Olaptesed Pegol

Minutes of the TME Pharma Annual General Meeting Berlin, Germany, June 17, 2026, 6:30 p.m. CET – TME Pharma N.V. (Euronext Growth Paris: ALTME), a clinical-stage biotechnology company specializing in the development of novel therapies for brain cancer and eye diseases, today announced that all resolutions were adopted at the meeting held on June 15. The Annual General Meeting of TME Pharma shareholders was held on Monday, June 15, 2026, chaired by Mr. Diede van den Ouden. Four shareholders were present, had granted proxies, or voted by mail. Together, they represented 6.87% of the shares and voting rights. The Annual General Meeting unanimously adopted all resolutions submitted by the Board of Directors. The voting results are available on the TME Pharma website. For more information, please contact: About TME Pharma TME Pharma is a clinical-stage biotechnology company specializing in the development of novel therapies for cancer and eye diseases. The Company’s lead compounds have been designed to act on the tumor microenvironment (TME) and the cancer immunity cycle by breaking tumor protection barriers against the immune system and blocking tumor repair. Here is some additional background on the company’s assets that they are seeking to outlicense: NOX-A12 (olaptesed pegol, an anti-CXCL12 L-RNA aptamer), which is being studied (GLORIA Phase 1/2 clinical trial) in newly-diagnosed brain cancer patients who will not benefit clinically from standard chemotherapy. The US FDA and the German BfArM have approved the design of a randomized Phase 2 trial in glioblastoma, and TME Pharma was awarded Fast Track Designation by the FDA for NOX-A12 in combination with radiotherapy and bevacizumab for use in the treatment of the aggressive adult brain cancer, glioblastoma. NOX-A12 in combination with radiotherapy had also previously received orphan drug designation (ODD) for glioblastoma in the United States and glioma in Europe. NOX-E36 (emapticap pegol, L-RNA aptamer inhibiting CCL2 and related chemokines), which is being evaluated in ophthalmic diseases with a high need for well-tolerated therapies with anti-fibrotic effect. The Company is currently seeking opportunities to secure the financial resources to unlock the value of NOX-A12 and NOX-E36. These steps include: Raising funds from alternative sources Pursuing stable, cash-generating business opportunities to achieve positive operational cash flow for the Company Leveraging tax loss carry forwards Further information can be found at: . About the GLORIA Study The GLORIA (NCT04121455) study, currently on hold, is TME Pharma’s dose-escalation, Phase 1/2 study of NOX-A12 in combination with radiotherapy in first-line partially resected or unresected glioblastoma (brain cancer) patients with unmethylated MGMT promoter (resistant to standard chemotherapy). GLORIA further evaluates safety and efficacy of NOX-A12 in the expansion arm in which NOX-A12 is combined with radiotherapy and bevacizumab. About the OPTIMUS Study OPTIMUS (NCT04901741) is TME Pharma’s planned open-label two-arm Phase 2 study of NOX-A12 combined with pembrolizumab and nanoliposomal irinotecan/5-FU/leucovorin or gemcitabine/nab-paclitaxel in microsatellite-stable metastatic pancreatic cancer patients. Disclaimer Translations of any press release into languages other than English are intended solely as a convenience to the non-English-reading audience. The company has attempted to provide an accurate translation of the original text in English, but due to the nuances in translating into another language, slight differences may exist. This press release includes certain disclosures that contain "forward-looking statements.” Forward-looking statements are based on TME Pharma’s current expectations and are subject to inherent uncertainties, risks and assumptions that are difficult to predict. Factors that could cause actual results to differ include, but are not limited to, the risks inherent in oncology drug development, including clinical trials and the timing of and TME Pharma’s ability to obtain regulatory approvals for NOX-A12 as well as any other drug candidates. Forward-looking statements contained in this announcement are made as of this date, and TME Pharma undertakes no duty to update such information except as required under applicable law. Attachment ENG_Minutes of the TME Pharma Annual General Meeting

摘要随着肌肉骨骼疾病（如骨关节炎、骨质疏松症、炎症性关节炎、骨肿瘤和骨骼感染）负担的加重，传统的干预措施已不再足够，需要更加精准的治疗方法。核酸适体是一类新型配体，具有高亲和力、目标特异性、低免疫原性和可编程的化学特性。将适体整合到纳米颗粒、DNA纳米结构、水凝胶、微针、外泌体和植入物涂层中，正在重塑骨和关节疾病的治疗格局。本综述综合了体内和体外模型的临床前证据，重点介绍了用于靶向骨吸收、软骨损伤、滑膜炎症、细菌感染和骨骼恶性肿瘤的适体功能化载体。根据适体靶点类型（包括细胞、细胞外基质、信号通路和病原体特异性配体）的分类框架，将适体与相应的纳米载体和递送途径相匹配。关键的工程参数，如解离常数、配体密度、多价性、连接器设计、粒径和表面电荷，是决定生物分布、组织渗透性和目标特异性的关键因素。本文提出了骨-网状内皮系统比值和关节组织滞留指标，以指导合理的设计。安全性、免疫原性和制造可行性也被纳入转化路径中。标准化的报告协议和优先适应症（包括关节炎的关节内递送、骨缺损再生和骨骼恶性肿瘤的靶向递送）已经确定，以促进临床转化。1 引言肌肉骨骼疾病，包括骨关节炎、骨质疏松症、炎症性关节炎、骨肿瘤和骨骼感染，在全球老龄化人口中构成了日益严重的公共卫生负担。骨关节炎影响了高达50%的51岁及以上的成年人，导致疼痛和残疾[1]。骨质疏松性骨折与死亡率升高、需要医疗照护和长期健康需求相关[2-5]。炎症性疾病，如类风湿性关节炎（RA）和脊柱关节炎，会导致不可逆的关节损伤和系统并发症，严重影响生活质量[6-8]。恶性骨肿瘤和骨骼转移会进一步损害结构完整性，增加治疗难度。2021年，全球约有16.9亿人受到肌肉骨骼疾病的影响，比1990年增加了95%，这些疾病仍然是全球致残的主要因素[9]。在美国，骨关节炎的年经济负担估计为1368亿美元，包括直接医疗费用和生产力损失[10, 11]。在欧洲联盟，2017年骨质疏松症的相关成本为370亿欧元，其中超过70%来自骨折相关费用；而在美国，骨质疏松性骨折的直接费用每年超过190亿美元[10, 11]。