Inotersen sodium

从基因组的双链DNA（dsDNA），到编码和非编码RNA（mRNA、lncRNA和miRNA等），只要与疾病发生相关，都可能作为基因治疗的靶标。这些靶标可被替换、修复、补充、抑制或消除，取决于所采取的具体基因治疗方法。基因编辑技术是将致病基因裁剪缝补为正常的基因，而化学合成的和体内表达的核酸药物则主要靶向致病性RNA。与此同时，转运核酸药物的方法也在大力研发中，包括病毒或质粒表达载体和各种聚合物材料。核酸药物的成药性、转运载体的安全性和效率是基因治疗方法面临的挑战性问题。本文简要综述近年来基因治疗药物，特别是反义核酸、核酶、脱氧核酶、小干扰RNA（siRNA）和微小RNA（miRNA）等化学合成的核酸药物，以及化学修饰在提高核酸药物的效价、抗酶解稳定性和有效转运等关键技术方面的进展。随着对基因调控在疾病发生过程中认识的逐步深入和核酸药物优化技术的进步，核酸药物的研发步伐将会越来越快，期待包括siRNA药物在内的更多核酸药物在不久的将来应用于临床治疗。 随着分子生物学技术的不断发展，基因突变和缺陷与疾病之间的关联性获得了越来越深入的认识；细胞内大量的非编码基因的存在，无论长短，都不是无意义的，而是细胞内具有主动调控基因转录、翻译及蛋白质功能的重要组成部分［1-3］。利用核酸分子的主动和被动调控，可作为干预疾病过程的工具和药物。与疾病相关的核酸分子包括来自病毒和细菌的致病基因，与疾病相关的突变基因和缺陷基因，以及过表达的、表达不足的、突变的编码信使RNA（messenger RNA，mRNA），微小RNA（microRNA，miRNA）、长非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）等非编码RNA。它们可产生病理性功能蛋白，也可对基因转录和翻译发挥负调控作用。因此，从源头进行干预，抑制疾病相关基因，使其不能表达为病理性蛋白；或引入能表达正常蛋白的基因，弥补功能蛋白的不足和发挥正向调控作用。这种在基因水平进行药物干预的策略就是基因治疗。 单基因遗传病是基因治疗的首选目标，理论上，将正常的基因导入细胞，表达出正常蛋白即可弥补和提供生理活动所需的蛋白质及其功能，实现永久性治愈。这一技术是随着基因和基因组调控机制的发现、基因操作技术的不断发展和逆转录病毒复制机制的发现而成长的。导入方法是其关键所在，目前已建立了腺病毒、腺相关病毒（adeno-associated virus 1，AAV1）和慢病毒等载体。但基于这些载体对于宿主基因组可能的干扰，以及在应用中曾出现的严重不良反应事件，其潜在的毒性使这一类基因治疗方案的应用需非常谨慎。随着对这类载体的认识和逐步改造，近几年的临床试验表明了改造慢病毒载体的可行性和安全性，已获得可用于临床的几种病毒表达载体，如AAV1和AAV2在治疗A型和B型血友病、先天性黑朦症、重症联合免疫缺陷疾病等方面获得了初步的成功。 另一种方法则是对于致病基因的修补。利用锌指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFN）和类转录激活因子效应物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN），尤其是2013年以来发展的成簇规律间隔短回文重复序列/相关蛋白9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated protein 9，CRISPR/Cas9）基因编辑技术，对基因组的缺陷基因进行消除或替换。虽该法能带来一劳永逸的治疗效果，但不可控的脱靶效应仍是亟待应对的巨大挑战。 直接利用外来核酸片段干预致病性RNA是非常重要的一大类基因治疗策略，在近40年里已发展出多种功能核酸作为这种基因治疗策略的候选结构，包括反义核酸、核酶（ribozyme）、脱氧核酶（deoxyribozyme）、小干扰RNA（mall interfering RNA，siRNA）和miRNA等。它们在抗肿瘤、抗感染、心血管系统疾病、神经系统疾病、代谢失调、炎症、免疫治疗，以及传统的小分子药物无法发挥治疗作用的疾病和罕见病等治疗中已显示出巨大的应用潜力。 针对病理性蛋白，也发现了核酸作为药物应用的可能性，一些核酸片段的特殊功能，如CpG核酸和decoy核酸，可与特定蛋白相互作用而激活免疫功能，或发挥抑制蛋白质功能的作用；尤其是各种各样的非编码RNA与蛋白质的相互作用，具有参与调控多种信号分子的功能。利用这些核酸的片段来增强免疫反应和调控蛋白质的功能，是目前研发核酸药物的一个重要方向。而且，对于很多疾病相关蛋白，可采取主动筛选其适配体（aptamer）的方法，即利用指数式扩增的配体系统进化（systematic enrichment of ligands by exponential amplification，SELEX）技术筛选出它们的高亲和性和特异性核酸适配体，使其成为病理性蛋白的潜在抑制剂。 随着对疾病成因的深入了解，人们逐渐认识到一种疾病可能是多通路多基因共同参与造成的结果。对于传统的小分子药物来说，很难针对每一通路来设计特异性的治疗药物，但对于一种疾病发生时的多基因表达异常，却可设计相应的核酸药物来调控多个相关基因及其mRNA。如胰岛素抵抗和高糖血症涉及了多个关键基因的异常表达，可针对它们分别设计多个siRNA来验证疾病的起因和实施治疗。 针对HIV-1感染所开展的基因治疗靶标涉及了病毒感染过程中的所有基因和宿主的相关基因，涵盖了所有核酸药物类型，从最初的反义核酸药物到基因编辑技术，设计了多种抗HIV的核酸药物，例如针对重要的保守区域，设计组合的短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA），以尽可能包括耐药性的突变体。其中一些品种已处在临床评价阶段。由此可见，基于碱基配对的核酸药物设计效率远高于传统的小分子药物设计，且靶标范围广，涵盖了从基因组到蛋白质的各个阶段（图1）。 目前关于核酸药物的分类方法略有不同，一种是基于核酸药物是否与靶标序列发生碱基互补配对来区分［18］，如反基因核酸、反义核酸、核酶和脱氧核酶、siRNA、各种miRNA抑制剂和类似物以及基因编辑技术等；与碱基配对无关的核酸药物有适配体、CpG和decoy核酸等。另一种则是根据各种核酸药物的反应机制来定义，即所针对的靶标RNA是否会发生分解来分类。本文以基因编辑技术、反义核酸、核酶和脱氧核酶、siRNA、miRNA等为主要线索，介绍当前核酸药物的发展趋势，所面临的问题和已有的解决方案，以蛋白质为靶标的核酸药物种类（CpG核酸、decoy核酸和适配体）不纳入本综述的范围。 图1 核酸药物种类及作用靶标示意图 注：siRNA：小干扰RNA；miRNA：微小RNA；lncRNA：长非编码RNA；shRNA：短发夹RNA；ZFN：锌指核酸酶；TALEN：类转录激活因子效应物核酸酶一、化学修饰 用于基因治疗的核酸药物，设计理念与小分子药物不同，但以化学合成的方式提供用药时，则和小分子药物一样，需满足以下要求：①具有相当程度的化学稳定性和抗酶解稳定性，在体内循环过程中能保持足够数量的完整结构形式；②具有一定的脂溶性，能跨越各种生物膜到达作用部位；③在作用部位有足够浓度的药物分子；④对于靶标具有高特异性识别；⑤产生预期的治疗效果，副作用无或只有极少。而核酸药物分子，无论碱基组成如何，结构上与内源性核酸分子无异，极易被各种核酸酶所降解，其核糖-磷酸骨架结构具有负电性，极性大，完全不能满足作为一个药物使用的基本条件。这是核酸药物研发中，高的设计效率和低的成药比例之间的矛盾所在。因此，核酸药物的研发离不开化学修饰，在谈到每一类核酸药物，或一个具体的核酸药物分子时，会同时涉及到它们的化学修饰方法。在此本文首先介绍核酸药物的化学修饰策略。 反义核酸是研究历时最长、最深入的一类核酸药物，化学修饰是其中不可或缺的一个环节。因此，大量的化学修饰最先应用在反义核酸性质的优化上。对于大部分化学修饰的性质评价来自于其对反义核酸性能的影响。对于其他核酸药物的化学修饰和性能优化，这些结果无疑是具有很好的借鉴意义的。 化学修饰在改善核酸药物的成药性方面发挥了关键作用。其首要任务是提高核酸药物的抗酶解能力，因为体内无处不在的核酸酶，能在几分钟内降解核酸药物序列，使其效价大打折扣；而降解产生的短片段，既可能带来某些序列毒性，又易于产生新的靶结合位点而导致脱靶效应。只有保持完整的序列和足够的半衰期，才能发挥预期的作用。其次，化学修饰用于改善其物理化学性质，如在核糖的2′-位引入烷基，氟原子等可降低极性，用中性或带正电性的基团代替带负电性的磷酸骨架，可提高与靶序列的结合亲和性和增加脂溶性，或在末端引入脂溶性分子，改善核酸跨膜转运到达作用部位的能力。第三，为了改善药物转运过程的靶向性所进行的化学修饰，一般在核酸序列的末端引入细胞表面受体的配体分子或适配体。第四，为了提高核酸药物的效价（结合亲和性、沉默效率和催化反应效率等）而进行的化学修饰。1.1 碱基修饰 优化核酸药物所采用的化学修饰种类繁多，已在核酸的3个结构单元，即碱基、磷酸基和核糖部分进行了各种各样的单一或组合的修饰（图2）。碱基上有多个位点可用于取代基修饰，嘧啶碱基的5-位和嘌呤碱基的8-位为常用的取代位点，可引入各种功能基用于增加碱基对的稳定性和核酸药物对于靶标序列的亲和性，及提高核酸结构的化学活性，增强某些核酸药物的功能。引入的功能基有羧基、氨基、咪唑基和各种芳香基团等，连接臂有炔基、烯基和烷基等。1.2 磷酸基团上的修饰 磷酸基团的改造位点常常是非桥连氧原子，用硫原子取代磷酸基团的一个非桥连氧原子得到硫代磷酸（PS-DNA/RNA，图2），是反义核酸药物的第一代化学修饰，达到了提高核酸的抗酶解能力的目的。而且，简便易行的固相合成就能实现，是目前广泛使用的修饰方法［19］。该法对于药学性质的影响也得到了深入细致的研究。