诱导对CD8+/Th1 T细胞反应或抗体/Th2反应的免疫反应。 9.3.基于纳米粒子的流感疫苗 传统的流感疫苗可以提供针对病毒的系统性保护；然而，对于流感病毒，也期望在粘膜呼吸道中提供局部保护。纳米粒子具有如溶解度和稳定性等特性，使它们适合粘膜免疫，因为它们能够诱导针对呼吸道病毒的免疫。这些纳米粒子可以来自天然或合成来源，并作为抗原载体。因此，与其他病毒相比，使用纳米粒子对抗流感病毒的研究更多。番木瓜花叶病毒纳米粒子被用作三价灭活流感疫苗的佐剂，并已在小鼠免疫中进行了测试。这种纳米粒子疫苗在诱导基于IgG2、IgA和支气管肺泡灌洗样本及血清中的IgG滴度的抗流感免疫方面，发现优于IIV，特别是在鼻内免疫后。此外，聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米粒子与流感A（H1N1）保守肽结合，并作为疫苗鼻内给药。这种疫苗能够诱导抗原特异性的CD4+和CD8+ T细胞，从而在猪的肺部诱导保护。因此，诱导能够针对感染过程中涉及的多个途径的交叉保护性抗体，对于更好地保护流感病毒将大有裨益。两种不同的保守流感抗原（螺旋C和基质蛋白2（M2e）的外域）被链接在一个自组装的纳米粒子中，以实现这一目标。它们能够在小鼠模型中诱导中和抗体。 9.4.通用流感疫苗 尽管疫苗接种是预防流感感染的最有效方式，但流感病毒的抗原转变和抗原漂移使它们能够逃避抗体中和。流感病毒的这些变化是不可预测的，因此流感疫情管理非常具有挑战性。为了克服当前流感疫苗的局限性，一种提供长期和广泛保护的通用流感疫苗将非常理想。理想的通用流感疫苗应该对所有流感病毒（A型和B型）的HA和NA亚型或抗原突变都有效。为了达到这个目标，疫苗应该诱导交叉保护性抗体，这可能通过针对HA、NA或M2或内部蛋白如M1和NP中发现的保守表位来实现。HA的茎或柄区域在不同毒株的流感病毒中高度保守，被认为是开发通用流感疫苗非常有希望的目标。此外，一些从人类中分离出的针对病毒柄区域的抗体能够中和所有流感A型病毒亚型，可以用于开发通用流感疫苗。例如，开发了一种顺序嵌合HA疫苗技术，将免疫反应从头部重定向到柄域（表3）。嵌合HA由来自第1组或第2组流感病毒的柄域和来自禽流感病毒亚型的头部域组成。在2020年完成I期临床试验后，这种通用流感疫苗候选物被发现是安全的，并能唤起针对血凝素保守、免疫亚显性柄的广泛、强烈、持久和有效的免疫反应。此外，开发了一种计算优化的广泛反应性抗原（COBRA）针对H1作为通用流感疫苗（表3）。为了评估B细胞的广度，由COBRA血凝素（HA）（称为P1）诱导的抗体分泌细胞与由历史H1N1疫苗株诱导的抗体分泌细胞进行了比较。P1 HA诱导的单克隆抗体（mAbs）展示了广泛的HA识别范围，从狭窄到广泛的反应性mAbs。还开发了一种新的疫苗Multimeric-001，通过包含流感A型和B型毒株的HA、NP和M1蛋白的保守线性表位，来防御季节性和大流行性流感病毒类型，与突变无关（表3）。这种疫苗在2020年的III期临床试验中进行了评估，以评估其保护和耐受性，以及体液和细胞免疫反应。该疫苗耐受性良好，没有记录到严重不良效应。体液和细胞反应表明，该疫苗具有针对突变无关的流感病毒株的交叉免疫。在接受季节性疫苗接种前给予Multimeric-001剂量的参与者中，与单独季节性疫苗接种相比，H1N1和H3N2株的抗体反应更大。此外，在接种Multimeric-001的人群中，与基线相比，H1N1、H3N2和流感B的CD4+和CD8+ T细胞反应有所增加。 10.疫苗产品的表征  大部分疫苗生产时间（70%）都用于质量测试，以确保纯度、效力和疫苗安全性。在流感疫苗开发过程中，需要进行广泛的表征，以确保生产步骤遵循现行良好生产规范（cGMP）。尽管疫苗生产不同，质量控制测试必须考虑某些物理化学参数的方面，如纯度、含量、均质性和稳定性。 10.1.纯度  疫苗的纯度是确定最终疫苗产品中“活性”疫苗抗原比例的关键物理化学标准。最终，通过疫苗抗原测量的纯度程度将取决于测试的特异性、额外的定量方法以及产品样本的准备，以及非产品杂质。因此，至关重要的是使用选择性测定法来测量潜在的非产品/工艺相关杂质（例如，宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA和/或RNA、脂质、细胞培养诱导剂等）和产品相关杂质（例如，分子重量变体，如聚集体和降解产物），以界定低于定义量的污染物和杂质的存在。