Vintafolide

蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）可以说是当下极具潜力的新型治疗方式，虽然活性表现亮眼，但目前已报道的分子普遍存在一个明显短板 ——组织特异性不够。 大多数 PROTAC 都要靠招募 E3 连接酶来实现蛋白降解，而这类连接酶家族足足有 600 多个成员，在体内多种组织器官里都广泛表达。即便有些 PROTAC 能通过器官特异性 E3 连接酶，提升对特定细胞的选择性降解，可一旦全身给药，分布不均+潜在脱靶效应，还是会让正常组织里的目标蛋白被 “误杀”，进而引发毒性，大大压缩临床治疗空间。所以，靶向递送已经成了 PROTAC 走向临床的关键一步。 目前，科研人员也开发出了抗体偶联 PROTAC（DACs）来做靶向递送，可这条路同样不好走：分子不稳定、分子量偏大、肿瘤穿透性差等问题，都实实在在影响着治疗效果。 除了抗体，像叶酸、环肽这类小分子配体，在肿瘤成像和治疗里早就得到了临床验证。和抗体比起来，小分子配体结构更小巧，能让PROTAC兼具成本低、肿瘤穿透深、免疫耐受性好等优势。 图1 叶酸靶向的SMDC分子 基于叶酸、iRGD 等配体的小分子-降解剂偶联物（SMDC）也已经被开发出来。这类分子在体外能精准降解癌细胞里的目标蛋白，可一到体内，疗效就大打折扣。核心问题就出在连接键不稳定、体内半衰期太短，PROTAC 很难在肿瘤部位有效聚集，效果自然上不去。类似问题在不少小分子偶联药物里都很常见，比如叶酸偶联药 Vintafolide，就是因为这个原因止步 Ⅲ 期临床。 图2 Vintafolide分子结构及裂解机制 连接子作为 SMDC 的核心部分，需要在循环稳定性和肿瘤部位激活释放之间找到精准平衡。虽然 SMDC 的连接子设计和 DACs 有不少相似之处，但受小分子配体本身化学特性影响，还得额外考虑偶联方式、肾脏清除率、稳定性等关键问题，这部分也急需更系统的研究来优化。 近日，武汉大学的研究团队发表于JMC上的“Small Molecule-Degrader Conjugates: Evaluating theStructure-Activity Relationshipof Linkers to Overcome In VivoBarriers in PROTAC Delivery”探索了SMDC的连接子的结构-活性关系（SAR） 。他们选择cRGD（（靶向肿瘤细胞高表达的 αvβ3 整合素）与高活性BRD4 PROTAC GNE-987（DC50=0.03 nM）构建SMDC，，通过四轮优化设计出兼具长循环、高稳定性、肿瘤精准释放的新型连接子，成功克服 PROTAC 体内递送的多重屏障，实现低剂量下的肿瘤生长抑制，为 PROTAC 的精准化、高效化递送提供了全新解决方案。 连接子优化过程 SMDC1：碳酸酯二硫键连接子 —— 血清不稳定性初显 连接子设计：含二硫键的碳酸酯连接子 效果：虽能通过胞内二硫键还原实现 PROTAC 快速释放，且对肿瘤细胞具有 1000 倍的选择性，但碳酸酯键在小鼠血清中极易被水解，0.5 小时内即大量释放 PROTAC，无法满足体内循环需求。 SMDC2：氨基甲酸酯二硫键连接子 —— 提升血清稳定性 连接子设计：碳酸酯键替换为ADC中经典的氨基甲酸酯键，该键在临床中已被验证具有优异的体内稳定性。 效果：优化后 SMDC2 在小鼠血清中8小时仍保持 70% 以上的完整性，且对正常细胞的细胞毒性显著降低，靶向选择性进一步提升，解决了血清水解的核心问题。 图3 SMDC1及SMDC2的结构 SMDC3：引入CBB延长子 —— 实现长循环与高肿瘤蓄积 连接子设计：针对小分子 SMDC 肾脏快速清除的问题，团队在SMDC2连接子的赖氨酸位点嫁接考马斯亮蓝（CBB） 白蛋白结合延长子。CBB可通过非共价作用与血清白蛋白结合，显著增大SMDC的表观分子量，减缓肾脏清除。 