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题目：Establishment of a Bernard-Soulier syndrome model in zebrafish 原文链接:https://haematologica.org/article/view/haematol.2021.278893 期刊：Haematologica 摘要 血小板在血栓形成和止血过程中发挥关键作用。止血异常可导致自发性出血或创伤后严重出血。伯纳德-苏里耶综合征（BSS）是一种罕见的遗传性出血性疾病，由GPIb-IX-V复合物完全数量性缺乏引起。GP9基因的多种突变会导致BSS的临床表现。阐明GP9在血小板生成中的作用及潜在机制，并建立合适的BSS动物模型，对于理解该疾病的发病机制、改善其诊疗具有重要意义。本研究利用CRISPR-Cas9技术构建了斑马鱼gp9SMU15突变体，以模拟人类BSS。斑马鱼gp9基因的破坏会导致血小板减少、明显的出血倾向，以及祖细胞异常扩增。\(gpgSMU/5\)斑马鱼可作为BSS动物模型，因为GP9在血小板生成中的作用从斑马鱼到哺乳动物具有高度保守性。利用该BSS模型，我们通过体内功能实验验证了临床GP9突变，并检测了临床药物提升血小板数量的效果。因此，遗传性BSS斑马鱼模型可为体内验证意义不明的患者来源GP9变异体、开发BSS潜在治疗策略提供助力。 引言 血小板在血栓形成和止血过程中发挥着关键作用。血小板无细胞核，是哺乳动物血液中体积最小的有形成分，由巨大的多倍体前体细胞——巨核细胞生成。巨核细胞由造血部位（骨髓、卵黄囊、胎肝和脾脏）的造血干细胞分化而来。 学界公认，造血干细胞首先分化产生巨核细胞-红细胞祖细胞，这些祖细胞进一步定向分化为红系和巨核系细胞。 在血小板生成过程中，巨核细胞由定向分化的巨核系前体细胞发育而来，经历数次内倍体分裂周期形成多倍体细胞，并以细胞碎片的形式将血小板释放到血液循环中。当血管破裂时，黏附的血小板被激活并启动血小板聚集过程，循环中的血小板黏附于血管内皮下结构的不同成分，从而实现止血。 功能性血小板需要一系列血小板膜受体的正常表达，因为这些受体对血小板黏附至关重要，使其能够在受损血管壁处形成血凝块，并触发跨膜信号传导，最终引发细胞聚集与活化。糖蛋白 Ib‑IX‑V 复合物（GPIb‑IX‑V）表达于血小板和巨核细胞，属于富含亮氨酸重复序列的膜蛋白家族。该复合物包含 4 种不同的跨膜多肽亚基，其中“GPIbα、GPIbβ 和 GPIX”是该受体高效生物合成所必需的，而GPV与复合物的结合相对松散。当血管破裂发生出血时，GPIb‑IX‑V 复合物介导血小板黏附于血管壁损伤部位，并激活血小板。 伯纳德-苏里耶综合征（BSS）是一种罕见的常染色体隐性遗传性出血性疾病，也被称为出血性血小板营养不良症，由膜GPIb-IX-V复合物的数量或质量缺陷引起。该综合征的特征为血小板减少、血小板体积巨大且对瑞斯托霉素无血小板聚集反应，以及多种可能危及生命的黏膜皮肤出血性疾病。BSS患者中已发现GP1BA（GPIbα）、GP1BB（GPIbβ）和GP9（GPIX）基因的突变一项针对 211 个伯纳德‑索利耶综合征（BSS）家系的研究报道，GP9 基因的突变频率高于另外两个基因。GPIX 是血小板膜糖蛋白复合物的一个亚基，已有报道表明GP9基因的多个点突变与 BSS 患者发病相关 。已报道的若干GP9点突变，例如GP9 70T>C 和GP9 182A>G，会改变蛋白质构象，进而造成 GPIb‑IX‑V 复合物各组分的表达水平下降。但目前仍然缺乏体内功能实验证据，无法证实这些突变是否会对血小板（血栓细胞）产生影响 。敲除小鼠 GPIX 基因会出现血小板减少、巨大血小板以及出血时间延长等表型，与人类 BSS 病症相似；但小鼠为宫内胚胎发育，很难对其早期发育阶段开展实验操作 。而GP9是否参与、以及通过何种方式调控胚胎期血小板的发育，目前尚不十分清楚。 斑马鱼（Danio rerio）是发育生物学以及多种人类疾病建模研究中十分重要的脊椎动物模型。斑马鱼繁殖力强、体外发育，且早期胚胎身体透明，非常适合开展高通量基因筛选与小分子药物筛选，尤其便于在发育早期快速观察体内表型。重要的是，低等脊椎动物的血栓细胞等同于哺乳动物的血小板在功能与调控机制层面具有等效性。 斑马鱼体内的血栓细胞生成过程已有相关研究，其调控因子高度保守，发育过程也与哺乳动物相似 。多种血栓细胞相关疾病已经成功在斑马鱼中构建疾病模型，包括先天性无巨核细胞性血小板减少症、遗传性血小板减少症、原发性血小板增多症以及数种血小板功能障碍 。此外，现已获得血栓细胞谱系特异性的斑马鱼转基因报告品系，例如 Tg(cd41:eGFP) 和 Tg(mpl:eGFP) 品系。血栓细胞功能可通过凝血效率进行检测，检测指标为血管闭塞时间或者血栓表面积，这两项检测方法在斑马鱼体系中均已成熟建立。由于GP9的多种突变与伯纳德‑索利耶综合征（BSS）的临床表型相关，阐明GP9在血栓细胞生成中的功能及其潜在分子机制、构建合适的 BSS 斑马鱼模型，将有助于解析该疾病的发病机制，同时验证患者来源的GP9变异的临床意义。 本研究利用 CRISPR-Cas9 技术靶向敲除gp9基因，构建遗传性伯纳德‑索利耶综合征（BSS）斑马鱼模型。gp9突变斑马鱼可很好地模拟 BSS 疾病表型：从早期发育阶段至成体阶段均表现出血栓细胞减少，成体造血过程中血栓细胞祖细胞发生扩增，并存在出血性疾病表型。我们进一步证实，人源GP9基因可重现该斑马鱼模型中的血栓细胞表型，且患者来源的GP970T>C与GP9182A>G突变属于血栓细胞生成缺陷型突变，是人类伯纳德‑索利耶综合征（BSS）的致病突变。此外，本研究发现，临床上用于促进血栓细胞生成的重组人促血小板生成素（rhTPO），能够改善该模型中 BSS 相关的复发性血小板减少表型。有意思的是，临床上用于治疗白血病以及免疫性血小板减少性紫癜的地西他滨，同样可以有效缓解 BSS 斑马鱼的血小板减少症状。因此，gp9smu15斑马鱼可作为理想模型，用于研究 BSS 相关的血栓细胞生成缺陷与止血功能异常；同时该模型也可作为有力工具，快速解析临床意义尚不明确的人源患者GP9基因变异，并用于 BSS 治疗策略的研发。 图1. 利用CRISPR/Cas9技术构建并鉴定\(gpgSMU15\)斑马鱼。(A) 斑马鱼gp9基因结构。起始编码区标注为ATG，靶向编码区的序列显示在紫色虚线框内。