此外，需要通过过滤、离心或蒸发方法去除灭活剂来纯化IIV。需要在最终产品中去除分裂病毒疫苗中的分裂材料，如Triton-100，这可以通过过滤或其他分离方法如疏水作用色谱来完成。表4总结了几种可能使用的方法，通常结合使用，以确定疫苗纯度。例如，使用正交过程如质谱法，可以准确测量分子质量，并且还可以详细说明共价变化（即糖基化）的身份和位置。此外，由于杂质在质谱分析中可能表现出与疫苗抗原相同的质量/电荷（m/z）比率，因此使用另一种正交方法如光散射（尺寸排除色谱、多角度激光光散射）来测量基于半径的回转半径的质量，有助于在质谱分析中将疫苗抗原与未解决的杂质分离。 10.2.含量 HA是流感病毒中的主要抗原蛋白，疫苗中的HA含量必须足以激发免疫系统。因此，任何类型的流感疫苗中HA的含量必须达到15 µg/mL。使用传统的蛋白质估算方法如UV吸收280 nm、双缩脲酸测定、Bradford测定、Lowry测定、基于洗涤剂的荧光检测、带荧光染色的定量凝胶电泳、胺标记“衍生化”（使用荧光探针）和酶联免疫吸附测定（ELISA）来进行定量。尽管每种方法都有潜在的优点和缺点，但了解测量方法与样本体积、pH环境、灵敏度、通量、稳健性和测定精度之间的关系至关重要。最后，评估“活性”疫苗抗原在产品相关杂质存在下的数量对于制定正确的剂量指南至关重要。 10.3.均质性 可以使用多种技术确定疫苗抗原中蛋白质的大小或分子量：分离和散射方法是主要的两种方法。在分离方法中，可以对样本施加力（例如，机械、离心、电力），根据大小、电荷、疏水性等不同特征分离分子，然后根据其运动确定生物分子的大小、形状或电荷。分离方法包括色谱测定，如高效液相色谱、凝胶电泳和沉降平衡。除了光散射方法，质谱和荧光光谱等其他光谱方法在样品表征时也常被使用。此外，透射电子显微镜（TEM）和流动成像显微镜等显微镜方法在蛋白质表征方面也有重要应用（表4）。场流分离是一种根据分子在狭窄通道中层流的取向分离蛋白质/糖蛋白/颗粒的技术，较小的分子流动更快，较大的分子（无法快速分散）流动缓慢。使用质谱法评估蛋白质的分子量或规模有助于蛋白质识别，并在定量和定性阶段量化蛋白质纯度、共价修饰和降解产物。光散射和电子显微镜（EM）是用于表征和确定基于蛋白质/糖蛋白的疫苗抗原的大小或WIVs中病毒大小分布的两种常用技术。此外，疫苗产品中蛋白质聚集的存在可能影响疫苗的稳定性和效力。这些聚集体可能是由于在分裂病毒流感疫苗的生产中去除分裂剂（表面活性剂）引起的。除了EM和光散射，UV-Vis吸收光谱和荧光发射光谱是识别蛋白质聚集的可靠技术。EM是确定大型蛋白质或蛋白质复合物大小和形状的直接成像工具。然而，由于仪器的高成本和进行此类实验所需的专业知识，通常选择其他技术（如光散射）作为大小分析的主要方法。通过动态光散射可以测量分子量、分布、扩散系数和流体动力学半径。 10.4.稳定性 了解蛋白质/糖蛋白疫苗抗原的功能和稳定性对于疫苗在激发所需的保护性免疫反应方面的总体效力至关重要。疫苗的不稳定性可能由不同因素引起，如热量、光线、辐射、环境变化或与容器或其他疫苗成分的相互作用。过度加热或冷冻可能会加速疫苗效力的丧失。因此，必须谨慎处理疫苗，密切关注它们的处理，以确保它们质量高，并提供最大效力。这可以通过使用冷链将疫苗保持在限制性温度环境中（这是保持效力所需的）从生产者到最终消费者来实现。此外，在分裂病毒疫苗中，表面活性剂类型、孵化时间、病毒浓度、表面活性剂浓度和病毒分裂比例是可能影响疫苗稳定性的其他因素。例如，在稀释或去除表面活性剂后可能会出现聚集，因此应通过优化过滤步骤的数量来监测剩余表面活性剂浓度，以维持疫苗的稳定性和效力。可以使用多种分析方法来研究疫苗稳定性，如荧光发射光谱、UV-Vis吸收光谱和血凝抑制试验（HI）测定（表4）。由于聚集和/或降解是影响蛋白质/糖蛋白稳定性的典型特征，利用这些分析方法有助于识别聚集体的大小或分子量，以了解疫苗的短期和长期稳定性。 11.流感疫苗的有效性 流感疫苗的有效性一直是流感疫苗的主要问题，因此每年都会评估季节性流感疫苗的有效性。疫苗的有效性测量可能会受到一些因素的影响，如被调查的人群、研究设计、评估的结果以及分析的流感疫苗季节。