MK-8189

👆 点击上方 Bits & Bases 加入我们 🧬 Bits & Bases # 110Nat. Commun. 精读｜从片段命中到先导化合物，FBDD 的真正瓶颈在哪里？阅读时间：约 28 分钟 | 难度：⭐⭐⭐⭐📄 推荐论文档案 论文标题： Developments and challenges in hit progression within fragment-based drug discovery 研究团队： Harold Grosjean, Philip C. Biggin 主要单位： University of Oxford；Diamond Light Source Ltd 发表期刊： Nature Communications, 17:2226, 2026 研究方向： 基于片段的药物发现（FBDD）、Design–Make–Test 循环、片段命中推进、结构生物学、计算化学、自动化合成、生成式 AI、direct-to-biology、共价片段、DNA-encoded library一句话摘要 这篇 Nature Communications 综述以 Design–Make–Test（DMT）循环 为主线，系统讨论了 FBDD 中最关键也最难的阶段：如何把毫摩尔到微摩尔级弱结合片段，通过结构验证、计算设计、可合成化学和高通量测试，逐步推进为可优化的先导化合物。00. 引言：为什么 FBDD 的 hit progression 最难？ 新药研发里有一个经常被提到的现象：Eroom's Law。过去几十年，单位研发投入带来的新药产出持续下降，几乎与 Moore's Law 反向而行。药物发现变得越来越昂贵、越来越复杂，也越来越需要更高效的早期发现策略。 在这样的背景下，Fragment-Based Drug Discovery（FBDD，基于片段的药物发现） 已经成为现代小分子发现中被充分验证的一类方法。与传统高通量筛选（HTS）不同，FBDD 不从百万级甚至更大规模的 lead-like compound library 中寻找相对强的初始命中，而是从更小、更简单、覆盖化学空间更高效的 fragment library 出发。 FBDD 的基本逻辑是： 与其一开始就寻找一个“接近成药”的大分子，不如先用小片段识别蛋白结合口袋中的关键相互作用，再通过 growing、linking 或 merging 等策略逐步把弱结合片段推进为先导化合物。 但这条路线也有一个天然难点：fragment hit 通常很弱。 很多 fragment hit 的亲和力只有毫摩尔到高微摩尔级。它们可能只占据结合口袋的一小部分，结合姿态不稳定，SAR 信号很弱，甚至在不同实验方法之间出现明显不一致。因此，FBDD 真正难的地方往往不是“找到一个片段命中”，而是： 如何判断这个弱信号是否真实、是否值得推进，以及如何把它变成一个可优化的 lead series。 这正是 Grosjean 和 Biggin 这篇综述的核心主题。 这篇文章不是一篇普通的 FBDD 入门综述，也不是单纯总结 fragment screening 方法。它的主线非常明确：以 Design–Make–Test（DMT）循环 为框架，讨论 fragment hit progression 中每个阶段的具体瓶颈，以及近年来结构生物学、计算建模、自动化合成、生成式 AI 和 direct-to-biology 测试如何尝试缓解这些瓶颈。 需要先明确一个边界：这篇综述不是一篇“AI for FBDD 综述”。AI/ML 和生成式模型只是其中一部分。原文真正强调的是一个更完整的闭环： FBDD 的 hit progression 不是单点技术问题，而是 DMT 闭环问题：     Design 负责提出可验证的化学假设；     Make 决定这些假设能否被快速、可靠、低成本地合成；     Test 决定弱结合信号能否被敏感而可信地解释；     三者不断迭代，才可能把 fragment hit 推进为 lead-like compound。 因此，这篇综述的价值不在于提出一个新算法，而在于给出了一张比较清晰的“路线图”：在 FBDD 的真实 DMT 流程里，每种新技术到底解决了哪个瓶颈，又在哪些地方仍然需要人工经验、正交验证和实验闭环。01. 为什么是片段：分子复杂度、命中率与弱结合的权衡1.1 FBDD 不是低配版 HTS FBDD 经常被简化理解为“筛更小的分子”。但这并不准确。FBDD 的核心不是分子小，而是它对化学空间的采样方式不同。 HTS 通常筛选的是更大、更接近 lead-like 的分子库，数量可以达到百万级以上。这些分子如果命中，亲和力可能相对更强，但化学空间组合爆炸，使得即使筛选百万分子，也只是触及整个可能空间的一小部分。 FBDD 则使用更小、更简单的片段，通常遵循“Rule of 3”： molecular weight ≤ 300 Da； logP ≤ 3； hydrogen bond donors ≤ 3； hydrogen bond acceptors ≤ 3。 片段更小，单个分子形成的相互作用更少，所以亲和力通常更弱。但也正因为复杂度低，它们能更高效地覆盖局部化学空间，因此 hit rate 通常高于 HTS。 原文 Fig. 1a 很好地展示了这个权衡：随着 molecular complexity 增加，结合亲和力可能提高，但可有效探索的化学空间迅速变得不可控；FBDD 选择从低复杂度空间出发，牺牲初始亲和力，换取更高命中率和更好的后续可优化性。 1.2 弱结合意味着必须正交验证 fragment hit 的亲和力通常在 mM 到 μM 范围内，因此检测本身就很难。弱信号很容易被实验噪声、非特异性结合、溶剂效应、荧光干扰、金属螯合、胶体聚集或 PAINS 机制污染。 因此，原文反复强调：FBDD 的 fragment hit identification 通常需要多种正交方法交叉验证。 大体上，fragment screening 和 validation 方法可以分为三类。 第一类是 biochemical assays-生化功能实验。这类实验主要回答一个问题：片段是否会影响靶点蛋白的功能？ 例如，如果靶点是一个酶，酶活实验（enzymatic assay）会检测片段加入后，酶把底物转化为产物的能力是否下降。类似地，时间分辨荧光共振能量转移实验（TR-FRET, time-resolved fluorescence resonance energy transfer）、AlphaScreen 和荧光偏振实验（fluorescence polarization, FP）常用于检测蛋白–配体相互作用、蛋白–蛋白相互作用或竞争性结合是否被片段干扰。这类实验的优点是通量高、成本相对低，可以快速给出功能读数，例如抑制率、剂量–反应曲线和 IC50。因此，它们适合作为早期筛选工具。  