文章类型：研究论文
DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2026.01.034
发表日期：2026-3-4
第一作者： 滕飞 通讯作者：李伟、胡宝洋、周琪
主要单位：中国科学院动物研究所
摘要
清除脑内异常β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积是阿尔茨海默病（AD）极具前景的治疗策略，然而，当前主流的抗Aβ免疫疗法因频繁的不良反应而存在安全性隐患。胞外靶向蛋白降解（eTPD）技术为安全、高效清除致病蛋白提供了新思路。本研究开发了新一代eTPD平台——合成肽程序化溶酶体靶向嵌合体（SPYTACs），该平台基于完全人工合成的双功能肽，利用低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）实现胞外蛋白的靶向降解，并具备穿越血脑屏障的能力。在5×FAD小鼠模型（涵盖前驱期和症状期）中，SPYTACs不仅有效降低了外周与脑内的Aβ负荷，缓解突触丢失，还显著改善了认知功能。尤为关键的是，相较于传统免疫疗法，SPYTACs治疗在减少脑出血和炎症等副作用方面表现出明显优势。该平台高度模块化且可基因编码，可根据需要灵活定制针对不同致病蛋白的降解工具，展现出在多种致病蛋白相关疾病中的治疗普适性与转化潜力。
前言
一、研究背景：Aβ清除面临疗效与安全性的两难困境
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是目前全球范围内导致痴呆的首要病因，影响约5700万人口。其病理特征老年斑和神经原纤维缠结驱动着进行性认知衰退。随着淀粉样蛋白-β（Aβ）被鉴定为老年斑的核心成分，学术界提出了“淀粉样蛋白级联假说”，认为脑内Aβ的异常积聚是AD发病的核心驱动因素。基于此，靶向Aβ成为AD治疗药物研发的主攻方向。近年来，抗Aβ免疫疗法的临床试验显示，减少脑内Aβ负荷可在疾病早期阶段延缓认知衰退。然而，这类治疗在患者及动物模型中可能诱发脑部炎症及淀粉样蛋白相关影像学异常（ARIA），而试图减轻ARIA副作用的策略往往又会削弱疗效。因此，亟需发展既能高效、选择性清除Aβ，又能最大限度规避抗体相关不良反应的新型干预手段。
二、技术突破：胞外靶向蛋白降解平台开启新路径
胞外靶向蛋白降解（extracellular targeted protein degradation, eTPD）是近年来兴起的清除病理性胞外及膜蛋白的重要策略，代表性技术为溶酶体靶向嵌合体（lysosome-targeting chimeras, LYTACs）。通过双特异性生物制剂或小分子化合物，eTPD平台借助受体介导的溶酶体运输途径，实现对有害蛋白的特异性降解。该领域发展迅速，已衍生出多种技术形式，包括基于去唾液酸糖蛋白受体的模块化降解剂（MoDE-A）、靶向蛋白降解的抗体（PROTABs）、细胞因子受体靶向嵌合体（KineTACs）等。在体内研究中，eTPD制剂可加速外周致病蛋白的清除。然而，现有eTPD制剂的入脑能力（血脑屏障通透性）不理想，限制了其在神经退行性疾病中的应用。
与基于抗体、融合蛋白、适配体或小分子的eTPD平台相比，多肽基平台在设计合成上更为简便、生产成本更低，且具有更优的血脑屏障穿透能力。更重要的是，抗体类药物依赖其Fc段与Fc受体结合，可能引发促炎反应及突触消除，而多肽基系统不含Fc段，从而避免了Fc受体介导的免疫激活。
三、本研究成果：SPYTAC——一种可编程的肽基溶酶体靶向嵌合体
基于上述背景，研究团队开发了一种名为合成肽程序化溶酶体靶向嵌合体（synthetic peptide-programmed lysosome-targeting chimeras, SPYTACs） 的新型肽基eTPD平台，用于降解AD中的胞外Aβ。该平台选择低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）作为介导受体，既能实现受体介导的胞吞作用，又能完成跨血脑屏障的转胞吞作用。LRP1在肝脏和脑等多种组织中广泛表达且具有组成性循环特性，使其能够协同降解外周和脑内的Aβ。
研究团队遵循模块化和合成简便的设计理念，将LRP1靶向肽与Aβ靶向肽偶联，构建出嵌合肽分子。鉴于Aβ在AD发病机制中的核心地位以及靶向Aβ清除的临床价值，SPYTAC平台旨在直接针对AD的核心病理。在5×FAD小鼠模型的疾病前驱期及症状期，SPYTAC均展现出良好的体内疗效和安全性。SPYTAC治疗显著改善了小鼠的认知功能和学习行为，同时减少了脑淀粉样血管病（CAA）相关的微出血和炎症反应。
四、研究意义与展望
SPYTAC平台代表了eTPD领域的一种创新范式：兼具可编程性、通用性与遗传编码特性，为AD及其他神经退行性疾病的临床转化提供了极具潜力的新策略。该研究不仅在技术上突破了传统抗Aβ疗法的安全瓶颈，更为基于多肽的脑靶向蛋白降解开辟了新方向。
结果
一、LRP1介导的SPYTAC平台开发
SPYTAC是一个人工合成的“双头短肽”，它的一头能抓住致病蛋白Aβ，另一头能抓住细胞表面的“快递员”LRP1受体。抓住后，细胞就会把这个复合物吞进去，送到溶酶体（垃圾处理厂）把Aβ彻底降解。
作者设计了哪些实验来验证这个平台？
✅第一步：证明这个肽确实能“同时抓住”Aβ和LRP1
1. 设计肽的序列
- 肽的一头：用KLVFF这个五肽（已知能结合Aβ）作为“Aβ抓手”
- 肽的另一头：设计一个能与LRP1结合的序列
- 中间用GSS柔性连接子连接，让两个头能灵活摆动
- 在肽的N端加上生物素/FITC，方便追踪
2. 筛选出最好的那个肽（SP^Aβ-1）
- 用表面等离子体共振技术，直接测量肽与Aβ或LRP1的结合强度
- 结果：SP^Aβ-1既能结合Aβ寡聚体/纤维（Kd = 45.3 nM），也能结合LRP1（Kd = 87.2 nM），亲和力很强。
- 同时设计三个对照肽（见图1B）：
- SP^Aβ-m1：只结合LRP1，不能结合Aβ
- SP^Aβ-m2：只结合Aβ，不能结合LRP1
- SP^Aβ-m3：两者都不结合
这一步证明了：SP^Aβ-1确实能同时结合两个靶点，而对照肽只能结合一个或都不结合。
✅第二步：证明在真实的生物样本中，这个肽也能结合“内源性”的Aβ和LRP1
3. Pull-down实验
把生物素标记的SP^Aβ-1固定在磁珠上，分别与5×FAD小鼠的脑裂解液（含有内源性Aβ）和肝裂解液（含有内源性LRP1）孵育