通常情况下，在流感季节，当大多数流通的流感病毒与流感疫苗中使用的病毒非常匹配时，流感疫苗接种会降低一般人群感染流感疾病的风险，降低幅度在40%到60%之间。然而，如果流感疫苗与流行病毒匹配度不高，则对由常见流通病毒引起的疾病几乎没有或没有保护作用。因此，流感疫苗的有效性每年都有所不同，从2004-2005年的10%到2010-2011年的60%不等（见图6）。 图6.根据美国疾病控制中心的数据，2004年至2020年间季节性流感疫苗在美国的有效性波动。 许多参数导致疫苗反应的不一致性，包括内在的病毒特性以及宿主因素。越来越多的数据表明，宿主变量如年龄、性别、怀孕和免疫历史在改变流感疫苗的有效性方面发挥重要作用。因此，更好地了解影响流感疫苗诱导的免疫的宿主变量，可能有助于通过优化甚至定制疫苗类型、剂量和佐剂使用，提高现有季节性和未来通用流感疫苗的有效性。自2004年以来，通常使用测试阴性设计（TND）来测量流感疫苗的有效性，当时卫生官员开始追踪流感疫苗的有效性。TND是一种修改后的病例对照方法，它对比了因流感样症状来到医疗保健场所的个体的疫苗接种状况。尽管它最大限度地减少了与寻求医疗活动相关的选择偏差，但它的局限性在于它只包括寻求呼吸疾病治疗的人。然而，随机对照试验更适合测量疫苗的有效性，因为它们较少受到选择和混杂偏差的影响。 为了提高流感疫苗的有效性，可以使用不同的策略。例如，增加疫苗的HA抗原剂量，以实现更高的血凝抑制滴度和免疫原性。最近的元分析显示，高剂量IIV比标准剂量IIV更有益于避免因流感住院，以及减少65岁以上个体与流感相关的死亡率。使用皮内疫苗接种是提高疫苗有效性的另一种选择，显示出等于或优于通过肌肉注射获得的血凝抑制水平。这归因于真皮内抗原呈递细胞数量的增加，这是增强皮内疫苗接种免疫原性的机制之一。向疫苗中添加佐剂是另一种提高疫苗效力的方法。与无佐剂的三价灭活疫苗相比，引入新型佐剂三价灭活疫苗已被证明可以增强老年人的免疫反应，并减少因流感和肺炎住院的风险。另一个选择是使用非基于鸡蛋的系统，以避免突变和其他变化，如在病毒鸡蛋适应过程中病毒蛋白的翻译后修饰，包括糖基化。 12.结论  由于广泛的病毒变异和漂移，流感可以逃避宿主的免疫防御，因此，它仍然是一个重要的、周期性的全球公共卫生挑战。因此，需要每年更新流感疫苗。目前市场上有三种流感疫苗：灭活流感疫苗（IIV）、减毒活流感疫苗（LAIV）和重组血凝素（HA）疫苗。像大多数其他疫苗一样，流感疫苗的配方复杂，需要几个关键成分，如病毒抗原、佐剂、防腐剂和稳定剂，以保持稳定和有效的疫苗配方。此外，疫苗在加工步骤和最终产品中经过许多质量测试，以确保疫苗符合标准并且安全使用。尽管如此，仍需要更多的研究来克服当前流感疫苗的局限性，如效力低、生产时间长以及缺乏交叉保护。为此，新的流感疫苗候选物正在进行中，以提高疫苗效力或提供针对许多不同毒株的交叉保护（即通用流感疫苗），以克服每年更新疫苗的需求。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要:疫苗接种是预防流感的关键工具，但由于流感病毒不断变化的特性，疫苗成分需要每年更新。虽然医疗保健和经济负担有所减轻，但病毒仍然是一个挑战。过去十年的研究揭示了通过基础和临床研究改进的途径。病毒监测在更好地选择疫苗候选病毒和早期检测耐药菌株方面发挥着至关重要的作用。本页提供了未来疫苗发展的描述和当前疫苗选择的概述。在未来几年，我们预计疫苗生产将发生重大变化，从传统的基于鸡蛋的方法转向DNA和RNA疫苗等创新技术。这些新方法比传统的基于鸡蛋和基于细胞培养的流感疫苗生产提供了显著的优势。 流感病毒是一种急性呼吸道疾病，严重影响人类福祉。通常被称为季节性流感，它对疫苗开发构成了持续的挑战。制造流感疫苗主要有三种方法：灭活流感疫苗、减毒活流感疫苗和重组血凝素（HA）流感疫苗。流感具有高变异率，这需要每年两次生产新的重组疫苗以减少其传播。全球卫生组织如世界卫生组织（WHO）和其他利益相关者每年两次召开会议，评估病毒的流行情况，并推荐适合全球使用的疫苗。 疫苗开发通常涉及两类：三价和四价疫苗。三价疫苗包括两种流感A型病毒株和一种流感B型病毒株。它们主要是在鸡蛋中生产的。相比之下，四价疫苗包含两种流感A型病毒株和两种流感B型病毒株，并在实验室中使用重组技术开发。