Tolcapone

药物性肝损伤（DILI）是指由药物或其代谢产物引起的肝脏损害，是常见的药物不良反应，长期以来被认为是患者安全和药物开发的主要关注点。严重的DILI临床上可出现器官功能障碍，有时甚至死亡，会导致药品撤市或监管机构要求更严格标签（例如，禁忌症或黑框警告）。很不幸的是，这类不良反应通常只有在大样本量患者暴露于研究药物时才会显现，而这意味着在后期关键临床试验或上市后才能发现。因严重肝毒性而从市场撤市的药物包括溴芬酸（1998）、托卡朋（1998）、曲格列酮（1999）、曲伐沙星（1999）、奈法唑酮（2003）、希美加群（2006）、鲁米考昔（2007）、西他生坦（2010）和奥贝胆酸（2025）。尽管在临床试验中发现了这些药物引起的肝酶异常，但在支持人类安全性风险评估的非临床毒理研究中几乎未发现肝毒性的证据。2009年，针对这一日益严重的情况，FDA发布了指南文件《药物性肝损伤：上市前临床评估》。其中规定：如果在临床试验期间观察到一例或多例符合海氏法则的病例（总血清胆红素升高>2倍正常上限伴ALT升高>3倍正常上限），即是药物导致严重肝损伤显著风险的强预测因子。鉴于肝脏具有清除胆红素的强大能力，可引起胆红素轻微升高的肝细胞损伤即代表了肝脏的高度损伤。该指南还指出，对于随后在更大人群中未发现引起严重DILI的药物，临床研究中均没有出现过海氏法则假阳性病例。这也就是说，临床研究中未出现符合海氏法则病例，则药物引发严重DILI的风险低；出现了符合海氏法则病例，则临床引起DILI的风险显著升高。 该指南也指出，由于大多数撤市的肝毒性药物导致死亡或移植的发生率≤1/10,000，海氏法则发生率约为1/1000，指南估计需要在临床试验期间暴露约3000名受试者才能有95%的概率观察到至少一例肝毒性药物的海氏法则病例。因此，新药研发仍需要在研发的早期及时识别严重肝毒性，而非仅依赖涉及数千人的临床试验来识别肝毒性药物；早期对肝毒性进行充分评估可降低后期临床因出现肝毒性导致开发失败或撤市的风险，是典型的花小钱、办大事。 目前，肝毒性仍然是药物临床开发阶段常见的失败原因。在临床试验期间遇到转氨酶升高导致停止开发的小分子候选药物包括AMG009、fasiglifam和telcagepant。 此外，寡核苷酸和抗体疗法等新形态药物的开发同样带来了新肝损伤机制和挑战，在非临床动物种属和人类中均有肝毒性报道。因此，怎样在早期临床开发中发现影响药物开发的严重安全仍然是制药行业持续关注的问题，而在进入临床开发之前找到减轻这些风险的方法是行业面临的首要挑战。 尽管有许多关于动物模型无法准确反映人类肝毒性风险的文章，但动物试验用于识别、消减安全风险的价值早已为人所知。在IQ联盟进行的分析中，182个新分子中有16个在动物中引起肝损伤，在大鼠、犬和非人灵长类动物研究中的敏感性分别为65%、50%和27%。识别DILI信号的总体阳性预测值在大鼠中为33%，在犬中为27%，在非人灵长类动物中为50%；而DILI阴性预测值则较高，在大鼠中为89%，在犬中为88%，在非人灵长类动物中为85%。以上结果表明：即使结合两个物种的安全性评估结果，人体肝毒性阳性的预测值仍然只有62%。物种间肝毒性潜力存在差异的原因有很多。例如，胆汁酸谱及其疏水性特征存在主要种间差异；肝脏药物转运蛋白表达水平和主要药物代谢酶的遗传多态性等。 已有大量文献专注于开发非临床研究研究策略以期识别和淘汰对人类具有肝毒性危害或风险的新型治疗实体。大量研究通过回顾性分析识别了DILI的众多风险因素和危害。