结果：用抗体检测被“钓”下来的蛋白：
- SP^Aβ-1（以及只结合Aβ的SP^Aβ-m2）能从脑裂解液中钓到Aβ
- SP^Aβ-1（以及只结合LRP1的SP^Aβ-m1）能从肝裂解液中钓到LRP1
- 只有SP^Aβ-1能同时钓到Aβ和LRP1
证明了：SP^Aβ-1不仅能结合人工合成的重组蛋白，也能结合细胞/组织中真实存在的Aβ和LRP1。
✅ 第三步：证明SP^Aβ-1的作用是“依赖于LRP1”的
4. 构建LRP1敲低的细胞（LRP1^KD）
- 用shRNA技术让HepG2细胞中的LRP1表达量下降
- 结果：在LRP1^KD细胞中，SP^Aβ-1与LRP1的结合明显减少（图S1F）免疫共沉淀实验也显示，在LRP1^KD细胞中，SP^Aβ-1富集的量减少（图S1I）
证明了：SP^Aβ-1必须靠LRP1才能发挥作用，如果没有LRP1，它就无法结合。
✅第四步：证明SP^Aβ-1是“特异性”结合LRP1，而不是其他受体
5. 检查与其他受体的结合
- 用pull-down实验检测SP^Aβ-1与另外两个已知的内吞受体ASGPR和CI-M6PR的结合情况
- 结果：SP^Aβ-1不结合ASGPR和CI-M6PR（图S1G, S1H）
证明了：SP^Aβ-1只认LRP1，不会乱抓其他受体，保证了特异性。
✅第五步：证明SP^Aβ-1能同时抓住Aβ和LRP1，形成“三明治”复合物
6. 三元复合物形成实验
- 将生物素化的SP^Aβ-1固定在磁珠上；同时加入人工合成的Aβ42肽和重组LRP1蛋白
- 结果：磁珠上同时洗脱出Aβ和LRP1
证明了：SP^Aβ-1像一个“夹子”，把Aβ和LRP1夹在了一起，形成了三元复合物这一步是证明SPYTAC机制最核心的实验：它必须同时抓住两端，才能把Aβ“拖”到LRP1旁边，启动后续的内吞和降解。
🎯总结
问题
实验
结论
这个肽能同时结合两个靶点吗？
SPR
能，SP^Aβ-1同时结合Aβ和LRP1
在真实样本中也能结合吗？
Pull-down
能，能从脑/肝裂解液中钓到靶蛋白
作用依赖于LRP1吗？
敲低LRP1
依赖，LRP1减少后结合显著下降
只结合LRP1，不结合其他受体？
检测ASGPR/CI-M6PR
不结合，特异性好
能同时抓住两个靶点形成复合物吗？
三元复合物实验
能，同时洗脱出Aβ和LRP1
作者用这一系列递进的实验，证明了：SP^Aβ-1是一个双功能分子，能特异性地同时结合Aβ和LRP1，形成三元复合物，这是后续细胞内吞和降解的分子基础。
图1. 基于LRP1的SPYTAC平台开发
a, SPYTAC介导胞外蛋白降解示意图。（左）双功能肽的设计，包含LRP1靶向基序和靶蛋白结合基序。（右）LRP1介导的内吞将靶蛋白转运至溶酶体降解。
b, SPYTAC构建体的功能基序及氨基酸序列。
c, 表面等离子体共振（SPR）传感器图显示SPs与固定化Aβ42寡聚体及LRP1簇（II、III、IV）的浓度依赖性结合。平衡解离常数（K_D）已在图中标出。NA，未测得。
d, SPR传感器图显示SP^Aβ-1与固定化Aβ42及Aβ40的单体、寡聚体、纤维的浓度依赖性结合，K_D值已在图中标出。
e, Pull-down实验显示SP^Aβ-1和SP^Aβ-m2可特异性结合5×FAD脑裂解液中的内源性Aβ（MOAB-2抗体检测），而SP^Aβ-m1和SP^Aβ-m3无结合。Input裂解液为阳性对照，IgG为阴性对照（n = 3）。
f, Pull-down实验显示SP^Aβ-1和SP^Aβ-m1可特异性结合野生型小鼠肝裂解液中的内源性LRP1（抗LRP1抗体检测），而SP^Aβ-m2和SP^Aβ-m3无结合。Input裂解液为阳性对照，IgG为阴性对照（n = 3）。
所有数据以均值±标准误表示。统计方法：单因素方差分析结合Tukey多重比较校正（e、f）。****p < 0.0001。
图S1. SPYTACs在体外与LRP1及Aβ结合的设计，与图1相关
二、SPYTACs高效诱导可溶性蛋白质的靶向降解
在成功搭建SPYTAC平台（证明肽能同时结合Aβ和LRP1）之后，作者需要回答一个更关键的问题：这个SPYTAC真的能把Aβ送进细胞里降解掉吗？如果能，它是怎么进去的？进去之后走哪条路？能不能换成其他靶点？
✅SPYTAC能不能介导“货物”被细胞吞进去？
1. 直接看“吞进去”的过程（图2A, S2B）
方法：把生物素化的SP与荧光标记的链霉亲和素（FITC-SA）一起加给细胞。如果SP结合到细胞表面，FITC-SA就会被带到细胞上。
结果：在LRP1阳性的细胞（HepG2、Huh-7等）中，加SP^Aβ-1或SP^Aβ-m1的细胞里，10分钟后就出现了很多“点状”的绿色荧光，而且这些点和溶酶体红色染料（LysoTracker）重合。加SP^Aβ-m2或SP^Aβ-m3的细胞里几乎没有信号。关键对照：在LRP1敲低的HepG2细胞（LRP1^KD）和LRP1阴性的HeLa细胞里，所有SP都没有信号。
证明了：SPYTAC必须靠LRP1才能被细胞吞进去，而且吞进去之后直接送到了溶酶体。
2. 更精确地“定量”内吞（图2B, S2D）
方法：用一种叫“pHrodo Red”的染料，它在中性环境（细胞外）不发荧光，只有进入酸性环境（内体/溶酶体）才亮。把它连在SP上，就能只看到“被吞进去”的那部分。
结果：流式细胞仪定量显示，SP^Aβ-1和SP^Aβ-m1组荧光很强，SP^Aβ-m2和m3组几乎为零。LRP1敲低后，信号大幅下降。
证明了：SPYTAC确实能带着货物进入细胞，并且进入量依赖于LRP1。
✅能不能带着“真正的垃圾Aβ”一起进去？
3. 用荧光标记的Aβ直接看（图2C, S2E, S2F）
方法：把FITC标记的Aβ42和SP一起加给细胞。
结果：只有SP^Aβ-1能显著增强FITC-Aβ的信号，而且这些信号也和溶酶体重合。LRP1敲低的细胞里没有这个效果。
证明了：SP^Aβ-1能“抓着”可溶性的Aβ，一起被吞进细胞，送进溶酶体。
4. 用pH敏感的Aβ看内吞定量（图2D, S2G）
- 方法：把pHrodo Red连在Aβ42上，再次验证。
- 结果：流式定量显示，SP^Aβ-1显著增加了Aβ的摄取，LRP1敲低后效果消失。
-双重证明：SPYTAC确实能把Aβ拉进细胞。
✅能不能把“贴在细胞膜上的Aβ”也拽下来降解？
5. 构建膜表面表达Aβ的细胞模型（图S2H, S2I）
方法：用基因工程让HepG2细胞膜上“长”出Aβ（csAβ，cell-surface Aβ）。