目前的标准治疗方法，包括全身性抗炎药物、双膦酸盐和关节内皮质类固醇注射，虽然可以缓解症状，但受剂量依赖性毒性、疾病改善效果有限以及无法区分肌肉骨骼微环境中的不同细胞和分子靶点的限制。这些未满足的临床需求凸显了精准治疗策略的重要性。尽管在药理学上有所进步，但药物向骨和关节组织的递送仍然控制不佳。全身给药的生物制剂和小分子会在软骨下骨、软骨、骨髓和炎症性滑膜中与多种靶点相互作用，但缺乏持续的局部暴露，这常常导致脱靶效应。局部关节内注射或沉积物只能提供短暂的浓度峰值；然而，滑膜血管化和淋巴引流会迅速降低药物停留时间。此外，大多数递送平台无法区分特定的细胞类型或细胞外区室，导致药物复杂性和递送精确度之间的不匹配[12-15]。基于配体的纳米载体提供了一种提高肌肉骨骼靶点选择性的合理策略。抗体、肽、小分子和双膦酸盐已被用于功能化药物载体，以改善在骨、软骨、滑膜和肿瘤微环境中的定位[16-20]。然而，抗体体积较大且具有免疫原性；肽和小分子往往缺乏特异性或药代动力学较差；双膦酸盐虽然对矿物质有高亲和力，但难以控制细胞靶向，并可能干扰重塑过程[21-26]。相比之下，适体是通过指数富集法系统进化选择的短核酸配体，兼具高亲和力和特异性、低免疫原性、模块化及易于 conjugation 的特点。化学修饰（如2′-氟基、2′-O-甲基和锁定核酸）提高了稳定性，并已成功整合到脂质体、聚合物纳米颗粒、DNA纳米结构、水凝胶、微针、外泌体和植入物涂层中[27, 28]。Pegaptanib 的临床成功验证了适体治疗在人体中的有效性，此后肌肉骨骼应用的研发迅速扩张。针对成骨细胞、间充质基质细胞（MSCs）、软骨细胞、滑膜纤维细胞、硬化素、结缔组织生长因子（CTGF）以及骨肉瘤和骨转移中的肿瘤相关靶点，已经开发出了细胞和基质结合的适体[28, 29]。然而，尚无综述系统地整合适体靶点发现、载体设计、递送途径、生物分布、治疗结果、安全性以及化学、制造和控制因素，涵盖整个肌肉骨骼疾病谱系。现有文献缺乏将适体亲和力、多价性、间隔结构与纳米颗粒特性与功能性递送结果联系起来的定量框架。这篇基于概念的综述通过分析体内和体外模型（其中适体作为骨、软骨、半月板、滑膜、骨髓或感染关节环境中的靶向配体或治疗负载）来填补这一空白。所评估的结果包括骨矿物质密度（BMD）、滑膜炎症、肿瘤抑制和感染控制。通过综合这些发现，我们提出了一个用于肌肉骨骼精准治疗的适体引导纳米载体的转化框架。2 用于骨和关节靶向的适体基础适体功能化的纳米载体实现了大多数传统治疗方法无法达到的肌肉骨骼靶向特异性。与全身无差别分布的小分子和生物制剂不同，适体可以被设计成识别特定细胞类型（如成骨细胞、软骨细胞、滑膜纤维细胞、骨髓基质细胞、肿瘤细胞或细菌生物膜），同时在水解酶丰富和机械应力环境（如骨、软骨、滑膜和骨髓）中保持功能稳定性。其成功取决于三个相互关联的参数：适体识别方法、在骨骼组织中的稳定化，以及载体表面亲和力、配体密度、多价性和间隔结构的优化[30-33]。2.1 通过指数富集（SELEX）、细胞SELEX和体内SELEX在骨骼微环境中的配体系统进化适体发现的基础技术之一是SELEX，它能够从包含多达10^15个变体的文库中选择高亲和力的寡核苷酸，针对特定靶分子[34-38]。传统的SELEX使用纯化蛋白质，产生了针对可溶性因子和膜受体的适体[35, 39]。然而，在肌肉骨骼组织中，关键表位嵌入在结构复杂的环境中，如矿化骨基质、软骨网络或炎症性滑膜组织中，结合受到结构和病理状态的影响[40, 41]。这促进了细胞SELEX、组织SELEX和体内SELEX技术的发展，这些技术能在生理屏障下保持天然构象和翻译后特性[42-47]。使用活细胞进行选择的细胞SELEX对肌肉骨骼靶点特别有效[47, 48]。针对成骨细胞选择的CH6适体在嵌入GelMA水凝胶的四面体DNA纳米结构中仍保持纳米摩尔级的亲和力并保持了其靶向功能。在骨质疏松性下颌骨缺损中，CH6引导的构建促进了成骨细胞的招募并改善了骨修复效果[49, 50]。类似地，Apt19S通过基质细胞SELEX被识别并整合到半月板支架中，从而增强了MSCs的招募和区域特异性的纤维软骨再生[51]。这些例子表明，从细胞SELEX衍生的适体即使在三维生物材料中也能保持其靶向功能（图1）。图1展示了适体靶向和细胞特异性摄取的工程设计规则，将纳米尺度参数与骨和关节组织中的适体性能联系起来。上方面板总结了表面呈现的关键工程参数：适体密度/多价性（低密度与高密度及其对结合的影响）、载体特性和化学性质（大小、功能化和表面电荷决定摄取、生物分布和网状内皮系统（RES）清除），以及间隔长度（短链接器与长链接器控制靶点可及性和空间阻碍）。下方面板展示了结合骨或骨髓细胞受体、驱动受体介导的适体修饰纳米颗粒摄取的细胞SELEX衍生的细胞特异性适体。图中的关键指标包括通过细胞SELEX选择的CH6成骨细胞结合适体[50]、用于半月板支架的MSC招募适体Apt19S[52]，以及通过体内SELEX识别的骨导向适体[53]。体内SELEX通过在活体内施加选择压力，使适体库在真实的药代动力学约束下进化，如血管运输、清除和组织滞留[39, 44]。Chen等人（2018）使用体内SELEX分离出一种骨导向的DNA适体，当其结合到纳米颗粒时，在前列腺癌骨转移模型中显示出增强的骨骼积累[53]。尽管这个模型是针对肿瘤的，但该方法本身解决了骨髓过滤、系统清除和组织渗透等生物学屏障。类似的选择策略产生了针对骨骼肌的适体，使其能够在体内内化和滞留[54]。从基于蛋白质的SELEX到细胞和体内SELEX的进化，使得适体能够适应复杂的肌肉骨骼环境，为慢性骨丧失、骨髓炎和炎症性关节炎等病症提供了转化潜力[44, 47]。除了选择平台的多样性外，最近的技术创新加速了适体的发现并提高了选定候选物的质量。基于微流控的SELEX技术将孵育、分区和扩增步骤集成在芯片系统中，实现了对目标浓度的精确控制，并显著减少了试剂消耗和选择轮数[55, 56]。毛细管电泳SELEX根据电泳迁移率差异分离目标结合序列和非结合序列，允许在短短一到四轮选择中识别高亲和力适体，而无需目标固定[57]。最近，Pro-SELEX这种高维微流控方法结合了粒子展示、磁分离和高含量生物信息学，能够在单轮选择中生成亲和力范围可调节20倍的适体[57]。同时，高通量测序（HTS）与SELEX的结合使得能够在选择过程中全面监测文库富集动态，及早识别高亲和力候选物，减少了大量克隆和单独表征的需求[58]。这些进展对于肌肉骨骼靶点尤其重要，因为复杂的组织结构和有限的表位可及性历来限制了选择效率。微流控和测序结合的SELEX应用于细胞和基于组织的骨骼靶点选择，有可能大幅扩展可用于骨和关节应用的适体库。2.2 针对骨、软骨、滑膜和骨髓的化学稳定化未修饰的DNA和RNA适体在生物液体（包括血浆、血清和滑膜液）中会被内切酶和外切酶迅速降解，导致体内功能半衰期通常仅限于几分钟。因此，对于全身给药的和局部递送的关节内沉积物来说，化学稳定化至关重要[28, 47, 59-61]。稳定化策略已应用于自由适体以及在纳米颗粒、DNA纳米结构和水凝胶上展示的适体，使得在骨和关节疾病模型中实现重复或持续的暴露[图1]。一种广泛采用的方法是通过LNA增加结构刚性，限制核糖构象并稳定二级结构。当谨慎使用时，LNA可以提高耐酶性并可能改善结合性能[59, 61]。骨架修饰，特别是磷硫酸酯连接，进一步提高了对酶降解的抵抗力，并支持与纳米颗粒表面或支架骨架的稳定结合。然而，这些修饰可能会增加非特异性蛋白质相互作用，并在某些寡核苷酸情况下引入 innate 免疫或补体相关的问题[62, 63]。PEG化仍然是增加流体动力学大小、减少肾清除和延长系统循环时间的最成熟方法，这对于递送至骨骼组织和骨相关病变非常有利[28]。然而，已有或治疗诱导的抗PEG抗体和PEG相关的过敏反应在人类中被报告，这引起了对于需要长期或重复给药（包括骨质疏松症、骨关节炎和RA）的慢性肌肉骨骼疾病的担忧[64, 65]。这些限制激发了人们对PEG替代品的兴趣，如两性离子聚合物、隐身式合成涂层和基于亲水多糖的材料，这些材料旨在保持有利的药代动力学，同时可能降低免疫原性[66-68]。除了系统清除外，肌肉骨骼微环境还带来了额外的稳定化挑战。在炎症性关节炎中，滑膜液富含促进寡核苷酸降解的蛋白酶和核酸酶。骨髓微环境还使构建物暴露于变化的pH值、缺氧、巨噬细胞监视和基质细胞摄取。因此，面向转化应用的肌肉骨骼适体系统经常采用多层稳定化策略，结合双重修饰的糖替换、谨慎限制的磷硫酸酯引入和适当大小的隐身涂层。这种集成方法在应用于水凝胶、类似细胞外囊泡的载体、微针或固体植入平台时，能够保持适配体的折叠结构和功能性能[28, 61, 69]。2.3 设计变量：亲和力、配体密度/价态、间隔区和连接剂化学性质适配体功能化结构在肌肉骨骼系统中的性能受三个相互依赖的设计参数控制：结合亲和力、配体密度（或价态）以及间隔区/连接剂的化学结构。这些变量是关键的工程控制因素，决定了结构是否能够有效导航并作用于骨骼、软骨、滑膜和骨髓中的分子靶点（图2）。2.4 肌肉骨骼系统靶标分类：细胞定向、基质定向和途径定向的适配体肌肉骨骼疾病的适配体可以根据它们主要靶向的目标进行分类，这些目标可以是细胞、细胞外基质组分或与疾病相关的信号通路。这种分类反映了适配体如何在纳米载体和生物材料系统中被应用，并为转化设计提供了功能框架[47]。细胞定向的适配体会结合到特定的细胞群体上，这些细胞群体驱动骨骼和关节的病理变化。例如，结合骨细胞的适配体CH6通过选择对比类似骨细胞的细胞而被发现，并且在整合到较大的核酸结构中时，仍保持低纳摩尔级的亲和力[49]。当CH6被展示在四面体DNA纳米结构上并整合到GelMA水凝胶中时，它能够选择性地招募和激活骨质疏松性下颌骨缺陷中的骨细胞系细胞，从而比非靶向对照组实现更好的骨骼再生和机械性能[49]。同样，针对间充质基质细胞的适配体Apt19S已被用于招募内源性基质细胞，并通过与各向异性半月板支架的结合来增强原位基质细胞的招募，促进区域特异性的纤维软骨再生[51]。Apt19S还被整合到适配体功能化的四面体框架核酸中，以实现靶向的双微RNA递送，促进体内关节软骨的修复[80]。除了骨骼和软骨外，体内选择策略还产生了针对骨骼肌的适配体，表明当将生物屏障和药代动力学限制纳入选择压力时，类似的方法可以扩展到整个肌肉骨骼组织中[54]。基质定向的适配体旨在将递送系统锚定在结构组分上，如羟基磷灰石和其他矿物质相关界面，从而提高在矿化或纤维软骨组织中的定位能力。结合羟基磷灰石的适配体已被用作骨髓基质细胞的靶向配体，在骨切割部位或矿物质暴露量高的溶骨性病变处实现长时间的局部作用[81, 82]。这种基质结合可以通过将载荷固定在相对稳定的基质组分上来延长局部作用时间，即使细胞群体会随时间重塑。途径定向的适配体会结合参与肌肉骨骼疾病进展的可溶性介质或通路调节因子。例如，分泌型Wnt信号抑制剂sclerostin的特异性抗sclerostin适配体已被开发出来，用于调节sclerostin的活性并促进体内的骨合成反应，展示了结合途径拮抗与靶向功能设计的可行性[83, 84]。在炎症性关节炎中，针对细胞因子和促纤维化介质的适配体提供了一种补充策略。一种白细胞介素-6 RNA适配体已在关节炎相关环境中进行了评估[41]，而CTGF DNA适配体抑制了胶原诱导的关节炎中的滑膜炎形成和关节炎症，显示出其在RA中的诊断和治疗潜力[85]。针对滑膜成纤维细胞的适配体进一步证明，疾病相关背景的选择能够直接作用于滑膜炎微环境[38]。感染定向的适配体越来越多地与骨科并发症相关联。针对金黄色葡萄球菌及其生物膜相关结构的DNA适配体和适配体引导的递送策略，与抗生素库或植入物涂层结合使用时，可能在骨髓炎和假体关节感染中发挥作用[86, 87]。总体而言，这种细胞、基质和途径的分类突显了适配体发现和工程变量（包括选择策略、稳定化学性质、亲和力优化、价态调整和间隔区设计）如何可以系统地应用于骨骼生成、软骨修复、滑膜炎症、肿瘤相关骨疾病和感染中，目标类别由治疗目的决定[47]。2.5 小结：肌肉骨骼应用中的关键适配体设计变量在骨骼和关节应用中，适配体功能化纳米载体的成功取决于一组相互依赖的设计变量。在复杂的骨骼环境中有效竞争并避免脱靶积累，需要具有高亲和力和特异性的配体，通常在低纳摩尔范围内[88, 89]。