目前正在努力开发一种更有效和全面的疫苗，称为通用流感疫苗。 背景 引起大流行流感的病毒被认为起源于野生水禽，是流感病毒的主要自然来源。基因重配是人感染病毒株与禽病毒株的遗传物质定期交换的过程。 第一种灭活流感疫苗是由密歇根大学的托马斯·弗朗西斯和乔纳斯·索尔克在美国军队的协助下开发的。在1945年被批准广泛使用之前，该疫苗在美国军队成员身上进行了安全性和有效性测试。本文的目标是防止季节性疫苗重新配制的需求，并探索全球可用的各种类型的疫苗。 1.引言 季节性流感病毒是由流感病毒引起的严重呼吸道病毒疾病，这些病毒在全球范围内分布。流感病毒分为四种类型：A型、B型、C型和D型。最致命的类型是流感A型，它可以引起死亡和各种呼吸道疾病。流感B型病毒也会导致人类的季节性流感大流行。季节性流感疫苗，如B/Victoria和流感B/Yamagata，针对目前正在流行的两个谱系。流感C型病毒不会引起流行病，通常引起较轻的流感症状。流感D型病毒被发现可以感染猪、牛和羊等动物，但不感染人类。 近几十年来，发生了几次大流行和年度流行病，对全球经济和公共卫生产生了重大负面影响。流感病毒属于Orthomyxoviridae科，包括包膜RNA病毒。这些病毒具有八段单链负义RNA基因组，可以分为七段（C型和D型亚型）或八段（A型和B型亚型）不同的片段。这些片段编码各种蛋白质，包括血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、核蛋白（NP）、基质蛋白1（M1）和（M2）、聚合酶亚基（PA、PB1和PB2）、非结构蛋白、核输出蛋白，以及最近识别的蛋白质，如PBI、M42、PB1-F2和PA-X。 流感每年在全球范围内引起重大疾病和死亡。疫苗对于预防未来的流行病和管理当前的流行病至关重要。疫苗已经使用了60多年，因为它们有助于增强生物体的免疫系统。随着时间的推移，对病毒的免疫力自然下降，这就是为什么建议每年接种流感疫苗。季节性疫苗的有效性取决于疫苗株与人群中流行株的匹配程度。病毒改变其基因构成的能力使其能够逃避免疫并再次感染宿主。大流行流感通常由抗原转变触发，这是由于两种共感染亚型株的基因重排导致病毒抗原特性发生显著变化。 几个挑战可能使疫苗计划的效果降低，包括需要预测每个季节常见的菌株、病毒的不可预测性以及人群中可能缺乏对新菌株的先天免疫力。当疫苗病毒与流行病毒株非常匹配时，流感疫苗最有效。为了应对流感病毒的持续演变，世界卫生组织（WHO）及其委员会成员每年两次举行会议，确定流感疫苗的成分。 传统疫苗有局限性，强调了多样化疫苗平台的重要性。分子工程工具加速创新疫苗开发，最终增强疾病保护。基因和蛋白质工程，以及病毒载体疫苗，是增强免疫策略的有希望的方法。探索更有效的递送方法有可能在疫苗开发中取得进一步的突破。防范流感病毒感染的最少侵入性、最具成本效益的策略是疫苗接种。目前，有三种季节性流感疫苗可用：来自鸡蛋和细胞的灭活流感疫苗、减毒活流感疫苗，以及在昆虫细胞中生产的杆状病毒重组HA疫苗（如表1所示）。然而，在疫苗可用性和有效性方面仍然存在各种限制。因此，流感疫苗配方和生产领域的创新技术可能掌握着解决当前流感疫苗限制的关键。本文概述了当前疫苗接种状况和下一代疫苗开发中的有希望的研究。 2.目标 主要目标是提高人们对流感病毒性质以及可用于对抗它的疫苗数量的认识，因为这是一个普遍存在的问题。包括重组HA疫苗、灭活疫苗和减毒活疫苗在内的众多疫苗已经在全世界开发并上市。世界卫生组织（WHO）和其他相关方对这些疫苗进行了认证。其他被称为下一代疫苗的疫苗旨在通过使用颗粒疫苗技术，提高持久性、增强对变异的抵抗力，并预防流感病毒感染。目前提高疫苗效力的发展包括通用流感疫苗和基于纳米颗粒的疫苗；所有这些疫苗都需要每年更新。 3.当前针对流感的疫苗 全球每年预计会有29万到65万例因季节性流感引起的呼吸道死亡，以及3到5百万例严重疾病病例。通常被称为季节性流感的流感病毒，可能会受到环境和天气因素的影响。由于表面糖蛋白HA和NA内的独特突变，该病毒可以逃避人类免疫系统。无论是自然感染还是疫苗接种都不能提供对病毒的终生保护。流感病毒抗原性的微小变化，即抗原漂移，是流感流行病的常见原因。 目前，全球采用了三种疫苗开发平台：灭活流感疫苗、减毒活流感疫苗和重组HA疫苗。