Dioctyl Sodium Sulfosuccinate

原文中文题目：一种由姜源外泌体与无机框架构成的仿生纳米复合材料，用于口服抗体的高性能递送 英文题目：A biomimetic nanocomposite made of a ginger-derived exosome and an inorganic framework for high-performance delivery of oral antibodies 期刊与年份：Nanoscale，2021 PMID：34846415 DOI：10.1039/d1nr06015e60 秒读懂 研究者将英夫利昔单抗装入大介孔硅纳米颗粒，再包覆姜来源囊泡，构建用于口服递送抗体的仿生载体。无机内核提高载药量并限制抗体聚集，囊泡外层帮助载体抵御胃肠环境。 在细胞和小鼠实验中，这种组合促进抗体向炎症结肠递送和跨上皮转运；姜来源囊泡自身也显示出与NLRP3炎症小体相关的抗炎作用。 这些结果来自制剂、细胞及DSS诱导的小鼠结肠炎实验，尚不能推定为人体治疗效果，也不等同于直接食用生姜。摘要 在炎症性肠病（IBD）治疗中，当前临床注射方式带来的抗TNF-α抗体全身暴露始终会引起严重的不良反应。通过口服途径实现抗TNF-α抗体的结肠靶向递送至关重要，但仍是一项艰巨的挑战。在此，我们报道了一种由姜源外泌体和无机框架构成的仿生纳米复合材料，旨在实现这一目的。一种大介孔硅纳米颗粒（LMSN）被独特地定制用于抗体（英夫利昔单抗，INF）的负载，使其负载量高达61.3 wt%，并防止其聚集。 从姜中分离出外泌体样纳米囊泡（GE），产量较高（17.5 mg kg⁻¹）。随后，利用超声技术将GE包覆在LMSN表面，获得仿生纳米复合材料LMSN@GE。如预期所示，LMSN@GE在INF的口服递送方面表现出优势：在胃肠道中具有良好的稳定性、实现结肠靶向递送以及具有较高的肠上皮通透性。令人惊讶的是，除了其递送价值外，GE还通过阻断NLRP3炎症小体表现出抗炎作用。因此，与静脉注射的INF相比，INF/LMSN@GE在结肠炎小鼠中显示出显著更高的疗效。 这项工作为通过口服途径实现抗TNF-α抗体的结肠靶向递送提供了新的见解。此外，它提出了一种利用单一治疗剂（草药源外泌体）进行药物递送的新策略。1 引言 炎症性肠病（IBD）是一种慢性复发性胃肠道疾病，目前尚无永久性治愈方法，全球有数百万患者受其困扰。在最严重的情况下，8%-20%的IBD病例会发展为结肠炎相关结肠癌。 目前，治疗IBD最有效的药物是抗肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体，如英夫利昔单抗（INF）、戈利木单抗、certolizumab pegol和阿达木单抗。 这些抗体通过抑制TNF-α发挥作用，TNF-α是IBD期间主要由巨噬细胞分泌的主要促炎细胞因子。 然而，目前抗TNF-α抗体的临床肠外给药途径，无论是皮下、肌肉还是静脉注射，均因全身性免疫抑制而总是引起严重的不良反应。 因此，通过将抗体直接递送至炎症部位以避免全身性免疫抑制，从而开发一种更有效且更安全的IBD抗TNF疗法具有重要意义。众所周知，口服给药是药物递送最方便且首选的途径，具有针对胃肠道疾病选择性递送药物的潜力。然而，由于大分子药物（如抗体）在胃肠道（GIT）中易降解或摄取效率低，通常需要相当高的剂量才能实现症状缓解。 胃肠道中的胃酸和消化酶、靶向递送效率低以及膜通透性差等多种屏障，使得抗体的口服递送仍是一项持续的挑战。 尽管已设计了一些先进的纳米颗粒用于口服递送肽、抗体及其他生物制剂以治疗IBD， 但通过口服途径将抗TNF-α抗体特异性且有效地递送至炎症黏膜的载体系统设计仍然困难。 