大致上，这些因素可分为三类：理化性质，如化合物亲脂性（log P）、总极性表面积（TPSA）和警示结构；药物代谢置因素，如反应性代谢物形成、每日剂量/暴露、广泛的肝脏代谢；以及毒性类型（细胞/细胞器表型），如细胞毒性、线粒体毒性、胆汁酸稳态抑制。 图1 肝毒性机制概览 许多制药公司已发布其基于回顾性分析的通用筛选流程、方法，用于检测化合物诱导人类肝损伤的潜力。然而，需要注意的是：过于保守的肝毒性筛选策略可能导致过多的假阳性。这可能使好的药物在有机会进行临床评估之前就被终止。因此，需要开发更适合的筛选方法，以更准确地预测临床肝毒性的潜在风险和严重程度。国际制药开发创新与质量联盟（IQ联盟）的DILI非临床转化工作组（NTWG）开展了两次调查，以了解工业界在非临床DILI风险评估方法的一致性或差异性。调查的重点是评估公司在DILI风险评估方面采取的方法和考虑因素，以及他们在5年期间内与非临床和临床DILI相关的经验。第一次调查于2017年进行，调查了20家成员公司，收集了2012年1月1日至2016年12月31日期间公司的数据和经验信息。同样，第二次调查收集了2017年1月1日至2022年1月1日期间17家公司拥有的数据和经验。这一调查报告提供了IQ成员公司非临床DILI风险评估的独特且当代的视角，以及对过去十年DILI风险评估如何演变的见解。本文就部分问题进行摘录阐发，收他山之石以攻玉。 常规评估方法 1、靶点安全性评估（target safety analysis，TSA） 企业是否在早期开发/药物发现中纳入了正式的TSA？如果是，考虑哪些因素？ 在2023年参与问卷调查的所有17家公司（100%）都在早期开发/药物发现中纳入了正式的TSA。在这些公司中，11家（65%）回应TSA涉及对文献的综述，11家（65%）包含对靶点在预期和非预期组织/器官中的表达的分析，10家（59%）包括生物信息学评估，9家（53%）包括信号通路分析；而其他评论则提到了基于人类遗传学、物种同源性、竞争格局以及来自转基因或敲除模型的体内数据进行综合分析。 TSA是一种系统性评估流程，旨在药物研发过程中系统识别、表征并管控与药物靶点相关的潜在安全性风险（Gashaw等，2011； Brennan，2017）。该评估采用多维度方法，通过深入的生物学、药理学及毒理学分析，预测并减轻调控特定靶点可能引发的不良反应。TSA的核心环节包括靶向效应的实验验证——需在细胞或动物模型中主动测试靶点调控可能产生的治疗性风险及非预期安全性问题。这些全方位的评估的目的主要是在研发早期构建完善的毒性风险特征、降低后期研发失败率并确保符合监管标准要求。 “知己知彼，百战不殆”。新药开发的确定性源自于对靶点、分子和竞争态势的全方位洞察基础上的扬长避短、快速推进。TSA这类评估文档或流程的作用就是在于整合各方知识提前识别风险、应对风险，让项目团队和决策者能够做到心中有数、决策有据，是提高新药研发成功率的可靠选择。 2、预测的人体剂量作为风险评估的阈值 公司是否将预测的人类最大剂量阈值作为选择潜在临床候选物的考虑因素？ 2023年调查时，17家公司中有13家（76%）报告使用预测的人类最大剂量阈值作为选择化合物的考虑因素，2家（12%）回答“否”，1家（6%）回答“不确定”，1家（6%）未回答此问题。附加评论说明中表示这是特定肝毒性策略的直接考虑因素，其中3家公司（18%）提到使用100毫克/天作为阈值，1家公司（6%）提到500毫克/天，其他公司描述了更定性的方法，包括疗效、暴露水平和安全窗口。需要主要的是，在2017年调查的20家公司中只有9家（45%）报告使用预测的人类剂量。 