结果：加SP^Aβ-1后，膜上的Aβ信号随时间减少，24小时后少了约一半。
证明了：SPYTAC不仅能吞掉游离的Aβ，还能把已经“粘”在细胞膜上的Aβ“拽”下来降解掉。
✅ 能不能“换靶点”？是不是通用的？
6. 把Aβ靶向换成Myc标签（图2E, 2F）
方法：把SP的Aβ结合序列换成能结合Myc标签的序列。
结果：新设计的SP能带着抗Myc的抗体进入细胞，并送到溶酶体。
证明了：SPYTAC的平台是模块化的，只要换掉“抓垃圾的抓手”，就能去抓其他目标蛋白。
7. 证明SPYTAC也能“基因编码”（图S2J–S2M）
方法：把SP的基因序列放进细胞，让细胞自己分泌SP。
结果：细胞自己产的SP也能降解Aβ和Myc抗体。
证明了 ：SPYTAC不仅可以外源给药，未来还可以做成“基因药物”，让细胞自己持续生产。
✅它是怎么进去的？进去后怎么降解的？
8. 用抑制剂“拆解”进入和降解路径（图2G, S3）
方法：用各种小分子抑制剂，分别阻断不同的内吞途径或降解途径，看哪个环节被阻断后SP的效果消失。
结果：阻断LRP1（用RAP蛋白）→ 效果消失 → 依赖LRP1（已证明）；阻断网格蛋白介导的内吞（用蔗糖、MβCD、Pitstop2）→ 效果消失 → 走网格蛋白这条路；阻断溶酶体（用氯喹、巴弗洛霉素A1）→ 效果消失 → 最终要送去溶酶体；阻断自噬体形成或融合（用ATG7抑制剂、DC-LC3in-D、CA-5f）→ 效果部分减弱 → 可能也涉及自噬途径
证明了：SPYTAC的进入依赖LRP1和网格蛋白介导的内吞，降解主要依赖溶酶体，同时也可能涉及部分自噬-溶酶体途径。
🎯总结：
问题
关键实验
结论
能吞进去吗？
活细胞成像 + pHrodo定量
能，依赖LRP1
能带着Aβ进去吗？
FITC-Aβ + pHrodo-Aβ
能，依赖LRP1
能拽下膜上的Aβ吗？
膜表达Aβ细胞模型
能，24小时降解~50%
能换靶点吗？
换成Myc标签
能，模块化可行
能做成基因药物吗？
细胞自分泌SP
能，基因可编码
走哪条路进去？
抑制剂实验
LRP1 + 网格蛋白介导内吞
进去后去哪降解？
溶酶体/自噬抑制剂
溶酶体为主，自噬参与
这一系列实验形成了一个完整的证据链，从“吞进去”到“降解掉”，从“可溶性”到“膜结合”，从“单一靶点”到“模块化替换”，从“外源给药”到“基因编码”，层层递进，证明了SPYTAC平台的功能和机制。
图2. SPYTACs介导LRP1依赖性的内吞与降解
a, 活细胞成像显示，野生型（WT）和LRP1敲低（LRP1^KD）的HepG2细胞与FITC-SA（1 μM）及生物素化SPs（12 μM）于37°C共孵育10 min后的摄取情况。标尺：10 μm。
b, 流式细胞术定量分析野生型与LRP1^KD HepG2细胞中生物素化SPs介导的pHrodo Avidin Red内化水平（n = 3）。
c, 活细胞成像显示，野生型与LRP1^KD HepG2细胞与FITC-Aβ42（1 μM）、AF647-SA（1 μM）及生物素化SPs（12 μM）于37°C共孵育10 min后的摄取情况。标尺：10 μm。
d, 流式细胞术定量分析野生型与LRP1^KD HepG2细胞中生物素化SPs介导的pHrodo-Aβ42 Red内化水平（n = 3）。
e, f, 活细胞成像（e）及定量分析（f）显示，在HepG2细胞中，SP^Myc-1或SP^Myc-m1于37°C孵育10 min后，Cy5标记的抗Myc标签抗体的内化情况（n = 30个细胞，来自3次独立实验）。标尺：10 μm。
g, 流式细胞术定量分析不同抑制剂处理后，生物素化SP^Aβ-1/pHrodo Avidin Red的内化水平（n = 3）。
所有数据以均值±标准误表示。统计方法：双尾t检验（b、d、f）；单因素方差分析结合Tukey多重比较校正（g）。ns，无统计学差异；*p < 0.001，**p < 0.0001。
图S2. SPYTACs促进表达LRP1受体的细胞对胞外蛋白及膜蛋白的降解，与图2相关
图 S3. SPYTACs 促进 LRP1 介导的胞外蛋白溶酶体降解，与图 2 相关
三、SPYTACs会劫持肝脏，用于外周的靶向蛋白质降解
在成功证明SPYTAC在细胞水平能“吞进去、降解掉”之后，作者必须回答一个更关键的问题：在活体动物里，这套系统还好不好用？ 它能不能真的在体内抓住Aβ，并把它送到肝脏里去降解？它会不会很快被身体清除掉？
✅SPYTAC进入体内后，主要去了哪个器官？
1. 看“全身分布”（图3A, 3B, S4A–S4C）
方法：把SP^Aβ-1和荧光标记的Aβ42（Cy5.5-Aβ42）一起静脉注射到小鼠体内。15分钟后，处死小鼠，取出各个器官，用近红外成像仪拍照。对照组用SP^Aβ-m3（无效肽）或单独注射Cy5.5-Aβ42。
结果：单独注射Cy5.5-Aβ42，主要分布在肾（代谢排泄）。注射SP^Aβ-m3 + Cy5.5-Aβ42，和单独注射Aβ差不多，说明无效肽不能改变Aβ的分布。注射SP^Aβ-1 + Cy5.5-Aβ42，荧光信号主要在肝脏，而不是肾脏。对照实验（图S4A–S4C）：只注射Cy5.5-SA（链霉亲和素，没有连SP），信号也在肾，说明SP^Aβ-1是导致肝脏蓄积的关键。
证明了：SP^Aβ-1能“劫持”Aβ，把Aβ从“走肾”改为“走肝”。肝脏成为Aβ的主要清除场所。
2. 看“细胞层面的分布”（图3C, S4D, S4E）
方法：用更精细的方法看肝脏里的信号到底在哪儿。把生物素化的SP^Aβ-1和Cy5.5-SA（远红荧光）一起注射到绿色荧光小鼠（全身细胞发绿光）体内，然后取新鲜肝脏，在显微镜下直接看。
结果：SP^Aβ-1组：荧光信号出现在肝细胞内部（绿色背景里有许多红色的点）。
SP^Aβ-m3组：荧光信号稀疏，而且是在细胞之间（血管或间隙），不在细胞里面。
证明了：SP^Aβ-1不仅把Aβ带到了肝脏，而且是被肝细胞吞进去了，而不是滞留在血管里。
✅SPYTAC把Aβ带进肝细胞后，有没有送到溶酶体？
3. 看Aβ和溶酶体是否在一起（图3D, 3E）
方法：把FITC标记的Aβ42和SP一起注射给小鼠。15分钟后取肝脏，做冰冻切片，用抗体标记溶酶体（LAMP1，白色），用共聚焦显微镜看。
结果：只注射FITC-Aβ42：肝脏里有很弱的绿色荧光，但不和溶酶体重合。注射SP^Aβ-1 + FITC-Aβ42：绿色荧光（Aβ）和白色荧光（溶酶体）高度重合。注射SP^Aβ-m3 + FITC-Aβ42：和单独注射Aβ差不多，没有共定位。定量分析（图3E）：SP^Aβ-1组，约60%的Aβ信号与溶酶体共定位。