除了给反义药物带来抗核酸酶的稳定性外，还利于增加其与血浆蛋白的结合，阻止快速肾清除。其另一个优点是硫代修饰序列保留了DNA的一个性质，即与靶RNA形成的杂交双螺旋片段能被核糖核酸酶H（RNase H）识别并降解靶RNA，使得这一修饰的反义核酸药物除了基于立体位阻的抑制，同时还有基于RNase H机制的靶RNA降解作用。不足之处是高浓度带来的细胞毒性和免疫刺激副作用，对靶序列的亲和性不如DNA，这可能影响到靶序列长度的选择和非靶杂交的可能性。不过，其优势和劣势在后来的核酸药物组合修饰中较好地实现了扬长避短，既利用了其RNase H机制，又降低了药效浓度和毒副作用。 图2 核酸结构的化学修饰举例 磷酸基上的非桥连氧原子和桥连氧原子还可被各种胺基或硼烷基取代，或整个磷酸基被酰胺基、胺氧基、烷氧基、三氮唑基等取代，有助于提高核酸结构的抗酶解稳定性［20］，但这些结构修饰尚未得到推广应用。1.3 核糖部分的修饰 核糖的改造大致分为两类，一种方式是在它的2′-位引入各种大小不同、极性各异的基团，具有以下4个方面的作用：①将2′-位的羟基改造为其他基团，消除了分子内的磷酸酯键水解反应，具有提高化学稳定性的作用；②在2′-位的取代基修饰，使核酸结构不能被大部分核酸酶识别，因而赋与了核酸的抗酶解稳定性特点；③2′-位的极性基团使核酸药物结构接近RNA的构象，从而增加与底物RNA的结合亲和性；④2′-位引入的烷氧基类基团、F原子等，能赋与核酸结构一定的脂溶性，有利于改善药代动力学性质［21］。在2′-位引入的多种修饰基团中，以含氧原子和氨基的烷基基团居多。从对核酸结构的理化性质和药理学性质的影响来看，常用的修饰主要有3种，即2′-甲氧基（2′-OMe）、2′-甲氧基乙氧基（2′-MOE）和2′-F［22-23］，称为反义核酸的第二代修饰。它们在核酸药物中表现出相当程度的相似之处，在提高核酸药物与靶序列的亲和性上有一定促进作用，但不被RNase H识别，因而以结合靶产生的立体位阻方式阻止靶序列的功能。对于酶稳定性的改善以前两种方式比较显著，且有助于消减硫代修饰带来的免疫刺激副作用，并减少脱嘌呤现象。核糖的4′-O-原子被S、Se和NH等取代［24-25］可对核糖的构象产生一定影响，目前在核酸药物修饰中的应用比较少。 另一种方式是核糖的构象限制性修饰。锁核酸（locked nucleic acid，LNA）对于互补RNA的高亲和性和抗酶解能力使其在核酸药物的修饰中得到了广泛应用［26-28］。因此，利用LNA结构来设计反义核酸时，可使用较短的序列来保持足够的靶亲和性。但LNA修饰的短序列可能带来的脱靶效应和由此带来更严重的毒性问题，在引入LNA修饰时需予以重视。LNA所表现出的优越性为核糖的构象限制性改造开了先河，已有多种多样的修饰见诸报道。实际应用较多的有UNA（unlocked nucleic acid）［29］、cEt-DNA［30-31］和tc-DNA［32］等。在这4种核糖结构的修饰中，因核糖结构和构象的改变而带来了结合亲和性的显著变化，同时也不被RNase H和其他核酸酶所识别，具有提高核酸抗酶解稳定性的能力，因而被用来与PS-骨架修饰相结合，形成优势互补的组合修饰方式。利用这类修饰，可使用较短的核酸序列，甚至可不借助载体，直接转运入细胞。 cEt-DNA也是赋予核糖以限制性构象，采取的C3′-endo折叠增强了其对于靶RNA的结合亲和性，也不被核酸酶所识别，其抗酶解能力甚至高于LNA和2′-MOE修饰［30-31］，且无显著的毒性，是比LNA更好的替代结构，含有cEt的反义核酸药物已进入临床评价。 tc-DNA除了具有抗酶解能力外，还能提高与DNA和RNA的亲和性［32］。将tc-DNA片段修饰引入反义核酸结构的两端，和PS-骨架修饰一起，形成嵌合体（gapmer）反义核酸。将它应用于针对杜氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）mRNA的反义核酸，只需要较短的13-mer和15-mer的序列，就能实现稳定的结合。在小鼠DMD模型上的应用研究表明，在骨骼肌和脑部出现了肌营养不良蛋白，改善了肌肉功能和与情感/认知缺陷相关的行为，且表现出较好的安全性，具有改善反义核酸药物疗效的潜力［33-34］。目前，这类修饰中只有LNA实现了商业化，广泛用于各种核酸药物的修饰。1.4 核糖-磷酸骨架的修饰 核糖-磷酸骨架的整体修饰主要有吗啉磷酰二胺寡聚体（phosphorodiamidate morpholino oligomer，PMO）［35］和肽核酸（peptide nucleic acids，PNA）［36］两种方式。它们的电中性结构带来的是结合亲和性高和抗酶解稳定性的特点。而且，PMO骨架还具有相当好的水溶性，在核酸药物的修饰应用上比PNA多。PMO反义核酸以高亲和性结合各种RNA，达到抑制mRNA翻译和干扰RNA剪接的结果，已成功用于核酸药物的修饰和基因功能的研究［37-38］。PMO也用在siRNA和miRNA的修饰上，有几个核酸药物已处于临床试验阶段。基于PMO的应用潜力，进一步的修饰包括引入穿膜肽（peptide-conjugated PMO，PPMO）和引入带正电性的胺基（positively charged PMO，PMOplus），以提高其透膜能力［39］。1.5 针对核酸药物的组合修饰 上述化学修饰各以其独特之处影响核酸药物的药学性质，而且对每类核酸药物，甚至每个核酸药物分子的影响都不同，对靶标序列的亲和性、抗酶解稳定性、能否被RNase H所识别、是否有利于转运，以及对于效价的影响等重要方面各有侧重。因此，在第2代反义核酸药物修饰策略中，最为典型的是组合修饰为gapmer型结构（图3），以中间的PS-修饰与两翼的核糖和（或）磷酸基修饰相结合。在这样的组合中，中间的PS-修饰部分可被RNase H降解，允许以RNase H机制达到降解靶mRNA的目的，两翼的修饰则以具有强亲和性和抗酶解能力的修饰为选择标准，如2′-MOE、2′-OMe、LNA、cEt-DNA、tc-DNA和PMO等。第2.5代修饰则是硫代修饰与cEt-DNA型核糖修饰的结合。因此，利用gapmer型核酸药物可组合各种化学修饰的优点，在药学性质上具有一定的优越性，如更短的序列设计，更好的细胞吸收，更高的效价和更低的毒性［31，40-42］。最近上市的药物很好体现了这一优化策略趋势。 图3 反义核酸的gamper型结构示意图 这些基于反义核酸的化学修饰已成功地运用于其他类型的核酸药物。对siRNA，抗酶解稳定性和透膜效率是同样需要解决的问题。值得注意的是，鉴于siRNA双螺旋的每个碱基或碱基对对于沉默效率的不同影响，末端及局部片段的稳定性对沉默效率的影响，利用化学修饰在碱基对上引入功能基，可使化学活性和稳定性发生变化，其中有一些修饰达到了提高siRNA沉默效率的目的。但因涉及到siRNA的修饰片段能否被RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）所识别及结合的效率，修饰方法的选择目前仍以实验结果为检验标准［43］。 对于核酶和脱氧核酶的修饰，则以不影响其催化能力为前提，主要在其识别臂部位进行抗酶解稳定性修饰，如引入硫代磷酸骨架、2′-OMe和2′-MOE，以及LNA修饰等。在催化结构域的修饰可能带来催化活性的损失。针对血管内皮细胞生长因子受体1（vascular endothelial growth factor receptor 1，VEGFR1）mRNA 的核酶药物 RPI.4610（angiozyme）［44］，在催化结构域和识别臂上进行了大量的修饰，包括硫代磷酸骨架、2′-OMe和2′-C-烯丙基取代，以及3′端的稳定性修饰（图4）。 对于CRISPR/Cas9基因编辑技术，其引导序列sgRNA（single-guide RNA）如采用化学合成方法提供，则需要对其进行化学修饰，以提高其抗酶解稳定性和对于错配的敏感性，包括核糖的2′-F、2′-OMe、cEt修饰和硫代磷酸骨架等［45］。 在核糖-磷酸结构上还有很多种化学修饰，限于篇幅，不在此提及。有不少综述总结了各类核酸药物的化学修饰优化策略［20，46］。有一些已应用于核酸药物的修饰，得到一定程度的评价，它们在效价、结合亲和性、抗酶解稳定性和毒性方面均表现出一定的优势和应用潜力［47］。新的修饰研究还在继续，以期找到性能更好、合成更方便、生物相容性更好的替代结构。 图4 核酶RPI.4610的结构示意图［44］ 注：小写字母代表2′-OMe修饰，大写字母代表核苷酸单元，B代表3′-3′-翻转的dT，u4代表2′-C-烯丙基尿苷二、针对致病基因组的核酸药物2.1 反基因核酸药物 在基因组的双链DNA（dsDNA）结构中，存在一些由富嘌呤片段与富嘧啶片段互补形成的双螺旋结构，这些片段如恰好出现在致病基因内，针对这样的片段可设计互补的富嘧啶序列，在局部形成稳定的三螺旋结构，利用附着在基因片段上的这一空间障碍，阻断转录因子对基因组的加工和转录（图5）［48-49］，这便是最早的反基因药物设计策略。但三螺旋的稳定性如较差，则可能不足以抵挡基因组的正常加工，甚或被剪切修复。因此，加强三螺旋的稳定性是这类核酸结构修饰的重点［50-51］。鉴于核酸序列难以透过细胞膜和核膜两个屏障，以及在接近靶dsDNA部位时的空间障碍，反基因药物逐渐让位于针对下游mRNA的反义核酸药物。 图5 反基因药物示意图 注：针对富嘌呤靶基因片段设计的反基因核酸，以稳定结合达到阻止蛋白质分子对于基因的转录等加工2.2 基因编辑技术 这是改造致病基因组行之有效的一类技术，直接对致病基因组进行定点剪接修复。利用ZFN或TALEN酶对基因组进行剪接修复，达到基因修复的结果［52-53］。2013年发现的基因组编辑技术CRISPR/Cas9，相比前两法，以互补RNA代替蛋白酶的构建来识别改造位点，质粒构建更易，操作更简单和精确，为基因治疗带来了更好的可操作性和更大的希望［54］。