基于外泌体的纳米载体因其囊泡在循环中的稳定性、优异的生物相容性、低免疫原性、低毒性以及穿越多种生理屏障的能力，在制药工业中引起了越来越多的关注。 大量、安全且成本效益高的外泌体的可获得性可能克服合成纳米粒子的局限性。植物来源的外泌体代表了草药的一种新型纳米尺寸产物，并显示出即使在种间通讯中也具有治疗功效。 与哺乳动物细胞来源的外泌体相比，植物来源的外泌体具有更好的生物相容性、成本效益、环保性以及大规模生产的能力。 此外，植物来源外泌体的脂质双分子层具有独特的化学组成，其特征是外层显著富集磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰胆碱（PC）。有趣的是，已被证明富含PE和PC的外层通过网格蛋白依赖性途径和巨胞饮作用引导植物来源的外泌体靶向M1型巨噬细胞，后者是TNF-α的主要来源。 更重要的是，这些植物来源的外泌体中含有的多种生物活性化合物（例如多酚、黄酮和功能蛋白）赋予其在临床试验中对各种炎症和恶性疾病具有前景的治疗效果。 姜是姜科植物姜（Zingiber officinale）的根茎，是用于治疗消化道疾病（如绞痛、胀气、腹泻和消化不良）的最广泛使用的草药之一。 据报道，姜中的活性成分，包括6-姜酚和6-姜烯酚，具有抗氧化、抗炎和抗癌活性。 最近的研究表明，含有6-姜酚和6-姜烯酚的姜来源外泌体样纳米粒子可以通过抑制炎症细胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的表达并促进抗炎细胞因子（IL-10和IL-22）的表达，从而调节肠道菌群并改善小鼠结肠炎。 如今，姜来源外泌体样纳米粒子代表了一种有吸引力的炎症性肠病（IBD）治疗策略。鉴于此，利用这种新型纳米草药——姜来源外泌体样纳米粒子——递送抗TNF-α抗体以治疗IBD，可能会实现前所未有的高疗效。 然而，低载药量和被包裹大分子稳定性差等缺点严重限制了外泌体在大分子药物递送中的应用。令人惊讶的是，框架材料凭借其独特的结构特性可以解决上述问题。 首先，多孔结构可用于高效负载大分子。此外，孔内的有限空间可以抵抗货物大分子的构象变化。因此，我们选择了具有良好生物相容性的无机框架——介孔硅，作为嵌入外泌体的合适纳米核，以实现更好的大分子递送。我们假设，草本外泌体与无机框架的双重特性将使这种仿生纳米复合材料成为口服抗体治疗炎症性肠病（IBD）的有价值纳米载体。 本研究利用姜源外泌体（GE）和无机框架构建了一种用于口服递送抗TNF-α抗体的仿生纳米复合材料（图1a）。简言之，INF被选为模型大分子。大介孔硅纳米颗粒（LMSNs）被独特定制用于稳定且高效地负载INF（INF/LMSN），随后从姜中分离出GE，并将其进一步包覆在INF/LMSN表面，以实现INF/LMSN@GE。 我们假设，INF/LMSN@GE将向结肠靶向递送高负载量的INF，并跨肠上皮转运，在固有层释放INF，以抑制邻近M1型巨噬细胞分泌的TNF-α （图1b）。本研究探讨了这种新型仿生纳米复合材料的特性，包括在胃肠道（GIT）递送过程中对大分子的保护作用、结肠靶向能力、膜通透性以及其对炎症性肠病（IBD）的治疗价值。 图1(a) INF/LMSN@GE仿生核壳纳米复合材料的组装主要步骤示意图。(b) 口服给药后INF/LMSN@GE在胃肠道（GIT）中的递送过程示意图（b1：INF/LMSN@GE以刚制备时的稳定完整结构通过胃肠道；b2：INF/LMSN@GE靶向炎症性结肠组织，随后以独特方式跨膜转运穿过上皮层，以INF/LMSN的形式到达结肠固有层；b3：在结肠固有层中，INF从LMSN中缓慢释放并抑制TNF-α）。2 结果与讨论2.1 LMSN@GE的理化表征 采用透射电子显微镜（TEM）观察所制备的GEs、LMSNs和LMSN@GEs的形貌。如图2a所示，GEs呈现为具有完整膜的平滑碗状囊泡。