证明了：SP^Aβ-1成功地把Aβ“拖”进了肝细胞的溶酶体，这是降解的前奏。
4. 其他器官检查（图S4E）
方法：看肾脏里的信号分布。
结果：SP^Aβ-1组在肾脏的信号主要局限在血管里，没有进入肾细胞。
证明了：SP^Aβ-1主要靶向肝脏，对肾脏没有非特异性蓄积。
✅SPYTAC本身在体内稳定吗？（药代动力学）
5. 体外稳定性（Table S3部分内容）
方法：把SP^Aβ-1放在大鼠的血浆、脑脊液、肝匀浆、脑匀浆里，37°C孵育，用质谱（LC-MS/MS）检测剩余肽的量。
结果：
-血浆：半衰期约331分钟（5.5小时）；
-脑脊液：半衰期约265分钟（4.4小时）；
-肝/脑匀浆：很快被降解（组织里蛋白酶多）
说明了：SP^Aβ-1在血液和脑脊液中相对稳定，但一旦进入细胞（组织匀浆），很快被降解。
6. 体内稳定性（Table S3）
方法：给大鼠和小鼠静脉注射SP^Aβ-1，不同时间点取血浆和脑脊液，用质谱检测。
结果：在血液中的半衰期只有几分钟，比体外快得多。
为什么：因为体内有复杂的“吸收、分布、代谢、排泄”过程（肾脏过滤、肝脏摄取、蛋白水解等），加速了肽的清除。
重要启示：SP^Aβ-1虽然体外稳定，但在体内清除很快，因此可能需要每天给药，或者需要后续改进（比如用D-型氨基酸、环化等）来延长半衰期。
🎯总结：
问题
实验
结论
进入体内后去哪了？
全身器官成像
主要到肝脏（“劫持”肝脏）
到肝脏后是进去了还是飘在外面？
活体共聚焦
被肝细胞吞进去了
进去之后去哪了？
溶酶体共定位
送到了溶酶体
能改变Aβ的体内命运吗？
对照注射Aβ
能，让Aβ从“走肾”变“走肝”
肾脏有蓄积吗？
肾脏成像
没有，信号在血管里，没进细胞
肽本身稳定吗？
质谱测定半衰期
体外稳定（几小时），体内清除快（几分钟）
图3. SPYTACs在体内利用肝脏实现胞外靶向蛋白降解
a, 近红外成像显示，Cy5.5标记的Aβ42与SP^Aβ-1或SP^Aβ-m3共注射15 min后，在器官中的分布情况。
b, 图a中各器官Cy5.5-Aβ42水平的定量分析（n = 3只小鼠）。
c, 活体共聚焦成像显示，在EGFP小鼠肝脏中，生物素化SP^Aβ-1或SP^Aβ-m3（Cy5.5-SA/红色）的亚细胞分布（n = 3只小鼠）。
d, 共聚焦成像分析显示，在注射SPYTACs与Aβ42（或仅Aβ42）的小鼠肝细胞中，生物素化SPs（Cy5-SA/红色）与FITC-Aβ42（绿色）在溶酶体（Lamp1/白色）的共定位情况。细胞核以DAPI染色（蓝色）。标尺：5 μm。
e, （左）生物素化SP^Aβ-1与溶酶体共定位的百分比；（右）图d中经SPYTACs处理小鼠肝细胞中FITC-Aβ42摄取量的相对定量分析（n = 3只小鼠）。
所有数据以均值±标准误表示。统计方法：单因素方差分析结合Tukey多重比较校正（b、e）。ns，无统计学差异；p < 0.05，**p < 0.001。
图S4. SPYTACs在体内将蛋白靶向肝脏，与图3相关
四、SPYTACs对BBB具有通透性，并促进大脑中细胞外蛋白的降解
在成功证明 SPYTAC 在外周（肝脏）能高效降解 Aβ 之后，作者需回答另一个更关键的问题：阿尔茨海默病的关键病理在大脑里，SPYTAC 能不能穿过血脑屏障，进入大脑去降解已经沉积的 Aβ 斑块？
✅SPYTAC 能不能穿过血脑屏障进入大脑？
1. 先看进入大脑了吗？（图4A, 4B）
方法：给 5×FAD 小鼠（脑内有大量 Aβ 斑块）注射生物素化的 SP^Aβ-1 或对照 SP^Aβ-m3。用 Cy3-SA（红色荧光）来标记生物素（和前面一样，用链霉亲和素显色）。然后取脑切片，用抗 Aβ 抗体（MOAB-2，绿色）染斑块，看红色信号在哪里。
结果：SP^Aβ-1 组：红色荧光出现在脑内，而且集中在 Aβ 斑块周围（红色和绿色重叠）。
SP^Aβ-m3 组：几乎没有红色信号，或者很弱的弥散背景。定量（图4B）：SP^Aβ-1 与 Aβ 的共定位比例显著高于 SP^Aβ-m3。
证明了：SP^Aβ-1 不仅能穿过血脑屏障，还能主动找到脑内的 Aβ 斑块并聚集在它周围。
✅穿进去之后，有没有把 Aβ 送到溶酶体？
2. 看“内源性”Aβ 是否被拖进溶酶体（图4C, 4D）
方法：这次不注射外源的荧光 Aβ，而是直接用 5×FAD 小鼠（自身脑内就有 Aβ）。注射 FITC 标记的 SP^Aβ-1（绿色）或对照肽。然后取脑切片，用抗体同时染 Aβ（MOAB-2，红色）和溶酶体（LAMP1，白色），看三者是否在一起。
结果：SP^Aβ-1 组：绿色（SP）、红色（Aβ）、白色（溶酶体）三者高度重合。SP^Aβ-m3 组：几乎没有绿色信号，红色和白色也不重合。定量（图4D）：SP^Aβ-1 组中，溶酶体里有大量绿色信号（意味着 SP 进去了），而且 Aβ 和溶酶体的共定位也显著增加。
证明了：SP^Aβ-1 不仅自己进了脑，还成功地把脑内原有的、沉积的 Aβ“拖”进了溶酶体。
3. 用“外源”Aβ 再验证一次（图S5A）
方法：换一种方式，给正常野生型小鼠注射 FITC 标记的 SP（绿色）和 HF555 标记的 Aβ（红色）。看它们进入脑细胞后，是否一起出现在溶酶体里。
结果：SP^Aβ-1 组，绿色和红色信号在溶酶体里重合；SP^Aβ-m3 组没有。
双重验证：无论是内源性 Aβ（5×FAD 小鼠），还是外源性 Aβ（野生型小鼠注射），SP^Aβ-1 都能把它们送进溶酶体。
✅进入大脑后，被哪些细胞吞了？
4. 看细胞类型（图S5B）
方法：用免疫荧光染色，标记不同的脑细胞类型（小胶质细胞 Iba1、星形胶质细胞 GFAP、神经元 NeuN），看 FITC-SP^Aβ-1（绿色）在哪些细胞里。
结果：绿色信号出现在小胶质细胞、星形胶质细胞、神经元里都有。
证明了：SP^Aβ-1 能进入多种脑细胞，不仅仅是内皮细胞或免疫细胞，这对广泛清除脑内 Aβ 很重要。
✅体外模拟——穿越血脑屏障的机制是什么？
5. 先看脑内皮细胞（bEnd.3）能否摄取 SPYTAC（图4E, 4F）
方法：用小鼠脑内皮细胞系 bEnd.3（表达 LRP1）做细胞摄取实验。加生物素化 SP 和 pHrodo Red Avidin（酸性发红），用流式细胞仪定量。
结果：能结合 LRP1 的 SP（SP^Aβ-1 和 SP^Aβ-m1）被细胞大量摄取；不能结合 LRP1 的 SP（SP^Aβ-m2 和 SP^Aβ-m3）几乎没有摄取。
证明了：脑内皮细胞摄取 SPYTAC 也依赖 LRP1。