CRISPR/Cas9原本是细菌抵御外来物种入侵的一种策略，以多种蛋白酶和RNA协同完成识别-结合-剪接过程（图6）。在经过遗传工程改造后，这个编辑工具被大大简化，只需一个蛋白酶Cas9和一个单链引导序列RNA（即sgRNA）。根据改造的目标序列设计互补的sgRNA，引导Cas9对目标dsDNA进行裂解，随后在裂解位点进行修复，包括同源重组和非同源末端连接等途径，在原基因组上实现单个碱基或片段的敲除、引入新的片段等。 图6 IL2RG sgRNA-Cas9的复合物与靶基因组结合的示意图［45］ 注：红色旗帜为修饰的位点 经改进后的基因编辑技术已适用于所有物种的基因改造、基因功能分析，尤其是人的基因治疗方面。其作为基因治疗方法的应用潜力，正在大力开发中，包括针对人体感染的病毒、修正致病性基因及引入具有治疗作用的基因等，已在细胞水平和动物模型实验中获得了预期的基因矫正效果［55］。 在临床试验前，尚需深入研究这个治疗策略的安全性。对其安全性的忧虑主要来自脱靶效应对于非靶标基因的永久性修改［56］。脱靶效应的产生可能出现在两个阶段：一是引导序列sgRNA对于靶DNA的识别与结合阶段［57］，在近PAM（protospacer adjacent motif）区，sgRNA对于靶序列的错配较敏感，易于解离；而在远离PAM区，sgRNA与靶DNA之间的错配结合不易发生解离和影响Cas9-sgRNA复合物的正常编辑功能发挥。二是在被剪切的基因组dsDNA缺口再连接的过程中，引入新的基因片段，或消除致病基因片段，未能完全达到预期的编辑效果。 因为存在这样的脱靶效应，采取的主要对策是对参与基因编辑的元件和过程的各个因素进行优化［58-59］，包括sgRNA［60］和核酸酶的筛选和优化［61-62］。针对核酸酶的改造和升级的研究报道很多，确实为基因编辑技术提供了更多的可能性，赋予该技术更高的特异性，有助于减少治疗应用中的脱靶效应，提高基因修正的效率，甚至能针对RNA进行编辑，实现对mRNA的特异性沉默［63］。另外，可通过突变Cas9，使其切割基因组双螺旋DNA的功能失活，但在该位点引入转录抑制因子。抑制目标基因的表达，称之CRISPR干扰（CRISPR interference，CRISPRi）技术［64］；或引入转录激活因子，激活目标基因的表达，称之为 CRISPR 激活（CRISPR activation，CRISPRa）技术［65］，它们在基因功能研究和基因治疗上的应用正在开发之中［66］。 为了提高基因编辑的效率，引导序列的设计是至关重要的因素，因为涉及到其与目标基因的识别和结合，在实际研究中可能需要设计多个sgRNA来针对目标基因的不同片段，筛选最佳的编辑效率和最低的脱靶效应。已有的研究表明，化学合成的RNA也能作为引导序列，序列的长短可进行改变，用来提高编辑效率［4，67-68］。为了提高引导序列的抗酶解稳定性，也可进行化学修饰，在其RNA结构的2′-位上引入甲氧基、氟原子、硫代磷酸基团，或构象限制性修饰等，CRISPR/Cas9组合能容纳这样的结构变化。合适的RNA结构修饰需要结合实验结果来确定［69］。 基因编辑技术需要核酸酶、引导序列和修正基因供体，在将它们组合为药物应用时，透膜转运则是一个极具挑战性的问题。利用病毒表达提供核酸酶和所需核酸组分，或结合病毒和质粒两种表达介质，以及表达载体和合成载体（脂质体和聚合物）相结合［70-71］等方式，都已进行了尝试。 选择哪种疾病、靶细胞或转运载体，都与基因编辑技术在临床治疗上能否成功息息相关。目前的应用还仅限于小鼠、非人灵长类动物和不以生育为目的的胚胎细胞。精准编辑缺陷基因，根除某些致命性遗传病的出现是人们的理想目标。但是，实际发生了什么，仍需以实验结果为最终判断标准。三、针对mRNA和各种非编码RNA的核酸药物3.1 反义核酸药物 反义药物的研发历史最为悠久，也是目前最为成功的核酸药物种类。它发端于Zamach的研究，通过引入一段与肉瘤病毒mRNA互补的序列，获得了抑制病毒复制的效果［72］。迄今，反义药物的靶mRNA已扩展到包括人体的各种致病性RNA和外来病原体RNA。理论上，只要利用碱基配对原理设计与致病性RNA片段（mRNA、miRNA等）互补的核酸序列（图3），在局部形成稳定的双螺旋结构，即可以多种方式终止致病基因的翻译，终止病毒复制，阻止病理性蛋白的产生。从这一基因治疗的设计理念出发，已开展了上百种反义核酸药物的基础和应用研究，其中4个已进入临床应用。尤其是2016年批准了2个治疗遗传缺陷的反义药物依替利生（eteplirsen，Exondys51）和奴西奈生（nusinersen），再次激发了对于核酸药物的研发热情。特别是反义核酸药物在中枢神经系统疾病治疗上所展示的应用前景，正是目前小分子药物难以解决的问题［73-74］。 经过多年对反义机制研究，一般认为反义核酸药物有以下可能的抑制机制：以反义核酸序列与RNA片段的结合带来RNA的局部空间位阻，干扰RNA的高级结构；阻止相关酶的结合和翻译启动；干扰前体mRNA（pre-mRNA）剪接；引起内含子跳跃；结合mRNA上游开放阅读框架产生RNA-激动剂；聚腺苷酸化的抑制；或所形成的DNA-RNA双螺旋结构被内源性RNase H降解靶RNA，完全破坏致病性mRNA和miRNA。这些机制可能与靶序列所处的位置和反义核酸的修饰结构有密切关系［75］。 在反义药物的研发过程中，化学修饰发挥了至关重要的作用，已上市药物展示了其发展和应用。第1个反义药物福米韦生（formivirsen，Vitravene），是由21个核苷酸单元组成的全硫代寡核苷酸，靶向巨细胞病毒（CMV）的IE-2（immediate-early-2 protein）mRNA，治疗巨细胞病毒引起的艾滋病患者的视网膜炎，因为HIV/AIDS患者的该感染病减少，现已退市。但其研发过程为后续的药物开发积累了宝贵的经验［76］。第2个反义核酸药物是米泊美生（mipomersen，Kynamro），靶向人载脂蛋白 Apo B100 mRNA编码区，用于联合治疗罕见的纯合子家族性高胆固醇血症。研究人员对这个含20个碱基的序列进行了广泛的修饰，以硫代磷酸骨架连接每个核苷单元，两端各有5个单元再以2′-MOE修饰核糖部分，起到抗核酸酶降解的作用，保持了RNase H对DNA-mRNA杂交结构中的mRNA片段的降解能力［77］，是第1个gapmer型修饰的核酸药物。 第3个反义核酸药物是依替利生，于2016年9月被美国FDA批准用于治疗DMD。DMD是一种致命性的隐性X-连锁遗传病，由于编码肌营养不良蛋白的基因发生了外显子的消除，阅读框发生迁移，所编码的蛋白质缺失正常功能。肌营养不良蛋白是肌浆复合物的一个组分，为维持肌细胞完整性所必需［78］。该蛋白的不足和缺乏，导致患者表现出进行性骨骼肌退化及心肌病，最终因心力衰竭和呼吸衰竭而死亡。肌营养不良蛋白的mRNA共有79个外显子，外显子45-50及52发生消除突变，干扰翻译阅读框，突变的基因无法翻译为功能性蛋白。如跳过外显子51，则能恢复翻译阅读框，表达出具有部分功能的肌营养不良蛋白。以高亲和性的反义核酸与外显子51结合，即可实现跳过外显子51，恢复功能蛋白的合成。针对外显子51设计了2个反义核酸药物屈沙派生（drisapersen）和依替利生。前者为2′-OMe-PS组合修饰，因炎性不良反应和未达到治疗指标而终止了进一步的临床试验。后者为含30个碱基的PMO结构，具有良好的抗酶解稳定性，不能被RNase H降解，与外显子51的结合牢固，干预了pre-mRNA的剪接，获得一个修补的mRNA，所翻译的蛋白质，能部分代替正常蛋白的功能，达到显著改善运动功能的目的［79］。 第4个反义核酸药物为奴西奈生（nusinersen，Spinraza），于2016年12月获得美国FDA批准，用于治疗脊髓性肌萎缩（spinal muscular atrophy，SMA）［80］。SMA是一种常染色体隐性遗传病，运动神经元生存蛋白（survival of motor neurons，SMN）基因SMN1的突变使SMN蛋白缺失，造成运动神经元的逐渐丧失，最终导致肌萎缩和瘫痪。幸运的是，人体内还有一个与SMN1基因几乎完全相同的SMN2基因，可利用它来补充SMN蛋白。但这个基因的转录子不能得到正确剪接，因为它的外显子7有多个核苷酸差异，导致剪接体无法识别而被排除，产生的蛋白被迅速降解，只有大约10%能合成完整的SMN2转录子和SMN蛋白，不足以弥补缺失的SMN1功能。以SMN2 pre-mRNA内含子7的一个区域为靶，设计了互补的反义核酸序列，通过两者之间的高亲和性结合，解除对于内含子7的抑制作用，使更多的外显子7被包含在SMN2 mRNA中，得到更多完整的SMN2 mRNA，和翻译为更多的SMN蛋白，实现治疗目的。这个反义核酸药物的18个核苷酸结构被修饰为gapmer型，两端为2′-MOE，中间为PS-修饰，所有的胞嘧啶碱基的5-位引入了甲基，以消减序列带来的免疫刺激副作用［81］。尤其值得注意的是，这个反义药物采用局部（硬膜内）给药方式，可迅速分布在脑部和脊髓中，被神经元有效吸收。给药方式虽然具有危险的侵入性，但实践证明这个给药方式有多个优点，具有可操作性：①可有效克服核酸药物无法透过血脑屏障的问题；②药物在非靶组织的分布低，副作用大大降低；③用药频率比系统给药低得多。这个实例为其他神经系统疾病的核酸药物治疗提供了一种可行的转运方案。 在其他反义核酸药物的研究中，还应用了其他修饰策略。Straarup等［82］针对ApoB mRNA设计了LNA修饰的反义核酸，在小鼠和非人灵长类体内评价具有预期的降胆固醇的作用，同时不增加血清的肝毒性标志物。在这个反义核酸结构中，不仅使用了LNA，还含有硫代磷酸骨架和2′-MOE、2′F-ANA、2′FRNA，并连接了脂溶性分子。各个修饰的数量和位置则是依据反义核酸的抑制效率来确定的。 