(B) Sanger测序鉴定出野生型（WT）序列（上方）以及\(gpgsmu15\)斑马鱼中存在17 bp缺失（红色箭头）。gp9的移码突变产生了提前终止密码子，以红色星号标注。(C) 野生型、突变型和杂合型斑马鱼聚合酶链式反应产物的琼脂糖凝胶电泳图。泳道1：野生型条带；泳道2：突变型条带；泳道3：杂合型条带。(D) 野生型和突变型斑马鱼中Gp9蛋白的结构。通过SMART程序分析的Gp9蛋白包含一个富亮氨酸重复序列N端（LRRNT）结构域、一个富亮氨酸重复序列C端（LRRCT）结构域和一个跨膜结构域。橙色椭圆表示LRRNT或LRRCT结构域，绿色框表示跨膜结构域。红色斜杠表示Gp9蛋白的提前终止。(E) \(ggSMU15\)突变体中产生的\(gp9017,+0\)突变转录本。引物对F1（wt_FP）、F2（mut_FP）、F3（common_FP）和R1（common_RP）分别用于检测野生型形式和\(gp9017,+0\)形式。采用双样本Student t检验确定统计学显著性，每组n≥10，数据来自四次生物学重复，以平均值±标准误表示。* \(* * P<0.01\)；\(*P<0.05\)；ns：无显著差异。 图2。\(gpgSMUTS\) 成年鱼表现出血小板减少症和前体细胞异常增殖。(A) 对野生型(WT)和\(gp9SMU15\) 鱼的外周血(PB)细胞进行流式细胞术分析。异硫氰酸荧光素(FITC)与488-绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞呈正比，侧向散射(SSC)反映细胞颗粒度。(B) 通过流式细胞术测定外周血中\(cd41:eGFP\) 血小板的百分比(学生t检验，\(n=6\)；平均值±标准误差[SEM]；ns：无显著差异；\(*P<0.05\))。(C) 对野生型和\(gp9smu15\) 鱼的肾髓(KM)细胞进行瑞氏-吉姆萨染色。比例尺代表20毫米。箭头：黄色为淋巴细胞或血小板，绿色为前体细胞。星号：蓝色为髓单核细胞，红色为红细胞。(D) 通过瑞氏-吉姆萨染色对野生型和\(gpgSMU15\) 鱼的肾髓细胞进行血细胞计数。L&T：淋巴细胞和血小板；P：前体细胞；M：髓单核细胞；E：红细胞。(学生t检验，\(n=6\)；平均值±SEM；ns：无显著差异；\(*P<0.05\))。(E) 对野生型和\(gp9smu15\) 鱼的肾髓细胞进行流式细胞术分析。FITC与488-GFP阳性细胞呈正比，SSC反映细胞颗粒度。(F) 通过流式细胞术测定肾髓细胞中\(cd41:eGFPlow\) 和cd41:eGFP高表达血小板的百分比(学生t检验，\(n=6\)；平均值±SEM；ns：无显著差异；\(**P<0.01\))。 结果 \(gp9SMU15\) 成鱼出现血小板减少症并伴随造血前体细胞增殖 为探究 gp9 在血小板生成中的作用，我们利用 CRISPR-Cas9 技术靶向 \(gp9\) 基因的外显子 2，构建了 gp9 缺陷型斑马鱼突变体。我们获得了携带 gp9（-17 bp，+0）突变的 F0 代突变株，并将该品系与野生型斑马鱼回交，培育出 F1 代杂合子和 F2 代纯合子后代。预测显示，gp9（-17 bp，+0）突变体编码的 Gp9 蛋白为截短型，缺失两个亮氨酸富集重复结构域和跨膜结构域。通过实时荧光定量聚合酶链式反应检测 gp9 mRNA 发现，突变斑马鱼仅产生突变型 mRNA。因此，gp9（-17 bp，+0）（以下简称 \(gpgSMUTS\)）被预测为功能缺失型突变体。 为了表征gp9基因敲除对斑马鱼血小板生成的影响，我们通过监测Tg(cd41:eGFP)品系中cd41:eGFP的表达，确定了\(gp9SMU15\)突变体及其野生型同胞的血小板数量，因为在成年斑马鱼中，绝大多数循环血小板可通过流式细胞术分析（FACS）被识别为cd41:GFP高荧光阳性。值得注意的是，尽管\(gp9SMUN\)突变体可存活并发育至成年，但\(gp9SMU15\)成年突变体表现出血小板减少症，其循环cd41:eGFP高阳性血小板的数量约为成年野生型同胞鱼的78%。这些数据表明，\(gp9SMUTS\)斑马鱼在成年阶段表现出血小板减少症，与人类患者的BSS相似。为了直接检测\(gp9SMU75\)成年斑马鱼中类似BSS的血液学异常，我们从\(gp9SMU75\)成年斑马鱼或其同胞中收集了肾髓（KM）细胞，并进行了细胞学分析和血细胞计数。我们发现\(gp9SMU75\)成年鱼的前体细胞群体显著扩增。最近对斑马鱼成年肾髓的单细胞RNA测序研究揭示了血小板发育的连续性，流式细胞术可识别造血干祖细胞（HSPC）至分化程度不同的血小板，其cd41:eGFP荧光从弱到强不等( \(GFPlaw\) 至 \(GFPhigh\) ) 成年KM细胞中的荧光。 为比较\(gp9SMU75\) 鱼与野生型（WT）同胞鱼KM中的血小板群体，通过荧光激活细胞分选（FACS）分离cd41:eGFP+细胞。与细胞学结果一致，FACS结果还显示cd41:e \(GFPlow\) 细胞群体占比从成年野生型同胞鱼的73%上升至成年\(gp9SMUN\) 鱼的82%，表明\(gp9SMUTS\) 鱼的cd41:eGFPlow 造血干祖细胞（HSPC）占比高于野生型同胞鱼。形态学分析显示，\(cd41:eGFPlow\) 造血干祖细胞群体内细胞大小无明显变化。然而，\(gp9SMU75\) 突变体KM和外周血中的\(cd41:eGFP\) 血小板群体均大于野生型同胞鱼（中等大小vs小细胞）。上述数据表明，\(gpgSMUTS\) 斑马鱼突变体可能存在发育阻滞，成年后出现较大血小板扩增和有核小血小板减少的现象。布鲁顿综合征（BSS）患者表现为骨髓巨核细胞增多但成熟血小板减少。 在本研究中，斑马鱼\(gpgsmurs\) 突变体祖细胞群体出现类似扩增，但循环血小板减少。 \(gp9SMU15\) 突变体的血小板功能受损 BSS患者通常存在中度血小板减少、巨大血小板及出血倾向，可能会出现受伤或手术时出现严重出血。正常条件下，野生型（WT）斑马鱼极少发生严重出血；而约 21%（4/19）的gp9SMU15突变体在躯体或尾鳍附近出现血斑，说明gp9突变会造成显著的出血倾向。血栓细胞功能可通过止血与凝血能力进行评估，该检测方法已在斑马鱼模型中成熟建立 。通过测定尾鳍切割损伤后的止血时间，我们发现gp9SMU15成体突变斑马鱼的平均止血时间约为 50 秒，远长于野生型组（约 20 秒）。