Dubermatinib

通信作者：Rolf A. Brekken and Anirban Maitra 第一单位：Department of Internal Medicine, Division of Hematology & Oncology, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA. 发表时间：11 May 2020 摘要 胰腺导管腺癌（PDAC）是西方国家癌症相关死亡的主要原因之一，其治疗选择有限，长期生存率极低。肿瘤性上皮细胞位于致密的基质中，而基质已被证实可通过对癌细胞的直接作用和对肿瘤免疫微环境的间接作用，成为疾病进展的关键调控介质。PDAC基质中的三大核心组分是细胞外基质（ECM）、血管系统和癌症相关成纤维细胞（CAFs）。ECM可作为屏障阻碍药物有效递送至PDAC癌细胞内，过去十年间，研究者们已尝试了多种靶向ECM的治疗策略。肿瘤血管系统是一个复杂的网络，尽管多种抗血管生成药物已在PDAC的后期临床试验中宣告失败，但其他旨在实现血管正常化和肿瘤免疫增敏的血管靶向策略已在临床前模型中展现出应用前景。最后，PDAC中的CAFs与TME内的癌细胞存在活跃的交互作用。肿瘤内CAFs异质性的发现是PDAC CAFs生物学研究的范式转变，其中肌成纤维细胞型和炎症型CAF亚群可能对PDAC进展发挥着截然不同的作用。本篇综述阐述了目前对PDAC基质三大核心组分的认知、其对主流免疫微环境的影响，以及该组分中具有应用前景的治疗靶点。 PDAC是美国癌症相关死亡的第三大原因，其5年总生存率仅为9%，预计2019年将有45750名美国人死于该疾病。全球范围内，2018年新发胰腺癌病例458918例，占全球癌症发病总数的2.5%；胰腺癌相关死亡病例432242例，占全球癌症相关死亡总数的4.5%。 约80%的PDAC患者确诊时已处于局部晚期或转移性阶段，无法接受根治性手术治疗，因此全身治疗成为其主要治疗手段。目前的化疗方案以5-氟尿嘧啶或吉西他滨为基础，在姑息治疗场景下仅能带来数月的生存期获益。过去十年间，这些化疗方案不断优化，已将生存期延长了数月，但除少数罕见情况外，目前FDA尚未批准任何用于PDAC的靶向治疗药物。为加速PDAC患者的合理药物研发，研究者们开展了多项大规模基因表达谱分析和DNA测序研究，以明确PDAC的分子谱。这些研究已识别出肿瘤上皮细胞至少存在两种分子亚型，即所谓的基底样（或鳞状）型，其预后较经典型更差。对肿瘤bulk表达谱数据集的数字反卷积分析也证实，PDAC患者样本中存在活化型和正常型基质特征，其中活化型基质具有独立的不良预后意义，凸显了PDAC基质在疾病发病机制中的作用。对患者-来源肿瘤异种移植模型（PDX）小鼠基质组织的转录组分析，也得到了一致的基质分型结果，发现了PDX相关基质的两种主要亚型。此外，对309例接受PDAC切除术的连续患者进行的基因表达谱分析，验证了肿瘤上皮细胞中基底样型和经典型PDAC亚型的存在，再次证实了PDAC基质在定义PDAC分子谱中的显著作用，确认了相同的“基质活化型”患者分组，并发现了促纤维结缔组织增生型基质亚型。这两种基质亚型患者的总生存期相近，均优于基底分子亚型患者，但差于经典分子亚型患者。 PDAC的肿瘤微环境（TME）由成纤维细胞、内皮细胞、周细胞、神经元、浸润性免疫细胞和ECM蛋白组成。因此，深入理解PDAC基质生物学，对新型治疗药物的研发至关重要。在本篇综述中，研究者们将探讨PDAC基质的三大基本组分：ECM、血管系统和成纤维细胞，阐述目前对这些PDAC基质组分的认知，重点介绍其中潜在的治疗机会。值得注意的是，尽管免疫细胞是TME的重要组成部分，研究者们也会提及核心基质成分对免疫系统的相关相互作用和影响，但对该TME组分的详细探讨不在本篇综述的范围内。 核心要点  • PDAC的TME由ECM蛋白、肿瘤血管、成纤维细胞和免疫细胞组成。 • PDAC中的ECM蛋白可升高肿瘤内压，成为药物有效递送至肿瘤的屏障。基于对PDAC ECM的认知，研究者们已开展了多项临床试验，但迄今为止尚未证实其能改善患者生存期。 • 临床前模型已证实，肿瘤相关血管在PDAC的发病机制中具有重要作用；然而，靶向PDAC血管的临床试验未能延长患者生存期。 • 修剪（pruning）PDAC血管（正常化）可能是一种改善化疗药物递送和宿主抗肿瘤免疫应答的策略。 • 目前已明确胰腺癌CAFs存在多种分子亚型，其中最受关注的是炎症型CAFs和肌成纤维细胞型CAFs，据推测二者分别具有促肿瘤和抗肿瘤特性。 PDAC中的细胞外基质 PDAC中的ECM生物学 PDAC组织学的一个标志性特征是纤维结缔组织增生，这是一种由成纤维细胞过度增殖和ECM沉积引发的纤维化反应，ECM占据了肿瘤体积的绝大部分（图 1）。ECM是由结构蛋白、衔接（adaptor）蛋白、蛋白聚糖（proteoglycans）和酶组成的致密网状结构，存在于所有组织中，为组织稳态提供生化和结构支持。PDAC组织中ECM的沉积显著增加，其中Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原是构成PDAC ECM的主要结构蛋白，而Ⅳ型胶原具有成为术后生存期预测血清生物标志物的潜力。胰腺癌细胞通过旁分泌方式刺激基质成纤维细胞上调胶原（collagen）家族蛋白和纤连蛋白（fibronectin）的表达，从而在肿瘤基质中引发纤维结缔组织增生反应。人类PDAC的原发灶和转移灶均表现出显著的纤维结缔组织增生，且透明质酸、胶原等ECM组分的表达升高。此外，携带不同驱动突变的基因工程小鼠模型（GEMM）也证实，肿瘤上皮细胞可在继发器官位点诱导显著的纤维结缔组织增生基质形成；与KPC GEMM（KrasLSL-G12D/+;Trp53R172H/+; Pdx1Cre/+）肝转移灶中显著的基质促纤维结缔组织增生不同，KPTC小鼠模型（KrasLSL-G12D/+;Trp53LSL-R172H/+;Tgfbr2flox/+; PtflaCre/+）的肝转移灶中基质几乎无促纤维结缔组织增生表现。注：后者在肿瘤上皮细胞中特异性敲除了Tgfbr2（TGF-β受体2），导致肿瘤细胞对TGF-β信号不响应。由于缺乏TGF-β信号驱动，肿瘤细胞无法有效诱导周围基质细胞发生纤维化反应。这些数据证实，强烈的促纤维结缔组织增生反应在PDAC发病机制中具有关键作用，这也使得靶向ECM组分成为PDAC的潜在治疗策略。 图 1 | 增生性反应是人类和小鼠PDAC的一个关键特征。来自KPC基因工程小鼠模型（a）和人类（b）的PDAC组织的H&E染色切片。小鼠和人类PDAC组织均显示出大量纤维化（黑色箭头）与恶性上皮（白色箭头）混合。这种致密的纤维化基质称为增生性反应，主要由大量成纤维细胞和胶原蛋白组成。放大倍数×20。PDAC增生性反应的主要成分示意图（c）显示成纤维细胞、透明质酸增加以及细胞外基质蛋白（主要是胶原蛋白和纤连蛋白）的沉积，这是PDAC增生性反应的标志。 胶原是肿瘤基质中具有生物活性的组分，而不仅仅是结构支架，其对癌细胞的增殖、存活和转移具有直接影响。研究证实，单个ECM组分与PDAC患者的生存期相关。例如，原发性PDAC患者中，基质透明质酸高表达者的中位总生存期为9.3个月，而低表达者为24.3个月。同一项研究还显示，ECMⅠ型胶原高水平者的中位总生存期为6.4个月，而低水平者的中位总生存期更高，为14.6个月。对大型公开基因表达谱数据集的患者按特定胶原（COL1α2、COL2α1和COL4α1）的表达进行分层后发现，这些纤维状胶原高表达患者的总生存期较非高表达患者更差。然而，当以同样的方式分析总胶原水平时并未发现其与患者预后存在相关性，这提示在人类PDAC样本的组织学分析中使用泛胶原检测方法时需谨慎。整合素（integrins）是癌细胞表面表达的一类跨膜受体家族，可介导与ECM蛋白的相互作用，进而影响癌细胞的存活、迁移、侵袭和黏附。其中，β1整合素家族在介导癌细胞与Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、纤连蛋白等多种ECM组分的相互作用中发挥关键作用。