效果：优化后的SMDC3分子量仅3.3 kDa，却将体内半衰期从SMDC2 的 0.7 小时延长至10 小时，血液清除率降低约 70%；同时在 U87MG 肿瘤模型中实现 72 小时以上的持续蓄积，且未丧失肿瘤靶向性，在 αvβ3 整合素阳性肿瘤细胞中仍能高效降解 BRD4，对正常细胞则无明显毒性。 图4 SMDC3结构 SMDC4：组织蛋白酶响应 GGFG 连接子 —— 消除提前泄漏，实现精准释放 连接子设计：SMDC3 性能优异，但二硫键在长期循环中仍会因血清中的硫醇-二硫键交换发生非特异性断裂，导致约23%的 PROTAC 提前泄漏。团队进一步将二硫键替换为FDA 批准 ADC（DS-8201a）中的组织蛋白酶敏感 GGFG 四肽连接子，打造出最终版 SMDC4。 效果：GGFG 连接子在血清中具有极高稳定性，24 小时无明显降解，彻底解决药物提前泄漏问题；且仅在肿瘤细胞内被组织蛋白酶特异性切割，实现 PROTAC 的精准释放。虽因额外的酶切步骤，其体外DC50 略高于 SMDC3，但体内稳定性与释放可控性得到质的提升。 图5 SMDC4的结构 总的来说，这项研究厘清了 SMDC 连接子的核心设计思路：优先选血清稳定的化学键、加白蛋白结合基序拉长体内循环、用肿瘤特异性响应连接子实现精准释放，还巧妙平衡了长循环和肿瘤靶向性，为 PROTAC 靶向递送打造了全新技术范式，开发的连接子模块也很实用，能拓展到多种肿瘤靶点研究中，也为后续 SMDC 的研发和临床转化稳稳打下了基础！ 参考文献：Small Molecule–Degrader Conjugates: Evaluating the Structure–Activity Relationship of Linkers to Overcome In Vivo Barriers in PROTAC Delivery, Shiwei Song, Weina Jing, Lei Peng, Jiaqi Liu, and Wanyi Tai. Journal of Medicinal Chemistry 2025 68 (16), 17323-17338. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.5c00862Chen, H.; Liu, J.; Kaniskan, H. Ü.; Wei, W.; Jin, J. Folate-Guided Protein Degradation by Immunomodulatory Imide Drug-Based Molecular Glues and Proteolysis Targeting Chimeras. J. Med.Chem. 2021, 64 (16), 12273– 12285,  DOI: 10.1021 Dragovich, P. S.; Pillow, T. H.; Blake, R. A.; Sadowsky, J. D.; Adaligil, E.; Adhikari, P.; Bhakta, S.; Blaquiere, N.; Chen, J.; dela Cruz-Chuh, J.Antibody-Mediated Delivery of Chimeric BRD4 Degraders. Part 1: Exploration of Antibody Linker, Payload Loading, and Payload Molecular Properties. J. Med. Chem. 2021, 64 (5), 2534– 2575, DOI: 10.1021/acs.jmedchem.0c01845 Miletić, N.; Weckesser, J.;Mosler, T.;Rathore, R.;Hoffmann, M. E.;Gehrtz, P.;Schlesiger, S.;Hartung, I. V.;Berner, N.;Wilhelm, S.Workflow for E3 Ligase Ligand Validation for PROTAC Development.ACS Chem. Biol.2025,20(2),507–521,  DOI: 10.1021/acschembio.4c00812 我们已经建立了医药交流群，群里有各大著名企业和重点高校的研究人员。