化学稳定策略，包括双 Primer 糖修饰、部分锁定的核酸整合以及选定的主链和隐蔽化学性质，对于在血浆、骨髓和滑液中保持适配体结构和结合能力至关重要，因为这些环境中含有高水平的核酸酶活性[28, 39]。配体密度和价态必须在适当范围内平衡，以增强亲和力而不促进聚集或被巨噬细胞加速清除[74]。间隔区和连接剂的化学结构必须提供足够的构象灵活性和表位可及性，以支持在致密软骨基质或矿化骨表面的结合[74]。这些原则在表1中的肌肉骨骼适配体面板中进行了总结，核心设计轴在图3中进行了说明。表1. 肌肉骨骼适配体面板：目标、化学性质和典型用途。**适配体名称** **主要靶点** **已使用或提议的适应症** **核酸类型及亲和力** **关键化学特征** **代表性载体应用场景** ---**CH6** **成骨细胞谱系细胞** **受体：成骨细胞表面表位（细胞SELEX；身份未确定）** **骨质疏松性下颌缺损；更广泛的骨骼再生** **验证：体内OVX大鼠模型；** **骨体积增加，小梁连接性增强，缺损桥接改善** **DNA适配体；对成骨样细胞具有低纳摩尔亲和力（细胞SELEX）** **可用于DNA纳米链（TDN）中；可进行2′修饰以提高稳定性；常与水凝胶库结合使用** **TDN嵌入GelMA水凝胶中用于缺损修复；** **概念性应用于全身性纳米颗粒（NP）以实现骨骼靶向（Hong等人，2024；He等人，2025）** ---**Apt19S** **间充质干细胞（MSCs/BMSCs）** **受体：MSCs表面表位（细胞SELEX；身份未确定）** **半月板再生；骨/软骨缺损修复** **验证：体内兔模型；** **MSC归巢增强，纤维软骨基质增加，半月板填充改善** **DNA适配体；对MSCs具有低纳摩尔亲和力（细胞SELEX）** **通常固定在固体支架上；可与其他稳定化措施结合使用（如磷酰胺键）** **表面偶联在各向异性胶原支架和DNA水凝胶上以招募内源性MSCs至半月板和骨缺损部位（Li等人，2022）** ---**骨靶向适配体 (Chen等人，2019)** **骨转移微环境/矿化骨微环境** **受体：羟基磷灰石/矿化基质相关表位** **骨转移性前列腺癌；** **概念性扩展至骨质疏松症和骨髓炎** **验证：体内小鼠模型；** **骨骼积聚增加，骨与靶组织的比率提高，脱靶信号减少** **通过体内SELEX筛选的DNA适配体；** **对骨的相对亲和力高于软组织** **具有耐核酸酶化学结构；** **在NP表面优化配体密度；** **常进行PEG化修饰** **偶联到聚合物/脂质NP上以增强在骨病变处的积聚并改善骨与靶组织的生物分布（Chen等人，2019）** ---**软骨细胞/软骨基质适配体** **软骨细胞或富含II型胶原的软骨基质** **受体：II型胶原表位或软骨细胞表面标志物** **骨关节炎（OA）软骨修复和局部病变** **验证：体内啮齿动物模型；** **OARSI评分降低，蛋白聚糖增加，II型胶原保留增强** **DNA/RNA适配体；** **通常具有低纳摩尔亲和力（细胞SELEX）** **常与PEG linker结合使用；** **可能包含2′-O-甲基或2′-F修饰以在滑液中提高稳定性** **修饰在亚100纳米脂质体或聚合物NP上用于向关节内递送miRNAs/抗降解剂（Ji等人，2021；He等人，2025）** ---**IL-6适配体** **白细胞介素-6（IL-6）** **受体：IL-6细胞因子（可溶性；直接结合）** **胶原诱导性关节炎；** **概念性应用于类风湿性关节炎（RA）和脊柱关节炎（spondyloarthritis）** **验证：体外/临床前关节炎模型；** **IL-6中和，炎症信号降低** **对IL-6具有高亲和力的DNA适配体** **某些研究中使用2′修饰和磷酸硫酯键进行稳定化；** **设计用于全身或局部给药** **可作为游离适配体或简单载体配方给药；** **作为载荷或配体用于RA靶向的库和NP（Nishina等人，2003；Shatunova等人，2021）** ---**CTGF适配体** **骨形成调节因子（CTGF，在RA滑膜细胞（FLS）中过表达）** **受体：CTGF（可溶性；直接结合）** **类风湿性关节炎（RA）** **验证：体内CIA模型；** **滑膜增殖（pannus）形成减少，关节炎症减轻** **对CTGF具有高亲和力的DNA/RNA适配体（视研究而定）** **经化学修饰以提高耐核酸酶性和减少脱靶结合；** **可能使用PEG或脂质偶联** **作为游离试剂或集成到靶向RA滑膜的局部递送系统中；** **作为候选配体用于滑膜靶向纳米载体（Wu等人，2022；Shatunova等人，2021）** ---**骨硬化素适配体** **骨硬化素（由成骨细胞分泌的Wnt抑制剂）** **受体：骨硬化素环结构（Wnt抑制剂）** **骨质疏松症；** **骨缺损修复** **验证：体内模型；** **骨合成反应增强，成骨细胞活性增加，骨形成标志物提升** **RNA或DNA适配体，具有纳摩尔级亲和力** **通过2′-F/LNA修饰；有时进行PEG化以延长半衰期** **作为拮抗配体和分析工具使用；** **适合作为双功能成分（靶向+载荷）用于骨靶向纳米载体（Lee等人，2021）** ---**细菌适配体（如抗金黄色葡萄球菌）** **病原体表面抗原/生物膜成分** **受体：金黄色葡萄球菌蛋白A或生物膜表面结构** **全身性和局部细菌感染；** **概念性扩展至骨髓炎和假体关节感染** **主要在体外验证；** **细菌检测和捕获；** **目前无体内数据** **DNA/RNA适配体；** **亲和力因菌株和抗原而异** **通常进行耐核酸酶修饰；** **常包含荧光团或药物偶联基团** **修饰在金颗粒或聚合物NP上用于靶向抗菌递送、生物膜破坏和治疗性成像；** **适用于骨感染库和植入物涂层（Ye等人，2024）** ---**领域未来的进展将依赖于对这些变量的严格定量报告，以及设计参数、生物分布行为与疾病相关结果之间的明确关联。** **建立这种关系将有助于制定适用于多种肌肉骨骼适应症和递送平台的稳健且可推广的设计规则。** **上述设计参数——适配体亲和力、化学稳定性、配体密度、价态和间隔结构——并非普遍适用，必须根据每种肌肉骨骼适应症的特定生物学和解剖学限制进行定制。** **以下部分探讨了如何在骨质疏松症、软骨修复、炎症性关节炎、骨肿瘤和感染等情况下配置这些变量以实现特定适应症的靶向和治疗效果。** ---**3 适应症概况与靶向-载荷匹配** **用于肌肉骨骼疾病的适配体功能化纳米载体可以沿着三个重叠轴进行组织：适应症、靶点类别（细胞、基质或通路）和载荷。** **在骨质疏松症和节段性缺损、软骨及半月板病变、炎症性关节炎、感染/骨髓炎、骨肿瘤和转移瘤中，最有吸引力的系统组合包括：** **（i）生物学验证的靶点，** **（ii）低纳摩尔级、化学稳定化的适配体，** **（iii）根据骨、软骨、滑膜或骨髓的解剖学要求进行了调整的载体。** **表2总结了主要的体内和体外平台，表1列出了适配体组合。** **表2. 骨骼和关节适应症中的适配体功能化纳米载体。** | 适应症/模型 | 靶点及适配体（类型） | 载体/配方 | 递送途径 | 载荷/功能 | 主要粒子参数（如报告） | 主要结果（与对照组相比） | 关键参考文献 |在这方面，最优的适配体设计应侧重于选择性招募修复细胞，并将其长期保留在软骨或纤维软骨中，而不是整个系统的普遍定位。其中一个最显著的效果是Apt19S对间充质干细胞（MSCs）的招募。Li等人开发了一种各向异性的胶原蛋白仿生支架，用于修复半月板软骨，并在其表面涂覆了通过细胞SELEX技术获得的、对BMSCs具有低纳米摩尔特异性的适配体Apt19S [43]。在半月板缺陷的小动物模型中，Apt19S结合的支架能够增强MSCs的原位归巢和类似纤维软骨的基质沉积，比非靶向支架更有效地恢复半月板的形状和机械功能 [43, 47]。这项研究表明，使用一种适配体之间的亲和力以及一个设计良好的适配体，可以将一个被动支架转化为主动招募天然前体细胞的工具（见表1和表2）。基于这一概念，Chen等人（2023年）开发了一种基于适配体的策略，用于招募内源性滑膜来源的修复细胞，以促进半月板的愈合。他们设计了双特异性滑膜-半月板适配体，其中一个适配体能够识别滑膜细胞群体，另一个适配体能够结合半月板组织，从而在无需外源细胞移植的情况下实现细胞在损伤部位的捕获和保留。在无血管的半月板损伤情况下，这种双特异性设计增加了滑膜细胞在损伤处的积聚，促进了纤维软骨样基质的沉积，并改善了机械性能，优于单特异性适配体对照组或非适配体支架 [64]。从概念上讲，这代表了一种更高层次的靶向方式，其中适配体“纽带”将富含前体细胞的微环境与损伤微环境连接起来，有效地将局部生物活性转化为一种再生仓库（见图4）。适配体功能化的水凝胶用于骨关节炎和半月板损伤的修复。适配体引导的软骨和半月板再生的概念框架：“目标”层关注纤维化和炎症性的关节微环境，包括M1/M2a巨噬细胞、成纤维细胞/肌成纤维细胞、间充质干细胞以及驱动软骨退化的致病性细胞因子网络，这些都被与疾病相关的适配体所识别。“载体和途径”层中，适配体被整合到水凝胶盘中，形成适配体功能化的水凝胶或支架，通过关节内注射和局部植入进行递送，从而实现在关节内空间受限、持续且对细胞响应的结合。“结果”层展示了细胞保留、基质合成和软骨质量的改善，导致软骨撕裂的结构修复和关节功能的恢复，关键评估指标包括软骨形态、软骨下骨密度（BMD）、小梁结构以及关节对称性。相关研究包括用于关节软骨修复的双微RNA递送的适配体功能化四面体框架核酸 [95]，用于特定区域半月板纤维软骨再生的Apt19S结合支架 [49]，以及用于骨关节炎模型中蛋白聚糖保留的软骨细胞靶向适配体。该图使用BioRender.com创建。在骨关节炎（OA）模型中，细胞SELEX技术识别出了结合软骨细胞和软骨基质的适配体，这些适配体可以与初级软骨细胞或富含II型胶原的基质结合，并与脂质体和聚合物纳米颗粒结合 [47, 96]。这些结合物通常与小于100纳米的颗粒以及柔性PEG连接剂相结合，以增强关节内的停留时间和miRNA或抗降解剂的递送，最终降低OARSI组织学评分并维持蛋白聚糖储备 [96]。在软骨和半月板的应用中，已观察到诸如OARSI评分、蛋白聚糖染色、压痕/压缩模量以及成像缺陷填充和整合等成果。总的来说，以Apt19S为基础的支架、双特异性滑膜-半月板构建体和软骨细胞导向的纳米载体等形式存在的适配体不仅能够定位到软骨，还能在适当的时间将修复细胞正确引导到正确的微解剖位置。3.3 类风湿性关节炎和脊柱关节炎（RA）及相关脊柱关节炎在RA及相关脊柱关节炎中，主要的治疗焦点从结构细胞转移到了发炎的滑膜，特别是类似成纤维细胞的滑膜细胞（FLS）和滑膜巨噬细胞，它们会促进血管翳形成、细胞因子分泌和关节损伤 [6]。这一领域的基于适配体的方法针对特定的通路配体和滑膜归巢序列，这些可以附着在关节内储存库、微针装置或小型隐蔽纳米颗粒上，如图5所示。基于适配体的策略用于RA和脊柱关节炎，旨在干预滑膜炎症。适配体被设计用来识别发炎的滑膜组织、活化的巨噬细胞、FLS、关键细胞因子和共刺激分子。这些配体被展示在纳米颗粒、水凝胶或生物载体上，以实现通过关节内或全身途径选择性地递送抗炎或疾病修饰物质。预期效果包括减轻滑膜炎症、减少结构损伤以及改善关节功能，通过临床评分、成像终点和组织学分析进行评估。关键实例包括针对RA相关成纤维细胞选择的滑膜成纤维细胞靶向适配体，在关节炎相关情况下评估的IL-6 RNA适配体 [41]，以及在胶原诱导的关节炎中抑制血管翳形成和关节炎症的CTGF DNA适配体 [85]。早期针对促炎细胞因子的研究证据支持了在这种情况下使用特定通路适配体的合理性。在胶原诱导的关节炎中，针对白细胞介素-6（IL-6）的DNA适配体通过中和IL-6信号通路减少了关节肿胀和结构损伤，表明高亲和力的核酸配体可以在体内调节关键细胞因子通路（Nishina等人，2003年）。最近的研究表明，CTGF结合适配体可以减少RA FLS的侵袭性行为，并降低临床前模型中的滑膜增生，突显CTGF作为重要的滑膜靶点 [85]。总体而言，IL-6和CTGF适配体构成了一个具有强大转化潜力的滑膜聚焦适配体组合的核心（见表1）。