但它们的局限也很明显：功能信号下降不一定说明片段真的结合在目标口袋。化合物可能通过荧光干扰、胶体聚集、金属螯合、PAINS 机制，或者干扰耦联酶体系造成假阳性。因此，生化功能实验通常只能说明“这个片段可能影响靶点功能”，还不能单独证明它是真实、特异的结合片段。 第二类是 biophysical assays-生物物理结合实验。这类实验主要回答一个问题：片段是否真的和靶点蛋白发生了物理结合？ 常见方法包括表面等离子共振（SPR, surface plasmon resonance）、光栅耦合干涉（GCI, grating-coupled interferometry）、生物层干涉（BLI, biolayer interferometry）、等温滴定量热（ITC, isothermal titration calorimetry）、微量热泳动（MST, microscale thermophoresis）、差示扫描荧光（DSF, differential scanning fluorimetry）、天然质谱（native MS）以及配体检测核磁共振（ligand-detected NMR）。这些方法通常不直接看蛋白功能，而是检测结合本身。例如，SPR / BLI / GCI 可以观察片段与蛋白结合和解离的过程，从而得到亲和力和动力学信息；ITC 可以测量结合过程中的热量变化，得到亲和力、焓变和熵变；DSF 可以观察片段是否改变蛋白热稳定性；native MS 可以直接检测蛋白–配体复合物；配体检测核磁共振则通过片段自身信号变化判断其是否与蛋白结合。这类方法的优点是能提供更直接的结合证据，有时还能得到亲和力、结合动力学或热力学信息。  但它们通常通量较低，对蛋白质量、浓度、缓冲体系和实验条件要求更高。对于很弱的 fragment binding，信号也可能接近检测极限。因此，生物物理实验可以提高 hit 的可信度，但仍然需要和功能实验或结构实验结合解释。 第三类是 structural 或 semi-structural methods-结构或半结构的方法。这类方法主要回答一个问题：片段结合在哪里，以什么姿态结合，后续应该往哪个方向优化？ X 射线晶体学（X-ray crystallography）和冷冻电镜（cryo-EM, cryo-electron microscopy）可以提供蛋白–片段复合物的三维结构信息，因此能够直接观察片段的结合位置、结合姿态，以及是否存在可以继续延伸的方向。对于 FBDD 来说，这类结构信息非常关键，因为 fragment growing、linking 和 merging 都高度依赖可靠的结合构象。蛋白检测核磁共振（protein-detected NMR）则更接近半结构方法。它通常不能像晶体学那样直接给出完整三维结合姿态，但可以通过蛋白化学位移扰动（chemical shift perturbation）判断片段结合后哪些氨基酸残基的信号发生变化，从而提供残基水平的结合位点线索。这里需要特别注意：NMR 不是单一类型的方法。 配体检测核磁共振（ligand-detected NMR）主要观察片段自身信号变化，更偏向生物物理结合验证；蛋白检测核磁共振（protein-detected NMR）观察蛋白信号变化，可以提供结合区域和受影响残基的信息，因此更接近半结构表征。前者回答“有没有结合”，后者进一步帮助判断“可能结合在哪里”，但二者通常都不能完全替代 X 射线晶体学或冷冻电镜给出的三维复合物结构。 1.3 结构信号也不是绝对答案 在 FBDD 里，结构方法非常重要，尤其是X射线晶体学（X-ray crystallography）。它可以在没有强功能信号的情况下直接看到 fragment density，从而提供 binding pose 和 growth vector 信息。 但结构信号也不是绝对答案。 原文指出，crystallographic fragment hits 有时在 solution assays 中没有信号。这可能是因为晶体浸泡使用的 fragment 浓度很高，超过了很多溶液方法的检测极限；也可能是因为晶体环境、蛋白构象、溶剂通道和晶体堆积改变了真实结合景观。 因此，一个漂亮的 electron density 并不自动等于一个值得推进的 functional hit。它还需要结合 functional assay、biophysical assay、binding site relevance 和后续 SAR 来判断。 ▲ 图 1（引自原论文 Fig. 1）：FBDD 与 HTS 在分子复杂度、结合亲和力和命中率上的差异，以及 biochemical、biophysical、structural 三类 fragment screening 方法。 (📍 个人理解)理解 FBDD 的关键不是“片段更小，所以更容易筛到命中”，而是“片段太弱，所以没有任何单一信号足够可靠”。FBDD 的很多复杂流程，本质上都是围绕一个问题展开：如何在弱结合、低占有率、低信噪比的环境中，建立足够可信的设计起点。02. Growing、Linking、Merging：三种 fragment progression 路线 fragment hit 被确认之后，下一步就是 elaboration，也就是把小片段推进为更强、更复杂、更接近 lead-like 的化合物。原文把经典策略概括为三类：growing、linking 和 merging。2.1 Growing：从一个片段逐步扩展 Fragment growing 是最常用、也通常最实际的一类策略。它从一个已确认的 fragment hit 出发，在结构允许的方向上逐步添加取代基，使分子覆盖更多结合口袋区域，形成更多有利相互作用。 它的优点是： 增量式推进，容易建立连续 SAR； 可以围绕一个 chemotype 逐步优化； 更容易与 catalogue search、parallel synthesis 和 automated DMT 兼容； 对几何约束的要求通常低于 linking。 原文 Fig. 2a 给出的 growing 案例是 human FGFR3。起始 fragment 的 IC50 = 120 μM，LE = 0.49，最终优化得到 FDA-approved compound，IC50 = 0.003 μM，LE = 0.35。 这个例子说明 fragment hit 虽然弱，但如果 ligand efficiency 高、growth vector 合理，后续可以通过多轮 DMT 获得非常强的活性提升。 2.2 Linking：理论收益高，但几何要求严格 Fragment linking 的设想非常吸引人：如果两个 fragment 分别结合在相邻 pocket 中，把它们通过 linker 连接起来，理论上可以获得显著 affinity gain。 FBDD 历史上最经典的案例之一就是 Shuker 等人在 1996 年提出的 SAR by NMR。