在人胰腺癌细胞系中敲除β1整合素，可使原位小鼠模型的肿瘤体积减小、转移能力完全丧失。 ECM作为化疗屏障的作用 研究数据表明，PDAC上皮细胞的基因改变会影响胶原结构和PDAC组织的最终张力。在一项使用PDAC GEMM的临床前研究中，KTC GEMM（KrasLSL-G12D/+;Tgfbr2flox/flox;PtflaCre/+）的基质胶原束较KPC GEMM更粗，且前者与转化生长因子-β（TGFβ）信号缺失、肿瘤上皮中β1整合素和STAT3信号激活相关，最终导致纤维化和组织张力增加。注：①成纤维细胞活化失控：TGF-β是成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的关键调控因子，可通过上调αSMA促进胶原（尤其Ⅰ、Ⅲ型）合成。KTC模型中Tgfbr2缺失虽阻断了经典的SMAD依赖的通路，但会通过代偿机制激活非经典信号（如β1整合素、STAT3通路），反而增强成纤维细胞的胶原分泌能力，导致胶原大量沉积并形成粗大束状结构。②胶原重塑机制受损：正常TGF-β信号可调控MMPs的表达，平衡胶原合成与降解。KTC模型中TGF-β信号缺失使MMPs活性下调，胶原降解减少，而合成持续增强，最终导致胶原纤维不断累积、交联，形成更粗的胶原束。而KPC模型完整的TGF-β信号可通过SMAD2/3磷酸化调控胶原代谢，避免胶原过度交联，因此胶原束更纤细且排列相对松散。另一研究团队发现，在KTC GEMM中使用STAT3小分子抑制剂联合吉西他滨治疗，较吉西他滨单药治疗可显著缩小肿瘤体积、改善模型动物的生存期。该治疗方案并未导致基质胶原耗竭，而是实现了肿瘤基质重塑，改善了吉西他滨在体内的肿瘤递送效率，其机制可能是缓解了基质组织张力。重要的是，在TGFβ-高表达（多存在SMAD4缺失）的低分化PDAC中，邻近上皮病变的胶原纤维直径和组织张力的生化替代标志物水平均高于高分化或中分化肿瘤，这一结果在独立的患者队列中得到了验证。综上，这些研究提出了一个新的观点：基质组织张力受其周围肿瘤的潜在基因特征调控，且这种效应可能对PDAC具有独立的预后意义。 PDAC基质中富含蛋白水解酶，这些酶参与基质重塑过程。研究者们已利用这一特性设计药物递送系统，构建了对基质金属蛋白酶2（MMP2）响应的两亲性肽-磷脂脂质体载体，并负载了吡非尼酮——一种FDA批准用于治疗肺纤维化的抗纤维化药物。将该复合物给予原位接种人类PDAC异种移植物的小鼠后，观察到肿瘤中Ⅰ型胶原、纤连蛋白和腱生蛋白（tenascin）C的蛋白水平显著下降。重要的是，接受该治疗性脂质体处理的肿瘤中，药物穿透性显著提升；与仅接受吉西他滨或吡非尼酮单药治疗的小鼠相比，接受吉西他滨联合负载吡非尼酮的MMP2响应型脂质体治疗的小鼠肿瘤体积显著缩小。另一项研究中，Jain及其同事证实，血管紧张素Ⅱ受体抑制剂氯沙坦可抑制CAFs中Ⅰ型胶原的合成，从而限制乳腺癌、皮肤癌和胰腺癌小鼠模型中的促纤维结缔组织增生反应。这种广泛使用的抗高血压药物可改善治疗性纳米颗粒和化疗药物的间质转运，一项纳入49例患者的早期临床试验显示，其在提高既往不可切除PDAC患者的R0切除率方面展现出良好的前景。综上，这些数据支持在PDAC中采用抗纤维化策略以对抗促纤维结缔组织增生反应、提高化疗药物的肿瘤穿透性。 缓解肿瘤内压以克服PDAC中的ECM屏障。有研究认为，ECM可通过特异性介导TME内间质液压（IFP）升高，损伤血管功能和肿瘤通透性，从而成为化疗药物递送的障碍。在KPC GEMM中，肿瘤的IFP几乎是正常胰腺组织的10倍。正常胰腺组织中存在大量直径＞10 mm的血管，而KPC GEMM的肿瘤中未发现达到该直径阈值的血管，这提示IFP升高可能导致了肿瘤内血管塌陷。透明质酸是PDAC基质中大量存在的基质糖胺聚糖，与IFP升高相关。聚乙二醇化重组人透明质酸酶20（PEGPH20）是经聚乙二醇包裹的透明质酸酶，可延长体内半衰期，降解透明质酸，同时最大限度降低超敏反应发生风险。对荷瘤KC（KrasLSL-G12D/+;PdxCre/+）和KPC小鼠全身给予PEGPH20后，24小时内肿瘤基质中的透明质酸即被耗竭，小鼠模型的肿瘤内IFP下降、血管直径增加。与接受吉西他滨单药治疗的KPC小鼠相比，接受单周期PEGPH20联合吉西他滨治疗的小鼠肿瘤体积显著缩小，这提示IFP降低可增强化疗药物的肿瘤灌注。与单药治疗相比，联合治疗显著降低了转移发生率、延长了模型动物的生存期（吉西他滨组55天，联合组91天；P=0.004）。其他研究团队也重复出了这些发现，证实KPC小鼠肿瘤基质中存在大量透明质酸，体内给予PEGPH20可缓解血管塌陷、增加吉西他滨的肿瘤内递送效率，与吉西他滨单药治疗相比，可使模型动物的生存期近乎翻倍。另有研究团队提出，癌细胞增殖并向ECM传递应力所产生的肿瘤内固体应力，而非IFP，才是TME内压力升高的主要原因，该团队还观察到IFP较Provenzano及其同事的报道低一个数量级。随后的研究发现，两种模型在核心原理上趋于一致，即PDAC中的大部分间质液实际上以凝胶-流体相存在，这是一种不流动的间质液组分，其中含有大量与水紧密结合的透明质酸。这些发现解释了PEGPH20在降低肿瘤总内压和血管塌陷方面的显著获益（图 2a）。 图 2 | PDAC细胞外基质中的治疗靶点。a | 聚乙二醇化重组人透明质酸酶20（PEGPH20）降解透明质酸可降低肿瘤内压，从而改善PDAC基因工程小鼠模型中的化疗药物递送。b | PDAC肿瘤细胞中活化的Rho-相关蛋白激酶（ROCK）可通过上调MMPs导致细胞外基质重塑。这一过程有利于转移并降低微血管密度（MVD），进而导致肿瘤灌注不良和药物递送减少。fasudil是一种小分子ROCK抑制剂，在临床前模型中具有抗PDAC活性。c | 活化的粘着斑激酶（FAK）可减少CD8+ T细胞向PDAC肿瘤微环境的浸润，并增加致密反应，从而阻碍药物向肿瘤的递送。defactinib是一种小分子FAK抑制剂，正在临床评估其与免疫检查点抑制剂联合治疗PDAC的效果。 研究者们开展了一项Ⅰb/Ⅱ期临床试验，评估PEGPH20联合改良版FOLFIRINOX（mFOLFIRINOX）在138例初治转移性PDAC患者中的疗效。出乎意料的是，PEGPH20组出现了不良效应：单纯化疗组的中位总生存期为14.4个月，而化疗联合PEGPH20组仅为7.7个月。重要的是，mFOLFIRINOX联合PEGPH20组中45%的患者出现了治疗相关的严重不良事件，而mFOLFIRINOX单药组仅为9%。因此，随机分配至mFOLFIRINOX单药组的患者接受了中位8个周期的化疗，而PEGPH20组患者仅接受了4个周期。mFOLFIRINOX联合PEGPH20组的毒性增加、治疗时长缩短很可能是该组总生存期更差的重要原因。该研究未将肿瘤透明质酸含量作为入组的必要条件，仅在少数患者中进行了评估，相关数据至今尚未公布。尽管总生存期结果令人失望，但值得注意的是，化疗联合PEGPH20组的55例患者中有4例达到完全缓解，这在晚期PDAC中极为罕见，而单纯化疗组无一例患者达到完全缓解。 研究者们还启动了一项Ⅲ期随机对照试验（RCT），对比吉西他滨联合白蛋白结合型紫杉醇加或不加PEGPH20在转移性PDAC患者中的疗效。这项名为HALO-109-301的研究，将免疫组化证实ECM中透明质酸高水平作为患者入组标准，同时所有受试者均预先接受了血栓预防治疗。遗憾的是，2019年公布的结果显示，该研究未能达到总生存期的主要终点和无进展生存期（PFS）的次要终点。PEGPH20联合化疗组的总生存期为11.2个月，化疗组为11.5个月（HR 1.00，P=0.9692）。按透明质酸染色分层的预后数据目前尚未发表。尽管如此，PEGPH20联合化疗治疗转移性PDAC的多项RCT均宣告失败，最终导致PEGPH20的研发项目终止。 其他的ECM治疗靶点 ECM-来源的能量底物。人类PDAC是一种营养匮乏的肿瘤，与邻近正常胰腺组织相比，其谷氨酰胺、葡萄糖和糖酵解中间产物的水平普遍较低。因此，PDAC细胞具备分解大量胞外蛋白以满足自身氨基酸需求的选择性能力，这一点已通过向荷瘤小鼠给予标记的白蛋白得到证实。