本研究还采用氢氧化钠（NaOH）造成化学损伤，诱导鳃部出血 。结果显示，gp9SMU15突变鱼的鳃出血程度比野生型鱼更严重。随后，使用三氯化铁（FeCl₃）诱导血管内皮发生氧化损伤，观察cd41:eGFPhigh阳性血栓细胞的募集情况 。结果表明，gp9SMU15斑马鱼幼体中，血栓细胞募集至受损小静脉所需时间显著更长（平均值 ± 标准误 [SEM]：36.4 ± 5.2 s），而野生型同窝对照为 22.2 ± 2.4 s。综上，上述结果证明，存在血栓细胞减少的gp9突变斑马鱼表现出出血性疾病，与 BSS 患者凝血异常、出血时间延长等典型临床表型一致。 图3. \(gp9SMU15\)突变体的血小板功能受损。(A-D) 成年野生型（WT）同窝鱼与\(gp9SMU15\)突变体的凝血情况。(A) 正常条件下斑马鱼体表或尾鳍附近血斑的代表性图像。(B) 成年WT同窝鱼（上）与\(gp9SMU15\)突变体（下）的止血时间。(C) WT同窝鱼与\(gp9smu15\)突变体止血时间的定量数据。(D) 同窝鱼与\(gp9SMU15\)突变体受伤后鳃部出血的代表性图像，代表性照片于90秒时拍摄。(E) WT与\(gp9SMU15\)鱼鳃部周围红色像素的定量数据，红色像素代表出血程度，通过Adobe Photoshop CC软件计数。(F) 1%氯化铁诱导受伤后的斑马鱼：受伤小静脉处血小板聚集时间的定量数据。统计显著性通过双样本Student t检验确定，数据以平均值±标准误表示，\(*P<0.05\)。比例尺：500毫米。 gp9基因敲除导致斑马鱼幼鱼出现血小板减少症 为了探究gp9基因敲除对斑马鱼胚胎或幼虫血小板生成的影响，我们通过监测cd41 mRNA和cd41:eGFP的表达，确定了\(gpgSMUTS\)突变体及其野生型同胞的血小板数量。在斑马鱼幼虫中，通过荧光激活细胞分选（FACS）或荧光显微镜整体观察，可识别出cd41:eGFP细胞的两个不同群体，即\(cd41:eGFPlow\)前体和祖细胞以及cd41:eGFP高表达的血小板 我们通过荧光激活细胞分选从3天龄（dpf）胚胎中分离出GFP阳性细胞，发现在3天龄的\(gp9SMUTS\)突变胚胎中，cd41:eGFP高表达的细胞群体显著减少，而\(cd41:eGFPlow\)细胞群体则增加，这表明gp9突变影响了血小板的分化。此外，定量分析显示，在4天龄时，与野生型同胞胚胎相比，\(gp9SMU15\)突变幼虫尾部造血组织（CHT）区域的cd41:eGFP阳性细胞信号显著降低，说明\(gpgsmu1s\)突变体在胚胎发育过程中存在血小板减少症。多个血小板相关基因（如cd41以及血小板生成所需的fog1和nfe2基因）的表达下调进一步证实了这一结论。值得注意的是，主要由造血干祖细胞（HSPC）构成的主动脉-性腺-中肾（AGM）区域cd41:eGFP低表达细胞在2天龄的\(gpgSMUTS\)突变体中未发生改变，且AGM和CHT区域的cmyb表达也未改变，这表明造血干祖细胞未受gp9突变的影响。其他定型造血谱系也未受影响，3天龄的\(mpo+\)中性粒细胞、5天龄的βe1珠蛋白阳性和邻联茴香胺阳性红细胞以及rag1阳性淋巴细胞的数量均未发生变化。此外，原始造血谱系（包括胚胎红系标志物αe1-珠蛋白和gata1以及原始髓系标志物pu.1）在\(gp9SMU75\)突变体中也未发生改变。综上，这些结果表明\(gp9SMU15\)突变体表现出谱系特异性的血小板生成缺陷，而其他造血谱系细胞未受影响。 为排除脱靶突变的可能性，我们在热休克启动子（hsp:gp9-egfp）的控制下过表达Gp9-eGFP融合蛋白，结果显示热休克诱导的gp9过表达能够保护\(gp9SMU75\)突变体免受血小板减少症的影响。这些数据证明gp9功能缺失会导致斑马鱼幼鱼出现血小板减少症。 \(gpgSMU15\)突变体中的血小板减少症由血小板前体细胞增殖减少引起 为了解释\(gp9SMUTS\)突变体血小板减少症的细胞基础，我们进一步探究了血小板生成是否在gp9缺陷型突变体中，细胞增殖减少或细胞凋亡增加。因此，我们在\(Tg(cd41:eGFP);gp9SMU15\)转基因品系中监测了CHT区域cd41:eGFP阳性细胞的增殖或死亡变化。 5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）脉冲标记掺入实验显示，在3 dpf时，\(gpgSMUTS\)突变体CHT中BrdU阳性cd41:eGFP+细胞在总cd41:eGFP+细胞中的占比显著降低，且减少的细胞群体为BrdU标记的\(cd41:GFPlow\)细胞，而非cd41:GFPhigh细胞，这表明gp9突变影响了\(cd41:eGFPlow\)造血前体细胞或血小板祖细胞的增殖。为了研究\(gpgSMUTS\)突变体中血小板的凋亡情况，我们进行了末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）实验，发现在3 dpf时，野生型同胞和\(gp9SMUTS\)突变体的CHT区域中几乎没有cd41:eGFP/TUNEL双阳性细胞，说明血小板减少症并非由细胞凋亡导致。这些结果表明，\(gp9SMU15\)突变体的血小板减少症主要可归因于增殖减少。 利用人类伯纳德-苏里耶综合征相关GP9突变验证斑马鱼模型 Gp9 的系统发育树表明其从斑马鱼到哺乳动物的进化保守性。多序列比对显示斑马鱼与哺乳动物的GPIX具有相似性，尤其是在胞外结构域中（同源性约为37%）。 据报道，人类BSS与多种GP9突变相关，例如GP9 \(c.70T>C\)（C24R）和GP9 c.182A>G（N61S），这些突变已被证实会改变GPIX的构象，并在分子水平上轻度损害其自身以及GPIB-IX-V复合物的蛋白表达。然而，目前仍缺乏这两种突变在动物模型中影响血小板生成的功能证据。为验证该突变在模型中的作用，我们首先研究了斑马鱼\(gp9SMU15\)，以探究人类GP9（下文简称\(ShGPS\)）是否能挽救斑马鱼的BSS表型。我们发现，过表达\(hsGP9WT\)可恢复斑马鱼\(gp9SMUT5\)突变体的血小板减少症，因为注射hsGP9WT mRNA的斑马鱼（\(gp9SMU75\)）的血小板计数（34.2±3.2个血小板）已回升至野生型同窝斑马鱼的正常水平（34.6±1.9个血小板）。这些结果进一步证实了斑马鱼与人类GP9在血小板生成功能上的保守性，并表明斑马鱼\(gp9SMUTS\)可作为BSS模型，用于快速验证人类GP9变异的功能意义。