从2017到2023，随着定量药理工具的应用的增多，项目团队逐渐开始基于预测的人体有效剂量及暴露水平定量评估产品的安全窗口和毒性风险。毒性风险的高低与暴露水平的高低密切相关。在体外或动物水平产生肝毒性的药物，不一定在临床产生肝毒性。基于定量药理手段的剂量或暴露水平的预估，可以预测药物在人体诱发肝毒性的剂量或暴露水平，有助于更准确、客观评估产品的毒性。当然，这也为临床前研究领域的定量药理学家提出了更多的要求，毕竟在早期研发数据不充分的情况下，准确预测的概率不会太高。 3、关于肝毒性评估中使用的体外研究方法 （1）体外肝毒性评估使用的试验方法、终点指标和技术手段 2023年，几乎所有参与调查的公司都报告使用2D培养（15家公司，88%），较少使用3D培养（10家公司，59%），且只有少数使用肝芯片（6家公司，35%）。大多数公司报告使用细胞系（14家公司，82%）和/或原代细胞（13家公司，76%）。10家公司（59%）报告使用无细胞/生化测定。 图2  2023年参与调查的17家公司对于体外测试方法、研究终点和技术手段的回答 对于体外试验终点指标来说，所有公司（17家公司，100%）都会使用细胞毒性，大多数公司采用线粒体毒性数据（15家公司，88%）和BSEP转运蛋白抑制数据（14家公司，82%），10家公司（59%）报告评估一种或多种其他转运蛋白的抑制，包括MRP2/3/4、MDR、NTCP、BCRP、OATP1B1/3、OAT1/3、OCT1/2和MATE1/2k。只有少数公司表示会评估溶酶体转运或免疫激活（各4家公司，24%）。此外，这些终点指标的使用率普遍高于2017年调查。 对于采用的技术手段，11家公司（65%）使用高内涵成像，11家（65%）在临床前使用毒理基因组学，而较少使用代谢组学（6家公司，35%）、蛋白质组学（5家公司，29%）或质谱成像（5家公司，29%）。相比2017年的调查，高内涵成像和毒理基因组学的使用率显著上升。 （2）是否在动物试验中鉴定反应性代谢物和/或生物活化途径？ 11家公司（65%）对此问题回答“是”，4家公司（24%）回答“否”，2家公司（12%）回答“不确定”。11家公司（65%）表示他们评估体内GSH结合物。作为药代动力学研究和早期毒性研究的一部分，对血浆（有时是胆汁）进行代谢谱分析有助于寻找生物活化途径的证据。 4、计算机预测软件 公司是否使用任何计算机工具、软件包或肝脏模型/模拟来“预测”哪些临床候选物可能面临人类DILI风险？ 只有6家公司（35%）反馈使用计算机工具、软件包或肝脏模型/模拟来预测临床候选物的人类DILI风险，9家公司（53%）回答“否”，1家公司（6%）回答“不确定”，1家公司（6%）未回答。4家公司（24%）在补充信息中提到使用或评估外部提供的平台，4家（24%）拥有内部开发或专有的工具来预测人类DILI风险。这一结果表明，采用计算机工具、软件或肝脏模型/模拟评估DILI的公司仍较少，或许这类工具仍处于起步或验证阶段。 探索性评估 1、生物标志物 公司是否在非临床研究中正在进行任何相关探索性DILI生物标志物（例如，miR122、GLDH、CK18、骨桥蛋白、胆汁酸谱）的研究？ 11家公司（65%）的反馈“是”，6家公司（35%）反馈为“否”。2017年调查中相应问题的回复相似，其中14家公司（70%）对此问题回答“是”，6家公司（30%）回答“否”。