他们用 NMR 找到两个结合相邻位点的 fragments，再通过空间约束进行 linking，最终获得高亲和力配体。 但 linking 的实践难度也很高。因为 linker 不能只是“把两个片段连起来”，它必须同时满足： 保留两个 fragment 原有 binding pose； 不引入明显 strain； 不破坏关键相互作用； 不导致分子过度柔性化； 与口袋空间和水网络兼容。 因此，linking 理论上收益高，但对结构信息和几何匹配要求严苛。一个 linker 的键长、角度或构象稍微不合适，就可能导致两个 fragment 原本的结合模式全部丢失。 原文 Fig. 2b 给出的 linking 案例是 SARS-CoV-2 Nsp3 macrodomain。两个 crystallographic fragments 被连接后，得到 IC50 = 0.50 μM，LE = 0.30 的 lead compound。 2.3 Merging：结合重叠片段的信息 Fragment merging 则是把两个或多个具有空间重叠、相互作用互补的 fragments 融合成一个新的 scaffold。它不像 linking 那样需要一个额外 linker，而是更强调对多个 fragment pose 的重叠区域进行整合。 Merging 的优势是：如果结构信息足够清楚，它有可能较快地整合多个 fragment 的相互作用，获得更强 potency。但它也更依赖高质量结构数据和药化经验，因为融合之后的新 scaffold 必须保持合理构象、合成可行性和相互作用模式。 原文 Fig. 2c 给出的 merging 案例是 human MAT2a。两个 starting fragments 分别为 Kd = 6.2 μM，LE = 0.37 和 Kd = 250 μM，LE = 0.38，最终 lead compound 达到 Kd = 0.022 μM，LE = 0.50。 2.4 三种策略不是谁替代谁 原文并没有简单说哪一种策略最好。更准确的理解是： growing 更增量、实用、容易建立 SAR； linking 理论上能带来显著亲和力提升，但几何约束严格； merging 技术上复杂，但在结构信息充分时可能更快整合相互作用。 ▲ 图 2（引自原论文 Fig. 2）：fragment growing、linking 和 merging 的三个实际案例。注意 Fig. 2a 是 FGFR3 growing，Fig. 2b 是 SARS-CoV-2 Nsp3 linking，Fig. 2c 是 MAT2a merging。 (📍 个人理解)这三种策略的核心差别，不只是“怎么把片段变大”，而是它们对结构信息的要求不同。growing 通常只需要一个可靠 fragment pose 和一个 growth vector；linking 需要两个 fragment pose 同时被保留；merging 需要多个片段的空间重叠关系和相互作用模式都足够可信。这也是为什么很多 AI/ML 方法开始强调 fragment pose anchoring：没有实验结构锚点，fragment progression 很容易变成不可靠的自由生成。03. DMT：FBDD 的核心不是一步设计，而是迭代闭环3.1 DMT 是什么？ DMT 指的是 Design–Make–Test： Design：提出 follow-up compound hypotheses，包括 growth、linking、merging、catalogue search、docking、generative design、FEP prioritisation 等； Make：将这些设计合成为真实化合物，或通过采购、平行合成、自动化合成、crude reaction arrays 等方式获得可测试样品； Test：通过 biochemical、biophysical、structural assays 评估 binding、activity、pose、kinetics、thermodynamics 和后续 ADMET 相关性质。 在实际 FBDD 项目中，DMT 不是线性流程，而是循环。每一轮 Test 产生的数据会反馈给下一轮 Design；Make 阶段的合成可行性又会反过来限制 Design；Test 的 throughput 和 sensitivity 决定了每轮能承受多少 follow-up candidates。 3.2 为什么 FBDD 的 DMT 比经典 SAR 更复杂？ 传统 medicinal chemistry 的 DMT 往往从一个相对较大的、已有一定 potency 的 hit 或 lead-like scaffold 出发。此时已经有较清晰的 SAR、功能 readout 和可优化方向。 FBDD 的起点则更“贫弱”： fragment hit 亲和力弱； 结合姿态可能不稳定； SAR 通常不清楚； 片段太小，任何一个小修改都可能改变整个 binding mode； 初始活性可能只有结构或生物物理信号，没有明确功能效应。 因此，FBDD 的早期 DMT 首先要做的不是简单提高 potency，而是建立一个可靠的 SAR series，确认哪些相互作用真实、哪些方向可扩展、哪些 binding site 有功能意义。 3.3 DMT 的真正瓶颈是跨阶段整合 原文 Fig. 3 强调，Design、Make、Test 三个阶段之间有大量重叠区域。很多新技术的意义并不在于单独提高某一阶段，而在于缩短阶段之间的延迟。 例如： structure-based design 需要 Test 阶段给出高质量 binding pose； active learning 需要昂贵计算结果或实验结果反馈给 Design； automated synthesis 缩短 Make 阶段； direct-to-biology 让未纯化 crude reaction mixtures 直接进入 Test； SAR models 需要大量高质量 Test 数据回流到 Design。 3.4 PDE10A / MK-8189：HTS-DMT 与 FBDD-DMT 可以互补 原文还用 PDE10A 项目说明，HTS 和 FBDD 并不是彼此排斥的路线。Fig. 5 展示了两条 DMT 轨迹如何互补推进：一条来自 HTS hit，另一条来自 fragment hit。两条路线在不同阶段提供了结构线索、化学启发和优化方向，最终共同导向 MK-8189 这一临床候选。 这个案例的意义在于：真实项目通常不会只忠于一种发现范式。HTS 可以提供较强初始活性和可优化 scaffold，FBDD 可以提供更高 ligand efficiency、更清晰的结构起点或新的化学向量。两者都可以进入 DMT 循环，并在中后期发生交叉。 ▲ 图 3（引自原论文 Fig. 3）：fragment hit progression 中的 DMT 循环。