在递送层面，RA提供了一个机会，可以通过微针使用局部给药制剂来增加关节周围组织的药物暴露，同时限制全身负担。已有报道显示，适配体支持的微针平台在关节炎模型中是可行的，这支持了将局部给药与核酸治疗结合的可行性 [97, 98]。在此基础上，将类似成纤维细胞的滑膜细胞或细胞因子靶向适配体整合到微针尖端、纳米颗粒载荷或水凝胶基质中，代表了进一步将治疗集中在血管翳内并减轻软骨和骨骼损伤的可行途径，尽管这种整合仍处于发展阶段，需要系统的验证 [24, 41]。在RA和脊柱关节炎模型中的结果表明，包括临床关节炎评分、关节肿胀、细胞因子谱型和组织学评估的血管翳和骨侵蚀等方面都有所改善。目前，很少有完全整合的适配体-纳米载体系统在RA中进行体内测试，该领域仍处于配体发现和平台原型设计阶段（见表2）。然而，从靶标-载荷匹配的角度来看，方法很简单：将滑膜归巢或细胞因子靶向适配体与关节内储存库、微针或设计用于在不被快速清除的情况下靶向发炎滑膜的小型PEG化纳米颗粒结合。3.4 感染和骨髓炎骨骼和关节感染，尤其是慢性骨髓炎和假体关节感染，带来了独特的生物物理和生物学挑战，因为生物膜包覆的骨骼和硬件中的细菌对抗生素和宿主免疫系统具有抗性。在这方面，适配体功能化系统有两个关键优势：病原体特异性和改善的生物膜穿透能力，如图6所示。适配体引导的用于治疗骨感染和骨髓炎的平台。基于适配体的策略概念概述了根除骨感染和骨髓炎的策略。目标层描绘了受感染骨骼中的细菌群体和生物膜，以及可以被抗菌适配体识别的疾病特异性生物标志物。载体层包括带有适配体的抗菌光动力纳米颗粒或其他纳米载体，这些适配体能够进行构象识别，从而实现针对细菌或生物膜靶点的作用。途径层展示了在受感染骨骼表面局部应用适配体功能化的支架或涂层，以达到高局部药物浓度并限制全身暴露。结果层突出了细菌菌落形成单位的减少、感染区域的缩小、通过支架支持的再生同步填充骨缺陷，以及最终恢复健康的骨髓和皮质完整性。适配体引导的策略包括针对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的DNA适配体和针对生物膜相关感染的适配体靶向药物递送系统 [87]。越来越多的文献报道了针对关键病原体（如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和大肠杆菌（Escherichia coli）的适配体。这些适配体已被整合到金和聚合物纳米颗粒、水凝胶以及诊断平台中 [87]。带有抗菌适配体的纳米颗粒已被证明在非骨感染模型中具有更好的细菌结合能力、抗生素或光动力/光热递送效果和生物膜破坏能力 [28, 87]。这些报告共享一个共同的设计理念：抗菌适配体可以将非选择性的抗菌纳米载体转化为针对病原体的治疗载体（见表1）。将这些设计应用于骨髓炎将涉及改变载体的大小、电荷和表面化学性质，以达到骨髓和皮质骨，并确保适配体-细菌相互作用在脓液和蛋白质丰富的微环境中仍然有效。到目前为止，还没有针对骨骼的特定应用，表2将骨髓炎和假体关节感染列为概念性示例。一些提出的配置包括针对骨骼上金黄色葡萄球菌生物膜的适配体功能化抗生素装载纳米颗粒、在感染缺陷中局部释放适配体的适配体-水凝胶储存库，以及结合细菌捕获和局部抗菌递送的植入物表面 [87]。感染模型的结果指标包括细菌计数、生物膜生物量、炎症标志物和骨骼完整性，这些可以通过成像和组织学进行评估。骨髓炎、感染和假体关节感染是需要进一步开发适合肌肉骨骼系统的适配体-纳米载体系统的前沿领域，鉴于这些条件的信息有限。3.5 骨肿瘤和转移瘤目前，基于适配体的靶向技术在肌肉骨骼系统中最成熟的应用是骨肿瘤和骨骼转移瘤，这些应用利用了数十年的肿瘤学相关适配体研究以及广泛的骨靶向化学方法 [99]。该领域的适配体-纳米载体系统结合了癌症干细胞（CSC）标记物、过度表达的肿瘤受体和骨归巢序列，以选择性地将细胞毒性或免疫原性细胞死亡（ICD）载荷递送到癌变组织而非正常骨组织 [99]。适配体-纳米载体系统在骨肿瘤和骨骼转移瘤中的应用涉及结合癌症干细胞标记物、过度表达的肿瘤受体和骨归巢序列，以选择性地将细胞毒性或信号载荷递送到癌变组织而非正常骨组织。3.4 感染和骨髓炎骨和关节感染，特别是慢性骨髓炎和假体关节感染，带来了独特的生物物理和生物学挑战，因为生物膜包裹的细菌和植入物对细菌和宿主免疫系统具有抗性。在这方面，适配体功能化系统具有两个关键优势：病原体特异性和改善的生物膜穿透能力。值得注意的是，它们还提供了一系列有用的配体和设计概念，包括CSC标记物、骨导向序列、ICD载荷和治疗性纳米颗粒，这些都可以应用于非恶性肿瘤引起的骨骼和关节疾病。4. 抗体纳米载体架构和偶联策略肌肉骨骼系统的抗体解决方案在很大程度上依赖于载体架构、抗体的展示方式以及配体。载体类型会影响工程结构在骨骼、软骨、滑膜、骨髓和肿瘤组织中的药代动力学、组织渗透性、机械整合性和可制造性，而偶联化学和方向性则决定了高亲和力抗体是否能在最终产品中保持其功能形式。这里通常总结了主要用于或建议用于骨骼和关节疾病的载体家族，包括基于脂质的纳米颗粒、聚合物颗粒和树状大分子、DNA纳米结构、水凝胶和支架、生物载体以及混合载体，同时说明了它们的设计对关键抗体参数（如亲和力、配体密度/价态和间隔分子化学）的影响。4.1 基于脂质的骨骼和关节递送系统脂质体及固体脂质纳米颗粒（SLNs）是抗体应用中最复杂的平台之一。它们在肌肉骨骼应用中至关重要，尤其是在骨肿瘤和骨骼转移中。这些载体具有灵活的双层结构，能够携带亲水性和疏水性载荷。其外表面可以通过PEG化连接子、马来酰亚胺-硫醇偶联或点击化学技术进行化学修饰[64]。抗體包覆的脂质体和聚合物-脂质混合物已被用于向骨转移性和乳腺癌模型递送细胞毒性物质和成像探针，研究显示抗體-脂质体及聚合物-脂质混合物在骨病变区域的浓度高于抗體-配体版本，并且骨与RES（红细胞）的摄取比率更高，从而实现了更好的肿瘤控制和降低了全身毒性[53, 99]。对于肌肉骨骼系统，基于脂质的载体通常被制成80–150纳米的大小范围，具有微负的ζ电位，以优化肿瘤或骨髓的穿透性并避免过度摄取RES[99]。多价结合可以定向到脂质体表面的受体上，例如癌干细胞标记物（CD133和EpCAM）或过表达的受体（核仁蛋白和整合素），同时控制密度，避免聚集或补体激活[29]。同样的设计逻辑也可以应用于纯骨科目标：抗體包覆的脂质体或SLN可以用于向骨质疏松症的全身区域递送治疗药物，而靶向软骨或滑膜的配体可以用于在关节组织中形成稳定的储存库，减少药物流失[47, 94]。4.2 聚合物纳米颗粒和树状大分子，包括双配体结构聚合物纳米颗粒（如PLGA、PEG-PLGA和其他两亲性嵌段共聚物及树状大分子）具有更稳定的结构和平稳的降解特性，这使得它们在骨骼和关节疾病中的持续递送具有潜力。众所周知的化学方法，如碳二亚胺交联、点击化学和硫醇-马来酰亚胺反应，可以用来密集地修饰这些纳米颗粒的表面，其核心可以装载化疗药物、核酸或生物制剂[74, 104]。具有肿瘤受体或CSC标记物靶向特性的抗體修饰聚合物纳米颗粒在癌症模型中的肿瘤内分布更好、穿透力更强，并且肿瘤消退效果更显著[99]。树状大分子的高度分支和单分散结构主要用于控制配体的价态。靶向骨骼的树状大分子系统需要优化，以获得最大的配体密度。过度修饰可能导致空间拥挤、表面电荷变化以及肝脏的过度摄取，而适度的修饰则能确保药物在骨骼或骨髓中的最大积累并减少脱靶效应[74, 105]。在肌肉骨骼应用中，这一点尤为重要，因为在狭窄的骨小梁空间或密集的骨髓中，过度修饰的颗粒可能会因物理阻塞而无法进入目标区域。结合骨导向抗體（通过SELEX技术选择）和肿瘤或滑膜特异性抗體的分层靶向结构将是可行的解决方案，首先在骨骼区域进行靶向，然后选择肿瘤或炎症细胞进行进一步作用[53, 99]。4.3 DNA纳米结构和DNA-聚合物混合系统DNA纳米结构在抗体递送方面提供了无与伦比的精准性。DNA折纸技术和其他类型的DNA纳米结构（如称为TDN的四面体）可以精确地定位多个抗体基序，允许系统地研究多价性和协同结合[28, 106]。在GelMA水凝胶中利用CH6修饰的TDN能够精确地靶向成骨细胞并促进骨质疏松性下颌骨缺损部位的骨形成，从而比未经修饰的对照组具有更好的骨体积和机械强度[47, 49]。TDN可以用作结构支架、多价抗体制剂支架，并同时递送核酸载荷，因为TDN由生物相容的DNA制成。这一设计空间进一步扩展到了DNA-聚合物混合系统。例如，可以通过利用DNA的可编程性和合成聚合物的机械强度及降解特性，将DNA与聚合物纳米颗粒或水凝胶结合或物理封装[106, 107]。含有软骨细胞或软骨基质抗体的DNA框架可以根据孔洞的大小和硬度进行调整，以优化其渗透密集蛋白聚糖网络的能力并保持抗体的可及性[96]。从工程角度来看，DNA纳米结构最适合用于预测抗体在生物材料界面上的间距、价态和构象灵活性[8]。4.4 水凝胶、局部储存库和支架水凝胶和三维支架是肌肉骨骼再生中主要的局部储存形式；然而，它们目前仍是惰性的，需要通过抗体制剂修饰才能成为主动靶向的支架。带有CH6-TDN结构的GelMA水凝胶揭示了一种机制，即这种承重的、对细胞友好的支架如何在招募和信号传导过程中提高对骨缺损的修复效果[49]。表面修饰的Apt19S已被设计用来招募天然滑膜和骨髓来源的MSCs到各向异性的半月板支架中，从而在体内促进纤维软骨的沉积和半月板结构的重建[51]。在大型动物身上进行了更广泛的研究，使用双特异性抗体制剂靶向滑膜前体：一个抗体制剂靶向滑膜前体，另一个靶向支架，有效地在原生微环境和缺损部位之间形成了分子桥梁[108]。水凝胶的化学性质和力学特性对抗体的性能有重要影响：降解速率、交联密度和孔径大小决定了抗体制剂修饰的载体和招募的细胞如何通过水凝胶的对流和扩散进行迁移。非特异性结合和抗体的稳定性受局部电荷和疏水性的影响[40, 49]。抗体可以通过悬挂基团共价连接到水凝胶骨架上，物理封存在水凝胶内部，或者作为DNA纳米结构存在。所有这些方式都在不同程度上平衡了稳定性、释放性和可及性的要求[28, 107]。在骨关节炎（OA）或类风湿性关节炎（RA）的关节内储存库中，这些基质需要承受反复的机械加载/剪切作用。因此，抗体制剂化学与整体力学之间的联系是关键的设计因素[8]。4.5 生物载体和混合载体：外泌体、细胞介导的递送和微针外泌体和细胞外囊泡（EVs）作为生物载体具有天然优势，包括生物相容性和免疫原性，以及穿越某些生物学屏障的能力，从而具备靶向肌肉骨骼组织的潜力。非骨骼模型已经通过在EV表面插入抗體-PEG-脂质偶联物、抗體结合域的基因融合或共价化学方法，将抗体制剂定向到特定的脑细胞和肿瘤，这些方法比未经修饰的EVs具有更好的生物分布效果[107, 109]。将这种技术应用于骨骼和关节疾病有诸多可能性：例如，用CH6或软骨基质抗体制剂修饰的间充质基质细胞来源的外泌体可以集中在骨质疏松或退行性软骨受影响的区域；具有滑膜靶点的抗体制剂（如IL-6或CTGF抗体制剂）可以向滑膜铺垫递送抗炎因子[47]。还有细胞介导的递送方法，即抗体制剂在活细胞内引起定向或在细胞内释放货物，而不是在惰性颗粒中。因此，可以在发育中的T细胞或巨噬细胞表面开发出能够识别骨肿瘤表位并激活局部细胞因子或细胞毒物质释放的抗体制剂。尽管这些系统在肌肉骨骼领域仍处于理论阶段[99]，但亟需研究将抗体制剂结合到微针和植入物表面上，实现局部、低侵入性的治疗。药物或纳米颗粒可以通过微针贴片直接递送到RA和OA的滑膜中，从而提高精准度并避免系统暴露于大量组织。将这些系统与靶向滑膜或细胞因子的抗体制剂结合，可以进一步将治疗集中在受影响的关节区域，避免对软骨和骨骼的伤害[21, 87]。在假体关节感染的情况下，抗体制剂修饰的金属或聚合物组件表面可以高亲和力捕获细菌，并局部应用系统性抗生素治疗[87]。4.6 化学修饰和方向性控制在任何载体类别中，用于将抗体制剂连接到纳米载体或基质上的化学修饰是决定其功能的重要因素。随机多点偶联可能会破坏抗体的二级结构，阻塞结合位点，并产生难以表征和维持的异质产品。定向偶联技术可以控制连接子的方向、密度和长度，使其与第2节中提到的设计变量相匹配[107, 110]。传统技术包括使用硫醇-马来酰亚胺反应将5′或3′-硫醇化的抗体制剂连接到含有马来酰亚胺的脂质、聚合物或支架骨架上；使用叠氮-炔烃环加成（也称为点击化学）；铜催化或应变促进的叠氮化载体和炔烃修饰的抗体制剂；或者使用碳二亚胺（EDC/NHS）连接胺修饰的分子。