6. 其他脑细胞也类似（图S5C–J）
在人胶质瘤细胞（U251）、星形胶质细胞（C8-D1A）、小胶质细胞（BV2）、神经母细胞瘤细胞（N2A）中重复，结果一致：SP^Aβ-1 和 SP^Aβ-m1 被高效摄取，送到溶酶体；SP^Aβ-m2 和 m3 无效。
证明了：SPYTAC 的 LRP1 依赖机制在不同脑细胞中通用。
✅体外血脑屏障模型——验证“穿越”
7. 建立体外血脑屏障模型（图4G, S5K）
方法：在 Transwell 小室的上层种 bEnd.3 细胞（模拟血管内皮），下层种 U251 细胞（模拟脑实质）。培养 7 天，等内皮细胞形成致密单层（用电阻 TEER > 200 验证屏障完整性）。然后在上层加 SP，看下层 U251 细胞是否能收到信号。
结果：SP^Aβ-1 组：下层 U251 细胞里有明显的绿色荧光（FITC-SA），说明 SP 穿过了内皮层。
SP^Aβ-m3 组：下层几乎没有信号。
证明了：SP^Aβ-1 能穿过由 bEnd.3 细胞构成的体外血脑屏障。
8. 带“货物”一起穿（图4H, 4I）
方法：把 SP 和 pHrodo Red Avidin（或连了生物素的 Aβ）一起加在上层，看下层细胞能否收到“红色货物”。
结果：SP^Aβ-1 能把红色货物送到下层细胞，SP^Aβ-m3 不能。
证明了：SP^Aβ-1 不仅能自己穿过去，还能“带着”Aβ 一起穿。
✅穿越血脑屏障是否依赖 LRP1？
9. 敲低内皮细胞的 LRP1（图4J）
方法：用 LRP1 敲低的 bEnd.3 细胞构建屏障模型（上层），下层是正常 U251 细胞。
结果：SP^Aβ-1 的跨细胞转运能力显著下降（下层细胞荧光减少）。
证明了：SP^Aβ-1 穿越内皮细胞依赖于内皮细胞上的 LRP1。
10. 敲低/敲除下层脑细胞的 LRP1（图4K, 4L）
方法：上层用正常 bEnd.3 细胞，下层用 LRP1 敲低或敲除的 U251 细胞。
结果：SP^Aβ-1 虽然能穿过去，但到达下层后，被 U251 细胞摄取的能力显著下降。
证明了：SP^Aβ-1 进入脑细胞（实质细胞）这一步，也依赖于靶细胞上的 LRP1。
🎯总结：
问题
实验
结论
能进入大脑吗？
5×FAD 脑切片成像
能，而且主动聚集到 Aβ 斑块周围
进去后能降解脑内原有的 Aβ 吗？
5×FAD 脑切片三色共定位
能，把 Aβ 拖进溶酶体
进入后去了哪些细胞？
细胞类型免疫染色
小胶质细胞、星形胶质细胞、神经元
穿越血脑屏障依赖什么？
体外 BBB 模型 + LRP1 敲低
依赖内皮细胞的 LRP1
进入脑细胞依赖什么？
敲低/敲除脑细胞 LRP1
依赖靶细胞的 LRP1
图4. SPYTACs穿越血脑屏障并促进脑内Aβ降解
a, （左）全脑荧光成像显示，生物素化SP^Aβ-1（Cy3-SA/红色）在5×FAD小鼠脑内的信号强于SP^Aβ-m3处理组。标尺：500 μm。（右）高倍共聚焦图像显示，生物素化SP^Aβ-1（Cy3-SA/红色）优先聚集于Aβ斑块（MOAB-2/绿色）周围，而SP^Aβ-m3呈弥散背景信号。CTX，皮层；CC，胼胝体；HIP，海马。标尺：20 μm。
b, 脑各区SP与Aβ共定位比例的定量分析（n = 3只小鼠/组）。
c, 代表性成像显示，FITC-SP^Aβ-1（绿色）而非FITC-SP^Aβ-m3，与Aβ（MOAB-2/红色）及溶酶体（Lamp1/白色）在5×FAD小鼠脑切片中共定位；在野生型小鼠中，FITC-SPs与Cy3-Aβ42（红色）也呈现共定位。标尺：3 μm。
d, 注射后5×FAD小鼠脑内SPYTACs与Lamp1溶酶体共定位信号的定量分析（n = 4只小鼠）。
e, 流式细胞术检测小鼠脑内皮细胞（bEnd.3）中生物素化SPs介导的pHrodo Avidin Red（10 μg/mL）内吞作用。
f, 图e中平均荧光强度（MFI）的流式细胞术定量分析（n = 3）。
g, （上）体外血脑屏障模型示意图，顶部为bEnd.3细胞，底部为U251细胞，显示SPYTACs从顶室转运并被U251细胞摄取。（下）活细胞成像显示SPYTACs介导的FITC-SA在U251细胞中的摄取，并定位于溶酶体（LysoTracker，红色）。标尺：10 μm。
h, （上）血脑屏障模型示意图，显示生物素化SP^Aβ-1和SP^Aβ-m3处理下，pHrodo Avidin Red靶向递送至U251细胞进行溶酶体降解。（下）流式细胞术定量分析平均荧光强度（n = 3）。
i, （上）血脑屏障模型示意图，显示SP^Aβ-1和SP^Aβ-m3处理下，pHrodo Avidin Red/生物素化Aβ42靶向递送至U251细胞进行溶酶体降解。（下）流式细胞术定量分析平均荧光强度（n = 3）。
j, （上）生物素化SPs经LRP1穿越血脑屏障并将pHrodo Avidin Red递送至U251细胞示意图。（下）流式细胞术定量分析显示，LRP1敲低（LRP1^KD）的bEnd.3细胞中跨细胞转运减少（n = 3）。
k, l, （上）生物素化SPs穿越血脑屏障后经LRP1在U251细胞内吞示意图。（下）流式细胞术分析显示，LRP1敲低（k）和LRP1敲除（l）的U251细胞中内吞作用减少（n = 3）。
所有数据以均值±标准误表示。统计方法：双尾t检验（b、d、j–l）；单因素方差分析结合Dunnett多重比较校正（f、h、i）。ns，无统计学差异；p < 0.05，***p < 0.0001。
图S5. SPYTACs具有LRP1依赖性的血脑屏障穿透能力，与图4相关
五、SPYTAC治疗在AD小鼠模型中前驱期的疗效
在成功证明 SPYTAC 能穿越血脑屏障、进入大脑、并将 Aβ 送进溶酶体之后，作者回答下一个问题：这套系统在活体动物中到底有没有治疗效果？ 它能不能真正改善阿尔茨海默病的病理和认知功能？和现有的抗体疗法（lecanemab）相比，效果如何？安全性怎么样？
✅第一步：先确定怎么给药（图5A）
实验逻辑：前面药代动力学发现SP^Aβ-1在体内清除很快（半衰期几分钟），所以必须高频给药。
怎么做：给5月龄的5×FAD小鼠每天腹腔注射20 mg/kg，连续30天。对照组用已上市的抗Aβ抗体lecanemab（阳性对照）和无效的IgG（阴性对照）。
结果：SP^Aβ-1组血浆Aβ下降约50%，比lecanemab组还略好一点。
证明了：每天给药是有效的，能显著降低外周Aβ。
✅脑内的Aβ斑块有没有减少？（图5B-5D, S6A-6B）