Design、Make、Test 并不是彼此独立的阶段，而是通过结构、计算、合成、测试和 SAR 数据不断互相反馈。 ▲ 图 5（引自原论文 Fig. 5）：PDE10A 案例中，HTS-DMT 与 FBDD-DMT 两条路线如何互补，并共同推进到 MK-8189 临床候选。 (📍 个人理解)FBDD 的真正瓶颈不是“没有一个足够强的设计模型”，而是 DMT 周期本身很慢、信号很弱、数据很噪。一个 AI 模型如果不能进入 Make 和 Test 的反馈循环，就很难真正改变 FBDD；反过来，如果自动化合成和 purification-agnostic testing 能把真实标签快速反馈给 Design，AI 才有机会发挥更大作用。04. 片段库不是“小分子集合”，而是为 DMT 优化过的工具集4.1 好片段库的目标不是单纯多样性最大 FBDD 的起点是 fragment library。一个好的 fragment library 不只是“结构多样”，还要满足多个 DMT 相关目标： 有足够的 pharmacophoric diversity； 具有良好溶解度和化学稳定性； 避免 PAINS、toxicophores 和不必要的高反应性； 具有可扩展的 synthetic vectors； 能够支持结构解析或后续 SAR； 对特定靶点类别具有功能相关性。 因此，fragment library design 本身就是 DMT 思维的一部分。 4.2 六类功能化片段库 原文 Fig. 4 展示了几类具有代表性的 fragment library design。 DSI-poised fragments这类片段含有适合快速扩展的“poised bonds”，能够通过常见、高产率、可自动化的反应进行多方向修饰。它们的价值在 Make 阶段尤其明显，因为 fragment hit 一旦被确认，就可以快速生成大量 analogues。 FragLites这类片段包含 halogens 和 hydrogen bond donor/acceptor doublets，可以增强 X-ray crystallography 中的 electron density fitting，从而帮助确定 binding pose。 3D fragments这类片段增加 sp³ character 和 out-of-plane functional groups，试图摆脱传统平面芳香片段的限制。理论上，这可能提高 solubility、specificity 和 pharmacokinetic properties。不过原文也提醒，sp³ fraction 是否能预测开发成功，近年来存在争议，不能被简单神化。 PepLites这类片段模拟氨基酸 side chains 或 peptide-like binding motifs，适合 bromodomain 等识别多肽或 acetyl-lysine motif 的靶点。 Chelator fragments这类片段含有金属配位原子，可用于 metalloproteins 或金属依赖酶的筛选。 Covalent fragments这类片段带有 electrophilic warheads，用于靶向蛋白中的反应性 residues，尤其是 cysteine。 4.3 库设计决定后续 DMT 的可走路径 一个很关键的点是，fragment library 不是只影响 hit finding，也会影响后续 DMT 能不能走下去。 如果片段没有可用 growth vector，即使能结合也很难优化；如果片段缺少合成扩展路径，Make 阶段会很慢；如果片段缺少结构定位特征，Test 阶段很难给出 pose；如果片段命中的是非功能 pocket，即使 affinity 提高，也可能得不到 functional activity。 ▲ 图 4（引自原论文 Fig. 4）：不同类型的功能化 fragment libraries。每类库并不是单纯追求结构多样性，而是针对 DMT 中的不同瓶颈进行设计。05. Hit finding 与 validation：每种方法都有看不见的盲区5.1 X-ray crystallography：强结构信息，但不是无条件可靠 X-ray crystallography 是 FBDD 中非常重要的 screening 和 validation 方法。它可以直接给出 protein–fragment complex structure，为 growth vector、binding pose 和后续 docking 提供基础。 高通量 crystallographic fragment screening 已经可以在一周内处理数百到上千个样品。晶体浸泡（soaking）尤其适合 fragment screening，因为同一种 crystal form 可以用于多个 compounds，不需要对每个 fragment 重新优化结晶条件。 但 X-ray 也有明显限制： fragment 必须能通过 solvent channels 进入 relevant pocket； crystal packing 可能限制蛋白构象； fragment 可能在晶体中结合，但在溶液中没有明显信号； low occupancy 和 partial density 会增加 model building 难度； fragment 可能绑定在结构上有利但功能无关的 site。 因此，结构命中需要结合 solution assays 和 functional readouts 进一步判断。 5.2 Cryo-EM：潜力大，但 fragment pose 仍难 Cryo-EM 在膜蛋白、大复合物和难结晶靶点上有很大潜力。原文也指出，它可能成为未来 FBDD 中越来越重要的结构工具。 但目前 cryo-EM 在 fragment screening 中仍然面临通量和分辨率限制。对于小分子 pose placement，局部分辨率通常需要达到约 2.5–3.0 Å 才比较可靠；3–4 Å 的 maps 很容易让 fragment pose 变得模糊。 因此，cryo-EM 可以扩展 FBDD 的 target scope，但还不能简单替代 X-ray crystallography。 5.3 NMR 和其他 solution assays：更接近溶液状态，但也有局限 NMR 是 fragment binding validation 中非常重要的方法。ligand-observed NMR 可以筛选 fragment cocktails；protein-observed NMR 可以通过 chemical shift perturbation 提供 binding site mapping。 