具体而言，富含Ⅰ型和Ⅳ型胶原的ECM可为PDAC细胞提供脯氨酸来源，胶原先被降解为肽段，随后进一步被消化为脯氨酸。在葡萄糖和谷氨酰胺受限的条件下，肽段的摄取会增强。脯氨酸被转运至线粒体后，可通过脯氨酸脱氢酶1（PRODH1）转化为谷氨酸，进而进入三羧酸循环并为其供能，在营养受限条件下为PDAC细胞提供丰富的ATP生成来源。当使用PRODH1的竞争性抑制剂deshydroproline（脱氢脯氨酸）阻断脯氨酸降解时，体外实验中观察到PDAC细胞的增殖和存活能力下降。PRODH1敲低实验也证实，体内肿瘤体积显著缩小。这些研究表明，PDAC肿瘤细胞可利用ECM，在营养受限条件下维持正向能量平衡。在此背景下，PRODH1已成为限制PDAC细胞能量适应策略的潜在治疗靶点，研发用于PDAC临床前模型的PRODH1小分子抑制剂具备可行性。 Rho-相关蛋白激酶（Rho-associated protein kinases）。Rho-相关蛋白激酶（ROCK）1和2通过对肌球蛋白（myosin）调节基因的底物-水平磷酸化，调控肌动球蛋白（actomyosin）的收缩性。研究显示，在人类PDAC疾病进展过程中，ROCK2蛋白表达升高，而TCGA数据集显示，ROCK1和ROCK2的mRNA表达升高和/或基因扩增与患者生存期缩短相关。重要的是，在KPC小鼠中条件性表达ROCK，会导致模型动物生存期缩短。ROCK1和ROCK2可通过上调多种MMPs引发基质重塑，直接促进体外胶原基质模型中KPC细胞系的侵袭能力。使用ROCK抑制剂fasudil可改善模型动物的生存期，同时升高组织胶原的替代标志物水平。另一项研究中，在器官型KPC-胶原基质模型中，fasudil联合吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇治疗后，ki67染色水平下降、活化的半胱天冬酶3染色水平升高。对皮下接种KPC肿瘤的小鼠进行活体成像发现，用fasudil对动物进行短暂预处理（启动），可增强吉西他滨或白蛋白结合型紫杉醇的疾病控制效果。这些发现在脾内注射肝转移模型中也得到了验证，接受fasudil预处理并后续接受联合化疗的小鼠，大转移灶数量显著减少。fasudil预处理还可增加原发和转移灶的微血管密度（MVD），这提示增加血管通路可改善化疗药物向肿瘤内的递送。在人类原代PDAC细胞系构建的小鼠模型中，这些数据同样得到了验证，即fasudil预处理后，给予吉西他滨联合白蛋白结合型紫杉醇治疗，可改善模型动物的生存期（图 2b）。目前，尚无FDA批准的fasudil治疗PDAC的相关临床试验。尽管如此，基于这些临床前数据，fasudil仍是一种极具吸引力的药物，且其专利已过期，有望成为一种高性价比的治疗方案。 黏着斑激酶（Focal adhesion kinases）。黏着斑激酶（FAKs）是一类非受体酪氨酸激酶（RTKs），可被包括整合素在内的ECM受体激活。在PDAC中，FAK的激活与ECM硬度相关。具体而言，FAK1已被证实是PDAC促纤维结缔组织增生和免疫抑制性TME形成的核心驱动因子。Jiang及其同事发现，绝大多数人类PDAC上皮细胞中FAK的表达和激活水平均升高，而正常胰腺上皮中几乎无表达。此外，活化的FAK（磷酸化FAK）与细胞毒性T细胞的肿瘤浸润减少、胶原沉积增加和粒细胞浸润高度相关，这些特征与免疫抑制性TME一致。磷酸化FAK1高表达、CD8低表达的人类PDAC肿瘤患者预后较无上述特征的患者显著更差。在KPC小鼠模型中使用FAK小分子抑制剂治疗可减少肿瘤纤维化、疾病进展、转移和浸润性免疫抑制髓系细胞群，最终改善模型动物的生存期。重要的是，FAK抑制剂联合PD-L1和CTLA4抗体治疗，较单一治疗方式更能显著改善模型动物的生存期，且部分小鼠实现了长期存活。目前，一项早期临床试验正在开展，旨在评估FAK小分子抑制剂defactinib在晚期PDAC患者中的最大耐受剂量和总缓解率（图 2c）。以摘要形式公布的早期结果显示，在15例可评估患者中超过半数患者疾病稳定，治疗前后的活检样本对比显示磷酸化FAK水平下降，肿瘤T细胞浸润情况发生改变。扩增队列的进一步数据即将公布。 盘状结构域受体1（Discoidin domain receptor 1）。盘状结构域受体1（DDR1）是PDAC细胞表面表达的一种RTK，可在与TME中的纤维状胶原和Ⅳ型胶原结合后激活。Ⅰ型胶原与PDAC细胞上的DDR1b和α2β1整合素结合后产生的协同信号，可引发E-cadherin向N-cadherin的转化以及上皮-间质转化（EMT），而EMT是PDAC化疗耐药和转移的重要原因。在信号通路层面，Ⅰ型胶原与DDR1结合，可在人类胰腺癌细胞系中促进蛋白酪氨酸激酶2（PYK2）和伪足富集非典型激酶1（PEAK1）的促肿瘤信号传导。DDR1的小分子抑制剂7rh可减弱PYK2和PEAK1信号传导，降低体外癌细胞的迁移能力，同时，在原位模型和KPC小鼠中可显著增强化疗带来的生存获益。胶原介导的DDR1信号传导在胃癌和KRAS突变型肺癌中同样具有重要作用，体内给予7rh可降低这两种恶性肿瘤异种移植模型的疾病负荷。鉴于PDAC中以ECM胶原为特征的显著促纤维结缔组织增生反应，阻断DDR1可能是一种潜在的治疗策略。 综上，PDAC的ECM是癌基质的核心组分，在疾病发病机制和整体临床病程中发挥着关键的调控作用。遗憾的是，尽管临床前数据充分，PDAC治疗中临床研发进展最快的ECM靶向药物PEGPH20最终未能达到临床试验终点。尽管这一失败令人沮丧，但基于前景良好的PDAC临床前模型，ECM中还有多个极具吸引力的治疗靶点目前正处于临床研究阶段。 PDAC相关的血管系统 PDAC中的血管生成生物学 近50年前，Folkman提出假说认为实体恶性肿瘤的生长依赖血管生成，抗血管生成药物具有治疗价值。当时，肿瘤血管生成这一新兴领域引发了极为乐观的预期，并最终推动FDA于2004年批准了靶向血管内皮生长因子（VEGF）A的治疗性单克隆抗体贝伐珠单抗（bevacizumab）用于结直肠癌的治疗。此后，多种抗血管生成疗法获批用于多种癌症的治疗，包括胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、肝细胞癌和多发性骨髓瘤。但遗憾的是，目前尚无任何抗血管生成药物在PDAC中被证实具有临床疗效。 尽管有研究认为人类PDAC肿瘤的基质为乏血供型，但MVD的差异极大，且MVD降低与不良生存期相关、与基质表面积呈负相关。在一项纳入40例手术切除的人类PDAC样本的研究中，67.5%的样本癌上皮中VEGF蛋白表达阳性，且与MVD存在中度相关性，同时VEGF和MVD均为独立的不良预后因素。早期PDAC血管生成相关研究证实，人类PDAC细胞系和手术切除的肿瘤组织可大量产生VEGF。此外，这些体外研究证实，在缺氧条件下，PDAC癌细胞可通过活化的HIF1α和STAT3调控VEGF的产生。另一项纳入55例人类PDAC手术切除标本的研究中，40%的病例存在HIF1α表达，且其与VEGF表达、转移性疾病和MVD呈正相关，与预后呈负相关。人类PDAC细胞系产生的VEGF具有生物学活性，可在体外促进内皮细胞增殖，在免疫缺陷小鼠异种移植模型中促进肿瘤生长。此外，抗VEGF策略可降低原位接种于小鼠的人类PDAC细胞系的生长能力，同时显著降低肿瘤MVD。然而，尽管临床前数据提示血管生成在PDAC中具有重要作用，但抗血管生成药物在PDAC中的临床应用均以失败告终。 靶向PDAC血管系统的临床试验 尽管过去十年间研究者们开展了多项RCT评估抗血管生成治疗在PDAC中的疗效，但目前FDA尚未批准任何用于PDAC治疗的抗血管生成药物。一项Ⅱ期临床试验显示，贝伐珠单抗联合吉西他滨在转移性PDAC患者中可能具有抗肿瘤活性。但随后一项纳入535例晚期PDAC患者的Ⅲ期RCT对比了吉西他滨联合贝伐珠单抗与吉西他滨联合安慰剂的疗效，结果显示该研究未能达到改善总生存期的主要终点。在另一项Ⅲ期RCT中，607例转移性PDAC患者被随机分配接受吉西他滨联合厄洛替尼（erlotinib，一种靶向表皮生长因子受体的RTK抑制剂，也是当时FDA唯一批准的另一种PDAC治疗药物）加用贝伐珠单抗或安慰剂。