实验逻辑：光降外周的不够，得看大脑里最核心的病理——Aβ斑块。
怎么做：
-用Thio-S和抗Aβ抗体染色脑切片，直接数斑块数量和面积。
-用化学方法分别提取可溶性Aβ（可能致病的寡聚体）和不可溶性Aβ（斑块），用ELISA定量。
结果：
-SP^Aβ-1组：斑块数量和面积都减少40%以上，效果比lecanemab组还好。
-SP^Aβ-1组：可溶性和不可溶性Aβ都显著下降。
-lecanemab组：只降了可溶性Aβ，不可溶的没变化。
证明了：SP^Aβ-1不仅能清除可溶性的致病Aβ，还能“啃掉”已经沉积的斑块，而抗体主要作用于可溶性形式。
✅斑块被清除后，形态有什么变化？（图5E, S7A）
实验逻辑：清除过程中斑块形态会改变，这可能反映不同的清除机制。
怎么做：他们根据形态把斑块分成三种类型，统计治疗后各种类型的比例。
结果：SP^Aβ-1组出现了特有的“III型”斑块（可能是正在被清除的中间状态），而lecanemab组没有。
证明了：SP^Aβ-1可能通过一种不同于抗体的机制来清除斑块。
✅神经元和突触有没有被保护？（图5F-5G, S7B-7G）
实验逻辑：光清斑块不够，最终得保护神经元。
怎么做：
- 用NeuN染色看神经元存活，测量海马CA1区细胞层厚度。
- 用Golgi染色看树突棘密度（突触功能的关键指标）。
结果：
- SP^Aβ-1组：神经元丢失显著减少，树突棘密度恢复接近正常。
- lecanemab组：虽然也有保护，但效果不如SP^Aβ-1。
证明了：SP^Aβ-1能更好地保护神经元和突触。
✅认知功能有没有改善？（图5H-5L）
实验逻辑：病理改善了，行为上要能体现出来才行。
怎么做：
-水迷宫：测试空间学习和记忆。小鼠需要找到水下隐藏平台，连续训练5天，最后一天撤掉平台，看小鼠在目标象限停留的时间。
-新物体识别：测试识别记忆。第一天给两个相同物体，第二天换一个新物体，看小鼠探索新物体的时间。
结果：- SP^Aβ-1组：找到平台的潜伏期缩短（学习能力恢复），目标象限停留时间增加（记忆巩固恢复），探索新物体的时间也增加了（识别记忆恢复）。- 效果和lecanemab组相当，但SP^Aβ-1组在某些指标上（如斑块清除、神经元保护）还略优。
证明了：SP^Aβ-1能有效改善认知功能，效果不亚于已上市的抗体。
🎯总结：
问题
实验
结论
能降低外周Aβ吗？
血浆ELISA
能，降50%
能减少脑内Aβ斑块吗？
Thio-S染色
能，斑块数量和面积都减少40%以上
能清除可溶性和不可溶性Aβ吗？
脑组织分级提取ELISA
能，两者都降；抗体只降可溶性
能保护神经元和突触吗？
NeuN染色、树突棘计数
能，神经元丢失减少，突触密度恢复
能改善认知功能吗？
水迷宫、新物体识别
能，学习、记忆、识别记忆都恢复
和现有抗体比怎么样？
直接对比lecanemab
斑块清除更强，神经元保护更好，认知改善相当
图5. SPYTACs治疗改善前驱期5×FAD小鼠的AD病理
a, SPYTAC或lecanemab治疗后5×FAD小鼠的血浆Aβ42水平（n = 4只小鼠）。
b, c, 5×FAD^veh、5×FAD^Lecam和5×FAD^SP小鼠脑切片的Thio-S染色（b）及Aβ斑块数量与面积定量分析（c）（n = 5只小鼠/组）。标尺：500 μm（左），250 μm（右）。
d, 用二乙胺和甲酸提取脑组织匀浆后的Aβ水平（n = 6只小鼠）。
e, 各组Aβ斑块类型比例的定量分析（n = 5只小鼠，每种条件分析100个斑块）。
f, 治疗后野生型和5×FAD小鼠海马切片的代表性免疫荧光图像，神经元以NeuN（红色）染色，Aβ斑块以MOAB-2（绿色）染色。标尺：200 μm。
g, 海马细胞层厚度定量分析（n = 6个切片，来自3只小鼠）。
h, i, Morris水迷宫实验中，5×FAD^SP小鼠寻找平台的潜伏期缩短（h），目标象限穿越次数增加（i），而游泳速度无变化（i）（n = 9~11只小鼠/组）。
j, 第6天探针测试中小鼠的代表性运动轨迹图像。
k, l, 新物体识别测试（NOR）中代表性运动轨迹图像（k），以及探索熟悉物体和新物体的时间百分比（l）（n = 9~11只小鼠/组）。
所有数据以均值±标准误表示。统计方法：单因素方差分析结合Tukey多重比较校正（a、g、i）；单因素方差分析结合Dunnett多重比较校正（c、d、h、i）；双尾t检验（l）。ns，无统计学差异；p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001，****p < 0.0001。
图S6. 早期5×FAD小鼠SPYTAC有效治疗，与图5相关
图S7. 早期5×FAD小鼠SPYTAC有效治疗，与图5相关
六、SPYTAC可最大限度减少Aβ抗体治疗的副作用
在证明了SPYTAC在前驱期和症状期都有效之后，作者面临一个更关键的挑战：和现有疗法（抗体）相比，SPYTAC是否更安全？ 毕竟，抗Aβ抗体虽然有效，但会带来严重的副作用——脑水肿、脑微出血、神经炎症。作者一步步证明SPYTAC比抗体更安全。
🎯抗体有哪些已知副作用？
背景知识：抗Aβ抗体（如lecanemab、aducanumab）虽然能清除Aβ，但会带来三大副作用：
CAA加重：抗体可能导致Aβ在血管壁上沉积更多，形成“脑血管淀粉样蛋白病”。
脑微出血：血管壁变脆，容易破裂，引起微小出血。
神经炎症：抗体的Fc段会激活免疫细胞（小胶质细胞、巨噬细胞），释放大量炎症因子，反而损伤神经元。
作者接下来要证明：SPYTAC能避免这些副作用。
✅第一步：SPYTAC会不会加重CAA？（图6A）
实验逻辑：直接看血管周围有没有Aβ沉积。
怎么做：用Thio-S（染Aβ）和CD31（染血管内皮）共染脑切片。如果Aβ和血管重合，就是CAA。
结果：
-lecanemab组：约20%的小鼠出现明显的CAA（血管周围Aβ沉积）。
-SP^Aβ-1组：和未治疗组一样，只有背景水平的Aβ在血管附近（正常生理情况）。
证明了：SPYTAC不会像抗体那样加重CAA。
✅第二步：SPYTAC会不会引起脑微出血？（图6B-6C）
实验逻辑：CAA加重后，血管会变脆，容易出血。得直接看有没有出血。
怎么做：
-诱导CAA：先把APP/PS1小鼠（另一种AD模型）的脑匀浆注射到8月龄5×FAD小鼠脑室，强制诱导CAA（这样能放大副作用，方便比较）。
-治疗：每天腹腔注射SP^Aβ-1、lecanemab或IgG，持续1个月。
检测出血：用普鲁士蓝染色，检测脑组织中的“铁沉积”（红细胞破裂后留下的含铁血黄素，是微出血的标志）。