大家可以一起讨论医药热点，分享经验，共同进步。想加入的话，扫码或添加小编微信（VX：Moon20240816），拉您进群！ 推文用于传递知识，如因版权等有疑问，请于本文刊发30日内联系医药速览。 原创内容未经授权，禁止转载至其他平台。 ©2021 医药速览 保留所有权利 往期链接 “小小疫苗”养成记 | 医药公司管线盘点  人人学懂免疫学| 人人学懂免疫学（语音版） 综述文章解读 | 文献略读 | 医学科普|医药前沿笔记 PROTAC技术| 抗体药物| 抗体药物偶联-ADC 核酸疫苗 | CAR技术| 化学生物学 温馨提示 医药速览公众号目前已经有近12个交流群（好学，有趣且奔波于医药圈人才聚集于此）。进群请扫描上方二维码，备注“姓名/昵称-企业/高校-具体研究领域/专业”，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。 简单操作即可星标⭐️医药速览，第一时间收到我们的推送 ①点击标题下方“医药速览”   ②至右上角“...”  ③点击“设为星标

-01- 引言 药物偶联物作为一种有前景的肿瘤靶向细胞毒性药物，与经典化疗药物相比，具有更高的治疗指数。传统化疗药物在全身给药后，通常会在健康组织（如肝脏和肠道）中积累，而非优先定位于癌症部位，这种肿瘤靶向效率低下往往阻碍了达到治疗活性且安全的剂量方案。通过利用对肿瘤相关抗原具有特异性的配体来改善化疗药物的治疗窗口，已成为一个极具潜力的方向。 -02- 一、ADC的机制与设计 典型的药物偶联物由三个关键部分组成：递送载体、细胞毒性有效载荷（或称“弹头”）以及连接前两者的连接子。抗体-药物偶联物是目前最常见的药物偶联物类型。常用的细胞毒性有效载荷包括微管蛋白抑制剂（如auristatins和maytansinoids）、拓扑异构酶I抑制剂（如喜树碱衍生物）以及DNA损伤剂（如calicheamicins）。连接子的选择对优化系统稳定性和有效载荷释放至关重要，而药物-抗体比率也会影响偶联物的疗效和安全性。 ADC的作用机制通常基于前药假设，即通过癌细胞的内化作用被激活。ADC的内化可由抗体部分与其靶标的相互作用触发，也可通过抗原非依赖性机制发生。部分ADC被设计为在肿瘤微环境中释放其细胞毒性有效载荷。非内化型ADC具有某些优势，细胞渗透性药物（如MMAE和deruxtecan）的细胞外释放及其从癌细胞中扩散出来，可以启动“旁观者效应”，即抗原阳性和抗原阴性的肿瘤细胞均发生凋亡。尽管某些同时靶向肿瘤细胞和TME上抗原的ADC对表达靶标的肿瘤显示出更高的疗效，但细胞外抗原提供了独特的靶向机会，因为它们通常比细胞靶标表达更丰富且更稳定。尽管靶点表达与肿瘤对药物偶联物的反应之间存在相关性已得到证实，但其对抗原阴性病灶的临床疗效表明，其他作用机制也可能有助于其抗癌功效，包括有效载荷在肿瘤位点外的释放以及Fc介导的癌细胞杀伤。 -03- 二、已获批ADC的发展历程 已获批ADC的演变历程及其监管批准的历史，反映了连接子-有效载荷技术的实质性进步，而非选择了更好的肿瘤相关抗原。 首个ADC是gemtuzumab ozogamicin，于2000年获批用于治疗CD33阳性急性髓系白血病，它通过酸不稳定性连接子将calicheamicin有效载荷与抗体连接。brentuximab vedotin于2011年获批，用于治疗霍奇金淋巴瘤和系统性间变性大细胞淋巴瘤，它使用蛋白酶可切割的二肽连接子来释放微管蛋白抑制剂MMAE。利用曲妥珠单抗的成功，trastuzumab emtansine成为首个靶向实体瘤的ADC，于2013年获批作为HER2阳性乳腺癌的二线治疗。