我们进一步过表达了人类BSS相关亚型GP9 c.70T>C和c.182A>G的mRNA（下文分别简称\(hsGP970T>C\)和\(hsGP9182A>G\)），在\(gp9SMUNS\)斑马鱼胚胎中评估两种异构体在血小板生成中的功能。与\(hsGP9WT\)过表达不同，\(hsGP970TDC\)和\(hsGP9182A>G\)过表达未能恢复\(gp9SMU15\)突变体中cd41:eGFPhigh血小板的数量，这表明两种人类GP9突变会影响GP9在血小板生成中的功能。上述数据证明，\(gp9SMU75\)斑马鱼模型可作为人类GP9突变功能验证的良好BSS模型，且hsGP970T>C和\(hsGP9182A>G\)均为功能丧失型突变。 图4. \(gp9smu1s\)斑马鱼胚胎的血小板减少症。(A-D) \(gpgSMUTS\)胚胎中cd41:eGFPhigh血小板减少。对受精后3天（dpf）的野生型（WT）和\(gpgsmurs\)胚胎中cd41:eGFP+细胞进行流式细胞术分析。GFP面积与488-GFP细胞数成正比，侧向散射（SSC）反映细胞颗粒度(A)。通过流式细胞术测定3天龄胚胎细胞中\(cd41:eGFPlow\)和\(cd41:eGFPhigh\)血小板的百分比（每组\(n>100\)个胚胎，数据来自三次生物学重复，平均值±标准误[SEM]，ns：无显著差异，\(**P<0.01\)）(B)。4天龄\(Tg(cd41:eGFP);\)野生型和\(Tg(cd41:eGFP);gp95MUl5\)突变体胚胎中cd41:eGFP蛋白染色的代表性图像。图像显示\(GFPhish\)信号(C)。采用双样本Student t检验确定统计学显著性，8a81f447-8037-490d-b02c-908564ff8b99，平均值±SEM，\(***P<0.001\)(D)。(E) 通过实时定量聚合酶链反应检测3天龄野生型同窝仔（蓝柱）和\(gp9SMUT5\)突变体（红柱）中血小板特异性标志物（cd41、nfe2和fog1）的相对表达水平。采用双样本Student t检验确定统计学显著性；每组n≥10，数据来自三次生物学重复，平均值±SEM，\(*P<0.05\)，\(***P<0.001\)。(F) \(gp9SMU15\)突变体的造血干祖细胞（HSPC）未受影响。对2天龄\(gp9SMUS\)突变体和野生型胚胎中定位于主动脉-性腺-中肾（AGM）区的\(cd41:eGFPlow\)造血干祖细胞进行定量分析。采用双样本Student t检验确定统计学显著性，\(n>10\)，平均值±SEM，ns：无显著差异。(G) 受精后36小时（hpf）和3天龄的对照组（左图）及\(gpgSMU15\)突变体（右图）胚胎中cmyb表达的整体原位杂交（WISH）结果。 图5. \(gpgsmu15\)突变体中血小板前体细胞增殖减弱。(A) 通过BrdU（红色信号）和GFP（绿色信号）双抗体染色，对受精后3天（dpf）的\(Tg(cd41:eGFP);WT\)（左侧）和\(Tg(cd41:eGFP);gp9\)（右侧）突变体尾部造血组织（CHT）中cd41:eGFP+细胞的BrdU掺入情况进行分析。白色三角箭头指示的黄色融合信号代表\(BrdU cd41low\)细胞。灰色三角箭头指示的黄色融合信号代表BrdU+cd41high细胞。将共聚焦参数设置为针孔大小35 μm、488激光增益700以过滤大部分\(cd41:eGFP\)信号，拍摄染色样本的图像并计数血小板荧光信号。比例尺：50 μm。(B) 统计数据显示尾部造血组织中cd41:eGFP+细胞的BrdU掺入百分比。星号表示统计学差异，采用双样本Student t检验，n≥10，均值±标准误，\(* P<0.01\)。(C) \(Tg(cd41:eGFP);gp95MUNs\)突变体（右侧图）及其野生型（WT）同窝幼鱼（左侧图）尾部造血组织中3dpf的cd41:eGFP*细胞未出现TUNEL掺入。绿色：GFP；红色：TUNEL。绿色箭头指示cd41:eGFP+细胞，红色箭头指示TUNEL+细胞，未检测到cd41:eGFP+/TUNEL+细胞。比例尺：50 μm。 促血小板生成素和地西他滨可有效修饰模型中的伯纳德-苏里耶综合征表型 在临床环境中，布鲁顿综合征（BSS）的主要治疗方法是骨髓移植。由于布鲁顿综合征患者会出现症状在血小板减少症的研究中，我们想知道临床上用于治疗血小板减少症的药物是否能有效缓解BSS。因此，我们利用\(Tg(cd41:eGFP);gp9\)号BSS斑马鱼模型来检测药物反应。重组人血小板生成素（rhTPO）是一种市售的促血小板生成药物，已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗人类血小板减少症39。我们用100 U/mL的rhTPO处理1.5天post-fertilization（dpf）的野生型（WT）同窝胚胎，直至4 dpf，以观察斑马鱼血小板是否能对rhTPO产生反应。结果发现，无论是野生型同窝胚胎还是gp9缺陷突变体，100 U/mL的rhTPO都能有效增加\(cd41:eGFPhigh\)号血小板数量。这表明斑马鱼血小板对哺乳动物细胞因子存在保守的反应，且rhTPO能够缓解BSS斑马鱼的血小板减少症。 图 6 在\(gp9^{SMU15}\)斑马鱼模型中对人源伯纳德‑索利耶综合征（BSS）相关GP9突变进行功能验证(A) 利用人源GP9突变对 BSS 斑马鱼模型开展功能验证的示意图。将人野生型hsGP9WT、突变型hsGP970T>C以及hsGP9182A>G的 mRNA 注射至单细胞期胚胎。(B) 受精后 4 天（4 dpf）的Tg(cd41:eGFP);WT野生型胚胎与突变体Tg(cd41:eGFP);gp9胚胎中 cd41:eGFP 蛋白染色代表性图片。图片展示高荧光（GFPhigh）信号。(C) 对尾造血组织（CHT）区域的GFPhigh阳性细胞数量进行定量统计。采用 Student‑t 检验判定统计学显著性，每组样本量\(n>10\)。数据表示为平均值 ± 标准误（mean ± SEM）**；**\(P<0.01\)，***\(P<0.001\)，****\(P<0.0001\)。比例尺：50 μm。 地西他滨已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗白血病和骨髓增生异常综合征，目前正处于临床试验阶段，被用于治疗特发性血小板减少性紫癜。