还有多种反义核酸药物处于临床前和临床研究阶段，美国Ionis Pharmaceuticals公司正在开发的伊诺特生（inotersen）针对家族性淀粉样多发神经病变（familial amyloidotic polyneuropathy，FAP）［83］，在Ⅲ期临床试验的2个主要终点指标上达到了预期的目标，前期已经获得孤儿药资格认定，计划于2017年底向美国FDA和欧洲药品管理局（EMA）递交新药申请。但它的毒性问题还有待进一步实验验证。进一步利用GalNAc作为肝靶向配体分子，改善治疗效果的临床研究也即将开展。 在反义药物的研发中，成功的比例虽很低，但在解决核酸药物的抗酶解能力和转运效率这两个挑战性难题上取得了巨大的进步，极大改善了核酸药物的成药性，为后续的反义核酸药物研发积累了很多经验，也为优化其他类型核酸药物提供了借鉴。3.2 核酶 核酶是天然存在的一类催化性RNA分子，具有催化核酸磷酸二酯键裂解和连接的功能［84］。这是第1个关于核酸的非遗传信息载体的功能，成为学者们重新认识核酸功能与结构的开始。目前，自然界存在的核酶，根据反应类型分为7大类，其本质是核酸磷酸二酯键的裂解和连接，包括分子内和分子间的反应。而核糖体的核酶特性的发现，即催化核糖体内的肽键生成或者说蛋白质的合成，真正证实和体现了核酸的酶催化潜力及其在生物体内的重要贡献［85］。 核酶的催化机制和结构研究表明，核酶有两种结构域，一是识别结构域，以Watson-Crick碱基配对方式特异性地结合RNA底物；另一是由特定序列组成的催化结构域，司职催化裂解底物的磷酸二酯键，具有很高的保守性。尤其是这个分子内的催化反应可移植到分子间进行，从而开辟了一条新的基因治疗途径，即利用核酶特异性识别和剪切与疾病相关的mRNA或其他RNA，中断病理性蛋白质的产生。较小的锤头型核酶和发卡型核酶易于改造，适合用于基因治疗［86］。 核酶作为药物应用的一个优势是可在质粒中进行表达，使机体能持续获得核酶，如针对HIV感染的不同阶段所需的蛋白质，设计了裂解其mRNA的4个核酶，利用逆转录病毒或慢病毒表达载体，获得了抑制HIV感染的结果［16，87］。OZ1是针对HIV的vpr-tat连接处保守片段而设计的核酶［88-90］，它的表达载体是基于莫洛尼小鼠白血病病毒的γ-逆转录病毒载体（LNL6）。Ⅰ期和Ⅱ期临床试验表明，在体外将OZ1转导入HIV-1患者的CD34+造血祖细胞，回输到患者体内，在试验的47周和48周主终点（primary efficacy endpoint）虽未获得显著的病毒抑制效果，但随后的40～48周期间和40～100周期间的试验结果表明HIV-1载量降低。且该试验中未检测到插入突变，也未产生核酶-耐药性病毒株。这一结果表明了病毒表达载体的可行性、长期安全性和核酶的有效性。同时，该法可保存免疫功能，避免抗逆转录病毒联合化疗带来的毒性。为提高疗效，还需在载体细胞的选择和转染效率、转染细胞在外周血和淋巴组织中的含量、核酶的裂解能力和治疗程序上进行优化。针对人卵巢癌细胞过表达c-neu mRNA设计的一个锤头型核酶，用U6表达体系建立了有效表达这个锤头型核酶的质粒，表现出对靶mRNA的特异性下调和对肿瘤细胞生长的抑制作用［91］。 利用合成的小型核酶针对特定靶标mRNA的治疗也进行了探索［92］。最常使用的是一个小型的锤头型核酶，剪切位点是GUC。理论上，靶RNA上如果含有GUC，以它的两端碱基序列设计锤头型核酶的识别臂，即可作为剪切这个RNA的核酶药物。 核酶的应用研究主要集中在抗病毒和抗肿瘤方面，针对多个相关的mRNA，在细胞和动物水平都观察到了核酶对靶mRNA的抑制作用。angiozyme（RPI.4610）是第一个进入临床的核酶（图4），针对VEGFR1的pre-mRNA而设计，在动物模型评价实验中具有抑制多种肿瘤生长的活性［93］，已完成了Ⅰ期和Ⅱ期临床试验［94］，并与其他抗肿瘤药物卡铂和紫杉醇进行了联合用药研究［44］。但在治疗侵袭性乳腺癌的Ⅱ期临床试验中因未观察到临床治疗价值而终止［95］。进一步的研究还未见报道。 另一个合成的锤头型核酶是heptazyme，靶向HCV RNA基因组的5′-非翻译区。由于某些毒性，临床试验结果虽表现良好，但进一步的试验已终止［96］。 herzyme也是一个合成的锤头型核酶，针对肿瘤基因人表皮生长因子2（HER2）mRNA设计的一个核酶，在细胞培养和小鼠移植瘤上观察到对于乳腺癌、胰腺癌和卵巢癌的抑制作用［97-98］。 鉴于核酶的RNA结构基础，针对化学合成的核酶药物的修饰是非常广泛的［99］，其主要目的是提高核酶的抗酶解能力和转运入细胞的效率（图4），但同时多种修饰可能带来各种毒副作用和降低核酶的催化反应效率。目前尚无具有临床应用价值的核酶药物的报道，但其在核酸药物基因治疗上得到的经验，包括化学修饰的作用和给药途径等，仍是不可忽略的。 图7 10-23脱氧核酶和8-17脱氧核酶的结构示意图 注：N为靶序列的组成，N′为脱氧核酶的识别臂组成，二者是互补的关系。箭头为靶序列的被剪切位点。指定碱基的部分为两个脱氧核酶的催化结构域［101］3.3 脱氧核酶 基于核酶RNA所具有的催化活性，迄今还未从自然界发现相应的催化性DNA。因此，模拟自然进化概念，以裂解RNA的磷酸二酯键为目的，建立了基于大量核酸序列的筛选-扩增的循环筛选技术（SELEX）来获得具有类似核酶功能的DNA分子。国际上多个实验室在不同的设定条件下，获得了多种催化性DNA分子，即脱氧核酶（DNAzyme）。同时，大大扩展了天然核酶的催化反应种类［100］。其中，以催化核酸裂解反应的脱氧核酶最具实用价值，脱氧核酶10-23和8-17为其典型代表［101］（图7），它们具有相对分子质量较小，催化效率高的特点，在基因治疗和生物传感器方面得到了广泛的应用研究。 3.3.1 10-23脱氧核酶作为基因治疗药物的应用 10-23脱氧核酶在Mg2+的辅助下，具有与核酶一样高效的催化能力和对底物的高特异性识别能力，甚至可用来区分核酸结构中的单个核苷酸差异［102］。因此，10-23脱氧核酶被广泛用来针对致病性mRNA。大量的研究结果表明，其具有作为基因治疗候选药物的巨大潜力。迄今已对各种病毒、细菌、肿瘤相关基因，神经系统、消化系统和心血管系统疾病的相关基因等，进行了多层次的评价，在细胞、动物模型和临床试验中都显示出潜在的治疗价值［103-105］（表1）。另外，10-23脱氧核酶的靶标也可以是疾病相关过表达的miRNA［106-107］。因此，10-23脱氧核酶可认为是一种潜在的广谱基因治疗药物。 碱性区亮氨酸拉链蛋白（a basic-region leucine zipper protein，c-jun）是激活蛋白1（AP 1）家族的一个成员，它的高表达与血管通透性、炎症和新生血管有关。对于炎性疾病，如风湿性关节炎、哮喘、感染后脓毒症、动脉粥样硬化斑块破裂和侵蚀、脑卒中和急性脑外伤等，传统的抗炎治疗存在多种副作用。因此，在基因水平下调c-jun的表达是一种可能的治疗方案。针对c-jun mRNA设计的10-23脱氧核酶Dz13，在体内外具有抑制血管通透性的作用，在风湿性关节炎大鼠模型中对炎症和骨坏死具有抑制作用［108］。在伴随病毒感染的肺炎等疾病的小鼠模型上观察到了抑制炎症的作用［109］。另外，Dz13显示出对平滑肌细胞内源性c-jun的抑制作用，对动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄具有潜在的治疗价值［110］。 同时，c-jun参与细胞增殖、转化和凋亡，在多种癌症组织中过表达，因此，Dz13抑制c-jun mRNA的作用也包括癌症的治疗。利用Dz13进行的抗肿瘤治疗包括基底细胞癌、鳞状细胞癌、骨肉瘤，前列腺癌和乳腺癌等，治疗基底细胞癌的Ⅰ期临床试验已完成［111］。 哮喘是一种常见的慢性炎性疾病，自身的和继发性的免疫反应在其发生发展过程中起到关键作用。这种过敏反应被Th2细胞（type 2 helper T cell）所驱动，产生多种细胞因子。而锌指转录因子GATA3（guanine adenine thymine adenine sequence-binding protein 3）对Th2细胞具有调控作用，被认为是Th2免疫激活路径的主要转录因子，在哮喘患者的肺组织中可检测到GATA3的过表达。靶向GATA3 mRNA的脱氧核酶hgd40以3种给药方式分别治疗与免疫激活有关的重度过敏性支气管哮喘、遗传性过敏性皮肤炎和溃疡性结肠炎的临床试验目前正在进行中［112］。 在针对其他致病性mRNA的研究中，动物实验也观察到了10-23脱氧核酶的治疗效果。鉴于基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）在乳腺癌细胞的侵袭和转移中发挥了重要作用，针对其mRNA设计的10-23脱氧核酶AM9D，能抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231内MMP-9的表达，肿瘤的侵袭性降低43%，且对小鼠模型进行瘤内注射可显著减缓肿瘤的生长［113］。VEGF在肿瘤组织中过表达，丰富的血管为肿瘤增殖提供所需的成分，以VEGF受体2（VEGFR2）mRNA为靶设计的10-23脱氧核酶能抑制体外乳腺癌细胞株的生长，对移植瘤裸鼠以瘤内注射的方式给药，能使肿瘤生长抑制率达75%［114］。这两种10-23脱氧核酶对其他含有同样过表达VEGFR2蛋白的肿瘤也具有抑制作用。 早期生长反应因子1（early growth response-1，Egr-1）是微血管内皮细胞生长、新血管形成、肿瘤血管生成和肿瘤生长所依赖的功能蛋白，针对其mRNA设计的10-23脱氧核酶，在小鼠、大鼠和猪等动物模型上观察到了对靶标的下调效应［115］，包括抑制Egr-1过表达的实体瘤生长，瘤内注射可大大缩小小鼠的肿瘤体积［116-117］，还可抑制心肌缺血再灌注损伤时的新内膜形成和自体静脉移植的血管再狭窄［118-119］。