SPR、GCI、BLI、ITC、MST、DSF、native MS 等方法则能提供 affinity、kinetics、thermodynamics 或 mass shift 信息。对于共价 fragments，intact protein MS 尤其重要，因为它可以直接检测 covalent adduct。 但 solution assays 也并不完美。SPR 可能受到 immobilisation 和 non-specific mass accumulation 影响；fluorescence-based assays 容易受化合物自身光学性质影响；DSF 可能出现间接 thermal shift；NMR 对蛋白大小和样品量有要求。 5.4 计算 fragment prioritisation 仍然困难 原文讨论了 SAMPL7 challenge 中的一个现实问题：计算方法在 fragment hit recovery 和 pose prediction 上仍然表现有限。 这背后的原因并不难理解。fragment 小、亲和力弱、binding pose 不稳定，导致能量景观非常平坦。传统 docking scoring function 很难区分真实弱结合和噪声；水分子的处理也经常成为关键不确定因素。 当然，也有一些 prospective computational fragment discovery 成功案例，例如 docking + MD、long-timescale MD、SuMD、unbiased MD replicas 等。但这些方法通常需要大量计算资源、精细系统准备和后续实验验证，尚未成为所有项目都能轻松部署的通用方案。 (📍 个人理解)这一节对 AI for FBDD 是一个重要提醒：fragment 场景下的计算任务比普通 lead-like molecule 更难。因为模型要面对的是弱亲和力、低占有率、多姿态不确定性和实验噪声。任何声称能用于真实 FBDD 的计算方法，都需要在这种弱信号场景下接受验证，而不能只在理想化 docking benchmark 上展示效果。06. 共价片段：通过化学反应提高有效结合6.1 共价 FBDD 解决了弱亲和力的一部分问题 共价 fragments 带有 electrophilic warheads，可以与蛋白中的 nucleophilic residues 形成不可逆或准不可逆共价键。这样可以显著提高有效结合能力，缓解 fragment hit 初始亲和力弱的问题。 早期共价 FBDD 主要靶向 cysteine，因为 Cys 亲核性强、天然丰度低，适合被选择性标记。常见 warheads 包括 acrylamides 和 chloroacetamides。 近年，warhead chemistry 已经扩展到更多 residue types，例如： sulfonyl fluorides 靶向 tyrosine； boronic acids 靶向 serine； aldehydes 靶向 lysine。 关键在于 reactivity tuning：warhead 必须足够活泼，能够标记目标 residue；但又不能太活泼，以免产生广泛脱靶反应。 6.2 共价 fragments 的代表案例 原文提到多个共价 fragment 相关案例。 Sotorasib 是 KRAS G12C 抑制剂，靶向 allosteric site 中的 mutant cysteine，已经成为 FDA-approved drug。它代表了共价片段和不可成药靶点之间的成功连接。 Sulfopin 则来自 Pin1 的 covalent fragment campaign。通过 MS-based screening 和后续优化，研究者获得了能够修饰 Cys113 的选择性 covalent inhibitor。 此外，SARS-CoV-2 main protease 的 crystallographic and electrophilic fragment screening 也展示了 covalent 与 non-covalent fragments 可以为后续 merging 或 lead development 提供结构起点。 6.3 共价 FBDD 也带来新的验证难题 共价结合并不满足普通平衡结合假设，因此不能简单套用标准 Kd 解释。共价 fragment hit 也不一定意味着有意义的 target engagement，因为它可能只是非特异性反应。 因此，共价 FBDD 需要额外验证： intact protein MS 确认 mass shift； tandem MS 或结构方法定位 labelled residue； mutation of targeted residue 作为对照； glutathione 或 reactive thiols 评估非特异性反应； qIT 等方法比较 protein reaction 与 nonspecific thiol reaction kinetics； crystallography 确认 warhead positioning 和 covalent bond geometry。 (📍 个人理解)共价 FBDD 是解决浅口袋、弱结合和传统“undruggable”靶点的一种强策略，但它不是简单地“把片段钉在蛋白上”。它把验证难度从“有没有结合”转移到“是否选择性、是否有意义、是否可控、是否有可接受 ADMET”。因此，共价 FBDD 的核心不是 warhead 越强越好，而是反应性、选择性和可开发性的平衡。07. Design 阶段：从 catalogue search 到 fragment-seeded generative model7.1 分层计算级联：便宜方法粗筛，昂贵方法精排 在 Design 阶段，目标是提出可合成、可测试、且有可能提升 potency 或性质的 follow-up compounds。 原文 Fig. 6 提出了一个分层计算级联。大致可以理解为： Ligand-based methods包括 catalogue search、QSAR、fragment network、VAE 或其他 ligand-based generative models。它们计算成本低，可以处理超大规模化学空间，但不直接建模 target structure。 Protein–ligand docking利用 target structure 和 fragment pose 对 follow-up 进行结构打分。它比 ligand-based 方法更有结构依据，但依赖 receptor conformation、water placement 和 scoring function。 Molecular dynamics simulations用于评估 pose stability、binding pathway、conformational variation 和动态相互作用，但计算成本更高。 