尽管含贝伐珠单抗组的PFS出现了具有统计学意义的升高，该研究同样未能达到主要终点，两组间总生存期无差异。研究者们还在一项多中心Ⅲ期RCT中评估了VEGF陷阱阿柏西普（aflibercept）联合吉西他滨在转移性PDAC患者中的疗效，但在对427例患者进行预设的无效性分析后该研究提前终止，结果显示吉西他滨联合阿柏西普组与吉西他滨单药组的总生存期和PFS均无差异。另一项大型Ⅲ期RCT纳入了632例晚期PDAC患者，分别接受吉西他滨单药或吉西他滨联合强效泛-VEGFR小分子抑制剂阿昔替尼（axitinib）治疗。该研究未达到总生存期的主要终点，在中期无效性分析后提前终止，进一步打击了PDAC抗血管生成策略的研发信心。多靶点抗血管生成激酶抑制剂索拉非尼（sorafenib）也在一项多中心RCT中进行了评估，结果显示其未能改善患者总生存期。其他血管生成调节药物如来那度胺（lenolidomide）的早期临床试验在PDAC中取得的结果也令人失望，目前已不再推进该适应症的研发。尽管抗血管生成药物在其他实体恶性肿瘤中取得了成功，但其在PDAC中的反复失败意味着若想让这类药物使PDAC患者获益就必须重新审视其应用的理论基础。 PDAC抗血管生成治疗失败的原因解析 在多种体内肿瘤模型中，抗血管生成治疗可导致肿瘤缺氧进而促进化疗耐药、癌症干细胞扩增、侵袭和转移。将人类PDAC细胞系原位接种于小鼠并给予贝伐珠单抗治疗后，肿瘤最终可对抗血管生成治疗产生耐药，并实现快速生长。分离贝伐珠单抗耐药细胞系后发现，与亲代细胞系相比，这些细胞呈现EMT表型，且CXCL1、CXCL3、IL-1β、CCL2、CCL5等多种炎症细胞因子过表达。此外，Aguilera及其同事使用PDAC GEMM发现，长期给予VEGF抗体治疗可诱导缺氧，导致胶原沉积增加、上皮可塑性增强和转移负荷升高。这些肿瘤中的纤维状胶原水平和胶原信号传导均升高，提示VEGF阻断至少部分通过缺氧诱导的胶原生成和信号传导促进PDAC的成瘤性。这些数据帮助研究者们理解了抗血管生成药物在PDAC临床试验中失败的原因：VEGF抑制降低了肿瘤内的MVD，但最终可能导致PDAC出现更具侵袭性的间质样表型，化疗耐药性增强，最终导致治疗失败。既然抗血管生成药物在PDAC中遭遇了全面的临床失败，那么抗血管生成策略在PDAC治疗的未来中究竟还能扮演何种角色？ 抗血管生成治疗作为PDAC血管正常化的策略。肿瘤血管正常化是一个新兴的概念，即通过清除多余的内皮细胞和无功能血管，修剪未成熟、低效的血管，从而实现静脉抗肿瘤药物的稳定递送。其关键在于，血管正常化需要增加血管内皮的周细胞覆盖率，降低血管渗漏性，这一看似矛盾的方式的最终目的是改善肿瘤灌注。相应地，肿瘤氧合水平的提升可抑制癌细胞转移，同时促进其分化。 研究者们已提出多种基于不同分子靶点的血管正常化临床前策略。信号素3A（SEMA3A）是内皮细胞分泌的一种分子，可通过对整合素的负向调控作用促进生理性的血管正常化。其在癌前病变中存在表达，但在肿瘤进展过程中表达缺失，这与疾病晚期肿瘤血管功能异常、结构紊乱的特征一致。在胰腺神经内分泌肿瘤和宫颈癌小鼠模型中，SEMA3A过表达可降低肿瘤组织缺氧，逆转特异性VEGFR2阻断和多激酶靶向抗血管生成药物舒尼替尼（sunitinib）治疗引发的促侵袭表型。遗憾的是，SEMA3A与其受体神经纤毛蛋白1（neuropilin 1）的相互作用可募集促肿瘤巨噬细胞，这无疑是基于SEMA3A的肿瘤血管正常化策略的一大缺陷。为解决这一问题，有研究构建了一种SEMA3A突变体，该突变体不与神经纤毛蛋白1结合，但对SEMA3A的共受体A型丛蛋白（plexin）具有高亲和力。通过与丛蛋白结合，这种新型分子可实现肿瘤血管正常化，抑制转移疾病进展，同时改善吉西他滨在胰腺神经内分泌肿瘤和PDAC小鼠模型中的递送效率。另一项血管正常化策略在PDAC原位小鼠模型中使用了核仁素（nucleolin）的小分子抑制剂，结果显示该药物可增加血管周细胞覆盖率和肿瘤灌注，最终降低肿瘤缺氧、实现有效的肿瘤血管正常化效应。该策略还可增强吉西他滨的肿瘤递送效率，提升抗肿瘤药效。这些分子靶点为临床中实现PDAC肿瘤血管正常化提供了潜在的强效策略，有望改善化疗药物的肿瘤递送，减少肿瘤缺氧引发的PDAC细胞恶性表型增强。 肿瘤正常化带来的另一项重要附加获益是可以让后续临床中使用的更有效的化疗方案发挥更大作用。PDAC的多药联合方案FOLFIRINOX在根治性和转移性场景中较吉西他滨单药治疗可改善患者总生存期。PDAC中的绝大多数抗血管生成临床试验均设计于FOLFIRINOX方案问世之前，当时的首选化疗方案为吉西他滨单药。若成功的肿瘤血管正常化策略能改善药物递送，那么后续使用FOLFIRINOX方案而非吉西他滨单药，有望实现更高的总体缓解率。 肿瘤血管正常化作为PDAC免疫增敏的策略。除了实现更稳定的药物递送、潜在减弱肿瘤缺氧相关EMT外，肿瘤血管正常化已成为促进抗肿瘤免疫应答极具吸引力的方法。体外实验显示，缺氧可通过依赖HIF1α的方式升高人类前列腺癌、乳腺癌细胞以及小鼠黑色素瘤细胞表面的PD-L1蛋白水平。此外，体外缺氧环境可通过调控T细胞共刺激分子和分泌型细胞因子受体的表达抑制人类巨噬细胞向M1型极化，使巨噬细胞向免疫抑制性M2表型转化。此外，在同基因小鼠乳腺癌原位模型中，低剂量（10 mg/kg体重）VEGFR2特异性抗体（DC101）在改善肿瘤血管周细胞覆盖率和血管正常化方面较高剂量（40 mg/kg体重）更具优势。低剂量DC101治疗可使血管周围肿瘤相关巨噬细胞向M1表型极化，最终促进T细胞向肿瘤内浸润。当与全肿瘤细胞疫苗策略联用时，低剂量DC101可降低肿瘤体积，改善小鼠生存期。鉴于PDAC的免疫豁免特性，未来有必要评估低剂量VEGF抑制策略的应用价值。 长期以来，研究者们已经认识到，VEGF配体本身可通过改变肿瘤细胞因子微环境在TME中发挥强效的免疫抑制作用，同时可抑制T细胞和树突状细胞的成熟，这意味着抗VEGF药物可能具有免疫增敏效应。肿瘤血管中VEGF的长期表达可通过下调内皮细胞表面的ICAM和VCAM1黏附分子减少T细胞外渗。为此，在同基因黑色素瘤小鼠模型中给予VEGF抗体治疗可增加过继转移T细胞的肿瘤浸润，改善模型动物的生存期。此外，对公开的乳腺癌基因表达谱数据中的血管生成相关基因进行提取分析后发现，PFS良好和不良的分组中，前者显著富集T细胞相关基因。将人类膀胱癌、乳腺癌、肝癌和卵巢癌的PDXs接种至免疫缺陷小鼠后观察到肿瘤缺氧水平较患者原发肿瘤升高，而在9例PDXs中的7例里过继转移1型辅助性T细胞可逆转这一表型。完整性差、周细胞覆盖少的肿瘤血管可能会限制T细胞向肿瘤部位的迁移，而通过使这些血管正常化可改善T细胞的肿瘤浸润，从而使肿瘤对免疫检查点抑制剂增敏。此外，在PDAC GEMM中将VEGF阻断与环氧合酶2（cyclooxygenase 2）阻断联用可逆转抗VEGF治疗诱导的EMT和胶原沉积。该联合治疗还可改变免疫格局，增加细胞毒性T细胞的肿瘤浸润，同时减少调节性T细胞。因此，通过使肿瘤血管结构正常化、同时减弱VEGF信号传导对T细胞的抑制作用，抗血管生成治疗有望被重新定位为PDAC治疗的免疫增敏方法。 综上，尽管靶向血管生成的策略在PDAC临床试验中均未取得成功，但最新的临床前模型为如何利用肿瘤血管系统治疗PDAC提供了新的视角。以肿瘤血管正常化为手段改善药物的肿瘤递送效率，同时使肿瘤对免疫检查点抑制剂增敏，为PDAC的抗血管策略带来了新的希望（图 3）。 图 3 | PDAC中血管正常化作为治疗策略。PDAC肿瘤微环境具有低效、渗漏的血管，周细胞覆盖不良，这与肿瘤灌注不良导致的缺氧和药物递送效果不佳有关。通过阻断血管内皮生长因子（VEGF）-VEGFR2轴实现肿瘤血管正常化，可改善周细胞覆盖和肿瘤灌注，从而减少缺氧、增加药物递送，并通过白细胞黏附分子ICAM和VCAM的作用促进CD8+ T细胞向肿瘤内迁移。 PDAC中的肿瘤内CAFs CAF的异质性 成纤维细胞是间充质来源的支持细胞，几乎在所有实体器官中大量存在。不同解剖部位的成纤维细胞具有特异性的基因表达谱，这与它们在主要解剖轴上的位置特征高度一致。