动态光散射（DLS）测得其粒径分布较窄，约为284.6 nm（PDI，0.169），Zeta电位值约为-12.1 mV。重要的是，以1000 g生姜为起始原料，我们获得了约17.5 mg的GEs。与纳米粒子的合成相比，这代表了高水平的GE产量。 INF（M w：149.1 kDa，晶胞尺寸：5.0 × 7.5 × 14.8 nm，源自PDB）在此被选为模型药物。DLS测得INF单体的水动力粒径为12.9 nm。为了提高INF的负载效率和构象稳定性，我们需要将INF置于孔内，而非简单地吸附在MSN球体的表面。因此，合适的孔径是一个必要条件。根据测得的INF粒径，LMSN被定制为具有约20 nm的通道（大于单体尺寸且小于二聚体尺寸），这恰好适合负载INF单体，并能有效限制单体的聚集。 LMSN的具体结构参数，包括BJH孔径（W BJH）19.58 nm、BET比表面积（S BET）399.6 m²·g⁻¹以及累积孔容（V p）2.082 cm³·g⁻¹，汇总于表S1。 LMSN的中孔结构进一步通过TEM进行可视化。其呈现为表面粗糙、边缘略不规则的球形，其中可清晰观察到许多径向大介孔，直径约为20 nm。LMSN的粒径分布通过DLS进行分析。LMSN具有约225.9 nm的单峰粒径分布。 随后，通过超声法将LMSNs嵌入制备好的GEs中，以获得LMSN@GEs。TEM显示，LMSN@GEs表现为分散良好且包覆有完整层的LMSN。同时，我们用Dir标记GEs，用FITC标记LMSNs。通过共聚焦激光显微镜（CLSM）观察到Dir标记的GEs与FITC标记的LMSNs的共定位，进一步验证了LMSNs和GEs已成功融合（图2b）。 为了验证包覆在LMSNs表面的外泌体膜的完整性，我们利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对比分析了GEs和LMSN@GE表面的蛋白信息。如图2c所示，未发现蛋白条带差异。结果表明，与GEs相比，LMSN@GE具有一系列相似的蛋白分子，这意味着LMSN@GE整体继承了GEs的膜蛋白。此外，采用荧光共振能量转移（FRET）分析来评估GEs和LMSNs之间的空间距离，以预测LMSNs与GE包覆层之间的空间关系。 使用TRITC标记的GEs（T-GE）和FITC标记的LMSNs（F-LMSN）制备了LMSN@GEs，二者形成了FRET对。F-LMSN在520 nm处的发射强度降低，而TRITC在573 nm处的发射强度增加，表明能量从供体转移到受体（图2d）。两个相互作用伙伴之间的FRET效率为41.6%，计算得出的FRET距离为4.2 nm。GEs和LMSNs之间的这种空间距离进一步证明LMSNs被一层约4.2 nm的外泌体膜所包覆。 总之，这些数据充分证实了由生姜来源的外泌体和无机框架构成的仿生纳米复合材料已成功制备。DLS测得LMSN@GE的水动力粒径为252.1 ± 5.5 nm（图2e），粒径分布较窄（PDI，0.172）。LMSN带有高度正电荷，Zeta电位为+20.9 ± 1.2 mV。GEs包覆后，观察到表面电荷的明显反转，如图2f所示；LMSN@GE具有-9.2 ± 1.3 mV的负Zeta电位。 如预期那样，V p值从2.082 cm³·g⁻¹（LMSN）急剧下降至0.6591 cm³·g⁻¹（LMSN@GE），S BET值从399.6 m²·g⁻¹（LMSN）急剧下降至48.15 m²·g⁻¹（LMSN@GE），且在LMSN@GE中未检测到真实孔隙（图2g和h），这表明GEs包覆能很好地密封LMSN表面暴露的孔隙，这将有助于保护负载的蛋白药物免受水解，并防止其在胃肠道（GIT）中的过早释放。 LMSN@GE在模拟胃肠道pH下的分散稳定性如图S1所示。 