链霉亲和素-生物素相互作用具有很高的亲和力，但会引入可能增加免疫原性和细胞培养基复杂性的蛋白质成分。在肌肉骨骼系统中，考虑到长期给药或永久性植入物的需求，建议使用完全合成的共价键合，确保精确的化学计量比和低免疫反应[46]。偶联时必须考虑间隔分子的设计。虽然正确方向性的抗体制剂具有生存能力，但过短或过硬的连接子可能会限制构象灵活性，特别是在表面拥挤或密集的基质（如软骨）中，即使其在溶液中的Kd值有利[110]。相反，过长的或松散的聚合物可能会导致水动力尺寸增大、ζ电位变化或使抗体制剂暴露于蛋白质中。在电化学抗体制传感器和靶向纳米载体的系统研究中，中等长度的间隔分子通常在信号传导和结合性能方面最为有利，这需要在骨骼和关节应用的背景下进行更明确的设计和报告[74, 110]。综上所述，这两项架构和偶联技术为基于肌肉骨骼抗体制剂的疗法设计提供了可行的方案（见图5和图6）。使用脂质和聚合物纳米颗粒可以实现骨骼肿瘤和骨质疏松症的系统性递送。利用DNA纳米结构、水凝胶和支架、外泌体、微针和涂层可以实现缺陷修复和软骨或半月板重建的空间控制[48]。在所有这些平台上取得成功需要严格控制抗体的方向性、密度、间隔分子化学和载体物化性质，并进行透明的报告，以便将该领域扩展到可复制、可转化的平台。5. 递送途径、生物分布和保留递送途径决定了抗体制剂修饰的纳米载体从循环系统或局部储存库迁移到骨骼、软骨、滑膜和骨髓的过程，以及它们在这些组织中的保留情况。对于肌肉骨骼疾病，最常见的递送方法是全身静脉（IV）给药，用于治疗骨质疏松症和骨转移。局部递送方法包括关节内注射、病灶部位植入以及新型微针递送方法，将重组药物递送到关节和关节周围空间[9]。这些途径的生物分布和药代动力学应基于肌肉骨骼特异性指标进行测量，包括骨与网状内皮系统（bone: RES）的比率以及关节中的滞留情况与全身暴露程度的比较[28]。图9可在图形查看器中打开。基于适配体的肌肉骨骼治疗的给药途径。适配体导向疗法的给药途径的比较概述。中央解剖结构突出了代表性的注射部位，而周围的面板总结了：（1）静脉全身给药，该方法可提供广泛的全身暴露，但肾功能快速且网状内皮系统清除速度快，半衰期短，需要化学稳定处理并谨慎管理免疫原性；（2）优化载体和靶点的给药方式，通过选择纳米载体和靶点位置（例如水凝胶-骨界面）来影响组织渗透性、特异性和滞留时间；（3）直接放置，将适配体功能化的水凝胶或支架植入缺陷部位或骨周围，以最大化局部滞留并减少全身暴露；（4）关节内注射，在关节内实现高局部浓度同时降低全身水平，特别适合膝关节等大关节，允许减少给药频率。给药途径的选择基于静脉骨靶向给药[53]、关节内的局部注射以保持药物在关节内[52]以及通过滑膜微针实现关节周围的药物递送[52]。该图是用BioRender.com生成的。5.1 骨质疏松症和骨转移全身静脉（IV）给药是管理弥漫性骨骼疾病（包括骨质疏松症和轴向及附着骨骼的转移性疾病）最可行的方法。针对骨骼的纳米载体和通过SELEX在体内选择的适配体已被证明会特异性地积聚在骨骼病变部位，而不是肝脏和脾脏中，从而相比于无靶向的纳米粒子，增强了骨与网状内皮系统的比率[53]。在这种系统中，适配体作为传统寻骨化学物质或按大小和电荷调制的载体的“地址标签”，使更大比例的注射剂量能够到达小梁骨和皮质骨区域。在转化医学层面，当需要重复给药且系统的安全性正在接受常规评估时（包括对肝脏、肾脏和骨髓的影响[29]，适配体的全身给药是有益的。在肌肉骨骼应用中，适配体-纳米载体系统必须穿透多个屏障，包括血浆蛋白、内皮壁、骨髓窦道，在某些情况下还包括肿瘤中的病理新生血管，以实现全身给药。药代动力学优化的设计空间是明确但严格的：粒径应在50-150纳米之间，以避免快速肾清除和脾脏的缓慢过滤；表面带有PEG或其他隐身修饰的类似物，以延长循环时间；适配体的价态需适当设置，以优化对骨骼或肿瘤的靶向效果，同时避免快速免疫调理和聚集[28, 111]；体内对目标具有高亲和力的适配体（如在转移模型中的骨归巢配体）在暴露于全身给药时更有可能在剪切力和蛋白质冠形成条件下保持靶向活性[29, 53, 112]。5.2 局部关节内注射、缺陷部位植入和肿瘤周围给药相比之下，局部给药技术更为可行，因为许多肌肉骨骼疾病的治疗具有明确的应用目标并且受到机械限制。将适配体包覆的纳米粒子、DNA纳米结构或水凝胶直接注入关节腔对于关节炎（如骨关节炎）、类风湿性关节炎（RA）和半月板疾病的治疗非常相关。这些方法无需先清除全身组织，可以减少在全身循环中的时间，并使载体能够靶向软骨渗透和在滑膜中滞留，而不需要长时间的循环[28]。粒径小于100纳米的粒子，含有柔性的PEG间隔层和接近中性或略微负的表面电荷，已被证明能更好地停留在软骨和滑膜中，尤其是与软骨细胞或滑膜归巢适配体结合使用时[96, 107]。第一种方法是缺陷部位植入，用于分段骨缺陷和半月板修复。在这种方法中，适配体功能化的支架、水凝胶或混合DNA-聚合物库在手术中被植入缺陷部位，形成一个永久性的储库，在现场释放生长因子、小分子或核酸。例如，为了再生骨质疏松的下颌骨，将CH6功能化的四面体DNA纳米结构固定在GelMA水凝胶中并植入缺陷部位，以诱导成骨细胞的迁移并实现局部骨形成，全身暴露主要限于降解产物[49]。适配体功能化的载体也在骨肉瘤和骨转移的肿瘤周围注射或植入模型中进行了研究，这些方法能够实现高局部药物浓度并降低全身毒性，特别是与细胞毒性或ICD靶向载荷结合使用时[29, 99]。5.3 使用微针的滑膜（关节周围）给药微针平台提供了一种介于局部注射和全身给药之间的解决方案。药物可以通过关节周围空间进行输送，而关节内注射常常会引起不适并存在感染风险。然而，可以在病变关节上方或附近放置微针阵列，将药物输送到关节与周围皮下组织之间的空间。可以将适配体添加到微针表面，或者通过溶解微针释放纳米粒子，新的针对滑膜成纤维细胞、细胞因子或软骨表面的适配体原则上可以将药物靶向炎症性滑膜或软骨表面的病变区域，而不是关节周围脂肪或肌肉[107, 113]。我们认为，基于微针的适配体递送简化了载体在血液中的稳定性问题，但引入了新的挑战，如机械强度、插入深度和释放动力学。可生物降解的聚合物微針在整个使用过程中必须保持足够的机械强度，但能够以可预测的方式溶解或侵蚀；适配体在制造和储存过程中必须保持其结构。早期试验表明，使用微针递送的纳米粒子的非肌肉骨骼效应迹象表明，这种技术可以实现有利的局部与全身粒子比率以及均匀的药代动力学[107, 109]。图9 schematically 总结了不同的给药途径，如关节内注射、缺陷部位植入、微针注射和全身给药，以展示这些途径在生物分布方面的差异。5.4 生物分布指标和药代动力学：骨、网状内皮系统指数和关节滞留无论采用何种途径，使用针对肌肉骨骼特异性的生物分布指标来优化适配体功能化系统是合理的。对于全身骨靶向治疗，骨与网状内皮系统的比率（通常定义为骨（或骨病变）中的适配体与纳米载体之比与肝脏和脾脏中的比例）是一个有用的靶向效果衡量指标[95]。体内SELEX衍生的骨归巢适配体显示出比无靶向纳米粒子更高的骨与网状内皮系统比率，在转移性疾病模型中与更好的病变控制效果和较低的脱靶毒性相关[53]。从工程角度来看，骨与网状内皮系统的比率是一个综合指标，它量化了粒径、表面化学性质、适配体亲和力/价态和循环半衰期的影响。评估了关节内和关节周围给药的关键参数、关节滞留情况和全身泄漏情况。可以使用标记的适配体-纳米载体测量滑膜和软骨的滞留半衰期，可以使用连续成像或采样滑膜液来测量血浆中的全身暴露情况和器官生物分布[28, 96]。最适合的设计是那些具有最大关节面积下的曲线下面积（AUC）和最小血浆AUC以及肝脏/脾脏摄取量的设计，因为在骨关节炎和类风湿性关节炎中，治疗效果是局部的。然而，必须防止全身不良事件的发生，如免疫抑制或肝毒性。在其他情况下，例如感染和骨髓炎时，还需要考虑细菌在骨骼中的载量与软组织中的载量比或生物库的洗脱动力学，主要是当通过细菌适配体将抗生素载荷递送到骨骼转换部位或生物膜涂层硬件时[87]。现在由肿瘤学系统和基因疗法生成的药代动力学模型包括了骨髓、皮质骨和滑膜液的组分，使得能够基于模拟分析适配体亲和力、价态或载体大小的变化对肌肉骨骼组织的影响及其暴露动力学。由适配体引导的骨科平台应该是下一代的模型，在这些模型中，无论何时使用适配体，标准和报告都应该是直接的[29]。5.4.1 从非肌肉骨骼适应体生物分布中获得的经验教训由于大多数肌肉骨骼适配体-纳米载体系统尚未达到许多应用的的概念验证阶段，因此必须谨慎调整其设计，以适应更高级的应用，如肿瘤学、神经学和传染病。一些基本原理已经通过基于适配体的非骨肿瘤全身治疗和用于脑部递送的适配体基纳米粒子建立起来。首先，这并不意味着高亲和力的适配体不需要解决不必要的尺寸、电荷或隐身特性问题；成功的肿瘤靶向系统是在纳米尺度上优化的，适配体的密度和方向也是经过精心设计的[28, 29, 107]。其次，延长循环时间的最可靠方法是用涂层（如聚（ethylene glycol）（PEG）覆盖适配体。然而，抗PEG抗体的存在和用药前的过敏反应会对PEG化药物的安全性和清除产生不利影响[111]。第三，基于外泌体和纳米囊泡的载体，可以利用生物衍生膜来积极影响生物分布；然而，配体递呈和批次间重现性成为CMC（化学制造控制）的关键问题[109]。要将这些经验应用于肌肉骨骼领域，意味着骨和关节靶向的适配体平台需要：（i）进一步提供详细的物理化学和表面-配体特征以及生物分布数据；（ii）在慢性疾病（如骨质疏松症和类风湿性关节炎）中监测PEG或其他隐身聚合物的免疫原性；（iii）解决制造和质量控制设施能够确保配体重复性的问题。6. 协调不同适应症的有效性指标临床前关于适配体-纳米载体在骨骼和关节疾病中的分析显示了多种结构、功能和生物学结果。为了比较不同的适应症和平台，必须使用标准的特定领域视角来评估有效性，包括骨骼、软骨/半月板、滑膜/炎症、肿瘤和感染。这里描述了当前关于这些领域益处的文献以及如何将这些指标归类为易于理解的解读体系（图10）。协调的适配体引导治疗在骨骼、软骨、滑膜和肿瘤模型中的有效性指标。该图综合展示了不同领域的治疗效果以及跨领域的效果方向分析。上层面板总结了特定领域的终点：微CT衍生的骨再生指标、骨密度（BMD）、小梁结构以及骨骼和缺陷模型中的生物力学测试；OARSI组织学评分、沙黄素O染色和软骨修复中的机械压痕测试；滑膜炎症中的组织学评估和炎症细胞因子分析；以及恶性骨病变中的肿瘤体积、生存率、转移负担和骨完整性。下层面板展示了效果方向图，便于直观比较骨骼、软骨、滑膜和肿瘤治疗的效果，从而有助于跨适应症的基准测试和适配体平台的优先级排序。结果领域基于微CT和骨密度测量（BMD）用于骨再生[49]，OARSI组织学评分和软骨修复中的蛋白聚糖量化，关节炎症指数用于关节炎[85]，以及骨骼恶性肿瘤的肿瘤体积和生存率指标。该图是用BioRender.com制作的。6.1 骨骼结果最广泛使用的多模态骨靶向适配体系统评估方法整合了微型计算机断层扫描（microCT）、骨密度（BMD）评估和生物力学测试。microCT提供高分辨率的结构数据，应使用标准化的参数和采集规范进行报告，包括小梁骨体积分数（BV/TV）、小梁厚度（Tb.Th）、小梁数量（Tb.N）、小梁间距（Tb.Sp）、连接密度和皮质厚度，以便在啮齿动物模型中进行跨研究比较[114]。BMD通常通过双能量X射线吸收测定法进行量化，当需要体积密度时，则使用定量CT，同时注意定位和感兴趣区域的定义，以确保小动物研究中的精度[115]。然后通过机械测试验证功能完整性，通常是通过三点弯曲、压缩或扭转测试，在标准化的小动物测试框架下评估缺损部位或骨质疏松部位的刚度、极限载荷和能量-失败值[116]。在这个框架内，如CH6修饰的四面体DNA纳米结构嵌入再生库中的适配体功能化构建物可以评估其结构和功能的协同优势，其中微结构和矿化的改善伴随着相对于非靶向载体或仅使用支架的对照组更高的机械性能[49]。6.2 软骨和半月板结果作为主要的结构测量指标，国际骨关节炎研究学会（OARSI）的组织病理学评分以及用于评估局部缺陷的相关系统被用于软骨和半月板。这些半定量尺度用于确定软骨表面完整性、病变深度和范围、基质丧失以及软骨细胞变化，并已在多种组织（人类）和小动物模型中得到验证[117, 118]。蛋白聚糖是软骨健康的生化标志物，通常通过沙黄素O染色或甲苯胺蓝进行可视化，并通过光学密度或评分进行测量。蛋白聚糖的含量常被用作证据，证明经过适配体处理的关节得到了保留或修复。