2017年，inotuzumab ozogamicin获批用于CD22阳性复发或难治性急性淋巴细胞白血病，将calicheamicin有效载荷的应用扩展到了Mylotarg最初的适应症之外。 ADC的批准在2019年加速增长，三种关键药物进入市场：trastuzumab deruxtecan、polatuzumab vedotin和enfortumab vedotin。基于抗HER2曲妥珠单抗抗体的Enhertu，通过可切割的四肽连接子递送拓扑异构酶I抑制剂deruxtecan，DAR为8。Polivy基于靶向弥漫性大B细胞淋巴瘤中CD79b的polatuzumab，Padcev基于靶向尿路上皮癌中nectin-4的enfortumab，两者均通过与Adcetris相同的缬氨酸-瓜氨酸蛋白酶可切割连接子递送MMAE有效载荷。 Sacituzumab govitecan于2020年获批用于治疗三阴性乳腺癌，它靶向TROP2，并基于可水解的碳酸酯可切割连接子递送拓扑异构酶I抑制剂SN-38。Loncastuximab tesirine于2021年获批用于复发或难治性DLBCL，它靶向CD19并使用吡咯苯二氮卓有效载荷，是首个获得FDA批准的CD19靶向ADC。同样在2021年获批的tisotumab vedotin是首个被授权用于治疗复发性或转移性宫颈癌的ADC，它靶向组织因子并通过蛋白酶可切割连接子递送MMAE。Mirvetuximab soravtansine于2022年获批用于治疗铂类耐药、高级别浆液性卵巢癌，它靶向叶酸受体-α并通过可切割的二硫键连接子递送微管蛋白抑制剂ravtansine。 在ADC领域中，安全性仍然是一个关键考量因素。常见的副作用可能包括中性粒细胞减少症、周围神经病变和肝毒性，其中眼毒性尤为显著。平台毒性特征的概念指的是不同ADC产品因携带相同的连接子-有效载荷组合而观察到相似的不良事件。例如，Mylotarg的肝毒性和肝窦阻塞综合征的不良反应也见于递送相同calicheamicin有效载荷的Besponsa。基于不具有旁观者效应的有效载荷的ADC产品（如Kadcyla和Blenrep）也观察到全身毒性，这可能是由于完整ADC在健康组织中的摄取，而非系统性的有效载荷释放。连接子化学、DAR优化、小靶向配体的使用以及有效载荷选择方面的进展改善了这些药物的治疗指数，但对不良事件的仔细监测对于在最大化临床获益的同时降低风险仍然至关重要。 -04- 三、连接子-有效载荷模块的选择 ADC的连接子可以是可切割或不可切割的，其在将细胞毒性药物释放到靶细胞内或TME内方面起着关键作用。理想的连接子应在循环中保持稳定，直到药物偶联物在肿瘤部位积累，然后在此时被定量切割，释放出毒性分子。多种连接子已被探索，包括氧化还原敏感型、pH敏感型、水解酶敏感型和蛋白酶敏感型连接子。 传统ADC连接子存在局限性。例如，Adcetris是基于缬氨酸-瓜氨酸可切割连接子的最古老的获批ADC之一。该连接子被描述为在癌细胞中内化后可由组织蛋白酶B切割，但实践中，其他蛋白酶（如羧酸酯酶1C）已被确定为负责激活基于该连接子的药物偶联物。其中一些蛋白酶仅在小鼠中表达，从而混淆了临床前模型中观察到的毒性和疗效的意义。对于新旧ADC在患者中的切割机制，仍有许多需要了解。识别那些真正在癌症部位选择性被激活的连接子，是该领域的主要挑战之一。 新的蛋白酶可切割连接子正在被探索。肿瘤中已鉴定出几种特异性表达的蛋白酶。肿瘤基质富含能够降解健康基质的蛋白酶，这些蛋白酶可被视为药物偶联物中智能连接子的触发因素。例如，基于甘氨酸-脯氨酸的连接子在基于抗体和小分子的构建体中，介导了最高和最选择性的MMAE在肿瘤部位的释放。预计TME中的其他蛋白酶也将适用于诱导有效的连接子切割。 pH敏感型和点击释放型连接子也是研究的方向。Mylotarg是基于pH可切割连接子的获批ADC的一个例子，但其在循环中的稳定性低于基于蛋白酶可切割连接子的其他ADC。