所以，针对同一个致病性基因，一种基因治疗方法可治疗多种疾病。这在10-23脱氧核酶的应用研究中已得到了证实和应用。 表1 目前正在临床研究中的10-23脱氧核酶 正如已有动物实验和临床研究结果证实，10-23脱氧核酶作为药物应用于患者，表现出了良好的安全性、耐受性和治疗潜力。在国内已有几个课题组先后应用10-23脱氧核酶针对肿瘤相关基因和几种病毒进行了细胞和动物水平的研究［120-128］。中南大学湘雅医学院利用10-23脱氧核酶进行了鼻咽癌的Ⅰ/Ⅱ期临床试验（随机、双盲、安慰剂对照，2009～2011年），证实其与放疗相结合，可加强放疗的敏感性［129-131］。 3.3.2 脱氧核酶作为基因治疗药物的优势 10-23脱氧核酶以碱基互补的方式结合靶标mRNA的一段序列，具有独特的性质：①进一步的催化裂解反应效率依赖于Mg2+的浓度和识别臂是否完全匹配。与siRNA的脱靶效应相比，具有高度的底物特异性，比反义核酸对错配更敏感，因而脱靶效应和所带来的不良反应也低，具有良好的安全性。②催化反应不依赖于细胞内的细胞器，不同于siRNA，是其内在的结构所赋予的独立的催化机制，因而其结构改造和功能优化不受外界因素的限制，尤其是催化结构域的优化，不受靶标序列的影响。③它结合了内在的催化性质和RNase H-依赖的反义机制，比单纯的反义药物更有效。但其高度保守的催化域含有CpG片段，可能激活TLR-9而产生免疫反应，但迄今已有的体内外实验均未观察到明显的免疫反应和免疫毒性。 3.3.3 10-23脱氧核酶的稳定性修饰 为了提高10-23脱氧核酶在体内应用时的抗酶解稳定性，可将研发反义核酸药物的经验直接应用起来，如硫代磷酸、2′-取代基及LNA等修饰。在催化结构域的某些位点引入硫代和2′-甲氧基［132］，可能对催化结构域的活性带来有利的或不利的影响，这与取代位置有密切的关系［133-134］。因此，提高稳定性的修饰位点主要选择在两端的识别臂部分，事实证明这种修饰方式对于催化活性的影响很小。甚至LNA在识别臂的引入产生了更高的催化活性［135］。对于Dz13，在其3′-端引入3′-翻转的核苷酸，半衰期可从约70 min提高到＞21 h，暴露在血清中至少24～48 h，能保持结构的完整性和有效的抑制作用［136-137］。 3.3.4 10-23脱氧核酶的催化功能优化 10-23脱氧核酶的一个不足之处是对于二价金属离子的依赖性，细胞内Mg2+浓度低是其体内效价低的主要原因。为了提高其催化活性，降低对Mg2+的依赖性，针对它的催化结构域进行了大量的修饰，包括天然碱基的替换［138］、逐个消除碱基［139］、随机引入修饰的碱基等［140］，但都难以达到改善催化结构域的目的。可见，10-23脱氧核酶的催化结构域具有高度保守性。本课题组针对10-23脱氧核酶的催化结构域进行了功能基水平的化学修饰，获得了催化速率提高9倍的新结构［141-142］（图8）。这一新结构仍具有原型结构的优势，它的催化特性不受靶序列的影响，也不对剪切位点的选择性产生影响，仍可与识别臂的稳定性修饰相结合，进一步提高其抗酶解的稳定性，并可与提高转运效率的化学修饰相结合。这个修饰策略为进一步提高10-23脱氧核酶的催化活性提供了一条途径。 图8 用于修饰10-23脱氧核酶和8-17脱氧核酶的部分核苷类似物3.4 小干扰RNA RNA干扰（RNAi）是生物体利用内源性小片段双螺旋RNA和核酸酶的复合物降解外来RNA的防御机制，小片段双螺旋RNA被称为小干扰RNA（siRNA）（图9）［143-144］。当利用siRNA沉默或降解致病性mRNA时，它便是一类新型的核酸药物。目前已成为基因治疗的一大热点［144-145］。 siRNA是内源性功能核酸，因此，通过构建表达体系，在细胞内即时表达和加工来提供是最方便的方法，可避免反复给药［146-147］，但如何终止这个表达体系，和表达体系本身是否带来宿主的基因变异，是其需要谨慎对待的安全性问题，这有赖于表达载体的不断优化［148］。在现有的技术条件下，针对靶标序列设计合成的外源性双螺旋RNA是目前开展siRNA基因治疗研究的主要选择。 合成的siRNA一般含19～21个碱基对，在2个互补序列的3′-端分别外接2个核苷酸，TT或UU。为避免脱靶效应、蛋白质干扰和获得最佳的沉默效率，从靶mRNA选择合适的靶序列或者设计siRNA序列是需要考虑的重要因素。研究者已从大量的实验研究中总结出了一些经验性设计原则，如序列中的G/C比例，避免引起免疫刺激的序列片段，双螺旋两端碱基对的稳定性与沉默效率之间的关系等［149］，还有多种算法用于siRNA的设计［150］。虽已有以上这些经验总结为指导，但仍须以实验的沉默效果和安全性为最终的选择标准。随着对siRNA序列与毒性之间相关性的认识逐步深入，在序列设计和修饰上也能采取一定的措施来减少或避免这样的副作用。如对于腺苷单元的修饰［151］。 图9 真核细胞中RNA干扰过程示意图［144］ 合成siRNA的高效沉默基因的能力使之成为目前最有前景的基因治疗候选药物之一，现已开展了对siRNA的广泛深入的化学修饰［152-153］来优化其成药性，主要表现在以下4个方面。 第一，提高抗酶解稳定性。siRNA的RNA结构在生物介质中的半衰期很短，几分钟到1 h，不足以对靶基因发挥沉默效果，PS-骨架、2′-F、2′-OMe、2′-O-MOE和LNA等是常用的修饰。因为siRNA必须装载到沉默复合物中，因此，这些修饰在siRNA双螺旋中的引入位置和数量都需经过实验来验证。在了解了各个修饰对于siRNA的理化性质和沉默效率的影响后，以组合修饰为主的方式可能达到最佳成药性质［154-155］。 第二，提高沉默效率。为此，已对siRNA双螺旋结构的碱基和核糖单元开展了大量的修饰。核糖部分2′-位的修饰，除了提高稳定性的目的外，还具有改善siRNA沉默效率的可能性，这取决于所引入的取代基及其在序列中所处的位置。将2′-O-benzyl和2′-O-CH2-（4-pyridine）引入到siRNA的反义链，在特定的位点能提高siRNA的体内活性［156］。2′-F修饰可引入到siRNA链上的多个位点，除了提高双螺旋的稳定性和抗核酸酶稳定性，体内外实验表明还改善了siRNA的生物活性，如降低免疫刺激和提高沉默效率［157］。在2′-和4′-位同时引入2个F原子，虽不能提高结合稳定性，但可被沉默复合物所识别，有助于提高siRNA的沉默效率［158］。另外的研究工作表明，siRNA两条链上的碱基修饰也是提高siRNA沉默效率的可能途径［159］；将siRNA末端的外接TT置换为5′-取代的dU，使siRNA活性得到了改善［160］。而且，碱基修饰可与稳定性修饰（磷酸-核糖骨架）相结合以获得更佳性能的siRNA。 调控siRNA的双螺旋稳定性，包括3′-端、5′-端和中间区域的修饰都对RISC复合物的沉默效率有影响，甚至每个碱基对及其稳定性都可能对沉默效率发挥不同的作用，因而不能一概而论稳定性的高低是否有利于siRNA的活性。甚至有研究表明，在siRNA的义链的中间部分以非天然碱基来降低稳定性，却显著提高了siRNA的活性［149］。至于这些修饰如何提高siRNA沉默效率，其机制尚不清楚，关键一点是它们首先能被RISC复合体所容纳，能形成沉默复合物。 第三，降低免疫刺激和脱靶效应等副反应。siRNA的免疫刺激与特殊片段的存在有关，如5′-UGUGU-3′、5′-GUCCUUCAA-3′以及某些二级结构。因此，在靶序列或siRNA序列的选择上，应避免出现这些片段［161］。但由于其免疫激活的机制尚不清楚，所设计的siRNA是否具有免疫刺激反应需通过实验来测定。在siRNA的某些位点引入2′-OMe、2′-F和LNA修饰，具有一定的阻止免疫激活的作用。siRNA的脱靶效应来自两个方面：①siRNA本身对碱基错配有一定的容纳度，②siRNA可能以miRNA沉默机制容纳除核心区外的错配碱基。通过化学修饰提高siRNA对于靶序列结合的特异性和亲和性，是降低脱靶效应的手段之一。据报道，UNA单元无核糖环的限制，碱基的空间取向有了更大的自由度，它在siRNA的多个位点的取代能被沉默复合物所容纳，具有降低脱靶效应的作用［162-163］。 第四，提高siRNA进入细胞的转运效率和靶向性。在以上修饰的基础上，在siRNA末端引入脂溶性基团、靶向分子单元等［164-165］是目前常用的方法。最有实际应用价值的是肝靶向配体分子N-乙酰半乳糖胺（GalNAc），它是肝中表达丰富的唾液酸糖蛋白受体的配体分子，在针对肝部疾病的siRNA药物中得到了成功的应用。 从已有的临床试验结果来看，因为体内疗效低或毒性大，一些siRNA的临床评价终止于Ⅰ期或Ⅱ期。siRNA的靶序列筛选和转运方法可能是进一步优化的关键。美国Alnynam公司走在siRNA药物研发的前列，目前已有siRNA药物在临床试验中显示了良好的治疗效果，成为开辟siRNA药物市场的先锋。 帕替西朗（patisiran，ALN-TTR02）有望成为第一个获批的siRNA药物，该公司计划于2017年年底向美国FDA、2018年向欧盟递交新药审批，其合作者Sanofi Genzyme公司也将向其他国家提出申请。这个siRNA分子针对遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性（hereditary transthyretin amyloidosis，hATTR）引发的多发性神经系统疾病和心肌病［166-167］。正常的转甲状腺素蛋白形成四聚体，以行使其作为甲状腺激素甲状腺素（thyroid hormone thyroxine）和结合视黄醇的视黄醇复合蛋白（retinol-binding protein complexed with retinol）的载体，转铁蛋白基因TTR突变而来的转甲状腺素蛋白发生错误的折叠和聚集，最终形成细胞外的淀粉样蛋白纤维，使肝产生的淀粉样蛋白沉积在外周神经、心和胃肠系统等多种器官和组织中。