结果：
-Lecanemab组：出现大量微出血（蓝色铁沉积点）。
-SP^Aβ-1组：和未治疗组一样，只有背景水平的微出血。
证明了：SPYTAC不会引起脑微出血，而抗体却会显著增加出血风险。
✅ 第三步：SPYTAC会不会激活神经炎症？（图6D）
实验逻辑：抗体激活炎症的另一条途径是Fc段，SPYTAC没有Fc段，理论上不应该激活炎症。
怎么做：用ELISA检测脑组织中的炎症因子（TNF-α、IL-6）。
结果：
-lecanemab组：TNF-α和IL-6都显著升高。
-SP^Aβ-1组：炎症因子水平很低，和未治疗组差不多。
证明了：SPYTAC不会像抗体那样激活神经炎症。
✅第四步：SPYTAC如何改变细胞的基因表达？（图6E-6F, S8F）
实验逻辑：炎症因子是蛋白水平的证据，还需要看细胞里基因水平的变化。用单细胞RNA测序，看所有细胞群中炎症相关基因的表达。
怎么做：取治疗组小鼠的海马组织，做单细胞RNA测序（scRNA-seq），分析16,943个细胞，分成15个细胞群（图S8C-8E）。
结果：
-lecanemab组：炎症因子（Tnf、Il6）、趋化因子（Ccl9、Cxcl16）、NF-κB通路激活基因（Nfkb2、Rela、Myd88）都上调。
-SP^Aβ-1组：这些基因都下调，同时上调了NF-κB的抑制因子（Nfkbia）。
-SP^Aβ-1还抑制了与细胞死亡相关的基因（焦亡、凋亡、坏死）。
证明了：在基因水平，SPYTAC抑制炎症，而抗体却激活炎症。
✅第五步：小胶质细胞（大脑的“免疫细胞”）发生了什么变化？（图6G-6H, S8G-8J）
实验逻辑：小胶质细胞是神经炎症的核心执行者。它们有两种状态：促炎的DAM（疾病相关小胶质细胞）和保护性的小胶质细胞。
怎么做：从单细胞数据中专门挑出小胶质细胞（cluster 0,2,3），分析它们的基因表达谱。
结果：
-lecanemab组：小胶质细胞高表达促炎基因（NF-κB、AP-1通路），炎症小体相关基因（Casp-8、Casp-1）上调，处于“炎症性小胶质细胞”状态（DAM）。
-SP^Aβ-1组：小胶质细胞高表达NF-κB抑制因子，以及多个研究报道的“疾病保护性小胶质细胞”标志基因（如Clec7a、Spp1等）。
证明了：SPYTAC能让小胶质细胞从“促炎状态”转向“保护状态”，而抗体却让它们停留在“促炎状态”甚至加剧。
✅第六步：星形胶质细胞（另一类重要胶质细胞）发生了什么变化？（图6I-6J, S8K-8L）
实验逻辑：星形胶质细胞也会在疾病中反应，分为“疾病相关星形胶质细胞”（DAA）和“保护性星形胶质细胞”。
怎么做：从单细胞数据中专门挑出星形胶质细胞（cluster 9），分析它们的基因表达谱。
结果：
-lecanemab组：星形胶质细胞高表达DAA基因（如Gfap、Serpina3n）和炎症因子基因。
-SP^Aβ-1组：星形胶质细胞高表达“保护性星形胶质细胞”标志基因。
证明了：SPYTAC也能让星形胶质细胞转向保护状态，而抗体却让它们变成疾病相关状态。
🎯总结：
问题
实验
结论
会加重CAA吗？
血管+Aβ共染
SPYTAC不加重，抗体会加重
会引起脑微出血吗？
诱导CAA+普鲁士蓝
SPYTAC不增加出血，抗体显著增加
会激活神经炎症吗？
ELISA测炎症因子
SPYTAC不激活，抗体激活
细胞水平看，炎症基因是升高还是降低？
单细胞测序（整体）
SPYTAC降低炎症基因，抗体升高
小胶质细胞是促炎还是保护？
单细胞测序（小胶质细胞子集）
SPYTAC让它们转向“保护状态”，抗体让它们变成“促炎状态”
星形胶质细胞是促炎还是保护？
单细胞测序（星形胶质细胞子集）
SPYTAC让它们转向“保护状态”，抗体让它们变成“促炎状态”
图6. SPYTACs为5×FAD小鼠提供安全的AD治疗
a, 治疗后5×FAD小鼠脑血管淀粉样蛋白（CAA，Thio-S/CD31阳性）的代表性图像（左）及定量分析（右）（n = 5只小鼠）。标尺：20 μm。
b, 8月龄5×FAD小鼠CAA诱导及后续腹腔注射治疗的实验流程示意图。
c, （左）普鲁士蓝染色的代表性共聚焦图像（黑色箭头示微出血）；（右）CAA诱导后接受治疗的小鼠脑微出血频率定量分析（n = 5）。标尺：200 μm。
d, 治疗后5×FAD小鼠脑中促炎蛋白水平（n = 5只小鼠）。
e, 不同治疗组小鼠海马中促炎基因表达的Dot plot图。点的大小表示表达该基因的细胞百分比，颜色表示平均表达水平。
f, 治疗组小鼠海马中Tnf和Il6 mRNA表达水平的Violin图。
g, 不同治疗组小鼠全小胶质细胞、稳态小胶质细胞、1期疾病相关小胶质细胞（DAM-1）和DAM-2中，参与炎症NF-κB和炎症小体信号通路的基因表达的Dot plot图。点的大小表示表达该基因的细胞百分比，颜色表示平均表达水平。
h, 治疗组小鼠小胶质细胞差异表达基因（DEGs）的热图。该基因集识别出疾病保护性小胶质细胞状态（每组n = 3只小鼠）。
i, 不同治疗组小鼠海马中DAA基因表达的Dot plot图。点的大小表示表达该基因的细胞百分比，颜色表示平均表达水平。
j, 治疗组小鼠星形胶质细胞差异表达基因（DEGs）的热图。该基因集识别出疾病保护性星形胶质细胞状态（每组n = 3只小鼠，p < 0.05）。
所有数据以均值±标准误表示。统计方法：单因素方差分析结合Dunnett多重比较校正（a、c、d）；单因素方差分析结合Tukey多重比较校正（f）。ns，无统计学差异；p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001，****p < 0.0001。
图S8. SPYTAC治疗5×FAD小鼠的安全性，与图6相关
七、SPYTAC在症状阶段改善AD型病理和认知障碍
在证明了SPYTAC在前驱期（5月龄）有效且比抗体更安全之后，作者还需要回答一个更严苛的问题：如果等到疾病已经进入症状期（大脑里已经堆满了斑块，小鼠已经出现明显认知障碍），再开始治疗，SPYTAC还管用吗？ 毕竟临床上的阿尔茨海默病患者大多是在出现症状后才就诊，所以验证症状期的疗效至关重要。作者一步步证明SPYTAC在症状期依然有效且安全的。
实验设计思路
模型：9月龄的5×FAD小鼠（这个年龄已经有大量Aβ斑块、神经元丢失和明显的认知障碍，相当于人类的中晚期AD）。
给药：同样每天腹腔注射SP^Aβ-1，连续30天。对照组只用IgG（5×FAD^veh）。因为前面已经和抗体做过头对头比较，这里主要证明SPYTAC本身在症状期是否有效，所以没有再用lecanemab对照。