能够快速在癌症部位积累的肿瘤靶向分子（如肽和小有机配体），为使用更不稳定的连接子（否则无法用于基于抗体的构建体）开辟了新的机会。点击释放概念由Tagworks公司开创，该公司投资于基于抗体片段的药物偶联物，该片段通过反式环辛烯连接子与药物有效载荷连接。该结构可以通过快速的环加成反应与四嗪反应，同时释放药物有效载荷。虽然这种方法在小鼠中效果良好，但其临床实施可能具有挑战性。 -05- 四、从大到小的药物偶联物 尽管技术取得进展且近期临床成功案例不断，但ADC仍面临某些局限性。ADC通常无法深入渗透到肿瘤肿块中，并可能导致潜在的脱靶组织损伤。小分子配体和肽是IgG抗体的有吸引力的替代品。它们的较低分子量与较短的循环半衰期相关，一方面可能导致总体肿瘤摄取低于IgG抗体，但另一方面改善了向实体瘤的扩散并减少了脱靶毒性。小分子-药物偶联物和肽-药物偶联物的制造成本低于ADC。抗体片段处于小分子和IgG抗体之间，具有相对较短的循环半衰期、良好的肿瘤渗透能力和在疾病部位的较长停留时间。 药物偶联物主要基于大抗体形式开发，大抗体的延长循环半衰期有助于减少给药频率，从而改善患者依从性。然而，IgG抗体的巨大尺寸阻碍了其从血管系统的有效外渗和向实体瘤的渗透。IgG抗体在给药后通常需要5至7天才能达到1:1至10:1的肿瘤-器官比率。在微观层面，免疫球蛋白的分布通常局限于血管周围区域，使得许多肿瘤细胞无法充分暴露于治疗有效载荷。较小的抗体形式，如单链可变片段和纳米抗体，已成为有前景的替代品。这些较小形式通常可容纳一个或两个药物分子，而IgG抗体最多可容纳八个分子。IgG抗体可能更适合与较低效力的细胞毒性药物偶联，而抗体片段可能更适合递送高效力的有效载荷。 环状和双环肽-药物偶联物是ADC的有吸引力的替代品，特别是由于其相对较小的尺寸。将非天然氨基酸纳入并将线性肽环化成环状和双环结构，显著增强了这些药物的靶标结合亲和力和特异性，同时也提高了其对体内蛋白水解的抵抗力。这些肽的紧凑结构允许其快速从血流中外渗并深入渗透到实体瘤中，解决了与传统ADC相关的主要限制之一。然而，定量药代动力学研究表明，双环肽表现出高且持续的肾脏摄取，从而阻止了PDC与可能损害重要排泄结构的有效载荷的应用。靶向成纤维细胞活化蛋白和碳酸酐酶IX的单环肽显示出更好的生物分布特征，肾脏摄取较低。 小分子-药物偶联物（SMDC）是另一重要方向。与较大的配体相比，小配体提供快速的组织渗透，并能在注射后1小时达到≥20:1的肿瘤-器官比率。像抗体片段一样，靶向肿瘤的小分子可以有效地穿过血脑屏障并在脑癌病灶中积累。通常只有几分钟的短循环半衰期，可以通过在疾病部位的长停留时间来抵消，这可以通过使用具有亚纳摩尔解离常数的超高亲和力和选择性配体来实现。例如，vintafolide是一种靶向叶酸受体的小分子，通过二硫键可切割连接子与去乙酰长春碱酰肼偶联，在卵巢癌中进入了III期临床试验。尽管在该试验中失败，但其他报告强调了小配体在性能上超越PDC和ADC的潜力。与较大的生物分子相比，小有机配体可以促进更有效的肿瘤摄取和选择性，前提是适当优化靶抗原、配体亲和力以及连接子-有效载荷组合的选择。 -06- 五、与其他药物类别的联合机会 增强药物偶联物临床获益的一个平行途径是通过与具有正交毒性特征和不同作用机制的治疗方式联合。本节重点介绍与药物偶联物广泛联合的四种最常见的药物类型：免疫治疗药物、放射疗法、常规细胞毒性药物和抗血管生成药物。 与免疫检查点抑制剂的联合是常见策略。某些有效载荷的释放会触发一系列称为免疫原性细胞死亡的事件。该过程涉及应激蛋白的上调、肿瘤抗原的释放以及细胞毒性损伤后抗原呈递细胞的激活，这反过来增强了免疫系统对癌细胞的可见性。免疫治疗药物可以放大免疫细胞的抗肿瘤活性，使其成为药物偶联物的合理联合伙伴。EV-302/KEYNOTE-A39 III期试验将已批准的基于MMAE的药物偶联物Padcev与PD-1阻断剂pembrolizumab联合，用于局部晚期或转移性尿路上皮癌患者，代表了这种联合方法的成功实施。