在2023年调查的补充信息中，成员公司正在努力获取各种DILI生物标志物（包括miR122、GLDH、CK18、骨桥蛋白、HMGB1和胆汁酸）作为临床试验和非临床毒理学研究中的肝毒性探索性终点的经验，一些公司也在探索它们在体外（在类器官和肝芯片中）体系中的使用。 2、毒理基因组学 是否在非临床毒理学研究进行期间对肝脏或其他组织进行过任何毒理基因组学筛选？ 12家公司（71%）回答“是”，5家公司（29%）回答“否”。大多数回复者认为评估通常是针对特定原因进行的，用于根据具体情况理解临床前观察到的毒性的潜在机制；提到的技术包括RNA测序、使用与DILI相关的靶向标志物组、肝脏反应测定（LRA）和全转录组谱分析。 体内非临床试验对临床开发的影响 1、动物肝毒性是否影响早期临床研究设计 早期临床研究设计是否受到支持首次IND的（例如，1个月或3个月）GLP非临床安全性研究中一个或多个物种发现的非临床肝毒性的影响？ 9家公司回答“是”（53%），7家公司回答“否”（41%），1家公司回答“不确定”（6%）。动物体内发现的肝毒性对早期临床设计的影响包括降低起始剂量、强化毒性监测、设置剂量上限及额外的研究指标、严格的纳入和排除标准以及停止规则。 2、首次IND时发现的肝毒性是否影响1期临床开发决策 （1）当一个或多个动物物种中出现非临床肝毒性发现且没有可接受的安全窗时，这是否会影响进入1期临床试验的决定？ 对于这一问题，13家公司（76%）回答“是”，3家公司（18%）回答“不确定”，1家公司（6%）未回答此问题。发生这一情况后需进行额外的调查研究，但对于肿瘤或罕见病适应症，较低的安全窗可能是可接受的；然而，对于非肿瘤慢性疾病，是否进入临床开发的决策将基于风险/获益，毒性的类型、严重程度、可逆性和可监测性进行评估。 （2）当发现的肝毒性具有可接受的安全窗，是否会触发1期临床试验中超出标准实践的肝脏安全性监测？ 对于这一问题，11家公司（65%）回答“是”，4家公司（24%）回答“否”，2家公司（12%）回答“不确定”。补充信息中提到，将会根据毒性发现纳入更广泛的肝脏安全性分析物；建立外部专家肝毒性评估委员会；增加肝功能测试的频率及检测额外的生物标志物，如总胆汁酸（抑制BSEP的化合物）；开展代谢谱分析（针对反应性代谢物担忧）；以及明确的毒性管控和剂量递增停止规则等。 3、人源化肝脏模型/人细胞模型和3D生物打印/微流控芯片 公司是否有任何正在进行的研究工作，探索和实施以下内容以改进对候选药物潜在DILI危害的理解： (a) 人源化肝脏模型或人细胞肝脏模型，如球体和类器官？ (b) 3D生物打印/微流控芯片？ 对于问题(a)，13家公司（76%）的回答“是”，4家公司（24%）回答“否”。列举的肝脏模型包括2D原代肝细胞、球体、类器官、微生理系统、人iPSC和人源化小鼠。目前正在进行的工作侧重于筛选、机制研究、推进化合物优先级的危害识别方法、评估临床前可转化性，以及为新类型分子（例如，寡核苷酸）建立证据权重方法。通常实施分层风险降低策略，该策略利用单细胞2D培养进行大型化合物集筛选，并结合更具生理相关性的先进体外方法和/或人源化模型进行定制分析。 对于问题(b)，13家公司（76%）回答“是”，4家公司（24%）回答“否”。评论表明，公司正在考虑将这些系统纳入其DILI风险降低策略，正在开发模型，或目前将这些系统用于临时调查性肝脏研究。由于技术复杂性和资源挑战，这些模型通常不用于候选药物的筛选，因为有其他具有更高通量和可接受的DILI敏感性和特异性的替代模型可用（例如，肝脏球体）。 4、新的分子形态 除了传统的小分子疗法，贵公司的研发组合中有哪些形态？