图 2 INF/LMSN@GE 的物理化学表征。(a) GE、LMSN 和 LMSN@GE 的 TEM 表征。比例尺，200 nm。(b) LMSN 和 GE 的共定位。比例尺，10 μm。(c) 标记物、GE 和 LMSN@GE 的 SDS-PAGE 蛋白图谱。 (d) FITC 标记的 LMSN (F-LMSN)、TRITC 标记的 GE (T-GE) 和双标记纳米复合材料 (F-LMSN@T-GE) 在 440 nm 和 545 nm 激发下的发射光谱。(e) 通过 DLS 测定的 GE、LMSN 和 LMSN@GE 的水动力粒径和 (f) Zeta 电位。数据为均值 ± SD (n = 3)。(g) 制备的 LMSN 和 LMSN@GE 的氮气吸附-脱附等温线和 (h) 相应的孔径分布。2.2 LMSN@GE对负载大分子的双重保护 在成功构建LMSN@GE后，我们进一步探究了INF/LMSN@GE的体外特性。首先，研究了LMSN在大分子递送方面的优势。众所周知，低负载能力严重限制了传统递送系统在口服大分子药物中的应用。在此，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）测定LMSN中INF的负载量。如图3a所示，获得了61.3 wt%的平均INF负载率（INF：负载INF的LMSN），该值显著高于相应有机纳米颗粒中截留的大分子含量。 经GE包被后，INF的负载率仍高达51.5 wt%（INF：负载INF的LMSN@GE），足以用于口服给药，表明在GE包被过程中仅有少量INF损失。此外，由大分子聚集引起的不稳定性是大分子药物递送中的另一个问题。如图3b和3c所示，溶解后30 min，INF的粒径开始增加，表明此时INF已发生聚集。180 min后，强度直径结果显示溶液中已无INF单体，且几乎所有INF均已聚集。大分子药物的这种自聚集将严重限制其疗效。 我们预期，LMSN的刚性骨架可有效防止这种聚集，从而改善大分子药物在递送过程中的自稳定性。采用动态光散射（DLS）和圆二色谱（CD）研究了LMSN在防止INF聚集中的关键作用。如图3c所示，从LMSN中释放的INF粒径约为10 nm，推断LMSN中含有的INF仍能保持单体形式。图3d中的CD光谱显示，INF在负载于LMSN孔道后其二级结构发生了改变，但在从LMSN中释放后得以恢复，表明负载于LMSN孔道中的INF能够保持其原有的二级结构。 这些结果表明，当孔尺寸适合大分子负载时，LMSN 可有效防止 INF 的自聚集。 随后，我们探讨了GE涂层在胃肠道（GIT）递送过程中对口服抗体的保护作用。GE囊泡在胃肠道中的完整性和稳定性起着决定性作用。首先，在模拟胃液（SGF；pH 1.2，含胃蛋白酶）和模拟肠液（SIF；pH 7.4，含胰蛋白酶）中评估了GE囊泡的结构稳定性。如图3e、f和图S2所示，动态光散射（DLS）分析显示，在SGF中孵育最初2小时后，分离得到的GE囊泡平均直径在254至277 nm之间，这与外泌体群体一致。 此外，相应的透射电子显微镜（TEM）图像显示了GE的囊泡形态，并证实囊泡直径约为280 nm，轮廓清晰完整。然而，在SIF中孵育12小时后，GE的尺寸增加至425 nm，且轮廓严重模糊，表明GE逐渐裂解，直至在SIF中孵育12小时。GE囊泡的这种优异的结构稳定性保证了在胃肠道递送时，封装的货物具有结构稳定性且无提前释放，从而实现了口服抗体的高效性。我们进一步进行了SDS-PAGE、圆二色谱（CD）和酶活性测试，以全面验证我们的假设。 首先，通过SDS-PAGE分析评估了INF的完整性。如图3g所示，在SGF中孵育2小时后，仅56.6%的完整INF从LMSNs中释放；在SIF中孵育6小时后，46.5%的完整INF从LMSNs中释放。