ADC与抗PD-1抗体的联合比常规铂类化疗更有效且更安全。类似的发现已在datopotamab deruxtecan与pembrolizumab联合用于非小细胞肺癌患者中观察到。预计药物偶联物将继续成功地与免疫检查点抑制剂联合。 放射疗法也已被用作与靶向细胞毒药物的正交癌症治疗。基于微管蛋白毒物的ADC已被证明能增强临床前肿瘤模型中的放疗疗效。体内研究表明，必须优化ADC和辐射的给药顺序和时间，以使靶向微管蛋白毒物能够最大化放射敏感性。辐射还可能影响和增强药物偶联物靶标和应激蛋白在肿瘤细胞上的表达，同时改善血管通透性。在患有脑转移的乳腺癌患者中，已报告trastuzumab deruxtecan或trastuzumab emtansine与放疗联合增加了辐射诱导的脑坏死的风险。Kadcyla可能是临床上与放疗联合研究最广泛的药物偶联物。 与化疗和抗血管生成药物的联合也被探索。已批准的ADC通常与化疗药物联合，但并不总是考虑这两种方式之间可能的协同机制。化疗可以影响药物偶联物靶标的表达水平并改变癌细胞周期。通常认为良好的做法是将药物有效载荷与干扰细胞周期不同阶段的化疗药物联合。大型药物偶联物由于与内皮细胞层相关的物理屏障和所谓的抗原结合屏障效应，表现出向实体病灶外渗缓慢。抗血管生成药物可以促进结构和功能异常的肿瘤血管系统的正常化，从而改善灌注、调节TME并降低间质液压力。然而，VEGF也是一种血管通透性因子，其阻断可能阻碍外渗。这一策略已在卵巢癌患者中得到有效实施。促炎蛋白的靶向递送可能达到相同目的。 -07- 结语  药物偶联物通过实现对病变组织的选择性递送，改变了靶向治疗的格局。ADC通过提供一种优先向肿瘤递送细胞毒性药物的方法，彻底改变了癌症化疗。尽管具有选择性，但ADC的靶向特性往往不理想且特征不充分，其在肿瘤组织中积累的能力存在不确定性。 SMDC倾向于比其基于抗体的对应物更均匀、更快速地积累在抗原阳性肿瘤中。SMDC，特别是那些使用超高亲和力配体的，已显示出优异的肿瘤靶向性能。其短循环半衰期减少了全身暴露，预计可减轻脱靶毒性。靶向配体的高亲和力也确保了在肿瘤部位的长时间停留，潜在地减少了对频繁给药的需求。SMDC的释放动力学可以仔细调节，以实现快速或缓慢释放。与ADC类似，SMDC提供了基于连接子设计和偶联小分子药代动力学优化其释放特性的灵活性。 在开始治疗前，使用明智选择的伴随诊断测试来证明ADC的靶向效率，将有助于避免让患者暴露于潜在无效或有害的治疗。肿瘤活检将是评估疾病部位药物水平的最直接方法；然而，此类样本在临床试验中很少可用，使得这些研究难以进行且常常是推测性的。核医学数据辅以质谱分析可以量化循环和肿瘤中偶联到药物的抗体以及释放的细胞毒性有效载荷随时间的变化。虽然这些方法不提供关于实体病灶内微观分布的信息，但关于药物偶联物全身给药后宏观分布的数据可以指导给药策略并优化治疗窗口。 SMDC的开发因早期的临床失败而受阻，例如vintafolide，其中次优的连接子-有效载荷组合可能导致了观察到的疗效不足。SMDC的主要挑战在于高质量小配体的可用性有限。配体发现技术的最新进展，结合改进的药物定位和有效载荷释放量化工具，为更广泛的SMDC进入临床应用铺平了道路。随着这些创新，预计SMDC将在不久的将来成为癌症治疗中一个强大且高度选择性的平台。 随着新的肿瘤靶向分子、连接子-有效载荷模块和联合方式可用于开发未来的药物偶联物，继续研究耐药机制并评估交叉耐药是否会损害基于相同或相似靶标或有效载荷测序药物的能力，将变得非常重要。 参考资料： Past, present and future of drug conjugates for cancer therapy. Nat Cancer. 2025 Sep;6(9):1494-1504.  公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。