这些疫苗各有优缺点。疫苗可以激活细胞和免疫效应物，包括B淋巴细胞产生的能特异性结合病毒抗原的抗体，以及破坏感染细胞并防止其在体内传播的细胞毒性CD8+ T淋巴细胞。由于对流感的保护只是暂时的，所有疫苗都必须定期更新以匹配目前正在流行的病毒株。 为了选择最合适的流感疫苗，每年举行两次会议，期间WHO和其他利益相关者推荐适合全球使用的流感疫苗。这些建议基于不同国家提供的遗传和抗原特性，以及流行病学数据，并与全球流行的病毒进行比较。 目前，各种制造商在市场上提供三价疫苗和最新的四价疫苗。多年来，三价疫苗的开发旨在提供对三种不同流感病毒的保护。这些配方包括一种流感B型病毒株和两种流感A型（H1N1和H3N2）病毒株。此外，还有两种不同的B型病毒株在流行，因此四价流感疫苗的配方中使用了第二种B型病毒株，可以提供对当前病毒突变的保护。目前，官方批准的流感疫苗在HA含量和免疫原性方面有显著的标准化（表1）。 3.1.灭活流感疫苗 基于灭活病毒的疫苗接种是最常用的技术，因为其生产成本低且安全性高。在这种疫苗接种方法中，病毒通常在培养的哺乳动物细胞和鸡胚中生产。虽然可能需要加强注射以维持抗体滴度，但已有证据表明灭活流感疫苗可以产生系统性免疫。有三种不同类型的灭活流感疫苗：分裂病毒灭活疫苗、全病毒灭活疫苗和亚单位灭活疫苗。 在分裂病毒疫苗接种中，通过二乙醚或洗涤剂处理破坏整个病毒的病毒包膜。全病毒疫苗可以通过使用甲醛或-丙内酯化学灭活病毒来生产。亚单位疫苗由进一步提纯的HA和NA组成，去除了所有的包膜。由于A型（H3N2）病毒的初始分离株在鸡蛋中复制不佳，灭活疫苗需要在鸡蛋中适应以实现显著的细胞毒性。在鸡蛋中过多的传代可能导致HA和流行分离株之间的抗原漂移不匹配。为了防止HA的鸡蛋适应性变化，可以使用培养的细胞系，如Madin-Darby犬肾和Vero细胞来实现病毒的适应和复制。然而，这些悬浮生长的细胞系在发酵罐中的疫苗种子病毒滴度通常低于鸡蛋滴度，导致成本增加和产量减少。 3.2. 减毒活流感疫苗 免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白G（IgG）在免疫系统中扮演着重要角色。IgA是主要在粘膜分泌液中发现的同种型，主要在上皮细胞表面发挥作用。另一方面，IgG是细胞外液和血液中的主要同种型，主要在人体组织内发挥作用。减毒活疫苗可以刺激在上呼吸道产生IgA和IgG，这是病毒最初复制的地方。这种免疫反应可以导致交叉反应。然而，有特定潜在疾病或免疫系统受损的个体不建议接种减毒活疫苗。在这些情况下，病毒可能会在个体内部复制并引起更大的感染，可能导致不良后果。 3.3. 重组-血凝素（HA）疫苗 重组HA疫苗显示出经济可行性，并取得了令人印象深刻的结果。一些制造商已经采用了基于昆虫细胞和杆状病毒的重组蛋白表达平台来生产这些疫苗。与基于鸡蛋的流感疫苗不同，重组HA疫苗不表现出不希望的突变，提供了一个显著的优势。此外，HA重组疫苗可以在不到两个月的时间内配制完成，使它们非常适合预防大流行流感病毒。尽管灭活疫苗和HA疫苗具有相同的作用机制，但市面上的重组HA疫苗含有的HA是灭活流感疫苗的三倍，同时产生的抗体与传统灭活疫苗相当。然而，需要注意的是，HA重组疫苗仅限于18岁及以上的个体。赛诺菲巴斯德的Flublok四价疫苗是首个可用的HA重组疫苗。 4. 疫苗平台：代表下一代疫苗 4.1. 病毒样颗粒疫苗 “病毒样颗粒”一词指的是模仿病毒的非复制性颗粒，由表面病毒糖蛋白组成。这些VLPs缺乏病毒遗传物质，但它们模仿病毒的原始形状，并且不能引发感染。已有报告称VLPs是有效的疫苗候选物，并已用于开发针对许多病毒的有效疫苗，如乙型肝炎病毒，包括Heptavax-B、Engerix-B（由GlaxoSmithKline Biologicals在比利时里克森生产）和Hepavax-Gene（由韩国仁川的Janssen Vaccines Corp.生产）。它们也已被用于人类乳头瘤病毒疫苗，如Gardasil、Cecolin、Gardasil-9和Cervarix（均由GlaxoSmithKline Biologicals生产），以及针对戊型肝炎病毒（HEV）的疫苗。因此，已经证明VLP平台是生产疫苗的一种有希望的技术，特别是对于流感。