在负载条件下的功能恢复的其他指标，包括机械压痕硬度，对于Apt19S修饰的半月板支架或连接滑膜的双特异性适配体而言，是重要的评估参数。整合度、缺陷占据情况、界面连续性以及软骨下骨重塑可以通过组织学方法或uCT（超声计算机断层扫描）来评估，后者提供了解剖学视角；换句话说，这些指标介于结构修复和表面覆盖之间[117, 118]。6.3 滑膜和炎症结果在临床前类风湿性关节炎（RA）及相关炎症性关节炎模型中，基于适配体的干预措施通常通过多种互补性的评估指标来评价，这些指标能够捕捉疾病的临床活动性、炎症负担以及组织损伤情况。疾病活动性最常通过综合临床关节炎评分来纵向监测，该评分结合了爪子或关节的肿胀、红斑以及功能丧失或畸形情况，并且经常与基于卡尺的客观测量结果相结合，以更高的分辨率减少观察者的主观性[119-121]。药物动力学效果则通过 pathways 相关的生物标志物来验证，包括循环中的细胞因子和趋化因子，这对于像IL-6拮抗适配体或CTGF靶向适配体这样的机制导向型适配体尤为重要[122-124]。组织病理学提供了最终的结构性评估结果，使用半定量评分框架来评估滑膜炎、内衬层增生、滑膜绒毛形成和血管生成的情况，以及软骨和骨侵蚀的程度；已经制定了标准化的显微镜评分指南，以提高不同炎症性关节炎模型之间的可重复性和报告质量[125]。在各项研究中，临床评分和卡尺测量肿胀的一致性改善、炎症介质的正常化以及滑膜绒毛引发的侵蚀性病理的减轻共同表明，适配体辅助策略在炎症性关节炎治疗中的有效性，尽管与现有疾病修饰疗法的严格头对头比较以及统一的结果报告仍然至关重要[85, 122, 126]。6.4 肿瘤和感染结果在临床前类风湿性关节炎（RA）及相关炎症性关节炎模型中，基于适配体的干预措施通常通过多种互补性的评估指标来评价，这些指标能够捕捉疾病的临床活动性、炎症负担以及组织损伤情况。疾病活动性最常通过综合临床关节炎评分来纵向监测，该评分结合了爪子或关节的肿胀、红斑以及功能丧失或畸形情况，并且经常与基于卡尺的客观测量结果相结合，以更高的分辨率减少观察者的主观性[119-121]。药物动力学效果则通过 pathways 相关的生物标志物来验证，包括循环中的细胞因子和趋化因子，这对于像IL-6拮抗适配体或CTGF靶向适配体这样的机制导向型适配体尤为重要[85, 122, 123]。组织病理学提供了最终的结构性评估结果，使用半定量评分框架来评估滑膜炎、内衬层增生、滑膜绒毛形成和血管生成的情况，以及软骨和骨侵蚀的程度；已经制定了标准化的显微镜评分指南，以提高不同炎症性关节炎模型之间的可重复性和报告质量[125]。在各项研究中，临床评分和卡尺测量肿胀的一致性改善、炎症介质的正常化以及滑膜绒毛引发的侵蚀性病理的减轻共同表明，适配体辅助策略在炎症性关节炎治疗中的有效性，尽管与现有疾病修饰疗法的严格头对头比较以及统一的结果报告仍然至关重要[85, 122, 126]。6.5 将不同评估指标整合到一个清晰的框架中在骨骼、软骨/半月板、滑膜/炎症、肿瘤和感染的应用中，结果报告仍然存在很大的异质性，难以进行有意义的定量综合（图10）。各项研究在物种、疾病诱导方式、解剖位置、载体类型、给药方案以及随访时间窗口等方面存在显著差异，即使使用相同的评估指标（如BV/TV、OARSI评分、关节炎等级、肿瘤体积、细菌负荷），其测量尺度也往往不同，或者只是以半定量形式报告，而不是作为完全可提取的数值数据[114, 117, 118]。此外，许多报告仍停留在概念验证阶段，侧重于展示代表性图像或百分比变化，而没有完整的数据库记录，而核心的内部有效性保障措施（随机化、盲法、预先规定的失访处理）的记录也不一致，这限制了结果的可解释性和跨研究的可比性[87, 123]。在这种情况下，统计汇总不仅在方法学上存在风险，还可能导致生物学上具有误导性的结论。在这个阶段，一种更可靠的综合策略是使用标准化结果领域进行结构化证据分析，如图10所示，这种方法可以揭示与设计相关的关键信息，而不会对稀疏或不均匀的数据进行过度解读[127, 128]。具体来说，未来的研究应遵循既定的测量标准，例如啮齿动物骨骼的微CT报告标准和用于软骨及滑膜的OARSI组织病理学系统，这将立即提高可重复性，使核心评估指标的提取更加一致，并为严谨的元分析创造条件，从而真正为工程决策和转化研究优先级的确定提供依据[114, 117, 118]。7 工程设计规则和性能目标针对用于治疗骨骼和关节疾病的适配体功能化纳米载体的设计变量包括颗粒大小和分布、表面电荷、配体密度和价态、间隔体结构，以及细胞、基质或 pathways 的靶点。考虑到表2中的系统以及表1中的适配体组合，可以发现指导进一步设计的明显空白区域，而不是重新发现之前已经测试过的经验原则。在这里，我们总结了这些结构-功能之间的模式，提出了针对性能的定量测量方法，并基于特定指标描述了决策方案。图1提供了重要的适配体设计变量的概述，图9将它们整合成了一个工程决策框架。7.1 从现有的肌肉骨骼系统中提取设计窗口在肌肉骨骼递送系统中，大多数报告能够有效进入骨髓、小梁区室或骨骼病变的适配体功能化纳米载体，它们的物理化学特性集中在一个相对狭窄的窗口范围内。对于针对骨骼的脂质体、聚合物纳米颗粒及相关系统，报道的流体力学直径通常在80–150纳米之间，分散度低（通常PDI <= 0.2–0.3），zeta电位为轻微负值或接近中性，这反映了在血管运输、外渗、骨髓穿透以及避免快速调理和清除之间的实际平衡[53, 129, 130]。这种设计逻辑与最近的使用适配体作为细胞选择性配体在纳米载体上的实现一致，这些适配体在骨质疏松相关环境中偏导生物分布和细胞摄取[131]，也与在肌肉骨骼和肿瘤相关领域使用的更广泛的适配体-纳米颗粒设计框架一致[95, 99]。相比之下，针对软骨的构建体通常设计得更小（通常小于约80–100纳米），并依赖于柔性的PEG类间隔体来穿越密集的糖胺聚糖网络，同时限制非生产性的静电捕获；这些限制在针对软骨的递送分析中反复被强调，并与在骨关节炎模型中使用的适配体辅助的软骨细胞靶向一致[47, 96, 132]。值得注意的是，虽然阳电荷表面可以增强核酸的结合能力，但也会增加蛋白质的吸附、网状内皮细胞的摄取以及体内的炎症/毒性风险，因此需要在面向关节和骨髓的配方中调节电荷[48, 95]。配体密度和价态也表现出类似的“设计窗口”限制。在靶向纳米医学中，当配体密度增加到中间范围时，细胞结合和摄取通常会有所改善，之后由于空间拥挤、构象限制和颗粒间的相互作用开始占主导地位，性能可能会达到平台期或下降，形成钟形响应曲线[64, 75, 133]。尽管肌肉骨骼相关的适配体报告并不总是量化“每个颗粒上的适配体数量”（或每个单位表面积的适配体数量），但成功的系统隐含地处于这个中间范围内，这一点通过骨髓趋向性的选择和针对骨骼的纳米载体得到了证实[53, 131]。此外，利用多价性而不强制纳米级拥挤的支架或DNA纳米结构可以实现适配体基序在更大长度尺度上的分布，从而在减少聚集风险的同时提高亲和力[49, 51]。间隔体和连接体的结构是性能的第三个决定因素。当连接体太短或嫁接密度过高时，表面固定可能会抑制适配体的折叠和可及性；相反，过长的聚合物间隔体会增加流体力学尺寸并改变界面行为，因此在中等长度的连接体上保持构象自由度同时维持可控的展示在系统研究中经常受到青睐[77, 133, 134]。在肌肉骨骼应用中，面向软骨的平台通常受益于更长、更柔性的间隔体，以便穿透基质屏障到达细胞表位，而面向骨髓或肿瘤的系统可以容忍较短的连接体，当表位更暴露时，这样既保持了紧凑的尺寸，又有利于药代动力学[53, 130, 132]。总体而言，表2中总结的系统支持三个可用于肌肉骨骼靶向的可操作设计规则：(i) 全身骨骼/肿瘤递送通常集中在约80–150纳米的载体上，这些载体具有轻微负值或接近中性的表面；(ii) 面向软骨/半月板的结构通常需要更小的构建体（通常小于约80–100纳米），并使用柔性的间隔体以在密集的基质中保持可及性；(iii) 局部储存库和较大的基底可以通过空间分布的多价性来利用亲和力，同时最小化纳米颗粒的聚集[47, 49, 51, 132]。7.2 针对骨骼靶向和关节保留的定量指标仅凭定性描述，如“增强骨骼摄取”或“延长关节驻留时间”，不足以进行工程优化或平台间的定量比较。向标准化迈出的一步是定义一个 bone-to-RES 指数，该指数计算为注射剂量在骨骼或骨骼病变中的百分比（%ID）与相同时间点在肝脏和脾脏中的百分比ID的比率。在肿瘤学背景下开发的骨骼趋向性适配体-纳米颗粒系统在这一指数上表现出显著改进，反映了优先在骨骼中的积累和减少在肝脏/脾脏中的沉积，与未靶向的纳米载体相比[53, 99]。将这一定量基准应用于非恶性骨骼疾病，如骨质疏松或骨髓炎，可以建立明确的转化治疗阈值，超越定性的影像学或组织学描述[1, 2]。对于关节内的应用，可以通过比较全身暴露和局部暴露来制定一个互补的关节保留指数，具体来说，就是比较关节内给药后血浆曲线下面积（AUC）与在滑液或软骨中测量的AUC的比率。控制释放的脂质体和聚合物储存库已经在骨关节炎和RA纳米医学模型中显示出显著的关节AUC改善，同时减少了全身药物暴露[135, 136]。用针对软骨或滑膜的特定适配体修饰这些载体预计将进一步减少药物洗脱，增强局部保留，并提高治疗效果[96, 123]。在整个适配体研究中标准化 bone-to-RES 和关节保留指数的报告，可以将靶向性能从定性的描述转化为可比较、可优化的定量工程指标，用于确定是否继续研究的标准[1, 2]。7.3 配体类别和价态策略的比较表1将肌肉骨骼适配体分类为细胞靶向、基质靶向、 pathways 靶向和病原体靶向类别，每种类别都有其独特的设计和功能含义。细胞靶向适配体，例如CH6（针对成骨细胞谱系的）和Apt19S（针对间充质基质细胞的），已经在空间控制的再生系统中显示出有效性，例如，CH6功能化的四面体DNA纳米结构嵌入GelMA水凝胶中增强了骨质疏松性下颌骨缺损中的成骨细胞招募和骨骼形成[49]，而Apt19S功能化的各向异性半月板支架通过内源性基质细胞招募改善了纤维软骨再生[51]。基质靶向适配体，包括结合羟基磷灰石的配体，有助于储存库的锚定和矿物表面的粘附，增强了细胞-基质相互作用和药物在骨界面上的保留[137, 138]。Paths 目标的适配体（如抗sclerostin、抗IL-6或抗CTGF）既作为靶向基序，也作为骨形成和炎症信号传导的功能调节剂，提供了双重治疗价值[85, 123, 139]。最后，正在开发针对病原体的适配体，以选择性结合细菌表面抗原，例如金黄色葡萄球菌上的抗原，用于骨髓炎和假体关节感染的治疗，支持定向的抗菌递送或诊断捕获[87]。虽然大多数肌肉骨骼系统使用单一适配体，但近年来在癌症纳米医学和生物传感方面的研究强调了双适配体和逻辑门控（AND-gate）设计的潜力，以提高特异性并减少脱靶活性[99, 107]。结合骨骼趋向性适配体和肿瘤或CSC特异性适配体的双靶向架构在转移模型中改善了骨骼靶向效果，类似的双特异性结构在大型动物研究中实现了功能修复[51, 135]。最终，配体类别和价态策略必须与治疗目的相匹配：细胞靶向的多价结构用于再生和免疫调节；基质靶向的配体用于储存库的锚定和长期的空间控制；以及多适配体或逻辑门控系统用于区分病变组织和健康组织[1, 9 和表1]。7.4 依据具体适应症的决策结构和架构在工程方面，现有系统支持一个实用的具体适应症决策框架（见图9）。对于骨质疏松和局灶性骨缺损，最可行的方法是结合：(i) 一种骨骼趋向性或成骨细胞靶向的适配体（例如，通过体内选择富集的骨骼趋向性配体或成骨细胞结合的CH6适配体），(ii) 具有适度多价适配体展示和低绝对zeta电位的纳米颗粒或DNA纳米结构平台（通常在80–150纳米的流体力学窗口内），以及 (iii) 旨在最大化骨骼到网状内皮系统分配的系统给药或局部整合到缓慢降解的水凝胶或支架中，以抵抗炎症和机械应力[44, 49, 53]（见图3）。对于软骨和半月板，有效的构建体倾向于优先选择 (i) 促进间充质基质细胞招募或软骨/基质导向的适配体，(ii) 小于100纳米的载体或使用柔性连接体的多孔支架，以在密集的细胞外基质中保持配体的可及性；以及 (iii) 关节内给药，其终点基于组织学、成分和机械恢复的评估[51]（见图4）。