成纤维细胞通过提供结构支持、分泌可溶性因子和ECM蛋白在调控功能性上皮细胞稳态的机制中发挥关键作用。大量研究表明，在癌症背景下，CAFs并非单纯的旁观者，而是癌症发生、进展和转移过程中的积极参与者。人们普遍认为，PDAC和其他癌种中CAFs的作用是促肿瘤的，这使得靶向CAFs成为一种极具吸引力的治疗策略。但研究者们也逐渐认识到，在PDAC生物学中CAFs的功能远比单一的同质性促肿瘤表型更为复杂。因此，精准解析肿瘤内CAF的异质性对于研发靶向PDAC基质的有效治疗药物至关重要。研究者们利用胰腺星状细胞（PSCs）和KPC小鼠来源的PDAC类器官构建三维体外共培养体系，提出了PDAC CAFs的分子学分类方法。PSCs是存在于正常胰腺腺泡、导管周围和血管周围间隙的成纤维细胞，可表达胶质纤维酸性蛋白，胞内存在脂滴。当PSCs与KPC小鼠来源的类器官直接共培养时，可表达α-平滑肌肌动蛋白（αSMA），呈现肌成纤维细胞样基因表达谱，这类细胞被命名为肌成纤维细胞型CAFs（myCAFs）。相反，当PSCs与KPC小鼠来源的类器官通过半透膜间接共培养时，PSCs不会上调αSMA的表达，反而表达IL-6和多种其他炎症细胞因子，这类细胞被命名为炎症型CAFs（iCAFs）。在人和小鼠PDAC组织中，αSMA蛋白确实在紧邻肿瘤的成纤维细胞中表达，而IL-6-阳性成纤维细胞更多见于远离肿瘤边缘的区域，二者的表达模式互斥。该模型提出，定植的PSCs可分化为两种主要的新型CAF亚群（图 4）。此外，对人类PDAC和导管内乳头状黏液肿瘤（IPMN）样本进行的单细胞RNA测序（scRNAseq）证实了myCAFs和iCAFs基质成纤维细胞群的存在，其中前者表达αSMA，后者表达CXCL12和IL-6。有趣的是，在低级别和高级别IPMN中均不存在iCAFs群体，而高级别IPMN中myCAFs大量存在，这可能反映了机体对晚期癌前病变的保护性应答。 图 4 | 胰腺导管腺癌CAF亚型的免疫组织化学分析。胰腺癌肿瘤微环境中存在不同的肌成纤维细胞癌相关成纤维细胞（CAFs）群体，分别被称为myCAFs和iCAFs，这些细胞已被证实分别位于肿瘤周围和癌上皮细胞的远端位置。该图像是一个处于衰竭状态的基因工程PDAC小鼠模型的图像。血小板-衍生生长因子受体-α（棕色）是iCAFs的标志物，α-平滑肌肌动蛋白（蓝色）是myCAFs的标志物。导管标志物SOX9（红色）用于标记癌上皮细胞。 肿瘤来源的细胞因子直接调控两种CAF分子亚型的生成。具体而言，将PSCs暴露于KPC癌细胞条件培养基或与KPC小鼠来源的类器官间接共培养后，iCAFs表达谱的形成伴随着核p65的快速磷酸化，而p65是核因子-κB（NF-κB）活化的标志物。使用NF-κB小分子抑制剂处理后iCAFs的基因表达谱受到抑制，证实PDAC iCAFs的形成依赖于NF-κB信号传导。此外，用重组IL-1α处理小鼠和人类PSCs可诱导炎症标志物的表达，下调Acta2和Ctgf等肌成纤维细胞相关基因；而用IL-1α-中和抗体处理培养于KPC类器官条件培养基中的PSCs可降低炎症基因的表达。IL-1α可上调PSCs中LIF的表达，进而激活JAK-STAT信号传导、促进iCAF表型的诱导，且该表型可通过STAT3信号传导维持。LIF中和抗体可阻断JAK-STAT活化，而中和粒细胞集落刺激因子或IL-6无法降低JAK-STAT信号传导和iCAF标志物基因的表达。事实上，研究发现，PDAC CAFs产生的IL-6和LIF可通过旁分泌方式作用于胰腺癌细胞，促进EMT表型、化疗耐药、免疫逃逸，并缩短PDAC小鼠模型的生存期。重要的是，PDAC患者血清中的LIF蛋白水平与低分化肿瘤相关，在预测PDAC患者新辅助化疗应答方面其效果优于最常用的PDAC肿瘤标志物CA19-9。这些数据证实，LIF有望成为PDAC疗效预测的血清生物标志物和治疗靶点。相反，myCAFs中SMAD2和SMAD3的磷酸化水平升高是TGFβ信号激活的证据。事实上，免疫荧光检测显示，人类PDAC和KPC小鼠组织的肿瘤周围成纤维细胞中存在αSMA-pSMAD2双-阳性的细胞。体外使用重组TGFβ1处理PSCs可重现myCAFs的特征，同时还可导致IL-1受体（IL-1R）的负向调控、减弱iCAF表型。这些数据阐明了PDAC中myCAFs和iCAFs形成的不同分子机制（图 5）。 图 5 | PADC中的肿瘤内成纤维细胞异质性。在肿瘤微环境中，当驻留的胰腺成纤维细胞分别从胰腺导管腺癌（PDAC）细胞接收到旁分泌和细胞接触信号时，就会产生原发性肿瘤炎症性癌相关成纤维细胞（iCAFs）和抗肿瘤肌成纤维细胞（myCAFs）。肿瘤细胞产生的IL-1α有助于iCAFs的生成，这些细胞会分泌LIF并维持iCAF表型。IL-1β也通过自分泌信号维持iCAF表型。iCAFs可增强一系列炎症性细胞因子的表达，如IL-6和粒细胞集落刺激因子（G-CSF），此外还促进局部胶原蛋白沉积。iCAFs的潜在标志物是血小板衍生生长因子受体-α（PDGFRα）和CXCL12。当IL-1受体（IL-1R）被IL-1配体激活时，IL-1受体相关激酶4（IRAK4）也会被激活，进而导致IKKβ的激活。这些事件使得核因子-κB（NF-κB）从抑制性蛋白质中解脱出来，使其能够转移到细胞核内，在那里它作为一系列炎症基因的转录因子发挥作用从而形成iCAF表型。iCAFs还通过JAK-STAT信号通路进行信号传导。胰腺导管腺癌细胞与肿瘤旁成纤维细胞之间的细胞接触通过转化生长因子-β（TGFβ）信号传导产生myCAFs。myCAFs的潜在标志物是成纤维细胞特异性蛋白1（FSP1）和/或α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）。来自骨髓的间充质干细胞衍生的癌相关成纤维细胞（mscCAFs）在肿瘤微环境中从骨髓中被招募，并产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），从而促进巨噬细胞向免疫抑制表型的极化，并抑制对肿瘤的强效T细胞反应。mscCAFs的CD44、CD49、CD73和CD90呈阳性。最后，表达MHCⅡ类的CAFs（apCAFs）已被证明能够向CD4+ T细胞呈递抗原。Shh，音猬因子。 Tuveson及其团队的另一项研究使用scRNAseq技术分析了多例人类PDAC肿瘤和KPC GEMM中的细胞异质性。这些数据再次证实了小鼠和人类PDAC中iCAFs和myCAFs的存在，更重要的是还发现了另一种潜在的CAF亚型——抗原呈递型CAFs（apCAFs）。apCAFs高表达多种主要组织相容性复合体（MHC）Ⅱ类家族分子，包括CD74，且蛋白水平检测证实其与泛-CAF标志物——平足蛋白（podoplanin）共表达。值得注意的是，该研究的scRNAseq分析提示，apCAFs在转录水平上与iCAFs和myCAFs存在差异。巧合的是，该研究团队此前在包含 KIC（KrasLSL-G12D/+;Cdkn2afl/fl;PtflaCre/+）和KPC GEMM的scRNAseq数据集中已发现富含MHCⅡ类分子的CAF群体。有趣的是，负载卵清蛋白（ovalbumin）肽后，表达MHCⅡ类分子的CAFs可在共培养体系中诱导T细胞表达CD25和CD69。这些关于apCAFs的初步数据开启了一个极具前景的研究方向，（但）仍需进一步分析，明确这种潜在细胞类型无法削弱PDAC免疫豁免特性的原因。 2019年，研究者们对KPP（KrasLSL-G12D;Cdkn2alox/lox;Pdx1Cre/+）小鼠和正常小鼠胰腺中的平足蛋白-阳性基质细胞进行了scRNAseq分析。与既往关于肿瘤内CAF异质性的scRNAseq研究一致，在晚期肿瘤中发现了富含ECM基因的CAF群体（与myCAFs一致）和富含炎症基因的CAF群体（与iCAFs一致）。进一步分析发现，正常小鼠胰腺和早期KPP小鼠中也存在相似的成纤维细胞群体，这些细胞最终会发展为晚期的iCAF和myCAF群体。对这些群体的通路分析结果分别与IL-1和TGFβ信号传导相关。有趣的是，在正常小鼠胰腺中发现了表达间皮素（mesothelin）的成纤维细胞群体，其表达MHCⅡ类基因，且与既往报道的apCAFs聚类紧密。