树突状细胞和抗原呈递巨噬细胞可以激活先天免疫，导致病毒特异性T细胞和B细胞反应的有序产生。基于VLP平台的流感疫苗可以将多种病毒蛋白如神经氨酸酶（NA）、血凝素（HA）、M2e或M1结合到一个VLP中，为疫苗配制提供更大的灵活性和更广泛的保护范围。 通过向常规流感疫苗中添加病毒神经氨酸酶，可以诱导全面而平衡的免疫反应。另一方面，M2e可能是未来通用疫苗的重点。由M1和NA组成的VLP触发了具有显著免疫性和交叉反应性的免疫反应，特别是对流感A型。目前正在对某些基于VLP平台的流感疫苗候选物进行临床前或临床试验。2012年，对Novavax的重组VLP疫苗进行了评估安全性和免疫原性的第二阶段临床研究。这种流感VLP疫苗在一次注射后产生了强大的免疫反应，引发了针对植物基VLP流感疫苗的强烈抗原特异性CD4+ T细胞和抗体反应。2019年，Medicago完成了基于植物的VLP（HA）疫苗的第二阶段临床研究。这些VLP疫苗候选物产生了细胞和体液免疫反应，导致产生了针对四种不同流感毒株（两种流感A型和两种流感B型）的抗体，以及交叉保护。 4.2. 纳米颗粒基流感疫苗 传统的流感疫苗可以提供对流感病毒的完全保护。然而，对呼吸道粘膜系统的流感保护也是有益的。纳米颗粒由于其溶解性和稳定性，适合增强粘膜免疫，这有助于防御呼吸道感染。这些纳米颗粒作为抗原的载体，可以由有机或合成材料制成。 以前，番木瓜花叶病病毒纳米颗粒被用作三价灭活流感疫苗的佐剂，结合使用以研究其在小鼠中的有效性。该研究基于抗体滴度，如支气管肺泡灌洗样本和血液中的IgG、IgA和IgG2，表明这种纳米颗粒疫苗在诱导抗流感免疫方面更为优越，尤其是在鼻内免疫后。此外，一种与流感A（H1N1）保守肽结合的聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒被用于鼻内免疫，显示出可以保护猪的肺部。研究表明，这种免疫可以激活特定于抗原的CD4+和CD8+ T淋巴细胞。 为了提高对流感病毒的防御并产生针对多个感染相关途径的交叉保护抗体，螺旋C和基质蛋白2的外域被结合起来创建一个自组装纳米颗粒。然后，这种纳米颗粒被用来结合两个独立的保守流感抗原，成功地在小鼠模型中引发中和抗体。 5. 限制 疫苗中某些纳米颗粒的细胞毒性带来了几个限制。此外，基于纳米颗粒的疫苗递送系统也有缺点。例如，当讨论病毒样颗粒时，多分散颗粒的大小可能不同，生产VLPs缺乏可重复性。在基于脂质体纳米颗粒的疫苗系统中，它们比聚合物颗粒稳定性差，装载抗原的能力有限，并且表现出较差的胃肠道稳定性。基于免疫刺激复合物的纳米颗粒疫苗含有水溶性抗原，这些抗原难以结合。抗原没有得到聚合物的充分保护，由于聚合物过早释放抗原，它们提供的抗原保护较少。基于无机纳米颗粒的疫苗递送技术不是生物可降解的，在水中的溶解度低。基于脂质纳米颗粒的疫苗递送技术装载效率低，在储存过程中会出现药物泄漏。外泌体也可以量化；然而，这个过程昂贵且不够敏感。 6. 纳米药物作为疫苗的挑战 来自世界各地的研究人员一直在关注与纳米药物和疫苗相关的问题，特别是纳米药物的生产成本比常规药物更高。此外，医院经常发现采购这些药物的费用过高，导致医疗保健部门不愿使用它们。纳米药物的监管方面是最大的障碍，需要解决。疫苗的特性变化，由于纳米技术，改变了它们在纳米尺度的生物安全概况。当涉及医疗设备时，监管变得更加具有挑战性，因为在纳米尺度上将它们与药品区分开来是一个更复杂的任务。 7. 通用流感疫苗 预防流感感染的最有效方法是接种疫苗。然而，在管理流感爆发时，还有其他具有挑战性的问题，通常是由于病毒基因组中的抗原漂移和抗原转变造成的。这些流感病毒的意外基因组变化使它们能够逃避抗体中和。开发一种提供全面和持久保护的通用流感疫苗是非常理想的，以解决当前疫苗的局限性和挑战。理想的流感疫苗将提供对所有流感病毒亚型（A型和B型）、各种抗原变异以及HA和NA亚型的保护。为了实现这一点，疫苗必须诱导交叉保护抗体。这可以通过专注于HA、NA和M2等蛋白质中的保守表位，以及M1和NP等内部蛋白来实现。 由于HA的茎或柄区域在预防各种流感病毒株中的感染中起着重要作用，因此通用流感疫苗被认为是一个有希望的候选疫苗。此外，从人类中分离出的针对病毒捕获区域的一些抗体能够中和所有流感A型病毒亚型，表明它们在开发通用流感疫苗中的潜在用途。