✅第一步：脑内Aβ水平有没有降低？（图7A-7C，S9A）
实验设计：
-图7A：直接用ELISA检测脑内可溶性Aβ42的水平。
-图7B-7C：用Thio-S染色，统计海马和皮层中Aβ斑块的数量和面积。
-图S9A：用抗Aβ抗体（MOAB-2）染脑切片，直观显示斑块减少。
结果：图7A：SP^Aβ-1组脑内Aβ42水平显著下降。图7B-7C：斑块数量和面积都显著减少。
证明了：即使在症状期，SPYTAC依然能有效清除已经大量沉积的Aβ斑块。
✅第二步：神经元和突触有没有被保护？（图7D-7E，S9B-9C）
实验设计：
-图7D-7E：用NeuN染色标记神经元，测量海马CA1区细胞层厚度（代表神经元存活）。用抗突触素（synaptophysin）和抗VGlut1抗体检测突触蛋白表达（Western blot）。
-图S9B-9C：用GFAP（星形胶质细胞标记）和Iba1（小胶质细胞标记）染色，看胶质细胞是否过度活化（神经炎症的标志）。
结果：神经元厚度恢复，突触蛋白表达回升。胶质细胞活化显著减轻。
证明了：SPYTAC不仅能清除斑块，还能保护神经元和突触，同时抑制神经炎症。
✅第三步：认知功能有没有改善？（图7F-7I，S9D）
实验设计：
-水迷宫（图7F-7H）：测试空间学习与记忆。小鼠需要找到水下隐藏平台，连续训练5天，第6天撤掉平台，看小鼠在目标象限停留的时间。
-Y迷宫（图S9D）：测试空间工作记忆。小鼠探索三个臂，计算自发交替率（正常小鼠会倾向于交替进入不同的臂）。
-新物体识别（图7I）：测试识别记忆。第一天给两个相同物体，第二天换一个新物体，看小鼠探索新物体的时间。
结果：SP^Aβ-1组：找到平台的潜伏期缩短（学习能力恢复），目标象限停留时间增加（记忆巩固恢复），自发交替率提高，对新物体的探索时间显著增加。运动能力没有差异（图S9E-9F，开放场测试），说明认知改善不是由于运动能力变化。
证明了：SPYTAC能显著改善症状期小鼠的多种认知功能（空间学习、空间记忆、工作记忆、识别记忆）。
✅第四步：有没有全身毒性？（图S9G-9I）
实验设计：
-肝功能（图S9G）：检测血清中ALT、AST、GGT、总蛋白水平（肝损伤的经典指标）。
-组织病理（图S9H）：取肝脏、肺、肾、心脏做H&E染色，看有无炎症、坏死等损伤。
-体重（图S9I）：记录治疗期间体重变化。
结果：肝功能指标正常，组织切片未见异常，体重无明显变化。
证明了：连续给药1个月没有引起肝毒性或其他脏器损伤，安全性良好。
🎯总结：
问题
实验
结论
能清除脑内Aβ吗？
ELISA、Thio-S染色
能，斑块数量和Aβ水平显著下降
能保护神经元和突触吗？
NeuN染色、突触蛋白Western blot
能，神经元存活恢复，突触蛋白回升
能抑制神经炎症吗？
GFAP、Iba1染色
能，胶质细胞活化减轻
能改善认知吗？
水迷宫、Y迷宫、新物体识别
能，空间学习、记忆、工作记忆、识别记忆都改善
有肝毒性或其他毒性吗？
肝功能、脏器切片、体重
无明显毒性
图7. SPYTAC缓解了有症状的5-FAD小鼠的AD型病态和认知障碍×
（a）Aβ水平42以及Aβ40在处理后5×FAD小鼠的大脑中（n=6只小鼠）。
（B和C）5×FAD中Thio-S染色（B）及Aβ斑块（C）数量和面积的代表性图像Veh以及5×FADSP小鼠大脑（n = 5或6只小鼠）。比例杆，500微米（上方），10微米（下方）。
（D和E）海马体脊数的高尔基染色（D）和定量（E）分析（n=3只小鼠）。比例杆，500微米（上方），5微米（下方）。
（F和G）在莫里斯水迷宫测试中，5×FADSP小鼠表现出改善定位平台的延迟（F）和目标穿越次数（G）的增加，而游动速度（G）则未变（每组8到10只）。
（H）探针测试第6天小鼠的代表性追踪图像。
（I） 运动代表性图像追踪NOR测试（上方），以及探索熟悉和新奇物体所占时间百分比（下层）（每组n = 8到10只小鼠）。
所有数据均以SEM±平均值呈现。无配对双尾t检验（C）;带有图基修正（A和E）的单向方差分析;无配对双尾T检验（F、G和I）。ns，无意义;∗p < 0.05，∗∗p < 0.01，∗∗∗p < 0.001，以及∗∗∗∗< 0.0001。
图S9. SPYTAC改善晚期×5期5FAD小鼠的AD型病变和认知障碍，与图7相关
讨论
本研究开发了一种基于合成肽的胞外靶向蛋白降解平台——SPYTACs。它通过“双功能肽”同时结合致病蛋白（如Aβ）和细胞表面的LRP1受体，利用受体介导的内吞将Aβ送入溶酶体降解。更重要的是，LRP1受体还能帮助SPYTACs高效穿越血脑屏障，实现外周与脑内协同清除Aβ，显著改善5×FAD小鼠的病理和认知功能。
一、平台创新：可编程、易合成、低免疫原性
1. 可编程性高 SPYTACs采用全合成肽设计，可灵活替换N端的靶向肽和C端的受体结合肽，理论上可适配多种致病蛋白（如tau、α-synuclein）和不同内吞受体（如ASGPR、CI-M6PR），为多种疾病提供通用降解平台。
2. 生产简便、成本可控 与抗体偶联物或纳米颗粒相比，合成肽的制备更简单、成本更低，且易于质量控制，有利于临床转化。
3. 安全性优势
不含Fc段，避免抗体疗法常见的Fc受体介导的炎症反应和免疫细胞过度活化
不依赖转染或基因整合，无插入突变风险，优于DNA类适配体
二、治疗策略：外周+中枢协同清除Aβ
SPYTACs同时靶向外周和中枢的Aβ，实现双重清除：（1）肝脏途径：快速清除血浆中的Aβ，阻断其向脑内转运（2）脑内途径：穿越血脑屏障，直接降解已沉积的Aβ斑块
这种“内外夹击”策略在5×FAD小鼠中表现出显著疗效：（1）Aβ斑块数量和面积减少50%以上（2）认知功能恢复至接近野生型水平（3）突触蛋白表达回升，树突棘密度增加
三、机制优势：避免抗体相关副作用
与抗Aβ抗体（如lecanemab）相比，SPYTACs在机制上具有独特优势：（1）不激活Fc受体 → 避免ARIA（淀粉样蛋白相关影像异常）和脑微出血（2）利用溶酶体降解 → 不依赖免疫细胞吞噬，减少炎症性胶质细胞活化（3）重塑胶质细胞表型 → 小胶质细胞和星形胶质细胞从促炎状态转向神经保护状态
研究的局限性
局限性
未来改进策略
药代动力学数据不足
开展系统的剂量-效应与药时曲线研究
体内稳定性差（半衰期仅数分钟）
引入D-型氨基酸、非天然氨基酸或环化修饰
需每日给药
开发长效制剂，探索缓释策略
长期安全性尚需验证
开展长期毒性研究，评估肝、肾蓄积风险