对于由滑膜炎驱动的疾病，最合理的短期策略是优化（i）针对滑膜的配体或路径定向的配体（例如，抗IL-6适配体）和/或（ii）局部递送系统，如水凝胶或微针辅助的关节内递送，以在滑膜翳内集中药物作用，同时减少对软骨和骨骼的靶外负担；然而，大多数整合了“适配体加上先进递送系统”的类风湿性关节炎（RA）系统仍处于开发阶段，需要在标准化模型中进行系统性验证[107, 122]。在骨肿瘤和骨骼转移中，最成熟的设计逻辑是分层靶向，将（i）肿瘤相关或癌干细胞的适配体与（ii）具有骨定向/病变富集行为的物质以及（iii）细胞毒性、免疫原性细胞死亡或治疗性载荷结合在一起，这些物质被装载在临床上可扩展的脂质或聚合物纳米载体上，并通过病变吸收和与生存相关的结果进行评估[95, 107]（图7）。最后，对于感染和骨髓炎，最可行的短期解决方案主要是局部的：将针对病原体的适配体与含有抗生素的纳米颗粒、水凝胶或植入物涂层结合，以增强在受感染骨骼/植入物界面的结合和生物膜作用，并持续局部暴露[86, 87]。总体而言，这些策略是谨慎的；它们没有穷尽所有设计可能性，而是将在不同模型中反复验证有效的方案提炼成一套可转化的规则集，这些规则集可以将尺寸、电荷、配体密度和靶标类别与生物分布指数、关节滞留时间、疗效终点和安全性特征联系起来（图9；表1）。8 安全性、免疫原性和生物相容性8.1 核酸适配体的固有安全性这些只是核酸适配体相对于蛋白质和小分子的一些安全优势，这些优势在慢性肌肉骨骼疾病中尤为有益。在大多数情况下，化学改性的DNA和RNA适配体不会整合、复制，也不会通过肾脏清除，而是会被热和酶降解为低分子量的代谢物，这些代谢物通常会被排出体外[28]。系统性地或局部施用的适配体已经在临床前研究中进行了测试，并显示出良好的总体安全性，例如用于新生血管性老年性黄斑变性的适配体pegaptanib以及一些处于临床前开发阶段的肿瘤学或心血管药物[28, 140]。不良事件的原因主要与给药途径（玻璃体腔内注射）或连接的化学物质有关，而不是与寡核苷酸的骨架本身有关[28, 140]。在这类研究中，没有关于基因毒性、器官毒性或适配体连接靶点以外的组织损伤的统一报告。这支持了一个观点，即安全性的关键属性是靶点的选择、化学修饰和载体设计，而不是核酸的固有性质。8.2 载体和载荷的毒性在肌肉骨骼应用中，载体和载荷可能比适配体本身更令人担忧。当基于脂质和聚合物的纳米颗粒的表面电荷、大小或赋形剂组成没有优化时，它们可能会引起限制剂量的肝脏或血液系统毒性、补体激活和输注反应[94, 107, 141-143]。它们可能会破坏细胞膜并引发炎症过程，在患有骨关节炎或类风湿性滑膜炎的发炎关节中是不合适的。水凝胶和DNA纳米结构通常在体内具有生物相容性。然而，它们的降解动力学、交联剂以及整合到生物材料中的骨诱导成分应谨慎选择，以防止形成慢性异物反应或骨骼和软骨组织的异位钙化[107]。第二个安全措施是载荷的选择。由于靶点失败或递送系统的泄漏，存在局部滥用细胞毒性化疗药物、免疫调节剂（ICD诱导剂）和高活性生物制剂的风险。基于适配体的系统，其中使用多柔比星或光敏剂靶向骨肿瘤，与自由药物相比可以减少全身暴露；然而，应逐步增加剂量，并进行心脏监测，并在长期使用中观察继发性恶性肿瘤和骨髓变化[28, 99]。同样，递送到骨髓炎结构中的抗菌载荷的剂量必须足够杀死生物膜，同时不损害成骨细胞功能。实际上，肌肉骨骼适配体-纳米载体临床前安全性测试应包括传统的纳米毒理学结果（血液学、血清化学和器官组织学）以及骨骼和关节的结果（软骨完整性、骨转换标志物和骨髓细胞计数）。8.3 免疫原性：抗PEG、抗核酸和补体激活免疫原性是任何用于慢性疾病（如骨质疏松症、骨关节炎或类风湿性关节炎）的适配体功能化纳米载体的关键问题。尽管经过修饰或适当改性的核酸通常比大多数生物制剂具有较低的免疫原性，但未甲基化的CpG或其他双链区域的序列基序在大量系统给予时可能会刺激Toll样受体和先天免疫[28]。通过仔细设计序列和选择性地使用2′-O-甲基、2′-氟或LOCKed核酸（LNA）残基，可以减少这些免疫反应，而不会影响靶点亲和力[107, 144]。然而，对隐蔽聚合物（特别是聚（乙二醇）（PEG）的免疫反应已得到充分研究。许多患者体内存在抗PEG抗体，这与加速的血液清除、输注反应和使用大多数PEG化药物时的偶发严重过敏反应有关[95, 111, 145, 146]。PEG化的RNA适配体基REG1抗凝剂在REGULATE-PCI试验中也失败了，表明PEG相关的过敏反应是主要问题，而寡核苷酸本身并不是反应的原因[147]。对于可能需要长期服用的肌肉骨骼候选药物，应系统性地筛查抗PEG抗体，测试替代的隐蔽涂层（如两性离子或聚肌胞苷酸基聚合物），并全面检查与补体激活相关的伪过敏反应（CARPA）。无论是否存在PEG，纳米颗粒表面都可能激活补体系统和先天免疫。高密度的适配体涂层、特定的脂质和聚合物组成以及调理作用都可能被激活，导致快速清除和输注相关反应[107, 142, 143, 149]。因此，早期的肌肉骨骼干预措施必须包括人类血清补体测试、细胞因子释放测试，以及当可用时，对患有炎症性疾病的患者进行滑液或骨髓抽吸物的体外测试。理论上，这些相互依赖的安全因素——适配体序列、化学修饰、隐蔽聚合物、载体表面和载荷——应作为一个整体来考虑，如图11中的“安全性-免疫原性轮盘”所示。8.4 骨骼、软骨、骨髓和滑膜的局部组织相容性系统性耐受性并不能保证骨骼和关节组织的安全性，因为这些组织具有独特的机械、血管和免疫环境。关节内制剂必须避免软骨毒性、滑膜刺激和润滑机制的破坏。几种批准用于关节的粘弹性补充剂和局部麻醉制剂已经显示出剂量依赖性的软骨毒性效应；装饰有适配体的纳米颗粒和水凝胶必须至少达到相同的标准[107, 150, 151]。对于靶向软骨的系统，通常需要小于100纳米的颗粒才能穿透致密的细胞外基质；然而，过于阳离子或刚性的载体可能会非特异性地结合蛋白多糖，破坏渗透平衡并损害基质完整性[28, 152]。在骨骼和骨髓中，放置在缺陷处或骨折线周围的局部沉积物必须平衡骨诱导作用与正常重塑和造血功能的维持。高度交联或缓慢降解的支架可能导致纤维化包裹或慢性炎症，而降解过快的系统可能会过快释放其载荷，危及其机械稳定性[153]。对于类风湿性关节炎和脊柱关节炎中的滑膜和关节周围应用，现有的慢性炎症和免疫失调是一个关注点；即使是由载体或化学物质引起的轻微的靶外免疫激活也可能加重疾病。因此，局部安全评估应超越基本的组织学检查，包括标准化的软骨损伤评分（如OARSI系统）、滑膜翳和侵蚀评估，以及对受影响组织的转录组学或细胞因子分析[118, 153, 154]。8.5 慢性肌肉骨骼疾病的长期和重复剂量安全性大多数临床肌肉骨骼疾病，包括骨质疏松症、骨关节炎、类风湿性关节炎、慢性骨髓炎和骨转移，都需要重复或长期治疗。因此，对适配体功能化纳米载体的安全性测试应考虑短期耐受性、累积暴露、免疫记忆和可能的组织积累。PEG特异性反应和补体激活会在重复剂量下恶化，特别是当剂量间隔与抗PEG抗体的动力学相匹配时[95, 111, 143, 147, 155, 156]。同样，完全不可生物降解的纳米颗粒可能会随着时间的推移在肝脏、脾脏或骨髓中积累，它们对造血和全身免疫的影响尚不清楚[19, 157, 158]. 对于首次在人体进行的肌肉骨骼研究，应采取逐步的方法：先进行局部或单腔室递送（如关节内注射或缺陷床中的储库注射），剂量应远低于临床前观察到的不良反应阈值，随后逐步监测肌肉骨骼功能、骨骼和软骨成像以及基本免疫状况，并预先确定在出现过敏反应时应停止的标准[145, 159]。随着临床经验的积累，可以逐步增加重复剂量方案，重点考虑化学性质保守的适配体、可生物降解的载体和已建立的载荷组合。同时，需要按照纳米医学和风湿病学/骨科试验的标准进行标准化的安全性报告，以支持跨项目学习，并优化下一代肌肉骨骼适配体疗法的安全性和免疫原性特征[87, 107, 159-162]。9 转化和CMC制造适配体功能化纳米载体将首先应用于人体试验，并且不仅依赖于化学性质，还依赖于生物功能以及制造和控制（CMC）功能。与蛋白质不同，溶液中合成的寡核苷酸适配体是化学合成的，因此具有高度标准化。然而，添加载体结构、隐蔽聚合物和生物活性载荷为先进的纳米药物和组合产品带来了复杂性（图12）。9.1 工程化适配体的分析法规在适配体层面，生产可以基于自动化的固相磷酸酰胺化学方法，序列的身份和功能基团（硫醇、叠氮化物和胺）或2'到2'-F / 2'到F' /O甲基和异基团的位置可以在在线或批量条件下进行检查[28, 163]。身份验证（LC-MS、HPLC）、纯度（通常为90%–95%）、反离子含量、残留溶剂以及确认生理离子条件下的结合亲和力和二级结构等质量方面是主要的释放测试[28, 163]。用户必须确保适配体在适合骨骼和关节疾病的适当基质中的构象和靶点结合得以保持，而不仅仅是缓冲液中，以便将适配体应用于肌肉骨骼应用。9.2 可扩展的适配体纳米载体平台开发在GMP适配体合成过程中的相互作用之后，可扩展的适配体-纳米载体组装是CMC中的主要挑战。工艺参数（如溶剂配方结构、微流控混合速率以及下游处理操作，如溶剂过滤和浓缩）将被优化，以获得所需的大小（通常在50–150纳米之间）、低的多分散度指数（PDI<0.2）和表面电荷的理想分布[107, 164, 165]，尤其是在脂质和聚合物纳米颗粒的情况下。其中一个特点是适配体密度，这对适配体修饰系统特别敏感；低密度会导致靶向效率低下，而高密度可能会导致空间拥挤或聚集[76, 107]。为了实现这一目标，批量释放测定需要测量每个颗粒上的适配体拷贝数（例如通过荧光标记、同位素检测或表面等离子体共振），并将结果与体外结合和细胞摄取进行比较。这对于树状大分子、DNA纳米结构和混合载体同样适用。DNA纳米结构和水凝胶的制造方向与折叠状态、交联水平以及网状结构的大小有关，这些因素会影响其机械性能和释放动力学[28, 107]。在生物应用中的其他差异还包括外泌体和细胞外囊泡平台：上游的细胞培养、囊泡分离和适配体修饰必须同步进行，以确保囊泡大小、负载和表面配体的稳定性[107, 109, 166]。9.3 复杂产品的分布大多数引人注目的肌肉骨骼设计，如用于修复骨质疏松缺陷的适配体-GelMA水凝胶、适配体功能化的半月板支架、适配体修饰的微针阵列以及关节空间中的基于外泌体的储存库，都是多组分的。实际上，共同制造更可能采取模块化形式：（i）适配体的GMP制造；（ii）载体的GMP或高级制造（纳米颗粒、水凝胶、支架、微针、外泌体）；（iii）一个巧妙的 conjugation 或装载步骤，该步骤在不改变适配体和载体完整性的条件下将两者结合[107, 109]。9.4 稳定性、灭菌和实际使用条件将应用于骨骼和关节条件的适配体-纳米载体系统稳定性计划必须同时考虑标准药物压力因素和肌肉骨骼特有条件。应进行加速稳定性测试，并对物理化学性质（大小、PDI、ζ电位和配体密度）、适配体稳定性（核酸酶降解和脱嘌呤化）以及在不同储存温度下的功能结合进行长期稳定性测试[28, 107]。为了将这些产品通过静脉注射到滑液和血清中，还需对人类/动物滑液和血清进行额外筛选，以检测潜在的聚集、调理作用或过早的适配体解聚[87]。灭菌是一个关键问题。这些聚合物纳米颗粒、DNA纳米结构和水凝胶无法承受高压灭菌或高剂量伽马辐射。任何可通过过滤处理的事件都应优先进行无菌处理和无菌过滤，以调节适配体结构、配体密度和机械性能。支架、微针和植入物应避免过滤，而是采用低剂量伽马或电子束辐射或环氧乙烷处理[49, 104, 167]。对于承重部位的肌肉骨骼植入物，可能需要在生理条件下进行额外的机械疲劳测试，以确保灭菌不会影响其长期性能。9.5 多组分适配体作为纳米药物使用的监管方面监管机构要求纳米药物的申办者全面报告其产品，明确对生物功能和临床安全具有重要意义的材料特性。对于适配体-纳米载体，这意味着采用“按设计质量”方法，包括识别关键的质量属性（CQA），如适配体序列和修饰模式、颗粒大小和PDI、配体密度以及载荷装载，并将它们与关键工艺参数相关联[30, 159, 168-170]。欧洲药品管理局发布的关于基于纳米技术的药品的反思文件以及美国食品药品监督管理局提供的指南都指出，在进行有意义的体内研究之前，充分表征结构、聚集、表面性质和体外释放行为是必要的第一步。这是因为，在像适配体功能化的支架或微针设备这样的组合产品中，开发者必须满足生物相容性、灭菌和机械性能的要求，此外还需要符合药物产品的药理学、毒理学和药代动力学标准。