例如，可以使用逐步嵌合HA疫苗技术将免疫反应从头部区域域重定向到捕获域（表2）。 嵌合HA是通过将1组或2组流感病毒的茎域与禽流感病毒亚型的头部域结合起来创建的。这种通用流感疫苗候选物被发现是安全的，并且能够引发广泛、强大、持久和有效的免疫反应，针对通常被忽视的血凝素的茎部，在2020年完成的I期临床试验后。此外，还开发了一种基于广泛反应性抗原（COBRA）的通用流感疫苗，针对H1（表2）。为了评估B细胞反应的广度，研究人员比较了以前H1N1疫苗株诱导的抗体分泌细胞与COBRA血凝素（也称为P1）诱导的细胞。对P1 HA的反应产生的单克隆抗体（mAbs）显示出广泛的HA识别范围，从狭窄反应到广泛反应的mAbs。Multimeric-001是一种新型疫苗，含有来自流感A和B型株的HA、NP和M1蛋白的保守线性表位，也旨在保护免受季节性和大流行流感病毒类型（表2）。在2020年，这种疫苗进行了III期临床试验，以评估其安全性、可接受性和体液和细胞免疫反应。该疫苗耐受性良好，未观察到显著不良反应。 细胞和体液反应表明，疫苗提供了针对无突变的流感病毒株的交叉免疫。与仅接受季节性疫苗的个体相比，在接受季节性疫苗之前接受一剂Multimeric-001的个体对H1N1和H3N2株的抗体反应更强。此外，接受Multimeric-001疫苗接种的个体对H1N1、H3N2和流感B的CD4+和CD8+ T细胞反应高于基线。 7.1. 当前和未来疫苗的经济利益 在评估新型mRNA和组合流感/COVID-19疫苗在低收入和中等收入国家的价值时，检查其成本效益至关重要。当前的模型研究，如水洛等的研究，存在局限性：它们侧重于医学上关注的流感病例，但没有考虑流感影响的全谱。这包括非呼吸道和非医疗关注的病例，这对于婴儿和老年人尤其重要。此外，这些模型没有考虑到流感疫苗的更广泛好处，例如减少严重疾病，预防心脏病发作等非呼吸道并发症，或减少抗生素的使用。为了更全面地了解流感疫苗的优势，我们应该改进未来模型评估中使用的数据。 7.2. 临床试验 国家过敏和传染病研究所（NIAID）的一部分疫苗研究中心，已经开发了一种基于纳米颗粒的流感疫苗。这种疫苗由弗雷德里克国家实验室制造，用于第一阶段临床试验，已被证明是安全、耐受良好且对各种流感亚型有效。与传统的每年注射的流感疫苗相比，它有可能提供更持久和更广泛的保护，可能导致通用流感疫苗。与传统的在鸡蛋中生产的基于蛋白质的流感疫苗不同，后者制作耗时且由于病毒突变需要每年更新，这种纳米颗粒疫苗生产更快，并且可以快速适应新的流感菌株，使其对大流行响应具有价值。研究团队使用了一种自组装成支架的铁蛋白蛋白，允许他们附加触发针对流感H2亚型的免疫反应的病毒蛋白。 第一阶段临床试验涉及50名18至70岁的健康志愿者。研究包括有和没有H2流感亚型暴露史的个体，以评估疫苗在两种情况下的有效性。结果表明，疫苗在两组中都是安全且耐受良好的，参与者产生了抗体，包括针对病毒稳定区域的抗体。这表明与标准季节性流感疫苗相比，纳米颗粒疫苗可能提供更广泛和更持久的保护。总之，第一阶段试验展示了使用有序抗原阵列的新一代疫苗的潜力。结果表明，这种基于铁蛋白纳米颗粒的疫苗平台可能对大流行准备和通用流感疫苗的开发有益。 7.3. 疫苗设计 生产 疫苗生产包括几个不同的阶段。疫苗制造过程可以分解为以下关键步骤： 抗原生成：最初，抗原是从病毒或微生物中产生的。这涉及在各种介质中培养微生物，如流感的鸡蛋、甲型肝炎的细胞系、乙型流感嗜血杆菌的培养人类细胞或生物反应器。也可以在酵母、细菌或细胞培养中生成该生物体的蛋白质或组分。在某些情况下，细菌或病毒可能使用化学物质或热能被削弱以创建疫苗。 抗原分离：在生成抗原后，将其与用于生产它的细胞或介质中分离。对于减弱或减毒的病毒，这可能不需要进一步纯化。然而，重组蛋白通常在适合使用之前经历多个纯化步骤，如超滤和柱色谱。 配方：一旦获得抗原，就通过添加佐剂、稳定剂和防腐剂将其配制成最终疫苗产品。佐剂增强对抗原的免疫反应，稳定剂延长产品的保质期，防腐剂使多剂量瓶的使用成为可能。开发组合疫苗可能具有挑战性，因为抗原和其他疫苗组分之间可能存在不相容性和相互作用。 为确保疫苗生产符合质量标准，产品必须避免暴露于空气、水和人类潜在污染。此外，生产环境应防止抗原泄漏。 应用 疫苗设计在预防和管理传染病方面有广泛的实际用途。