然而，LMSN@GE表现出显著改善的保护效果，在SGF中孵育2小时后释放了84.7%的完整INF，在SIF中孵育6小时后释放了79.9%的完整INF，表明GE的庇护作用能够抑制酶对INF的水解。大分子的二级结构对其生物功能至关重要。 通常，二级结构对环境、温度、pH等敏感。在此，利用CD分析负载在LMSN或LMSN@GE中的INF的pH诱导构象变化。如图3h所示，从LMSN中释放的INF在pH 1.2下孵育2小时后，其β-折叠结构发生了显著变化，而从LMSN@GE中释放的INF则保持了主要和次要构象。此外，我们还比较了游离INF以及分别从经SGF处理的INF/LMSN或INF/LMSN@GE中释放的INF的抗TNF-α能力。 图3i的结果显示，从经SGF处理的INF/LMSN@GE中释放的INF保持了与游离INF相当的抗TNF-α活性，表明LMSN@GE凭借其对抗酸性环境和酶消化的有效保护能力，赋予了货物大分子高生物功能。综上所述，LMSN@GE的孔径大小接近所负载大分子的大小，并带有外泌体鞘，对负载的大分子表现出双重保护效果。 随后，在模拟胃液（SGF）和模拟肠液（SIF）中评估了INF的体外释放曲线。INF/LMSN和INF/LMSN@GE的INF释放曲线如图3j所示。在SGF中的前2小时内，INF从LMSN（少于9.23%的INF）和LMSN@GE（5.12%）中缓慢释放。在将释放介质更换为SIF后，85.33%的INF在10小时内从LMSN的孔隙中逐渐释放。然而，在SIF中，LMSN@GE在10小时内仅释放了16.12%的INF。 与INF/LMSN的骨架型扩散相比，由于GE包覆在INF/LMSN上，INF/LMSN@GE表现出储存型扩散，这能有效防止INF在胃肠道（GIT）中从LMSN中过早释放。 综合上述所有结果，LMSN@GE无疑能够促进具有活性生物功能的治疗性抗体的有效口服递送。 图3 LMSN@GE对GIT中负载INF失活的潜在保护作用。(a) LMSN和LMSN@GE的INF负载能力。数据为平均值 ± SD (n = 3)。(b) INF从单体到聚集体的聚集率。数据为平均值 ± SD (n = 3)。(c) 不同条件下INF的粒径分布，通过动态光散射测定。(d) INF以及负载于LMSN和LMSN@GE中或从中释放的INF的CD光谱。(e) 在SGF和SIF中孵育不同时间间隔的GE的形态学及(f)尺寸表征。比例尺，200 nm。 (g) 不同组别INF的SDS-PAGE蛋白图谱：(1) 游离INF，(2) SGF处理的INF/LMSN中的INF，(3) SIF处理的INF/LMSN中的INF，(4) SGF处理的INF/LMSN@GE中的INF，以及(5) SIF处理的INF/LMSN@GE中的INF。(h) INF以及SGF处理的INF/LMSN或SGF处理的INF/LMSN@GE中INF的CD光谱。(i) 通过ELISA测定的RAW264.7细胞培养上清液中的TNF-α水平。 细胞首先用100 ng mL⁻¹ LPS激活。添加INF、INF/LMSN、INF/LMSN@GE以及SGF处理的INF/LMSN或SGF处理的INF/LMSN@GE中的INF以抑制LPS诱导的TNF-α产生。所有组别中INF的浓度为20 μg mL⁻¹。数据为平均值 ± SD (n = 3)。(j) INF/LMSN和INF/LMSN@GE在SGF和SIF中的体外释放曲线。 蓝色线条曲线显示INF/LMSN和INF/LMSN@GE在SGF中的体外释放；绿色线条示意图展示负载于LMSN中的INF的释放过程，红色线条示意图展示负载于LMSN@GE中的INF的释放过程。数据为平均值 ± SD (n = 3)。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。