目前尚无有效的治疗方法。该药在Ⅲ期临床试验中的疗效和安全性达到了预期目的。为进一步改善其肝靶向的新一代siRNA药物ALN-TTRsc02，其连接了多个GalNAc配体分子，在剂量和给药方式上前进了一大步。前者采用脂质体纳米包裹，每3周给药1次；后者则只需皮下给药，每3～6个月1次。 英利西朗（inclisiran，ALN-PCSsc）是一个合成的siRNA，用于降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c），针对的靶标是前蛋白转化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin-kexin type 9，PCSK9）mRNA，采用脂质体包裹的转运方式，正在治疗家族性高胆固醇血症的临床评价阶段。PCSK9是丝氨酸蛋白酶家族的一员，与胆固醇代谢有关，其突变体与肝低密度脂蛋白受体（LDLR）结合，导致其被溶酶体降解。抑制PCSK9在肝中合成，可降低血液循环中PCSK9水平，从而降低LDL-c水平。因此，针对PCSK9 mRNA设计了siRNA药物ALN-PCSsc，采用PS-骨架、2′-OMe和2′-F的组合修饰提高抗酶解稳定性，并一步在3′-端连接3个GalNAc，实现了肝组织的靶向性，结合脂质体包裹递送方式，最终改造成为可皮下注射、长效的药物形式。在前期临床试验中显著降低PCSK9水平和LDL-c的效果，且持续有效时间长达6个月，无严重副作用，尤其是避免了载体的应用。英利西朗的这些特性为其今后实际应用提供了巨大的便利［168-169］。该药即将进入Ⅲ期临床试验。基于这些积极的临床效果，还有一些针对肝病的siRNA药物也在采用GalNAc配体修饰技术［83］。 针对siRNA的修饰种类很多，需要考虑siRNA沉默复合物RISC中的多种蛋白酶的容纳度。siRNA两条链上的不同位点，包括3′-外接的两个单元，尤其是配对区域的各个位点的修饰，与RISC复合物中的蛋白酶识别有密切关系，对于沉默效应的影响各不相同［170］。虽已有一些经验总结，但现在仍然缺乏理性的指导性修饰策略来优化siRNA的沉默效应，在具体的siRNA结构中尚待以实验结果来确定修饰的位点和方式。 siRNA本身的机制研究和技术在不断进步，已发现ssRNA也能发挥沉默效应，并对其进行了多种化学修饰，在3′-端引入2′-OMe或LNA结构，不仅提高抗酶解稳定性，还能改善ss-siRNA的沉默效率［171-172］，其机制和功能优化尚在进一步研究之中。3.5 miRNA 细胞中存在数量巨大的非编码RNA（ncRNA）片段，对转录后的基因表达发挥调控作用，也可能与各种细胞因子、蛋白酶发生相互作用，其结果是激活或抑制了mRNA的翻译，对蛋白分子的表达和功能产生正向或负向调控，从而对细胞生理或病理过程产生影响（图9）［173］。其中最受关注的是约18～22个核苷酸组成的短miRNA。它们与编码蛋白的mRNA 3′-或5′-端的非翻译区以不完全互补方式结合，可调控多个mRNA的翻译抑制或降解，并以这种方式形成一个调控基因表达的网络。因而其失调与许多病理性活动有关，如肿瘤的发生和迁移、心血管疾病、代谢系统疾病和神经系统疾病等［174-175］。尤其与肿瘤有关的miRNA备受关注，有些miRNA的过表达促进肿瘤的发生发展，有些则具有抑制肿瘤发生和迁移的作用。因此，在针对miRNA发展基因治疗药物时，需要辨别其在疾病发生发展过程中的作用，采取抑制合成和封闭致病性miRNA，或补充表达不足的关键miRNA等对策。 对于过表达的病理相关性miRNA，除了筛选小分子来抑制相关蛋白对其前体RNA的加工外，以其为靶标设计的siRNA、反义核酸、脱氧核酶，已达到抑制其作用的效果［176-179］。所设计的抗miRNA（antimiRNA），称为antagomiR，与反义核酸药物有很多相似之处。反义核酸常用的化学修饰都适用于an-tagomiR的优化，包括PS-骨架、2′-F、2′-OMe和2′-MOE取代，以及LNA和PNA等［176-177］。 miR21被公认与肿瘤的发生有关，在多种肿瘤中有高表达，下调多种肿瘤抑制基因的表达，尤其是在结直肠癌的发生发展中有重要作用。针对它的序列组成设计了互补序列，并以LNA进行修饰，得到LNA-anti-miR21，以阳离子脂质体转染到结肠腺癌细胞株LS174T，抑制了细胞生长，降低了细胞的迁移功能［180］。miR27a也与多种肿瘤及其化疗耐药性相关，针对它的2个位点设计的10-23脱氧核酶有效下调miR27a的水平达50%［178］。 miR-122在肝中特异性表达并行使多重功能，调控胆固醇、葡萄糖和铁稳态，参与脂代谢和HCV感染等。可见，它既是一个重要的肿瘤抑制剂，又是HCV复制和翻译的促进剂。因此其本身及其拮抗剂均可作为药物。目前有多种miR-122修饰类似物，也有腺相关病毒表达的miR-122用于治疗低胆固醇血症、肝癌和HCV感染等肝疾病［181］。miR-122类似物的修饰包含2′-OMe、2′-MOE、PS-骨架和LNA，以及连接脂溶性分子等。不过，仍需密切关注这一药物治疗可能给肝功能带来的损伤。 对于需要上调的miRNA，则通过合成的miRNA及其类似物，作为内源miRNA功能的补充。Gilam等［182］的研究发现，miR-96/miR-182通过下调蛋白palladin，减少乳腺癌细胞的浸润和转移。但是miR-96/miR-182的点突变导致其失去与靶mRNA的结合能力而不能下调palladin。采用水凝胶包裹的金纳米载体递送正常的miRNA实现局部给药，可在乳腺癌小鼠体内持续释放miR-96/miR-182，并代替小鼠体内有缺陷的miR-96/miR-182，使肿瘤的侵袭得到明显抑制。在发展miRNA型药物时，化学修饰同样是必不可少的环节，在研究工作中已广泛应用了反义核酸药物成药性优化的修饰方法［183］。 目前已有多个miRNA类似物和抗miRNA处于临床前评价阶段，针对实体瘤、病毒感染和代谢性疾病的治疗，但只有少数进入临床试验阶段。 当miRNA被载入RISC形成沉默复合体时，不同于siRNA只特异性地沉默一个靶基因，它能同时调控多个mRNA表达。miRNA对于靶序列的错配容纳度要比siRNA高得多，与靶mRNA之间只需要核心部分的互补结合，就能产生沉默效应，导致多个mRNA的功能被同时抑制，这可能是miRNA参与多种功能调控的物质基础。但在治疗应用上，miRNA对于靶mRNA的错配容纳度却是造成其脱靶效应的主要原因［184］。另一方面，由于miRNA参与调控体内动态平衡，要确认与疾病相关的关键miRNA，在目前也是很大的挑战。四、转运 核酸药物的转运载体有两大类，分别为病毒载体和非病毒载体。它们各有优势，也各有不足，都已应用于多种核酸药物的研发中。 用于基因治疗的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒和慢病毒，在基因的替代疗法中，将正常的功能基因嵌入病毒载体，高效转运到细胞内，可实现在作用部位的长期表达和供应所需的正常蛋白，达到补充功能蛋白的目的。最近，利用腺相关病毒携带人视网膜色素上皮细胞-特异性蛋白（RPE65）的cDNA，注入到视网膜下腔，转运到视网膜色素细胞内，实现了基因替代治疗。更重要的进展是改造的腺相关病毒载体具有良好的临床实验结果，在不久的将来，这一病毒载体将可能获得美国FDA批准［185-186］，为基因治疗带来一个巨大的飞跃。其他基于RNA的核酸药物也在尝试用病毒载体转运和表达，如siRNA、miRNA等。但在临床治疗过程中，仍需长期观察其安全性。 大部分合成的核酸药物转运是采用非病毒载体。要将合成的核酸药物送达作用位点，需要解决以下几个问题：如何实现核酸药物的组织特异性分布，高效的靶细胞特异性转运，跨越细胞膜，细胞内的内含体逃逸，和在靶序列位点的相互作用。在核酸药物研发的早期阶段，鉴于转运方法和效率的限制，多以浅表器官为靶器官，如眼、肺、内膜、皮肤等部位［187］进行核酸药物的体内外实验研究。随着化学修饰的进步和转运技术的发展，系统给药方式也正在研究中，主要是胃肠外给药、静脉输液或皮下注射。 对核酸药物从给药部位进入循环、从血液到组织、血浆浓度和组织的分布比例、清除途径及细胞内的运行轨迹等进行深入的药代动力学研究表明，其代谢性质与化学修饰方式和转运载体密切相关。动物模型药代动力学研究表明，反义核酸广泛分布到中枢以外的组织中，如肝、肾、脊髓、脂肪和淋巴，尤以肝组织聚集为甚。 如何实现组织的靶向性分布和选择性进入靶细胞，是提高核酸药物效价和降低非靶毒性的重要手段。利用靶细胞上的高表达受体与配体的特异性识别，将配体分子连接到核酸药物上，可大大改善靶向性和提高靶细胞的吸收。转铁蛋白受体在肿瘤细胞上有丰富的表达，将转铁蛋白连接于脂质体纳米，包裹siRNA，可增加siRNA在肿瘤细胞的吸收量和速率。但载体的复杂性和不稳定性需要进一步优化［188］。 近年来，肝细胞上唾液酸糖蛋白受体的配体分子（图10A）GalNAc［189］在反义核酸和siRNA的转运上得到了广泛研究，大大改善了肝靶向转运和肝细胞的吸收效果，效价得到了显著提高，同时减少了在其他组织的分布。该配体分子与核酸药物的连接反应类型，引入的位置和数量，对转运和活性的影响得到了比较深入系统的研究［190-191］。目前有多个siRNA和反义核酸药物分子正在使用这种靶向性修饰，在临床试验中针对肝疾病进行评价。其他小分子配体（如叶酸，图10A）也已应用于靶向转运核酸药物到肝细胞［192］。 图10 改善核酸药物转运效率的化学修饰举例 注：A.靶向基团；B.脂溶性基团；C.