对于每种形态： (a) 考虑到传统的非临床肝毒性风险评估方法主要集中在小分子疗法，您是否对解决这种新形态肝毒性风险的非临床方法有不同的看法？ (b) 您是否有针对这种形态的专用体外非临床风险评估方法？ (c) 对于体内一般毒性研究和非临床动物模型，您是否增加了额外的终点、生物标志物或关于肝毒性的考虑因素，这些不是项目特定的，而是形态特定的？ 传统上，预测和重现DILI机制的风险评估方法主要集中在小分子疗法。然而，小分子疗法现在只是整个行业产品组合中众多治疗形态之一，这引发了关于这些新兴形态的DILI风险评估方法相关性的问题。当被要求选择他们目前研发组合中拥有的所有形态时，答案显示16家公司（94%）从事单克隆抗体（mABs）工作，15家公司（88%）从事蛋白质降解剂工作，14家公司（82%）从事抗体药物偶联物（ADCs）工作，11家公司（65%）从事ASOs工作，11家公司（65%）从事基因治疗工作，11家公司（65%）从事基于肽的药物/大环化合物工作，4家公司（24%）从事其他形态工作，如细胞疗法、siRNA和/或双特异性抗体疗法（见图3）。 图3 2023年17家参与调研的公司研发的产品类型 对于每种选定的形态，公司随后被问的一系列后续问题及答复，总结见表1。 表1 2023年调查中17家公司对于新分子类型的评估问题及答复 对于每种形态，虽然很大比例的公司回应称他们对所讨论形态的非临床肝毒性方法有不同的看法（除了基于肽的药物/大环化合物），但只有少数公司（通常是1或2家）表示他们有针对特定形态的体外和体内风险评估方法。 5、疾病状态模型 贵公司是否曾将疾病动物模型用于肝脏非临床安全性测试？ 早期临床研究设计是否受到疾病动物模型（与其野生型对应物相比）中发现的非临床肝毒性的影响？ 只有3家公司（18%）回答“是”利用了疾病模型，13家公司（76%）回答“否”，1家公司（6%）回答“不确定”。两家公司留下的评论提到了疾病状态（包括影响肝脏的疾病状态），如HBV、MASH、MAFLD、肥胖和癌症，并提到了在长期疗效模型中监测ALT，而第三家公司提到了探索性使用BSEP、MRP2和POR/B5的机制敲低模型。 对于第二个问题，没有公司表示在此类模型与野生型对应物中观察到的肝毒性影响了临床研究设计。然而，一家公司确实表示，特别是对于ASOs，分子已停止进展，而另一家公司指出，在一个仅在疾病模型中观察到肝毒性的实例中，这触发了使用动物模型进行额外的机制研究。 讨论与结论 1、DILI的普遍性以及非临床数据对项目研发进展的影响 在过去的几十年里，制药公司开发了多种非临床工具和策略来最小化肝毒性风险。然而，DILI对于新药仍然是一个大问题。2023年的调查中，有几家公司报告在过去5年内至少提交了一份临床（7家公司，41%）或一份非临床（5家公司，29%）DILI相关的快速安全报告。这与2017年调查的结果相似（分别为10家公司，50%和5家公司，25%）。9家公司（53%）基于发现风险（包括体外数据）停止了化合物进入临床开发。 因此，虽然各个公司正在积极使用非临床策略以在早期研发中识别和终止具有肝毒性的项目，但现在报告提交临床DILI相关快速安全报告的公司数量与之前的调查相比似乎相似。因此，DILI对于进入临床的化合物仍然是一个问题，这或许反映在76%（13家公司）报告公司内部有一个专门委员会（通常有付费专家）来处理新药项目的肝脏安全性问题，而这一比例在2017年为40%（8家公司）。在2023年调查中，35%（6家公司）报告在过去5年内收到了FDA的询问，18%（3家公司）表示监管反馈影响了项目的临床研究设计。 