监管机构应注意，当肌肉骨骼适配体项目承认现有纳米脂质体药物、库形皮质类固醇和step-premo boiler house-ones的监管历史附件时，它们将有最快的发展前景，并重新调整其CMC（化学、制造和控制）包装，以满足小型分子/核酸调节机构和设备监管机构的期望[107]。10 临床和监管预测10.1 首次人体使用的价值目前关于基于适配体的系统治疗的临床经验表明，大多数现有的临床适配体（如用于新生血管性老年性黄斑变性的VEGF结合适配体pegaptanib和用于血液系统恶性肿瘤的CXCL12结合适配体olaptesed pegol）已经证明，化学修饰的适配体可以在人体内实现可接受的安全性和可预测的药代动力学[23, 140, 171]。对于局部或区域特定应用（其中风险更容易管理），以及药效表达仅限于解剖学区域的肌肉骨骼系统，临床症状会更早出现。可以提出三个早期目标。为了治疗关节内骨关节炎，可以将带有抗降解或促合成分子的适配体功能化水凝胶或纳米颗粒直接注射到关节内，这种给药方式可以到达疾病部位，并提供特定的成像和临床结果（疼痛、功能以及MRI软骨形态[172]。其次，骨骼缺陷系统包括针对高风险骨质疏松或创伤性缺陷（如下颌骨或长骨缺陷中的CH6样成骨细胞特异性储存库）的局部骨骼缺陷系统，这些系统已经具有骨移植替代物和生长因子浸渍支架的监管先例[47, 173]。在骨科和创伤学领域，系统骨转移方面，骨定向适配体-纳米载体可以先作为成像模式或在高风险环境中作为递送载荷进行评估，利用肿瘤学中的系统耐受性[87, 100, 130]。10.2 原型I/II期设计试验一种可能的一膝关节内适配体-水凝胶储存库试验可以是这样的I/II期试验，其中主要终点可能是安全性（局部反应、感染、渗出）和滑液中的药代动力学，次要终点可以包括疼痛、功能以及MRI或放射学数据下的软骨结构变化（6–12个月[172, 174]。在骨质疏松或节段性缺陷的情况下，可以将适配体修饰的骨再生支架植入已经手术受损患者的下颌骨或干骺端缺陷中，安全性和局部整合将是主要结果，uCT、BMD和生物力学替代指标将是次要结果[175, 176]。对于骨转移，无论是诊断性还是治疗性构建物，例如骨定向适配体-纳米颗粒作为成像剂或低剂量细胞毒性剂，最初可以用于诊断或治疗，例如测量骨转移患者的生物分布、骨：RES比率以及初步的抗肿瘤活性[87, 177]。在所有情况下，剂量递增计划都应该是合理的，并且必须特别注意药物的免疫原性、脱靶器官毒性、关节内事件和进行性关节萎缩。10.3 监管途径和组合产品的问题大多数用于治疗肌肉骨骼疾病的适配体纳米载体系统被归类为组合产品，包括一种药物、一个设备，在某些情况下还包括一部分生物制剂。关节内的适配体-水凝胶属于药物-设备组合产品；适配体功能化的支架或微针阵列可能受到设备法规的监管，同时包含药物成分；基于外泌体的系统也会引发其他生物制剂分类问题[178, 179]。为了在后期避免延误，必须尽早与监管机构建立正确的互动，明确主要作用机制、产品分类和临床前包装。纳米材料的监管规定基于以下信息：CMC数据应与体内性能相关。欧洲药品管理局和美国食品药品监督管理局都强调，必须详细描述纳米材料的结构、表面特性、聚集和释放动力学，并提供适当的体外和体内模型，以反映所建议的临床用途[178]。在肌肉骨骼适配体生物传感器方面，这意味着在开发早期阶段必须使用通用肿瘤异种移植物或背部储存库以及与骨骼和关节相关的模型。转化方法是通过使用生物标志物和成像读数来监测细胞和组织生理的缺陷和破坏，以及疾病的严重程度[174, 180]。最终，成功的临床转化依赖于强大的生物标志物和成像方法，这些方法可以评估靶向效果和治疗反应。定量CT、高分辨率外周CT和MRI用于详细检查骨量和微结构[175, 176]。组合物MRI（T2、T1r和dGEMRIC）和标准化放射学评分正在成为软骨和半月板的结果指标[174, 181]。在临床评分中，将使用成像技术（超声波和MRI）和细胞因子来评估滑膜炎的炎症反应。在骨肿瘤和感染的情况下，需要进行体积成像和骨完整性测量（必要时使用功能性成像，例如PET示踪剂来评估感染或肿瘤代谢[87, 182, 183]。从工程角度来看，这些读数不是最终结果；它们将是指导迭代过程的控制信号，如适配体选择、配体密度、载体几何形状和剂量调度，并在设计思想、CMC和临床结果之间建立反馈循环。因此，肌肉骨骼适配体领域有望利用制造、监管和生物标志物驱动的试验设计之间的紧密配合，将现有的大量临床前单元转化为可行的人体首次使用候选物（图13）。11 开放性问题与未来方向已经开发出了针对肌肉骨骼疾病的带有适配体和功能性基团的纳米载体。表1和表2分别展示了案例研究和适配体面板，展示了可以实现的效果。然而，它们也暴露了该领域的结构问题：缺乏连贯的表征、多种模型以及对共享基准的共识不足。未来必须通过标准化、更深入的目标发现和综合转化基础设施，将有前景的原型转化为可行的临床平台，而不仅仅是单一的、基础的概念。11.1 表征和报告标准化文献中的一个持续限制是对关键设计变量的不完整报告。亲和力通常被报告为很高，但没有有效量化生理条件下的解离常数。 également，已经报道了适配体修饰的纳米颗粒，但没有描述配体密度、间隔物化学性质、取向、颗粒大小、PDI或ζ电位；然而，如骨到RES比率或关节保留率等生物分布结果很少被报告。在生物方面，使用类似上述的装置来测量骨、软骨、滑膜组织、肿瘤和感染的结果；然而，协议和评分系统经常被更改、缩短或未详细描述。最可行的解决方案是采用最小的报告集。在物理化学层面上，任何用于转化应用的适配体-纳米载体系统都必须提供Kd（在试验条件下）、适配体拷贝数/颗粒或表面积、间隔物/连接物的性质和长度，以及核心颗粒参数，如大小、PDI和ζ电位。在生物层面，应使用社区标准的成像、组织学、生物力学、肿瘤和感染方法来记录骨、软骨/半月板、滑膜、肿瘤和感染的结果（如果可用的话）。在他们缺席的情况下，将无法进行有意义的跨平台比较，也无法进行真正的结构-功能分析（图10）。11.2 目标的发现和模型相关性目前的肌肉骨骼适配体库包含了明显的目标，如成骨细胞、基质细胞、软骨细胞、滑膜细胞因子、癌症干细胞标记物以及细菌表位。尽管这是一个合理的起点，但它可能忽略了骨骼和关节微环境的多样性。目前，单细胞和空间组学正在以前所未有的细节绘制骨骼、软骨、滑膜和骨髓的细胞和分子异质性；这些数据集应该经过广泛分析，以识别用于SELEX和体内SELEX的疾病特异性表位，而不是依赖于传统的标记物。模型选择必须与其他过程同步发展。如今有许多基于有缺陷或疾病模型的小型动物的系统，但这些系统并不能完全再现人类的解剖结构、负载模式和免疫反应。在异位、承重和易感染部位进行的体内SELEX的实施将非常重要，以确保所选的适配体在类似人类的骨骼生理条件下仍能保持功能。11.3 基于逻辑门控和多适配体的设计到目前为止，大多数肌肉骨骼平台都在同一载体上使用了一个适配体。这限制了核酸结构的信号处理能力。基于逻辑门控和多适配体的设计已经在肿瘤学和生物传感领域得到应用，下一步在骨骼和关节应用中的逻辑步骤就是使用逻辑门控。因此，双适配体系统必须同时识别结构信号（如矿化基质）和与疾病相关的受体，以提高对病变组织和健康组织的区分能力。此外，可以使用OR/NOT逻辑来阻止在表达特定不目标标记物的组织中或具有特定信号组合的微环境中适配体的吸收。这样的架构对控制配体密度、空间结构和构象动态提出了更高的要求。将它们整合到肌肉骨骼模型中不仅需要创造性设计，还需要谨慎评估逻辑门控结构对生物分布、脱靶吸收和治疗指数的影响与单配体类似物的比较。11.4 适配体-纳米载体系统在肌肉骨骼应用中的当前限制尽管有令人鼓舞的临床前结果，但仍需承认几个关键限制。首先，适配体在肌肉骨骼微环境中的稳定性仍然是一个问题。虽然化学修饰可以提高抗核酸酶能力，但在富含蛋白酶和核酸酶的滑液、酸性骨吸收窝和生物膜相关感染部位，适配体-纳米载体构建体的长期功能完整性尚未在临床相关暴露时间范围内得到系统研究。其次，全身给药后形成的蛋白质包膜可能会掩盖表面展示的适配体，减少有效配体的可用性，并以难以通过体外结合试验预测的方式改变生物分布。这种现象在肌肉骨骼适配体研究中很少被量化；然而，它可能显著影响体内的靶向效率。第三，几乎所有现有证据都来自不能完全再现人类骨骼和关节组织的机械负载、解剖规模、血管结构或免疫复杂性的小型动物模型。缺乏经过验证的大型动物或人源化模型限制了报告的疗效和生物分布数据在临床转化中的预测价值。第四，没有适配体功能化的纳米载体进入任何肌肉骨骼适应症的临床试验。该领域缺乏与临床已建立的靶向配体（如抗体或双膦酸盐）在相同条件下的直接比较，这使得难以评估基于适配体的系统的真正竞争优势。第五，制造的可扩展性仍是一个未解决的问题。适配体偶联效率、配体取向和纳米载体物理化学性质的批次间重现性尚未在临床开发所需的规模上得到证明。多组分适配体-纳米载体产品的监管途径尚未明确，为转化时间表增加了不确定性。这些限制并不削弱适配体引导递送的潜力，但强调了在临床进步之前进行严格标准化评估的必要性。11.5 人工智能辅助的SELEX和计算适配体设计机器学习和深度学习开始改变适配体的发现方式。计算工具，如AptaDiff、RaptGen和Apta-MCTS，可以生成具有预测高亲和力结合的新颖适配体序列，从而绕过了传统SELEX的迭代周期。值得注意的是，一种应用于抗硬化素适配体SELEX后化学修饰的交互式机器学习方法使结合亲和力提高了105倍，直接证明了人工智能引导优化对于肌肉骨骼目标的相关性。将这些计算策略与微流控和高通量SELEX平台相结合，可以显著加速针对通过单细胞和空间组学发现的未充分探索的骨骼表位的适配体识别。11.6 用于靶向骨骼和关节治疗的多功能DNA纳米结构DNA折纸和其他可编程DNA纳米结构提供了对配体呈现、药物装载化学计量学和刺激响应释放的精确空间控制。它们的可编程性使得构建多价多适配体结构成为可能，这些结构可以同时与细胞目标和基质成分相互作用，这特别适合于骨骼缺陷、关节软骨和发炎滑膜等异质性微环境。尽管DNA纳米结构已在肿瘤学和生物传感领域得到探索，但其在肌肉骨骼适应症中的系统应用仍处于起步阶段，代表着下一代适配体引导药物递送的一个有前景的前沿。11.7 适配体引导的治疗诊断学与免疫疗法或细胞疗法的结合结合适配体介导的靶向和成像功能（如荧光、光声或磁共振对比）的治疗诊断策略，可以实现骨骼和关节组织中药物生物分布和治疗反应的实时监测。此外，将适配体功能化的纳米载体与新兴的免疫疗法或细胞治疗方法（包括巨噬细胞极化策略、用于骨肉瘤的嵌合抗原受体T细胞疗法和间充质基质细胞共递送）整合起来，可能会产生单模式适配体系统无法独立实现的协同效应。11.8 临床转化和工业化路径加速适配体-纳米载体系统的临床转化需要在多个方面协调努力：建立符合GMP标准的制造流程，并确保批次间重现性；开发伴随诊断测试，以识别最有可能从适配体引导疗法中受益的患者群体；并与监管机构合作，定义多组分适配体产品的分类和批准途径。高优先级的首个人体试验应用，包括用于骨关节炎的关节内递送、用于骨再生的缺陷床植入以及用于骨骼转移的系统靶向递送，应通过结合药代动力学终点、基于成像的生物分布读数和标准化临床结果测量的适应性临床试验设计来推进。12 结论适配体功能化的纳米载体为骨骼肌肉疾病的靶向干预提供了一个合理且可适应的平台，越来越多的证据支持其在骨质疏松缺陷、软骨和半月板修复、发炎滑膜、骨肿瘤和假体关节感染中的应用。这些配体提供了三个关键优势：可编程的亲和力和选择性、可调的化学稳定性以及与各种递送载体的模块化集成。尽管有这些前景，大多数当前系统仍处于原型阶段，关键设计参数（如结合亲和力、配体密度、间隔化学和载体物理化学性质）的报告并不一致。要从概念验证阶段过渡到临床可行的疗法，必须严格定义这些变量，并结合标准化的生物分布、组织学分析和在机械和组织相关模型中的全面安全性评估。一旦满足这些基准，转化就成为性能问题。用于骨关节炎和半月板修复的局部递送系统、用于骨质疏松或创伤性骨丢失的缺陷床系统以及用于骨骼转移的骨靶向载体代表了最现实的首个人体应用，每种应用都有可测量的结果和现有的护理标准可供比较。该领域的未来不取决于新的概念突破，而取决于操作执行，包括设计能够承受骨骼、软骨、滑膜和骨髓独特挑战的适配体，并通过可重复、定量定义的平台进行递送，从而影响治疗决策和肌肉骨骼健康结果。这项研究得到了中国国家自然科学基金（32571692）的支持。作者声明没有利益冲突。数据可用性声明：由于在本研究过程中没有生成或分析任何数据集，因此不适用于数据共享。