它是否能被用于BSS 的处理方式尚不清楚。我们发现 20 毫摩尔地西他滨可有效增加野生型同胞胚胎中的 \(cd41:eGFPhigh\) 血小板，同时也能扩增 \(gpgSMUTS\) 胚胎中的血小板，这表明地西他滨可增加斑马鱼血小板的数量，并可能缓解BSS模型中的血小板减少症。上述结果表明，重组人血小板生成素（rhTPO）和地西他滨均能有效缓解BSS斑马鱼的血小板减少症（尽管血小板数量未完全恢复），这提示这些临床上用于治疗血小板减少症的药物也可应用于BSS的治疗。BSS斑马鱼模型对这些治疗药物的反应表明，该模型可用于血小板生成药物的评估与筛选研究。 讨论 BSS以出血时间延长、血小板增大、凝血障碍和血小板减少为特征，是由糖蛋白Ib复合物基因（包括GP1bA、GP1bb和GP9）突变引发的出血性疾病。10 其中，GP9是211个BSS患者家系中报道的突变频率最高的基因。10 本研究构建并鉴定了一种CRISPR-Cas9靶向的斑马鱼突变体（\(gp9SMUTS\)），这是首个建立的遗传性BSS斑马鱼模型。gp9缺陷型斑马鱼具有生存能力，且表现出血小板减少和出血性疾病特征，与GP9基因敲除小鼠及人类BSS患者的表型相似。该斑马鱼突变体（\(gp9SMU/S\)）为辅助研究\(gp9\)在血小板生成及BSS中的多种作用提供了互补模型。血小板减少是人类BSS和GP9基因敲除小鼠均报道的重要特征。本研究数据进一步深化了对\(gp9\)在脊椎动物血小板生成中作用的认知，因为gp9缺陷型斑马鱼从胚胎阶段到成年期均表现出稳定的血小板减少表型。研究还发现，\(gp9SMU15\)斑马鱼从胚胎到成年阶段，血小板数量减少但前体细胞数量增多。有趣的是，3天龄全胚胎原位杂交结果显示，cmyb表达未发生改变，而\(cd41:eGFPlow\)阳性细胞数量增加，这表明增多的\(cd41:eGFPlow\)细胞可能是血小板-红系祖细胞，而非cmyb阳性的造血干细胞或其他谱系祖细胞。尤为重要的是，这些斑马鱼的KM cd41:eGFP阳性细胞体积大于同窝对照个体，与小鼠和人类中较大的血小板样细胞体积特征一致。9,16 关于gp9突变导致血小板减少的细胞机制，本研究进一步明确血小板减少可能源于血小板谱系细胞的增殖缺陷。增殖受阻的前体细胞或血小板祖细胞可能在向血小板分化过程中出现后续问题。 斑马鱼中的血栓细胞是哺乳动物血小板的功能等价物，在凝血和防止出血方面发挥着重要作用。 血小板减少症患者或出血性疾病患者在受伤或手术后可能出现严重出血。与BSS患者类似，gp9缺陷斑马鱼也表现出自发性出血综合征，受伤后伴随出血时间延长。综合来看，这些结果证实gp9缺陷会增加出血倾向，这一特征在斑马鱼到人类中均具有保守性。gp9缺陷动物和患者的出血性疾病可归因于血小板功能不足。多项研究报告指出，GP9突变个体的血小板活化也可能受到影响。综上，这些结果表明，携带遗传性gp9缺陷、表现出类似人类BSS出血性疾病的斑马鱼，可作为一种补充模型，帮助我们进一步理解GP9在血小板生成、血栓形成和止血过程中的多种作用。 基于血小板生成调控因子的保守性以及GPIX在不同物种间的高度相似性，我们验证了人类GP9可补偿斑马鱼gp9，因为人类\(GP9WT\) mRNA能够挽救\(gp9SMU75\)斑马鱼的血小板减少症。针对BSS患者来源突变的功能验证，以往研究主要局限于细胞系。本研究提供了一个利用斑马鱼快速验证患者来源突变的实例，我们证实\(gp9SMUTS\)斑马鱼可作为一种成本效益高的模型，用于验证与BSS相关的人类GP9突变。通过在斑马鱼模型中直接过表达，我们评估了两个与BSS相关的GP9突变（\((hsGP970T>c\)和\(hsGP9182A>G\)），而未能挽救血小板减少症的结果证实，这两个突变是血小板生成过程中的功能缺失突变。因此，具备高通量筛选能力的BSS斑马鱼模型，有助于在体内加速发现潜在的临床意义不明的遗传变异。 BSS的主要临床治疗为支持性治疗，包括输注血小板、使用抗纤维蛋白溶解药（尤其用于黏膜皮肤出血）以及重组活化因子Ⅶ，以期缩短出血时间。 目前迫切需要更有效的BSS治疗方法。既往研究表明，重组人血小板生成素（rhTPO）可快速升高特发性血小板减少性紫癜患者的血小板计数， 小剂量地西他滨可促进特发性血小板减少性紫癜患者及健康对照者的血小板生成。 本研究发现，rhTPO和地西他滨能有效缓解斑马鱼幼鱼的BSS表型。鉴于斑马鱼幼鱼和成鱼阶段均能持续观察到血小板减少的特征，我们认为若以合适的剂量和给药方式使用这两种药物，可能仍能缓解成年BSS斑马鱼的血小板减少症状。BSS斑马鱼模型将为药物研发提供助力，本研究中rhTPO和地西他滨的应用已证实了这一点。用于促进血小板生成，还有效缓解了斑马鱼幼虫中的BSS表型，这也可能为通过促进血小板生成来治疗BSS提供思路。 总之，我们成功构建了gp9基因敲除斑马鱼模型，该模型表现出血小板减少症和出血性疾病，与患者的Bernard-Soulier综合征（BSS）临床特征相似。我们证实了GP9在斑马鱼到哺乳动物中对血小板生成以及血栓形成和止血过程中的作用具有保守性。该BSS斑马鱼模型可作为一种成本效益高的模型，用于评估人类相关突变的功能，也可用于体内筛选治疗BSS的新型药物。作为原理验证案例，该斑马鱼BSS模型与其他已构建的血小板相关斑马鱼模型相结合，将有助于我们探究临床发现的、临床意义尚不明确的突变对血小板发育和功能的影响，同时还能开展可靠的药物评价，或建立筛选平台以评估BSS的治疗反应，尤其是针对伴血小板减少症突变的治疗反应。 关于木芮生物 ABOUT MURUIBIO 苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。 木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。 木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。 敬请关注