Alchemical free energy calculations例如 FEP、RBFE、ABFE 等，用于更精细地估计 binding free energy，但通常只适合较小候选集合。 Active learning loop用昂贵的 structure-based 或 free energy scores 给少量样本打标签，再训练更便宜的 ligand-based model 扫描更大空间，从而降低整体计算成本。 这个级联的核心思想是：不同计算方法不应该互相替代，而应该按成本和可信度分层使用。 7.2 Enamine REAL Space 与可合成空间 原文提到 Enamine REAL Space 作为 synth-on-demand virtual catalogue 的代表。2025 release 中，它包含约 78 billion 个 accessible drug-like products，规模远大于传统百万级 HTS deck。 这类 catalogue 的意义不只是“大”，而是它连接了 Design 和 Make：分子不是随意生成的，而是基于 validated reaction rules 和 building blocks 枚举出来，通常具有更明确的合成可达性。 对于 fragment-seeded design 来说，这非常重要。一个 fragment hit 周围可以快速获得大量 congeneric follow-ups，再通过 docking、shape overlay、pharmacophore constraints 或 FEP 进一步筛选。 7.3 生成式 AI：有潜力，但仍需要实验结构锚点 原文对生成式 AI 的态度是谨慎乐观。 一方面，generative models 可以避免穷举超大化学空间，直接从 learned distribution 中采样新结构，用于优化 potency、novelty、synthetic feasibility 和多参数目标。例如： FaST 使用 VAE 做 fragment-based sequential translation； DeLinker 通过 graph-based model 设计 linker，同时保留 fragments 的 3D 相对姿态； AutoFragDiff 将 chemically viable fragments 融入 diffusion-based 3D generation； FragGen 结合几何约束与机器学习组装可合成分子； Link-INVENT 结合 reinforcement learning 和 docking feedback 设计 linkers； Syndirella 则强调 synthesis-directed design，从 fragment-derived scaffolds 规划多步数字化合成路线。 另一方面，原文也明确指出：当前很多 3D de novo generative approaches 仍容易产生 chemically unviable compounds 或 unphysical binding poses。许多方法还难以纳入常规 FBDD pipeline，原因包括 synthesisability、interpretability 和 validation 的限制。 因此，更稳妥的结论不是“生成式 AI 已经解决 FBDD”，而是： 在 FBDD 中，生成式模型最可靠的使用方式，往往不是完全自由生成，而是以 experimentally resolved fragment pose 为锚点，在受约束的局部化学空间中提出 follow-up hypotheses。 ▲ 图 6 / 图 7（引自原论文 Fig. 6 和 Fig. 7）：fragment-seeded follow-up design 中的分层计算级联。低成本 ligand-based 方法用于大规模探索，docking、MD 和 free energy calculations 用于逐步精排；experimentally resolved fragment poses 是结构计算和生成模型的重要锚点。08. Make 阶段：合成速度决定 DMT 能转几轮8.1 Make 经常是 DMT 的限速步骤 在 FBDD 中，Design 阶段可以一次提出大量候选，但 Make 阶段决定这些设计能不能变成真实样品。 传统 medicinal chemistry workflow 往往需要人工路线设计、合成、纯化、质量控制，每一轮可能需要数周到数月。对于 fragment hit progression 来说，这会显著降低 DMT 迭代速度。 因此，近年来 Make 阶段的发展主要集中在三个方向： retrosynthesis and route planning； high-throughput / robotic synthesis； novel synthetic methodologies for fragment elaboration。 8.2 AI 与自动化正在进入合成环节 深度学习 retrosynthesis 工具可以根据目标分子反推可行合成路线，并将 starting materials 限制在 fragment hit 或其 analogues 周围。SPAYA、AiZynthFinder 等平台都属于这一类工具。 机器人和高通量合成平台则可以把合成从“单个分子手工做”推进到“plate-based parallel chemistry”。原文提到多种例子： acoustic droplet ejection 用于多 fragment scaffolds 的平行合成； cluster synthesis 在同一平台上执行多种反应类型，提高结构多样性； continuous flow synthesis 可整合多种合成方法，提高吞吐和可放大性； automated end-to-end synthesis platform 可将合成、萃取、纯化和 QC 串联起来。 这些技术的意义不是让药化专家消失，而是让更多 follow-up hypotheses 能够更快进入 Test 阶段。 8.3 新反应方法打开新的 fragment growth vectors FBDD 中一个很实际的问题是：fragment hit 上哪个位置可以被修饰？如果可修饰向量少，Design 再好也很难进入 Make。 因此，C–H activation、late-stage functionalisation、photoredox chemistry、click chemistry、Au/Ag dual catalysis 等新合成方法，都可能扩大 fragment elaboration 的可达空间。 