2、公司间非临床风险评估的相似性和差异性 许多制药公司已发布其通用筛选流程的方法。从这项调查中，可以比较公司间常见实践的相似性和差异性。作为选择具有降低肝毒性倾向的化合物方法的一部分，绝大多数公司（≥75%）整合了TSA、理化性质评估和临床试验剂量考虑，并进行体外细胞毒性（在细胞系或原代人肝细胞中）、线粒体毒性、BSEP抑制和反应性代谢物测定（GSH捕获和CYP的TDI）以全方位评估。 然而，也有一些技术可以看到实践上的差异，只有25-75%的公司报告使用这些技术。对于已建立/长期存在的能力，包括其他转运体的分析、质谱成像、高内涵成像、其他反应性代谢物测定（包括硬亲电试剂捕获、共价结合和体内生物活化途径分析）和毒理基因组学，这可能代表了对其价值的不同看法。而对于新兴能力，包括使用3D培养、肝芯片、蛋白质组学和代谢组学以及计算机建模平台，应用的速度较慢。然后，一些技术大多数公司似乎没有使用，如只有24%（4家公司）评估溶酶体运输，24%（4家公司）评估免疫激活；后者可能是由于目前缺乏现成的方法学。 正如预期的那样，所有公司都进行体内毒理学研究，对于大多数公司（13家公司，76%），具有不可接受安全窗口的肝毒性发现会影响进展，即使在发现具有可接受的安全窗的情况下，65%（11家公司）报告这些仍然会影响临床试验中的监测指标和频率的设置。 3、新形势下非临床肝毒性评估的未来方向 制药行业越来越努力地在新药研发中考虑疾病状态的影响并旨在为患者研发产品，而不是为健康志愿者。疾病状态可能影响药物的肝脏安全性以及肝毒性的可监测性，如代谢功能障碍相关脂肪性肝病/脂肪性肝炎（MASLD /MASH）、乙型肝炎感染和2型糖尿病可对肝脏功能产生影响。一些公司（3家公司，18%）报告使用疾病状态模型进行体内毒性研究，虽然此类研究通常不被监管机构接受用于非临床安全性评估研究，但公司确实报告它们在化合物进展决策中的效用。然而，如果要使用体内疾病状态模型用作支持申报的安全性评价研究的一部分，需要对疾病模型进行大量的表征。然而，微生理系统正成为活跃的探索领域，76%（13家公司）反馈在该领域正在进行研究。这些复杂的体外模型有潜力更紧密地模拟肝脏的3D结构，可以模拟血管系统的动态流动能力，并有可能包含其他细胞类型，包括免疫细胞。 新药物形态的开发为治疗以前无法治疗的疾病和扩大治疗前景带来了巨大希望。从基因疗法和RNA疗法到靶向蛋白质降解剂和细胞干预，这些新型形态有潜力以更高的精确度和疗效靶向疾病，从而实现超越症状缓解、解决根本原因，并有可能实现个性化和治愈性疗法。回应本次非临床DILI调查的绝大多数公司报告其产品组合中包含此类新形态药物，包括基于抗体的（94%，16家公司）、寡核苷酸的（65%，11家公司）、基因疗法的（65%，11家公司）、蛋白质降解剂的（88%，15家公司）和肽的药物（65%，11家公司）。然而，总的来说，很少有公司（通常只有1或2家）报告有针对这些形态的专用体外方法或体内终点，该领域尚处于起步阶段。 DILI的早期临床前评估技术和转化价值仍处于不断演进中。基于TSA、理化性质评估、人体安全窗口评估及体外机制试验数据的综合评估将会为肝毒性的评估提供更全面的视角。随着产品类型的多样，对肝毒性的评估将不仅仅限于小分子相关的细胞毒性、线粒体毒性、转运体抑制和反应性代谢产物的监测，也会涉及免疫等多系统的相互作用，考虑的因素更加多元。未来，随着传统2D、3D细胞培养技术的进步和微流控平台的发展，基于类器官的肝毒性评估技术平台应该能使人们对于肝毒性的评估更有针对性，跨越肝毒性预测不准的鸿沟。