重要的是，该研究团队此前在正常小鼠胰腺中发现的这种间皮素-阳性、富含MHCⅡ类分子的成纤维细胞群体可能是晚期肿瘤中apCAFs的来源。 值得注意的是，CAFs还可影响PDAC癌细胞的异质性。Ting及其团队通过人类PDAC原代细胞系与CAFs的体外直接共培养实验证实，CAFs可促进PDAC细胞向侵袭性和增殖性表型转化。对195例人类PDAC样本（包含近320,000个单细胞）进行的RNA原位杂交高内涵数字成像显示，肿瘤腺体“单元”中侵袭性和增殖性癌细胞的比例存在差异，且与基质丰度差异相关，最终导致不同的临床结局。 iCAFs。大量有力证据表明，iCAFs的促肿瘤特性在PDAC基质生物学中具有核心作用。iCAFs的生物学特征已成为多项正在开展的PDAC临床试验的研究基础（Table 1）。在Tuveson及其团队明确划分PDAC iCAFs和myCAFs之前，研究者们就已注意到多种癌种中CAFs的炎症特性。研究者们对皮肤癌小鼠模型来源的成纤维细胞进行基因表达谱分析，发现了促炎基因特征，而将正常皮肤成纤维细胞培养于皮肤癌细胞条件培养基中时也重现了这一特征，这提示iCAFs生成是一个旁分泌介导的过程。在体内，这些炎性皮肤CAFs可促进肿瘤生长、新生血管形成和巨噬细胞募集。短发夹RNA敲低IKKβ的实验证实，这些CAFs的促肿瘤表型同样依赖于NF-κB信号传导，而这一过程需要IL-1β的旁分泌作用（图 5）。 在PDAC背景下，从KPC小鼠肿瘤中分选的CAFs呈现出包含IL-6和CXCL1的炎症基因表达特征，这与PDAC iCAFs因IL-1α介导的旁分泌作用而出现显著NF-κB信号活化的相关报道一致。此外，与正常人类胰腺成纤维细胞中IL-1受体相关激酶4（IRAK4）较低的磷酸化水平相比，人类PDAC和KPC小鼠肿瘤的CAFs中IRAK4高度活化。CAFs中IRAK4的活化可促进细胞增殖、肿瘤形成，并增强体内基质纤维化。CAF自分泌和肿瘤旁分泌的IL-1β是导致CAFs中IRAK4活化的关键细胞因子。小分子抑制和基因敲低IRAK4或IL-1R可破坏肿瘤基质中的IL-1β-IRAK4正反馈环路，降低肿瘤胶原含量，增强体内肿瘤对吉西他滨的敏感性。IRAK4敲低和药物抑制后，IL-6、IL-8、CXCL2、CXCL5等多种细胞因子的表达均下降，这提示iCAF表型的维持依赖于IRAK4信号传导。组织芯片分析显示，基质IL-1β的表达具有预后意义，低表达者中位生存期为2.6年，而高表达者中位生存期仅1.2年。鉴于大量临床前数据证实IL-1介导的信号传导在iCAFs疾病病理生理学中的作用，目前研究者们正在开展临床试验评估IL-1R阻断联合标准化疗在晚期PDAC中的疗效。同样值得注意的是，鉴于JAK-STAT信号传导在PDAC iCAFs发病机制中的作用，使用JAK抑制剂作为iCAF靶向策略治疗KPC小鼠可降低肿瘤体积和癌细胞增殖，同时增加αSMA阳性成纤维细胞的数量。但遗憾的是，JAK1和JAK2抑制剂芦可替尼（ruxolitinib）在两项针对局部晚期或转移性PDAC患者的Ⅲ期RCT中均未能改善患者总生存期，这意味着需要研发更多靶向促肿瘤iCAF细胞类型的策略。 明确iCAFs的特异性细胞表面标志物有望发现易于成药的靶点。在可诱导KRAS和TP53突变的PDAC模型中，＞70%的基质细胞αSMA阳性，提示在该GEMM中绝大多数CAFs呈现肌成纤维细胞表型。该研究中，血小板衍生生长因子α（PDGFRα）阳性细胞约占基质细胞的一半，其中三分之一为αSMA和PDGFRα双阳性。目前尚不清楚αSMA+PDGFRα+ CAFs具有iCAFs、myCAFs的表型特征还是兼具二者的特性。但对PDGFRα阳性组分进行分选和表达谱分析后发现，与正常小鼠胰腺成纤维细胞相比，其多种细胞因子表达上调，证实该受体是iCAF表型的标志物。血清淀粉样蛋白A3（SAA3）是血清淀粉样蛋白A载脂蛋白家族的成员，在这些促炎CAFs中表达显著上调，且对PDGFRα+ iCAF群体的促肿瘤功能至关重要。野生型iCAFs可在原位小鼠模型中促进肿瘤生长，而敲除SAA3的CAFs可抑制肿瘤生长。但当在肿瘤细胞和CAFs中同时敲低SAA3时，这种抗肿瘤表型消失，这使得SAA3的靶向治疗在实际应用中面临挑战。尽管如此，PDGFRα仍有望成为CAFs的治疗靶点。事实上，目前一项早期临床试验正在开展，旨在评估PDGFRα单克隆抗体奥拉单抗（olaratumab）在转移性PDAC患者中的作用。 对流式-分选的FAP阳性细胞进行RNA测序分析发现，与正常胰腺相比，其肌成纤维细胞相关和炎症相关基因的表达均升高。在KPC小鼠肿瘤中选择性清除FAP阳性细胞后，肿瘤体积以依赖CD4+和CD8+ T细胞的方式缩小。对FAP阳性细胞清除后的KPC小鼠给予PD-L1或CTLA4阻断抗体治疗，肿瘤体积显著缩小。当KPC小鼠接受CXCR4和PD-L1阻断联合治疗时，也观察到肿瘤体积显著缩小。此外，由于FAP阳性成纤维细胞被证实是CXCL12（CXCR4的配体）的主要来源，因此iCAFs可能在抑制抗肿瘤免疫应答中发挥重要作用。此外，Garg及其同事将KPC肿瘤与正常小鼠胰腺成纤维细胞或NF-κB p50亚基敲除（p50-/-）的小鼠胰腺成纤维细胞进行原位共接种。结果显示，与p50-/-成纤维细胞共注射的小鼠肿瘤体积缩小，细胞毒性T细胞的肿瘤浸润增加，模型动物生存期延长。重要的是，研究证实NF-κB可介导与KPC肿瘤细胞共注射的非肿瘤性成纤维细胞分泌CXCL12，而这正是该模型中细胞毒性T细胞被排除在肿瘤外的原因。存在NF-κB信号活化的非肿瘤性胰腺成纤维细胞与已知的iCAFs生物学特征一致，这也为iCAFs在PDAC中介导抗免疫应答提供了另一例证。iCAFs来源的CXCL12是极具吸引力的PDAC免疫增敏潜在靶点。一项Ⅰ/Ⅱ期临床试验正在开展，旨在评估CXCL12抑制剂NOX-A12联合帕博利珠单抗在结直肠癌和胰腺癌中的疗效，主要研究终点为评估治疗前后肿瘤活检样本中免疫细胞浸润的变化。此外，在一项Ⅱ期临床试验中，研究者们将CXCR4抑制剂BL-8040与帕博利珠单抗、5-氟尿嘧啶和亚叶酸钙联合用于一线吉西他滨为基础的化疗进展后的转移性PDAC患者。公布的初步数据显示，15例可评估患者中，4例部分缓解，8例疾病稳定，12例患者实现疾病控制，该研究的总入组目标为40例患者。10例患者报告了严重不良事件，其中2例患者因此终止治疗。随着入组的持续进行，这些早期数据为该疗法带来了谨慎乐观的预期。 IL-6是iCAFs响应恶性上皮细胞的旁分泌信号而分泌的一种炎症细胞因子，可导致STAT3活化，增强体外胰腺上皮内瘤变和PDAC小鼠细胞的侵袭和克隆形成能力。使用抗IL-6R单克隆抗体联合吉西他滨治疗KPC小鼠，可降低癌细胞的STAT3活化，增强肿瘤细胞凋亡，诱导肿瘤消退，最终延长模型动物的生存期。人血清中IL-6水平升高，是PDAC患者发生广泛肝转移的独立危险因素。此外，在KPC GEMM中已证实，PDAC TME中iCAFs来源的IL-6可通过内分泌方式到达肝脏，与肝细胞上的IL-6R结合后诱导STAT3信号传导。后续的STAT3信号传导最终会导致局部免疫抑制性髓系细胞募集增加，肝细胞ECM沉积增多，从而为PDAC肝转移形成转移前微环境。为靶向PDAC中的IL-6信号传导，目前一项纳入140例局部晚期或转移性PDAC患者的临床试验正在开展，患者被随机分配接受吉西他滨联合白蛋白结合型紫杉醇加用IL-6R单克隆抗体托珠单抗（tocilizumab）或单纯化疗。尽管有报道称IL-6抑制可降低免疫缺陷原位小鼠模型的肿瘤生长，但目前已有的IL-6R阻断联合化疗的有限临床数据结果并不理想。 有研究认为CAF-来源的IL-6是PDAC免疫逃逸的重要驱动因素。此外，免疫健全小鼠模型中的其他临床前证据支持将IL-6R阻断作为PDAC检查点抑制的增敏策略。研究证实，IL-6在介导KPC动物的癌症相关恶病质以及GEMM和PDAC患者热量限制期间的肝脏酮体生成受损中发挥核心作用。由此导致的糖皮质激素代偿性升高可引发全身免疫抑制状态，进而导致KPC小鼠免疫治疗失败。