例如，原文提到 Tolinapant 相关案例中，通过 C–H activation 在 fragment scaffold 上进行精准修饰，一个简单 methyl group 的加入就带来了显著 potency 提升。这类例子说明，小而精准的化学修饰在 fragment-to-lead 中非常关键。 8.4 Make 阶段也有“低层但致命”的实验细节 原文还特别提到 solvent selection。对于 fragments 这种弱结合体系，溶剂影响可能非常明显。例如 DMSO 可与 bromodomain 的 acetyl-lysine binding motif 产生竞争，从而干扰 crystallographic ligand binding。 这类问题看似很小，但在 FBDD 中可能直接决定一次筛选是否失败。 (📍 个人理解)Make 阶段最容易被 AI 研究者低估。模型可以生成很多漂亮分子，但如果这些分子难合成、成本高、不稳定，或者溶剂和 assay 条件不兼容，它们就无法进入真实 DMT。FBDD 的一个重要启发是：可合成性不是生成后的过滤项，而应该从 Design 阶段就被纳入目标函数和搜索空间定义。09. Test 阶段：direct-to-biology 正在改变 DMT 节奏9.1 从“先纯化再测试”到 purification-agnostic testing 传统流程通常要求：合成 compound → 纯化 → QC → 测试。这个流程可靠，但慢。 近年来，FBDD 中出现了越来越多 purification-agnostic 或 direct-to-biology 方法：粗反应液不经过完整纯化，直接进入结构、生物物理或功能测试。这样可以显著缩短 Make 到 Test 的延迟。 这并不意味着不需要 QC。相反，direct-to-biology 对质量控制提出了更高要求，因为粗反应液中可能有： 未反应 starting material； 副产物； 降解产物； 反应中间体； 多种竞争性 binding species。 9.2 粗反应液直接做 crystallography 原文重点讨论了 crystallographic evaluation of crude reaction arrays。 一个代表性例子是 PHIP2 项目：研究者使用 affordable liquid handling device 生成大量 fragment elaboration crude reaction mixtures，然后直接 soak 到 protein crystals 中，再结合 LC-MS/MS quality control 判断哪些孔中含有目标产物，并从结构数据中提取 SAR 信息。 这种做法的优势在于：X-ray crystallography 不只是告诉你“有没有活性”，而是可以直接看到某个 reaction product 是否真的进入 binding site，以及它如何与蛋白相互作用。 但问题也很明显。粗反应液中不同 species 可能以不同扩散速度进入晶体，产生 partial occupancy、superimposed density 或错误 ligand assignment。因此，结构数据必须结合 LC-MS QC、resynthesis、solution assays 和人工审查。 9.3 SPR、GCI、NMR 和 MS 也可以处理复杂混合物 除了 crystallography，原文还讨论了多种 non-structural purification-agnostic assays。 例如，BRD3-ET 案例中，fragment follow-ups 的粗反应液通过 off-rate screening 识别出更强 binder，后续重合成纯化后得到相近 off-rate，说明 crude readout 并非随机噪声。 NMR 也可以用于 complex mixtures。protein-observed NMR 可以在 focused combinatorial libraries 中监测累计 chemical shift perturbations；ligand-observed NMR 可以用于 mixture screening。 MS-based affinity selection 和 intact protein LC-MS 对 covalent fragments 或复杂混合物中的 binding species 解析也很有价值。 9.4 DEL 与 FBDD 的潜在协同 DNA-encoded libraries（DELs）天然适合大规模、混合物式筛选。原文提到，fragment data 可以与 DEL readouts 形成互补。 一个例子是 BRD4 isoxazole fragment 与 NUDEL 的结合：X-ray 首先找到模仿 acetyl-lysine interaction features 的 fragment hit，随后通过 on-DNA Suzuki–Miyaura chemistry 连接到 focused DEL，最终优化出 51 nM inhibitor，并具有较好的 ADMET characteristics。 但 DEL readouts 本身噪声很大，包括 variable synthesis yields、PCR bias、sequencing errors、tag truncation 和 target-independent binding。因此，uncertainty-aware ML、docking integration 和 fragment co-structures 都可能帮助解释 DEL 数据。 9.5 GyrB 案例：结构和酶活都好，不等于细胞有效 原文还特别提醒，protein-level affinity 或 enzyme inhibition 不保证 cellular activity。 DNA gyrase GyrB 项目就是一个典型例子。早期 fragment-derived inhibitors 在 X-ray 和 ATPase assays 中表现不错，但几乎没有 antibacterial cellular activity。原因可能包括 poor permeability、active efflux、ionization / solubility 问题和 cellular exposure 不足。 后续优化通过调节 physicochemical properties、引入 intramolecular hydrogen bond、改善 permeability 和 systemic exposure，才逐步走向临床候选 AZD5099。 这说明，FBDD 的 Test 阶段不能只停在 binding 和 pose。随着 DMT 推进，cellular exposure、selectivity、ADMET 和 anti-targets 会逐渐成为核心问题。 ▲ 图 8（引自原论文 Fig. 8）：Make 与 Test 阶段的整合。自动化合成、质量控制、粗反应液测试和结构/动力学 readouts 共同压缩 DMT 周期。10. 这篇综述真正说明了什么？ 这篇综述最核心的观点可以概括为： FBDD 的瓶颈不是某一个单点技术，而是 fragment hit progression 中 Design、Make、Test 三个阶段如何形成高质量闭环。 fragment hit 的初始亲和力通常较弱，结合姿态可能不稳定，SAR 信号也不一定清楚。因此，FBDD 真正困难的地方不只是“找到一个片段”，而是判断这个弱信号是否真实、是否有功能意义、是否有可扩展方向，并进一步把它推进为可优化的 lead series。 围绕这个问题，原文给出了几条很清楚的判断。 第一，fragment hit 的弱信号决定了正交验证的重要性。弱结合、低占有率和低信噪比使得任何单一 readout 都可能出错。结构、生物物理和生物化学方法之间的交叉验证，是 FBDD 中非常基础但关键的要求。 第二，fragment pose 是计算设计的重要锚点。无论是 docking、MD、FEP、generative model 还是 active learning，experimentally resolved fragment pose 和 fragment affinity 都能显著提高后续设计的可靠性。完全脱离实验结构的自由生成，在 FBDD 场景中仍然风险较高。 第三，AI 的短期价值更可能体现在 prioritisation，而不是全自动替代。原文对 AI/ML 保持谨慎乐观。生成式 AI、co-folding 和 closed-loop labs 都有潜力，但许多方法仍处于 exploratory 或 proof-of-concept 阶段。当前更现实的路线是：用 AI 帮助提出、排序和筛选候选，再由实验 DMT 进行验证。 第四，Make 和 Test 的速度决定了 Design 能否真正迭代。如果合成和测试仍然需要数周到数月，再强的 Design 模型也很难快速学习。自动化合成、crude reaction testing 和 purification-agnostic assays 的意义，在于提高实验反馈速率。 第五，未来 FBDD 需要处理 noisy but useful data。随着 high-throughput crystallography、crude mixtures、DEL 和 direct-to-biology 的发展，数据会更大，但也更噪。如何从不完整、低占有率、多物种混合和 assay-specific artefacts 中提取可靠 SAR，将成为 AI/ML 真正可以发挥作用的地方。 总体来看，这篇综述不是在说“AI 已经解决了 FBDD”，而是在强调： 片段只是起点，真正的药物发现发生在 Design、Make、Test 不断互相纠错的过程中。11. 对 AIDD 研究的启发与边界 (📍 个人观点与延伸探讨) 第一，真实药物发现里的 AI 更像 DMT 加速器，而不是独立设计器。这篇综述提醒我们，AI 不能脱离 Make 和 Test。一个分子生成模型如果只生成结构，却不考虑可合成性、实验验证路径和下一轮 SAR 反馈，很难真正进入药物发现流程。 第二，实验结构是生成模型最重要的约束之一。对 FBDD 来说，fragment pose 是设计锚点。这个逻辑对 structure-based molecular generation 也成立：模型生成的分子必须受到真实 pocket geometry、关键相互作用、构象约束和实验结构数据的限制。完全自由的 de novo generation 很容易产生不物理或不可验证的 pose。 第三，closed-loop 的瓶颈在数据回流速度，而不只是模型架构。很多 AI for drug discovery 文章强调模型性能，但真实闭环里更关键的是每一轮能获得多少可靠实验标签。direct-to-biology、自动化合成和高通量结构解析可能比单纯改模型更能推动 FBDD 的 AI 化。 第四，弱信号场景需要更强的不确定性建模。fragment binding、crude reaction mixtures、DEL readouts 和 low-occupancy electron density 都是典型 noisy data。未来 AI 模型不应只输出一个确定分数，而应显式建模 uncertainty、assay-specific bias 和多证据融合。 第五，FBDD 对双靶点和片段生成也有启发。对于 dual-target ligand design，fragment-based 思想尤其重要：不同靶点可能各自提供一个局部 pharmacophore 或 fragment anchor，真正困难的是如何在保持两端相互作用的同时完成 linking / merging，并控制合成可行性和 ADMET。FBDD 的 growing、linking、merging 经验，可以为双靶点生成模型提供具体的设计语言。 当然，这篇综述也有几个边界需要谨慎理解。 第一，FBDD 的成功案例存在 survivor bias。Sotorasib、Sulfopin、MK-8189、AZD5099、ASAP-0017445 等案例都很精彩，但发表出来的往往是成功路径，大量失败项目不会被系统报道。 第二，fragment 优势不是普适的。对于没有清晰 hotspot、缺少可用 growth vector、或 ADMET 约束极强的项目，fragment-to-lead 仍然非常困难。 第三，生成式 AI 还没有成为 FBDD 的常规标准工具。原文明确指出，许多 AI-driven 方法仍存在合成可行性、可解释性、验证难度和泛化性问题。它们很有潜力，但不能被写成已经全面改变 FBDD 的成熟方案。 第四，direct-to-biology 不是“不用质量控制”。粗反应液测试可以显著加快 DMT，但也会引入副产物、降解物和多物种竞争结合的问题。高通量不应以牺牲数据可信度为代价。 第五，专家判断仍然不可替代。即使计算模型和自动化平台越来越强，药化专家对合成可行性、稳定性、反应风险、IP、ADMET 和项目优先级的判断仍然非常重要。 因此，对 AIDD 来说，这篇综述最有价值的提醒是： 模型不是药物发现流程的替代品，而是 DMT 闭环中的加速器。只有当生成、合成、测试和反馈真正接起来，AI 才可能在真实项目里产生稳定价值。 Disclaimer     本文为 Bits & Bases 学术笔记与深度解读，仅供参考。限于作者水平，文中难免存在理解偏差或疏漏，恳请各位同行专家批评指正。 Bits & Bases 专注 AI for Science · 深度笔记 · 庚续初心 👆 长按扫码，不错过每一篇硬核干货