Feedback from U.S. FDA supports advancement into Phase 2 STRIDE-MDS trial in patients with R/R HR-MDS First-in-class, mutation-agnostic approach has the potential to address a broad R/R HR-MDS population PureTech intends to secure external capital in the first half of 2027 to support the continued development of LYT-200 through its Founded Entity, Gallop Oncology PureTech Health plc (LSE: PRTC) ("PureTech" or the "Company"), a hub-and-spoke biotherapeutics company dedicated to giving life to science and transforming innovation into value, today announced the successful completion of the End-of-Phase 1 (EOP1) meeting with the U.S. Food and Drug Administration (FDA) and the receipt of FDA Fast Track designation for LYT-200 in combination with a hypomethylating agent (HMA) for the treatment of relapsed/refractory (R/R) high-risk myelodysplastic syndromes (HR-MDS). LYT-200 targets galectin-9, an important oncogenic driver and potent immunosuppressor, and is being advanced by PureTech’s Founded Entity, Gallop Oncology (Gallop). PureTech intends to leverage external capital to support the continued development of LYT-200 through the completion of the Phase 2 trial and expects to secure capital in the first half of 2027. “Our productive End-of-Phase 1 meeting with the U.S. FDA provides a clear path to advance LYT-200 into Phase 2 development,” said Eric Elenko, PhD, Acting Chief Executive Officer of Gallop Oncology and Co-founder of PureTech. “The STRIDE-MDS trial will seek to confirm the unprecedented clinical activity observed in Phase 1b, while its randomized, double-blind design will enable a clear assessment of the contribution of effect of LYT-200. Additionally, the inclusion of two doses is intended to fulfill the dose-selection requirements in accordance with FDA’s Project Optimus. With its mutation-agnostic approach and potential to benefit a broad range of patients, LYT-200 could represent an important new treatment option for R/R HR- MDS.” The Study of Two Regimens Investigating Dose and Efficacy of LYT‑200 in Relapsed/Refractory High-Risk MDS (STRIDE-MDS) will be a randomized, double-blind, placebo-controlled Phase 2 trial enrolling approximately 125 patients with R/R HR-MDS. Patients will be randomized 2:2:1 to receive LYT-200 at 12 mg/kg plus an HMA, LYT-200 at 7.5 mg/kg plus an HMA, or placebo plus an HMA, respectively. The trial will assess the efficacy of LYT-200 as measured by the rate of complete and partial responses to support dose selection. “R/R HR-MDS remains an area of profound unmet need, particularly for the vast majority of patients without an actionable mutation,” said Aleksandra Filipovic, MD, PhD, Chief Medical Officer of Gallop Oncology. “Galectin-9 represents a compelling therapeutic target because of its role as both an oncogenic driver and potent immunosuppressor, and its elevated expression in HR-MDS is associated with shorter survival. By addressing the foundational biology – independent of a specific genetic mutation – LYT-200 has the potential to offer a new approach for a broad population of patients, and we welcome the opportunity Fast Track designation provides to work more closely with the U.S. FDA as we advance its development.” The EOP1 meeting was supported by positive topline data from the completed Phase 1b trial evaluating LYT-200 in combination with an HMA (azacitidine or decitabine) in heavily pretreated patients with R/R HR-MDS. In that trial, LYT-200 demonstrated compelling clinical efficacy and a consistent safety profile in patients with R/R HR-MDS, all of whom had relapsed or become refractory to prior treatment with an HMA. Efficacy evaluable1 patients receiving LYT-200 (12 mg/kg) in combination with an HMA (n=11) demonstrated: 27.3% complete response rate 36.3% complete response + partial response rate 9.1% partial response rate 9.1% marrow complete response rate 45.5% overall response rate 18% conversion to transplant rate No dose-limiting toxicities No myeloid suppression “Patients with higher-risk MDS who relapse or become refractory to HMA treatment have very limited therapeutic options and poor outcomes, and the literature and clinical practice suggest that fewer than 5% of these patients typically respond to retreatment with an HMA rechallenge,” said Amer Zeidan, MBBS, MHS, Professor of Medicine at Yale University, Chief of the Division of Hematologic Malignancies at Yale Cancer Center, who will be the Global Principal Investigator of the Phase 2 STRIDE-MDS trial. “Against this backdrop, the clinical activity observed with LYT-200 in combination with an HMA in the Phase 1b study is particularly encouraging. STRIDE-MDS will allow us to further evaluate this activity in a randomized, placebo-controlled study.” Fast Track designation is a process designed to facilitate the development and expedite the review of drugs that target serious conditions with unmet medical need. Drugs receiving Fast Track designation may benefit from more frequent interactions with the U.S. FDA throughout development. Myelodysplastic syndromes (MDS) are a group of serious blood cancers characterized by ineffective blood cell production in the bone marrow, leading to anemia, infections, and bleeding complications.2, 3 MDS affects approximately 60,000-170,000 people in the United States, with an estimated 30-40% of patients diagnosed with the more aggressive form of the disease known as high-risk (HR) MDS.2, 4 HR-MDS is associated with poor outcomes, with median survival typically less than two years following diagnosis. The current standard frontline treatments for HR-MDS are hypomethylating agents (HMAs), such as azacitidine and decitabine; however, most patients do not respond to