此外，研究显示，在未分选的人类PDAC原代CAFs中，IL-6和其他多种促炎基因高表达。在同基因PDAC原位模型中，IL-6和PD-L1联合阻断治疗，以依赖CD8+ T细胞的方式缩小了肿瘤体积。在Kras-Tp53-Brca2驱动的PDAC GEMM中，IL-6-PD-L1联合阻断使中位生存期延长了35%，同时观察到循环中1型辅助性T细胞占总CD4+ T细胞的比例升高、肿瘤内淋巴细胞数量增加。这些数据为PDAC中IL-6和PD-L1双重阻断的进一步临床试验提供了支持，目前已有一项相关临床试验正在开展。 myCAFs。尽管过去人们认为CAFs与肌成纤维细胞是同义词，但现有证据表明，αSMA阳性肌成纤维细胞是一类独特的CAF亚群（myCAFs）。尽管αSMA阳性和阴性CAF群体的差异已引发广泛关注，但此前研究者们已证实，PDAC TME中αSMA阳性CAFs具有抗肿瘤功能。首先，尽管肿瘤来源的音猬因子（sonic hedgehog，Shh）可驱动PDAC中的促纤维结缔组织增生基质反应，但在KPC小鼠中，药物抑制和肿瘤特异性基因敲除Shh可导致原发肿瘤中的基质成纤维细胞耗竭，最终肿瘤分化程度更低、血管更丰富、转移更多，模型动物生存期缩短。在该模型中，所有αSMA阳性CAFs均存在活跃的Shh信号传导，且在癌细胞中基因敲除Shh后，这些细胞被清除，再次证实了旁分泌Shh信号传导与αSMA阳性基质成纤维细胞之间的相关性。除了基因和药物抑制Shh可降低促纤维结缔组织增生反应、缩短动物生存期外，体内给予Shh激动剂可增加基质成纤维细胞数量、降低肿瘤增殖水平。这些数据为既往Shh抑制剂临床试验的失败提供了机制解释，这些试验要么未能改善PFS，甚至与安慰剂相比还缩短了总生存期。与此同时，Özdemir及其同事证实，清除KPC小鼠基质中的αSMA阳性成纤维细胞可导致肿瘤分化差、模型动物生存期缩短。在人类PDAC中，对全肿瘤切片评估发现，肌成纤维细胞含量低也与患者总生存期更差相关。KPC小鼠中肌成纤维细胞清除后肿瘤中成纤维细胞特异性蛋白1（FSP1；也称S100A4）阳性成纤维细胞数量也减少，提示αSMA阳性和FSP1阳性CAF群体存在大量重叠。但FAP阳性CAFs的数量未发生变化，提示这是一类功能不同的CAF群体，很可能是iCAFs（尽管该论文发表时尚未使用这一命名）。尽管既往有研究显示，PDAC中αSMA基质成纤维细胞含量高与患者预后更差相关，但促纤维结缔组织增生基质与患者生存期改善相关。另一项研究显示，低分化人类PDAC肿瘤中αSMA阳性细胞数量减少。综上，这些数据引发了范式的转变，提示部分CAF亚群在PDAC中发挥抑制肿瘤生长的作用。目前，αSMA阳性CAFs介导抗肿瘤表型的具体机制尚不明确。尽管促肿瘤的iCAF亚群富含细胞因子、有望成为治疗靶点，但目前针对抑制肿瘤的myCAF亚群尚无明确的治疗策略。 mscCAFs。已有研究证实，多种实体肿瘤的TME中存在骨髓来源的间充质干细胞（MSCs），但其仅占基质成纤维细胞群体的一小部分。在功能上，在多个乳腺癌细胞系皮下接种的免疫缺陷小鼠模型中，骨髓来源的MSCs以依赖CCL5的方式促进肿瘤转移。研究者们已系统分析了人源和小鼠PDAC微环境中MSCs的存在情况。在手术切除的人类PDAC样本来源的体外培养CAFs中，通过4种已报道的MSC标志物（CD44、CD49a、CD73和CD90）阳性，鉴定出了一小群MSCs。13例患者的CAF培养物中，MSC的中位占比为7.3%，占体外总CAF群体的0.6%-20%，这一结果与新鲜解离肿瘤的检测结果基本一致。在原位小鼠模型中，将人类PDAC细胞与原代MSC来源的CAFs（mscCAFs）共注射，与单独注射癌细胞相比，原发肿瘤体积显著增大（P<0.01）、肝转移发生率升高，同时肿瘤中的胶原沉积增加。与单独注射癌细胞相比，将大量CAFs与PDAC细胞共植入并未导致肿瘤体积和转移显著增加，甚至有肿瘤体积缩小的趋势。研究发现，与大量CAFs相比，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）在mscCAFs中优先表达，且可通过旁分泌方式诱导癌细胞发生EMT和干细胞样表型。敲低mscCAFs中GM-CSF的表达可显著缩小肿瘤体积，消除转移，从而明确了介导mscCAFs促肿瘤作用的关键细胞因子，也发现了一个极具价值的治疗靶点。重要的是，同时发表的两篇论文均提供了证据，证实分泌GM-CSF的mscCAFs可促进巨噬细胞向免疫抑制表型极化。在PDAC GEMM中，研究者们发现GR1+CD11B+巨噬细胞群体可抑制抗原特异性T细胞，而该巨噬细胞群体的形成需要GM-CSF，体内敲低该细胞因子可通过依赖CD8+ T细胞的方式阻断肿瘤发展。第二项研究中，KRAS-突变的胰腺导管上皮是TME中GM-CSF的主要来源，而GM-CSF是募集GR1+CD11B+髓系细胞至肿瘤基质的必需因子。敲除肿瘤上皮中的GM-CSF可通过CD8+ T细胞介导的过程显著缩小肿瘤体积。此外，PDAC患者TME中的GM-CSF水平与不良生存期相关。在人类PDAC中，使用抗CSF1R单克隆抗体卡比鲁单抗（cabiralizumab）阻断CSF1R受体已展现出前景；一项早期临床试验的中期分析，评估了卡比鲁单抗联合PD-1检查点抑制剂纳武利尤单抗（nivolumab）在包括PDAC在内的转移性实体瘤中的疗效，结果显示6个月疾病控制率为13%，客观缓解率为10%。后续需要对患者进行分层，以预测CSF1R-纳武利尤单抗联合治疗的应答者，从而推进后期临床试验。 CAFs中的其他治疗靶点 IGF1和AXL信号传导。PDAC细胞可通过分泌Shh向胰腺CAFs发送信号，增加肌成纤维细胞含量和促纤维结缔组织增生反应。Shh还可上调CAFs分泌胰岛素样生长因子1（IGF1）和GAS6，进而激活其各自的RTK——IGF1受体（IGF1R）和AXL。这些并行的信号通路以非细胞自主的方式汇聚到下游的AKT信号通路。尽管PDAC细胞与Shh活化的CAFs之间的旁分泌信号传导可增强肿瘤细胞的线粒体功能、增殖、非锚定（anchorage-independent）生长和抗凋亡能力，但在异型体外模型中，IGFR-AXL双重药物抑制可逆转所有这些促肿瘤表型，而单独的RTK抑制则没这种效果。值得注意的是，AXL小分子抑制剂已被证实可在PDAC GEMM中增强肿瘤对吉西他滨的敏感性。此外，在KPC原位小鼠模型中发现，CAFs和肿瘤相关巨噬细胞是TME中IGF1的主要来源。使用单克隆抗体阻断IGF1R可显著使肿瘤对吉西他滨增敏，缩小肿瘤体积，增加癌细胞凋亡。免疫组化分析证实，72%的受检PDAC患者肿瘤中磷酸化IGF1R染色水平升高，凸显了这些发现的转化意义。此外，人原代CAF培养物可分泌更多的IGF1和肝细胞生长因子，后者可导致Src活化。活化的IGF1R和Src进而使转移驱动因子膜联蛋白A2（annexin A2）发生磷酸化。在KPC GEMM和原位小鼠模型中，Shh和肝细胞生长因子的双重药物抑制可降低基质αSMA含量，增加肿瘤E-钙粘蛋白（E-cadherin）表达。该双靶点策略可缩小肿瘤体积、降低转移发生率，而单药治疗未显示出疗效。鉴于已充分证实myCAFs在PDAC中具有抗肿瘤功能，因此应避免将靶向myCAFs和/或Shh作为降低PDAC TME中IGF1生成的策略。因此，更优的选择是阻断IGF信号传导，同时避免上游靶向Shh驱动的myCAF表型。此外，几乎没有证据表明IGF1由myCAF群体产生，相反，scRNAseq数据显示iCAF群体是TME中IGF1的主要表达者，这进一步证实了iCAFs和myCAFs分别为促肿瘤和抗肿瘤细胞类型的特征。 评估IGF1R阻断在PDAC中疗效的最大规模临床研究，纳入了800例初治转移性PDAC患者，随机分配接受吉西他滨联合安慰剂或吉西他滨联合加尼妥单抗（ganitumab，一种全人源化抗IGF1R单克隆抗体）治疗。该研究未达到总生存期的主要终点和PFS的次要终点，在预设的无效性分析后提前终止。 