核酸药物分子的序列（oligo）与外部基团连接的方式 针对肝外组织和细胞的靶向转运是核酸药物的广谱性面临的挑战，一方面，目前所发现的小分子配体的数量很有限；另一方面，利用抗原-抗体高亲和性和特异性识别的特点，将抗体偶联到核酸药物上，是一种解决办法，但目前还有很多技术问题尚待解决［193］。因此，适配体筛选、载体结构的改进等是目前研究的主要方法。 适配体是一类以高亲和性和特异性结合为筛选标准，针对某个靶标分子，从核酸序列库中筛选出来的核酸序列。靶标分子可以是细胞表面受体蛋白或其他高表达的分子、整个细胞或病毒。理论上，可针对任何药物靶向位点筛选出相应的适配体，作为靶向配体连接到核酸药物骨架上或载体上（图11）。如针对成骨细胞筛选出来的特异性适配体CH6，当连接到脂质体形成靶向性载体时，能将siRNA特异性转运到成骨细胞，发挥预期的沉默效应［194］。 图11 核酸药物的靶向转运结构示意图 注：蓝色代表适配体，粉色代表核酸药物，绿色代表脂溶性基团，灰色代表脂质体纳米粒子，黄色代表连接臂 前列腺-特异性膜抗原（prostate-specific membrane antigen，PSMA）是一个细胞表面受体，广泛表达在前列腺癌细胞和肿瘤血管内皮细胞上，针对这个分子筛选出了RNA适配体A10。将其直接结合siRNA，获得了siRNA的特异性细胞靶向和对靶基因的沉默效果［195］。随后，对siRNA进行化学修饰以优化沉默效应和提高抗酶解稳定性，对适配体进行结构简化，并连接PEG促进转运和稳定性，在前列腺癌小鼠模型体内获得了预期的抑制作用［196］。通过生物素-亲和素识别，将适配体连接siRNA是另一种结合方式，在小鼠体内也观察到了siRNA的有效沉默效应［197］。适配体作为靶向分子还有一个优点，它与核酸药物分子的结合可通过固相合成方法进行共价连接，中间的连接臂可以是天然核酸片段，通过在细胞内的降解，释放出药物分子片段。 在无特异性配体分子介导内吞的情况下，将核酸药物与脂溶性分子形成共价结合物，是目前被广泛应用的一种转运促进策略，在核酸药物分子的末端引入脂溶性分子如硬脂酸、胆固醇、维生素E、二十二碳六烯酸（DHA）等形成共价结合物［198-201］（图10B）。动物水平研究表明，针对神经系统退行性疾病相关mRNA而设计的siRNA，在连接了脂溶性分子胆固醇和DHA后，注入脑室，使siRNA以内吞途径进入细胞，提高了它的透膜效率，改善了药物的稳定性和在脑室内的分布，并有效地沉默了靶mRNA。对于具体的核酸药物分子种类，连接的方式可不同，依实际效果而定。 透膜肽（cell-penetrating peptides，CPP）是一类短肽分子，主要为阳离子性的赖氨酸和精氨酸组成，以非共价的静电相互作用与siRNA形成复合物，作为核酸药物的跨膜助剂或载体［202］。在一些实验研究中观察到CPP对转运效率有贡献。在实际应用前，尚需对透膜肽进行结构和性质优化，降低其毒性，提高其从内含体逃逸的效率［203］。 天然和合成的聚合物载体是转运核酸药物的重要手段之一，它们以纳米尺度的微粒包裹核酸药物分子，所形成的复合物与生物膜发生融合穿透，对药物也起到一定保护作用。根据核酸结构的负电性，最初发展了阳离子脂质体，使其与核酸药物以静电相互作用形成复合物，具有良好的递送效率，但受限于它们的肝毒性和免疫原性，主要用于细胞水平的评价研究中。从阳离子脂质体发展到中性脂质体，如DOPC的应用，则未观察到明显的毒性［204］。用β-1，3-D-葡聚糖靶向巨噬细胞，作为一种有效的经胃转运载体，其包裹的siRNA粒子在小鼠体内有效沉默了肿瘤坏死因子α（TNF-α）［205］。将角鲨烯连接一个阳离子基团，模拟阳离子脂质体，体外实验已验证了其转运siRNA的能力［206］。 目前，脂质体纳米颗粒已用于多个临床试验，有望成为未来核酸药物临床治疗的载体之一。进一步提高脂质体的转运效率并降低其毒性一直是核酸药物研发的关键点之一，如可离子化的脂质体［207］，可生物降解的脂质体等［208］。 天然的聚合物如壳聚糖、葡聚糖、环糊精［209］等也获得了比较成功的应用，应用中的具体问题，如内含体逃逸效率等，促进了对它们的进一步改造。新的可生物降解材料和多种聚合物单元的优势组合等策略是当前的研究热点之一。每一种载体的性能，包括稳定性、靶向性、转运效率、毒性、物理性质、制备的均一性、药物的释放途径及其对核酸药物的效价的影响等，在实际应用中都需要进行评价和优化，最终筛选出具有良好生物相容性的核酸药物递送载体［210-212］。 对于CRISPR/Cas9及后续发展的基因编辑技术的体内转运，与以上功能核酸的转运有所不同［213］。这个技术中需要转运最基本的组合包括核酸酶Cas9和引导序列sgRNA，用于发现目标基因和实施干扰；还需要一个模板DNA用于基因矫正；或一个基因用来插入到被编辑的基因组中；或附加一个sgRNA用于完全消除一个基因或部分基因；要实现靶向转运，还需要进一步附加靶向分子。而且，这个基因编辑技术的多个组分都比较大，一个载体不能装载所有组分。基于此，学者们提出了两大类转运策略：一是利用多个腺病毒和腺相关病毒表达载体转运所有组分，二是将质粒作为表达载体。如一个腺病毒表达Cas9，另一个腺病毒表达sgRNA和供体DNA，针对新生小鼠的基因缺陷设计的CRISPR/Cas9，获得了预期的基因校正效果［214］。在另一项研究中，Cas9以DNA表达质粒、体外转录子或作为重组蛋白结合到核糖核蛋白（RNP）质粒的RNA部分，sgRNA也作为DNA质粒或以体外转录子的方式成为RNP的一部分，这种核糖核蛋白载体是一种非常方便和有效的转运方法［215］。CRISPR/Cas9的转运也用其他质粒进行了评价，并结合显微注射、水压注射、电穿孔等以达到转运的目的［70，216］。这些物理方法具有转运效率高的优点，但可能对细胞和组织造成机械损伤，有的方法操作繁琐，且裸露的核酸药物易于被降解。鉴于这个治疗体系组分的复杂性，将病毒载体和非病毒载体组合起来，是目前研究的主要转运方法［217］。 针对中枢神经系统的特性，其给药方式则是避开血脑屏障采用硬膜内给药，将药物直接注射到围绕脊髓和脑的脑脊液中，获得在中枢神经系统迅速而广泛的分布。这种给药方法为神经系统疾病的基因治疗带来了一条可行的途径。已批准的反义药物证实了这种给药方式的可行性。 为了避免系统给药带来的药物降解和副作用，开发新型给药方式也是一种不错的选择，如应用微型渗透泵将针对c-myc的反义药物直接注射入小鼠肿瘤内，在瘤内的分布达到了治疗浓度［218］。 核酸药物分子经内吞途径进入细胞内，需要从内含体逃逸到胞质或进入胞核，运行到靶序列处发生后续的反应。因此，从内含体逃逸到胞质，免于被溶酶体降解是该阶段需解决的主要问题。除小分子外，利用蜂毒肽及其类似物溶解内含体膜也是一种备选的方案，但目前的研究还未找到一种安全、有效的试剂。五、核酸药物的毒性及对策 核酸药物的毒性主要包括肝毒性和免疫毒性。肝毒性主要表现为肝坏死和转氨酶升高，这与核酸药物分子在肝的高浓度分布有一定关系。这些毒性主要来源于两个方面，一是序列依赖性毒性。某些特殊的片段，如CpG、5′-UGUGU-3′、5′-GUCCUUCAA-3′可与 Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）蛋白发生相互作用，诱导细胞因子和趋化因子的产生；以及核酸片段对于补体系统的激活而产生毒性［219］。因此，在选择靶序列的时候，应当避免出现这样的结构片段。但有些核酸药物可通过化学修饰，如采用在胞嘧啶的5-位引入甲基化和核糖2′-位的修饰来减少免疫反应毒性。毒性来源的第二个方面是基于错配产生的脱靶效应，包括3个来源：①核酸药物分子本身对于错配的敏感性，如siRNA和miRNA对于错配的容纳度，后者只需要在核心种子区域有6～8个互补碱基对，即可对多个序列产生沉默效应。②反义核酸、核酶和脱氧核酶的识别区域对于双螺旋稳定性的要求，则需要在序列的长度与结合亲和性之间达成一个平衡，短的高亲和性序列产生错配的可能性比较大。因此，需要通过化学修饰提高核酸药物本身对于错配的敏感性。需要蛋白酶参与时，筛选对错配敏感的蛋白酶也是减少脱靶效应的一种方法。③合成中出现的失败序列和体内转运过程中被降解的片段，因高度的相似性，也会产生类似的序列-依赖性毒性和脱靶效应等副作用。 转运载体的毒性，也是必须考虑的重要因素。质粒、腺病毒、腺相关病毒和慢病毒等载体，对其安全性的忧虑来自对宿主基因组产生永久干扰的可能性。人工构建的载体，包括合成和天然的聚合物，和药物分子一样，必须满足安全性的要求。六、结语 将表达正常功能蛋白的基因导入细胞，或对有缺陷的基因进行编辑、裁剪或替换或抑制，实现致病基因的长期抑制和正常基因的长期补充，是一种理想的、一劳永逸的治疗方案。虽早在1990年就实现了将表达正常蛋白的基因导入白细胞，利用白细胞的体内表达获得正常的蛋白质功能，但由于表达载体的安全性和复杂性，使这种治疗策略暂时限于少数严重的单基因遗传病。病毒载体显著的优点和缺点是其继续改造优化的动力，第一个腺相关病毒载体有可能在2018年获批。 对于很多疾病的致病基因，体外合成的核酸药物是一种不错的选择。随着分子生物学的发展，人们对疾病相关的基因网络调控和相关功能蛋白会有更多的了解，尤其是各种内源性核酸对于基因转录和表达的自有调控系统，有利于选择关键的致病基因作为基因治疗的靶标和合适的基因治疗方案，包括利用基因编辑技术实施置换或消除致病基因；利用反义核酸剪切或封闭其表达，或调控外显子跳跃和剪接，达到下调或上调功能蛋白表达的目的；采用siRNA和核酶方法降解靶RNA；针对miRNA网络来调控靶RNA的表达。所以，针对一种或一类疾病的相关基因突变，可以有多种候选方法，这是基因治疗的一大优点。 处于临床前和临床试验中的核酸药物先后达到数百种之多，但因核酸结构离成药性要求相去甚远（极性大分子、带多个负电荷、易于被核酸酶降解和被肝肾清除、免疫原性和转运困难等），在研发过程中遭遇了极大的挑战。而化学修饰在核酸药物的成药性优化策略中发挥了巨大作用，并已取得了相当大的成效。在经历了第1代、第2代和第2.5代的进步，获得的一个重要经验是一种化学修饰不可能解决所有问题，多个修饰的组合是最有效的解决途径，也是目前所有核酸药物所采取的修饰方式。当然，核酸药物的种类和作用机制对修饰的方式和位点的选择具有重要意义。 经过近40年的发展，从已成功用于临床治疗的反义药物到充满希望的siRNA药物，核酸药物在化学修饰、转运载体、序列依赖性和非依赖性的药学性质、体内外评价方法等方面积累了丰富的经验。为今后扩大基因治疗范围，开发更多核酸药物提供了理论基础和实践经验。因此，期待中国大力开展核酸药物的基础研究和应用开发，尤其是在核酸药物的创新性优化研究上，取得更多知识产权，在未来核酸基因药物的巨大应用市场研发中占有一席之地。