these therapies or eventually stop benefiting from them.5 Once the disease becomes relapsed or refractory (R/R), outcomes are especially poor, with survival often limited to only a few months.5,6 Treatment options for patients with R/R HR-MDS remain very limited. Only one therapy has been approved by the U.S. Food and Drug Administration specifically for R/R HR-MDS in the past two decades, and it targets a genetic mutation found in only approximately 3% of patients.5 As a result, there remains a significant unmet need for treatments for the overwhelming majority of patients with R/R HR-MDS. LYT-200 is a Phase 2-ready, fully human monoclonal antibody in development for the treatment of relapsed/refractory (R/R) high-risk myelodysplastic syndromes (HR-MDS). It is the most advanced therapeutic candidate targeting galectin-9, which is an important oncogenic driver and potent immunosuppressor that plays a central role in some of the most difficult-to-treat cancers. With its mutation-agnostic, dual mechanism of action, LYT-200 is designed to address both the malignant cells and the immunosuppressive environment that sustain disease. LYT-200 has been granted Fast Track designation from the U.S. Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of R/R HR-MDS in combination with a hypomethylating agent. LYT-200 has also been granted Fast Track designation from the U.S. FDA for the treatment of acute myeloid leukemia (AML). Gallop Oncology is a clinical-stage biotechnology company dedicated to transforming the treatment paradigm for hematological malignancies. Its lead candidate, LYT-200, is a first-in-class, mutation-agnostic antibody in development for the treatment of relapsed/refractory (R/R) high-risk myelodysplastic syndromes (HR-MDS). Gallop Oncology was founded by and is currently wholly owned by PureTech Health plc (LSE: PRTC). PureTech Health is a hub-and-spoke biotherapeutics company dedicated to giving life to science and transforming innovation into value. We do this through a proven, capital-efficient R&D model focused on opportunities with validated pharmacology and untapped potential to address significant patient needs. This strategy has produced dozens of therapeutic candidates, including three that have received U.S. FDA approval. By identifying, shaping, and de-risking these high-conviction assets, and scaling them through dedicated structures backed by external capital, we accelerate their path to patients while creating sustainable value for shareholders. Amer Zeidan, MBBS, MHS, has received honoraria from PureTech in his role as a clinical advisor. The views and opinions expressed are his own and do not necessarily reflect those of his employer. 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