显著的应用包括： 疾病预防：疫苗主要是为了通过训练免疫系统识别和防御有害病原体来预防传染病。它们在控制甚至根除如脊髓灰质炎、天花和麻疹等疾病中发挥了关键作用。 大流行准备：疫苗设计在为潜在的大流行做准备中至关重要。科学家可以致力于为新的和新兴的传染病开发疫苗，如针对SARS-CoV-2病毒迅速开发的COVID-19疫苗。 癌症治疗：一些疫苗旨在刺激免疫系统靶向癌细胞。例如，HPV疫苗有助于预防某些癌症。 过敏管理：特异性免疫疗法，如过敏疫苗或注射，通过使个体对花粉或尘螨等过敏原脱敏来减少过敏症状。 通过媒介传播的疾病：研究继续进行设计针对由媒介传播的疾病，如疟疾或登革热的疫苗。 新兴疾病的疫苗：鉴于可能出现的新传染病，疫苗设计对于快速响应疫情并防止其成为全球健康威胁至关重要。 疫苗设计的局限性 抗原识别：对于某些病原体来说，识别能够刺激保护性免疫反应的合适抗原可能具有挑战性。 抗原变异：一些病原体表现出高度的抗原变异性，使得设计能够提供持久免疫力的有效疫苗变得困难。 递送和稳定性：开发在资源有限的环境中易于管理且稳定的疫苗可能是一个挑战。 伦理和监管障碍：疫苗的开发和测试涉及伦理和监管挑战，包括知情同意和临床试验标准。 新兴病原体：对新出现或新兴病原体的快速疫苗开发可能因知识有限和缺乏现有平台而受到阻碍。 • 用于靶向实体瘤和携带成纤维细胞激活蛋白的细胞的Teranostic CAR-T细胞疗法，以及流感疫苗的开发。它暗示了一种独特的策略，以改善癌症治疗和疫苗效果。肿瘤微环境（TME）在癌症进展中起着关键作用，特别是癌症相关成纤维细胞（CAFs）表达成纤维细胞激活蛋白（FAP）的存在。在肿瘤学中，检测和靶向FAP是一个重要兴趣点，使用各种成像方式如SPECT、PET、CT、荧光成像和MRI来达到这个目的。嵌合抗原受体（CAR）-T细胞在治疗某些癌症方面已经显示出效果。然而，它们在血液癌症中的成功并没有很好地转化为实体瘤，需要改进方法。通过分子成像和细胞追踪将CAR-T细胞递送到实体瘤也存在一些挑战。这种CAR-T细胞疗法在治疗实体和非实体瘤中突出了当前的进展，并讨论了克服治疗障碍的策略。虽然这些信息与优化癌症治疗有关，但并没有直接与流感疫苗联系起来。 8.结论 流感由于广泛的病毒抗原漂移和转变，给全球公共卫生带来了重大挑战。宿主的免疫系统能够防御流感，这需要每年更新疫苗接种。目前，有三种类型的流感疫苗可用：灭活流感疫苗、减毒活流感疫苗和重组血凝素（HA）疫苗。流感疫苗的配方复杂，通常包括病毒抗原、佐剂、防腐剂和稳定剂，以确保稳定性和有效性。为了满足监管标准并确保安全性，这些疫苗在生产过程和完成后都经过严格的质量测试。然而，仍需要进一步的研究来解决当前流感疫苗的局限性，例如它们有限的有效性、漫长的生产过程和缺乏广泛的交叉保护。研究人员正在努力开发新的流感疫苗，以提高效果，并可能提供针对多种菌株的交叉保护，最终目标是创建一种通用的流感疫苗，消除每年更新的需求。 为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。 名称：2024第三届新型疫苗研发峰会 时间：2024年8月16-17日（周五-周六） 地点：苏州（酒店定向通知） 主办单位：四叶草会展、生物制品圈 媒体支持：药时空、抗体圈、细胞基因研究圈 会议费用：点击二维码即可查询。 报名方式：扫描下方二维码→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，免交报名费，承担一定工作任务）！ 转发分享福利：疫苗研发企业、科研院校和监管机构人员，前30位报名人员转发分享会议信息可免费参会（不含餐饮）报名后，扫描下方二维码加工作人员微信后，发送截图即可。 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请，最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 大会日程 已经确定的报告人 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

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