在另一项研究中，研究者们开展了一项随机、安慰剂对照的Ⅱ期临床试验，纳入88例转移性PDAC患者，评估IGF1R和ERBB3双特异性抗体istiratumab联合吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇的疗效。该研究同样未能达到其共同主要终点，即高IGF1水平患者的PFS改善，以及同时具备高血清IGF1水平和肿瘤调蛋白（heregulin，ERBB3的配体）阳性患者的PFS改善。抗体治疗组的客观缓解率和总生存期也未显示出改善。IGF1的临床前药理学数据提示PDAC中单通路抑制可能失败。此外，尽管两项人类PDAC IGF1临床试验中采用了与表皮生长因子受体家族阻断的联合治疗，但临床前研究并不支持该联合方案。然而，使用AXL抑制剂联合IGF轴阻断的双重抑制策略具有明确的机制理论基础（图 6a）。AXL抑制剂已进入包括PDAC在内的多种实体恶性肿瘤的临床试验阶段，因此可以合理地在早期临床试验中与IGF1R抑制剂联合使用，并检测肿瘤中的磷酸化IGF1R和AXL用作富集生物标志物。 维生素D受体。对人类PDAC CAFs的基因表达谱分析显示，与正常胰腺成纤维细胞相比，其脂肪酸结合蛋白等脂质储存基因表达下调，而人和小鼠CAFs均高表达维生素D受体蛋白。体外用强效维生素D类似物钙泊三醇（calcipotriol）处理人CAFs可使绝大多数样本中形成脂滴，同时降低αSMA的表达。CAFs的条件培养基可诱导人类PDAC细胞系中多个与存活、EMT和化疗耐药相关的促肿瘤基因表达，而当CAFs经钙泊三醇预处理后，该效应可被消除（图 6b）。在KPC GEMM中，钙泊三醇联合吉西他滨可降低促纤维结缔组织增生反应和肿瘤体积，同时增加MVD和吉西他滨的肿瘤内蓄积，最终使模型动物的中位生存期延长57%。此外，miR-10a-5p被发现是人CAF来源外泌体中含量最高的微小RNA，且与CAFs的旁分泌促肿瘤效应相关。用维生素D处理CAFs可显著降低含miR10a-5p外泌体的释放，这阐明了维生素D在PDAC中发挥抗肿瘤作用的重要机制。事实上，此前已有研究证实，在斑马鱼异种移植模型中miR-10a可通过抑制HOXB1和HOXB3转录因子促进人类PDAC细胞系的转移行为。这些临床前数据为高剂量维生素D联合化疗治疗PDAC的人体临床试验提供了有力的理论依据。此外，鉴于维生素D处理CAFs可降低PDAC细胞系中GM-CSF的表达以及该细胞因子在PDAC微环境中促进髓系来源抑制细胞的作用，将维生素D治疗与检查点阻断策略联合用于PDAC也具备充分的机制理论基础。在一项前瞻性RCT的回顾性分析中，256例PDAC患者中77%的患者血清25-羟维生素D水平偏低，但维生素D水平与化疗应答或生存期无相关性。目前，旨在评估高剂量维生素D对接受根治性切除术的PDAC患者疗效的前瞻性探索性临床试验正在开展。此外，一项纳入10例转移性PDAC患者的早期临床试验数据显示，患者接受纳武利尤单抗、白蛋白结合型紫杉醇、帕立骨化醇（paricalcitol）、顺铂和吉西他滨治疗后，10例患者中有8例达到部分缓解。这些令人鼓舞的结果正在扩大的患者队列中进行进一步验证。 图 6 | PDAC胶质细胞中的治疗靶点。a | 胰腺导管腺癌（PDAC）肿瘤细胞的侵袭和转移行为可由胰岛素样生长因子1（IGF1）受体（IGF1R）和AXL的信号传导所导致。关于IGF1R阻断的临床数据并不理想，尽管临床前数据表明双重阻断GAS6-AXL和IGF1-IGF1R有可能具有一定的价值。目前一种名为TP-0903的小分子AXL抑制剂已进入晚期PDAC的临床试验阶段。b | PDAC肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）维生素D受体（VDR）的表达增加，而脂质储存基因的表达降低。当用钙泊三醇（一种维生素D的合成形式）处理这些CAFs时，可增加其脂质储存基因的表达，并抑制上皮-间质转化（EMT）、化疗耐药性和髓源性抑制细胞（MDSCs）的作用。多项临床试验正在进行，以评估维生素D治疗在PDAC中的益处。c | 维甲酸信号传导。当用全反式维甲酸（ATRA）处理PDAC CAFs时，后者可转变为脂质储存表型，抑制癌细胞的β-连环蛋白核定位和侵袭。ATRA正在一项针对局部晚期或转移性胰腺导管腺癌（PDAC）患者的临床试验中进行测试。 全反式维甲酸的再利用。全反式维甲酸（ATRA）是一种维生素A衍生物，是急性早幼粒细胞白血病根治性治疗的核心药物，其作用机制是诱导白血病细胞终末分化。目前该药物尚无实体肿瘤适应症，但多个研究团队已探索将ATRA再利用于PDAC治疗。在胶原基质三维培养模型中，用ATRA处理PSCs可显著降低PSCs介导的胰腺癌细胞系的基质侵袭能力。体外实验中，ATRA处理可降低胰腺PSCs对TGFβ结合蛋白（潜伏性TGFβ结合蛋白1；LTBP1）的机械性组装，进而减少TGFβ的释放。可利用的TGFβ配体减少很可能是PSCs呈现失活、静息表型的原因。向KPC小鼠给予ATRA可使PSCs进入静息状态、降低其迁移能力、减少Wnt旁分泌信号传导，从而为邻近癌细胞的侵袭建立屏障。相应地，癌细胞的增殖能力和β-catenin核定位降低，而恢复PSCs与癌细胞之间的Wnt旁分泌环路后，该效应可被逆转。值得注意的是，单独用ATRA处理癌细胞对其体外增殖无影响，这提示ATRA治疗通过干扰PDAC中CAFs与癌细胞之间的异常相互作用发挥效应（图 6c）。在KPC小鼠中将ATRA与吉西他滨联合使用可显著增加癌细胞凋亡、缩小肿瘤体积、抑制EMT，其中涉及Wnt、成纤维细胞生长因子和Shh等多条信号通路。综上，这些数据为一项已完成的单臂Ⅰ期临床试验提供了机制基础，该试验在28例局部晚期或转移性PDAC患者中评估了标准方案吉西他滨联合白蛋白结合型紫杉醇加用ATRA的疗效。该三药方案安全性和耐受性良好，探索性分析显示其中位生存期为11.66个月，而吉西他滨联合白蛋白结合型紫杉醇的历史对照为8.5个月。目前，研究者们正计划开展一项随机Ⅱ期临床试验，对比吉西他滨联合白蛋白结合型紫杉醇加或不加ATRA的疗效。 展望 为PDAC患者研发新型治疗药物是一项长期且极具挑战的工作。本篇综述阐述了多项转化研究的失败案例，同时也介绍了目前正在开展的临床试验，这些试验旨在探索PDAC基质生物学的多个方面，以寻求治疗获益（图 2、图 6 和Table 1）。鉴于美国临床试验入组率较低，必须基于可靠的临床前数据启动临床试验以最大化成功的可能性。许多PDAC临床试验均未在GEMM或原位PDX模型中进行临床前建模，而这些模型较使用了数十年的商业化PDAC细胞系能更真实地模拟人类疾病。事实上，早期PDAC血管生成的临床前研究均使用了商业化PDAC细胞系小鼠异种移植模型，尽管体内结果令人印象深刻，但临床试验却反复得到阴性结果。此外，随着肿瘤免疫治疗管线的不断扩充，利用具有免疫活性的GEMM（或人源化PDX模型）验证抗肿瘤表型和机制也将变得至关重要。此外，患者来源的PDAC类器官培养技术在预测治疗应答和模拟肿瘤-基质相互作用方面已展现出前景，尽管该平台的预测能力仍需在前瞻性临床试验中进行验证。此外，对基质细胞异质性的关键新认知将助力实现特定基质细胞群体的精准靶向（例如靶向iCAFs或mscCAFs而非myCAFs）。此外，前瞻性地使用目标基质靶点的血清或组织生物标志物有望成为优化患者选择、提高临床试验成功率的有效策略。 结论 PDAC基质是由多种细胞和非细胞组分构成的复杂体系，在PDAC的发病机制中发挥着核心作用。目前，研究者们对PDAC基质的认知已取得重大进展，尽管尚无获批的基质靶向治疗药物，但多种候选药物正处于临床前或临床研发阶段。PEGPH20临床研发项目的令人失望的结果凸显了临床转化中的一个关键问题：尽管靶点在临床前模型中已得到充分表征，但实验性治疗药物的毒性可能影响标准化疗的给药（尤其FOLFIRINOX联合治疗试验中）。此外，尽管既往PDAC抗血管生成临床试验的失败可能引发顾虑，但将PDAC抗血管生成策略重新定位于血管正常化和肿瘤免疫增敏具备充分的机制理论基础，应在未来的临床试验中进行探索。最后，对PDAC CAFs肿瘤内异质性的深入认知是推动CAF靶向药物进入临床试验的根本性进展，其中iCAFs以及潜在的mscCAFs群体是极具吸引力的治疗靶点。