中国需要进口的创新药⚠️仅产业科普，不构成投资建议。说明：国内创新药快速发展，但罕见病、部分前沿肿瘤、小核酸、复杂自免、神经、心血管遗传病领域，仍大量依赖进口；一部分已经国内获批上市（原研进口），一部分国内还没上市，需要临床急需通道、海南先行区获取。国产有同类在临床，但尚未完成上市。一、肿瘤领域（进口占比高）1、血液肿瘤1. CD38单抗：达雷妥尤单抗、艾沙妥昔单抗（强生）：多发性骨髓瘤核心用药，国产还在临床，一线主流依靠进口。2. 格菲妥单抗（罗氏）双抗：大B细胞淋巴瘤双特异性抗体，国内已获批，国产同靶点还在三期。3. 维奈克拉（艾伯维）：B细胞淋巴瘤/白血病，国内获批，国产同类尚未上市。4. CAR‑T细胞治疗：吉利德Yescarta、诺华Kymriah，国内已经有国产CAR‑T，但部分复发难治亚型仍然依赖进口产品。2、实体瘤1. CDK4/6抑制剂（哌柏西利、瑞波西利）：HR阳性乳腺癌，进口原研，国产部分处于临床后期。2. 佐妥昔单抗（安斯泰来，Claudin18.2单抗）：胃癌一线，全球首个该靶点上市药物，国内多家国产ADC、单抗在三期追赶。3. 艾立布林（卫材）：晚期乳腺癌，合成工艺难度极高，进口为主，国产仿制进度慢。4. 奥希替尼、阿来替尼：肺癌靶向，已经进医保；虽然有国产竞品，但临床上大量使用原研进口版本。二、罕见病用药（国内最大短板，大量依赖进口）罕见病一共7000多种，国内能够自主生产药物很少，大量依靠进口，很多进入临床急需境外新药名单。1. 酶替代疗法ERT戈谢病、法布雷病、庞贝病、黏多糖贮积症；酶蛋白分子大、工艺复杂，绝大多数依靠进口，北海康成等少数国产刚刚起步。代表：阿加糖酶β、维拉苷酶α等。2. 神经纤维瘤病：司美替尼（阿斯利康），国内唯一获批NF1丛状神经纤维瘤药物，进口，暂无国产上市。3. 转甲状腺素蛋白淀粉样变性ATTR：辉瑞口服药，治疗心肌、神经淀粉样变，国内无同类国产药。4. 阵发性睡眠性血红蛋白尿PNH：依库珠单抗（舒立瑞），补体抑制剂，重症PNH、难治重症肌无力，进口；国产补体管线还在临床阶段。5. 遗传性心血管罕见病• 肥厚型心肌病：aficamten（赛诺菲）；家族性高甘油三酯血症siRNA药物plozasiran，siRNA小核酸，国内刚刚获批，暂无国产上市产品。三、自身免疫&神经免疫疾病1. NMOSD视神经脊髓炎、IgG4相关疾病：伊奈利珠单抗（CD19单抗），全球首个IgG4‑RD靶向药，进口，国产同类尚在临床。2. 多发性硬化MS：奥扎莫德、奥瑞利珠单抗；国内MS药物基本以进口为主，国产管线大多临床阶段。3. 重症肌无力：尼卡利单抗、依库珠单抗，难治型患者主要依靠进口生物制剂。4. 银屑病、哮喘：IL‑17、IL‑4R进口原研（司库奇尤单抗等），现在已有国产竞品，但原研仍然占有不小份额。四、小核酸（siRNA）药物，高度依赖进口小核酸生产、递送技术壁垒很高，国内绝大多数siRNA药物还在临床。1. 降甘油三酯plozasiran；ATTR淀粉样变性inotersen；部分遗传性代谢病siRNA。现状：国内圣诺生物等在研，已上市产品几乎全部进口。五、抗病毒、儿科创新药1. RSV长效预防单抗：尼塞韦单抗、克莱罗韦单抗；国产2026年刚获批打破垄断，之前完全进口。2. 巨细胞病毒：马立巴韦，抗耐药CMV，移植患者刚需，进口。六、眼科创新药法瑞西单抗（罗氏）：双抗，用于黄斑水肿、糖尿病视网膜病变，给药间隔长；国内暂无同靶点国产上市，进口原研。七、国产替代进展总结已经实现大量替代PD‑1、EGFR‑TKI、部分IL‑17银屑病单抗；国内多款创新药上市，进口原研份额被挤压。仍然高度依赖进口三大赛道1. 罕见病酶替代疗法、补体药物（蛋白工艺难度极高）2. siRNA小核酸药物（递送系统壁垒）3. 部分血液肿瘤双抗、CD38、CDK4/6等成熟靶点，国产还没走到上市。八、跟踪A股对应国产替代方向1. 罕见病：北海康成（港股）；酶替代、孤儿药研发。2. 小核酸：圣诺生物；siRNA递送平台。3. 血液肿瘤双抗：百利天恒、康诺亚；CD3双抗。4. 补体靶点：恒瑞、科伦；追赶依库珠单抗同类靶点。5. Claudin18.2：康诺亚、礼新医药；对标佐妥昔单抗。 国外创新药授权国内生产/合作模式梳理⚠️产业科普，不构成投资建议国外创新药进入中国，不是简单直接把配方交给国内工厂生产；受MAH上市许可持有人制度约束，分成4种主流合作模式，区分：纯进口、国内仅商业化、技术转移国内生产（地产化）、CDMO委托代工、License‑in完整授权。四大合作模式（核心区分）模式1：仅国内商业化授权，不授权生产（产品依旧海外原装进口）国内企业只拿中国区推广、销售、渠道准入权；原料药、制剂全部海外工厂生产，以进口药报关进入国内；原研外资保留MAH（药品上市许可持有人）、生产、质控、药物警戒全部权利。• 权责：国内公司负责学术推广、进医院、销售；生产技术不转移到国内。• 代表案例：1. 正大天晴×GSK Bepirovirsen乙肝siRNA：GSK为MAH，海外生产，正大天晴负责国内销售分销，不涉及国内生产转移。2. 信达生物×第一三共 奎扎替尼：第一三共负责全部生产供货，信达只做国内独家商业化推广。• A股代表公司：中国生物制药（正大天晴）、信达生物、再鼎医药、云顶新耀。• 特点：落地快，不用建设产线；供应链完全依赖海外工厂，国内不掌握生产工艺。模式2：License‑in完整授权（获得技术，可转移国内生产）国内企业支付首付款+临床/注册里程碑+销售分成，拿到境外药物大中华区完整权益：开发、注册、生产、商业化；原研出让区域知识产权。满足监管后，国内企业可以做技术转移，把生产搬到国内工厂，国内企业成为MAH，产品从进口药转为国内生产药品。注意：生物药一旦MAH转给国内企业，地产化之后，不再保留原研参比制剂身份，监管层面视作国产药。• 典型公司：再鼎医药、复星医药、先声药业。• 例子：再鼎医药从Novartis引进瑞普替尼，拿到完整权益，后期计划国内落地生产。• 风险：技术转移难度大，大分子、酶替代、siRNA工艺壁垒极高，不是拿到授权就一定能顺利本地化生产。模式3：外资委托国内CDMO代工生产（境外MAH不变）外资药企仍然是药品上市持有人，不转让专利和区域权益；只是委托国内CDMO（药明康德、凯莱英等）做原料药DS/制剂DP代工生产，成品一部分运回海外，一部分供应中国市场。本质：就是代加工，国内CDMO只赚加工费，没有销售权益，拿不到药品知识产权。• 细分：1）小分子：原料药国内CDMO合成，制剂海外灌装。2）生物药分段生产：原液DS海外生产，运到国内CDMO做制剂灌装；保护核心原液工艺，国内只做后段工序。• A股CDMO标的：药明康德、凯莱英、康龙化成、九洲药业。模式4：跨国药企自建国内工厂（外资自有产线）外资自己在中国建厂，技术由总部把控，不授权国内第三方企业。• 案例：诺和诺德天津工厂、礼来苏州胰岛素工厂；原液海外生产，国内做制剂灌装生产，属于外资自有产能，不对外授权国内药企掌握完整工艺。关键现实难点：哪些国外创新药很难做到“授权国内生产”1. 酶替代疗法（ERT罕见病药）：蛋白折叠、细胞表达工艺壁垒极高，海外企业不愿意完整转移核心工艺；国内现阶段大多只能“模式1进口销售”，很难实现本土生产。2. siRNA小核酸药物：递送系统是核心秘密；大多只做进口销售，技术转移门槛高。3. 复杂双抗、ADC药物：Payload毒素、偶联工艺属于核心机密，对外完整授权生产案例少。小分子药物相对容易完成技术转移、实现国内地产化。交易关键名词通俗解释1. 首付款：签合同立刻支付。2. 开发里程碑：完成临床Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期、NDA申报、获批上市，分阶段给钱。3. 销售里程碑：产品销售额达到约定规模再付款。4. 特许权使用费（分成royalty）：产品卖出去以后，按销售额百分比持续付给海外原研方。5. 技术转移：把生产工艺、质量控制全套know‑how交付国内，国内可以独立生产同等质量药品。不同模式A股受益主体区分表合作模式 受益A股类型 收益来源 仅商业化授权 创新药企（license‑in） 药品国内销售利润，无生产收益 完整License‑in+技术转移 创新药企（自有产能） 国内生产+销售全部利润，但要付首付、里程碑、分成 外资委托代工 CDMO企业 加工服务费，不分享药品销售利润 外资自建工厂 国内几乎无上市公司受益 外资企业独享 行业现实趋势1. 早期：大量项目是模式1：只拿国内销售权，药品全部进口；快速把海外药引进国内，解决临床急需。2. 当前趋势：政策鼓励地产化，越来越多交易要求后期做技术转移，落地国内生产作为交易条款，但复杂生物药落地周期很长。3. 短板：罕见病酶替代、siRNA，大量项目目前只能停留在“进口销售”阶段，完整生产授权案例很少。跟踪要点1. BD公告仔细阅读：看清是否包含生产权益、技术转移义务，很多license‑in仅仅是商业化，不含生产授权。2. MAH持有人是谁：MAH是境外企业，产品就是进口药；MAH转为境内公司，代表完成国内地产化。3. 技术转移时间表：大分子生物药技术转移普遍需要2‑4年周期。