2.3 INF/LMSN@GE的口服结肠靶向递送 靶向递送设计是近期药物递送系统的研究重点。人工合成的纳米颗粒通常与周围生物环境相互作用，并引发机体的免疫识别，从而导致靶向效果不佳。此外，考虑到临床生产工艺的成本效益，复杂的靶向策略往往难以实施。与人工合成的纳米颗粒不同，天然的外泌体样纳米囊泡在细胞间通讯中发挥着重要作用。 这种天然的靶向识别能力和高生物通透性赋予了外泌体样纳米囊泡理想的靶向递送潜力。 Didier Merlin 证明，口服姜源纳米颗粒能够靶向结肠，并被患有或不患有结肠炎的小鼠中的上皮细胞和巨噬细胞摄取。 在本研究中，我们首先在体外测试了 LMSN@GE 的结肠靶向能力。LMSN@GE 对 HT29 细胞和 Raw 264.7 细胞均无细胞毒性（图 S3 ）。进行流式细胞术分析以探究 GE 包衣对肠道上皮细胞摄取 LMSN 的影响。 在此，选择 HT 29 细胞代表炎症性肠道上皮细胞，选择 3T3 细胞作为阴性对照细胞（3T3 细胞通常被视为无特定识别功能的正常细胞）。如图 4a、b 和图 S4  所示，HT29 细胞对 FITC-LMSN@GE 的细胞摄取量是对 FITC-LMSN 摄取量的 5.81 倍。此外，HT29 细胞对 FITC-LMSN@GE 的细胞摄取量是 3T3 细胞的 8.5 倍。 这些结果充分证明，GE 包衣能够促进 LMSN 被炎症性肠道上皮细胞高效且特异性地内吞。然而，GE 结肠靶向的分子机制尚不清楚，我们将在未来的研究中予以阐明。 即使被运输至靶部位，大分子药物也总是因其较差的膜通透性而无法发挥治疗作用。为了获得更好的炎症性肠病（IBD）治疗效果，INF 需要跨肠上皮运输，以抑制分布于固有层中的巨噬细胞释放的大量 TNF-α。随后，我们初步探索了 LMSN@GE 跨肠上皮的独特运输过程。首先，探索了 LMSN@GE 在肠上皮细胞中转运时的细胞内归宿。然后通过 CLSM 观察了 Dir-GE 与 FITC-LMSN 的共定位（图 4c）。 与 HT 29 细胞共孵育 3 小时后，在细胞边缘观察到代表 FITC-LMSN@Dir-GE 的黄点。此外，在细胞质中观察到代表 FITC-LMSN 的独立绿点和代表 Dir-GE 的红点，几乎未观察到黄点。这些数据表明，一旦在受体细胞中被内吞，这些外泌体（GE）会释放其包裹的货物（INF/LMSN），如图 4d 所示。为了进一步揭示 LMSN@GE 在体内的递送特性，通过 CLSM 和生物 TEM 追踪了 LMSN@GE 在炎症结肠组织中的分布和形态。 有趣的是，口服给予 TRITC-LMSN@Did-GE 6 小时后，在结肠腔中心观察到大量代表 TRITC-LMSN@Did-GE 的黄点，但在远离结肠腔中心的位置仅观察到代表 TRITC-LMSN 的红信号（图 4e）。我们假设，当 GE 涂层辅助 LMSN@GE 跨肠上皮细胞时，GE 本身逐渐从 LMSN 表面剥离。上述实验结果支持了这一假设，表明当 GE 遇到肠上皮细胞时，通过膜融合或内吞作用释放其内含物（INF/LMSN）。 TEM 图像提供了对 LMSN@GE 在炎症结肠上皮中细胞内归宿的额外理解。图 4f 显示了 LMSN@GE 在早期溶酶体中具有明显定位的外观。此外，在胞吐之前，LMSN 表面清晰可见一层薄薄的涂层（GE 层）。然而，当纳米复合材料运输到上皮细胞底部（胞吐之前）时，GE 的薄涂层层已经丢失，最终 LMSN@GE 以裸露的 INF/LMSN 形式跨肠上皮细胞。 这些结果表明，GE 涂层促进了 INF/LMSN@GE 的细胞摄取，并使 INF/LMSN@GE 以 INF/LMSN 的形式跨炎症结肠上皮进入 TNF-α 富集的固有层。在 GE 涂层从 INF/LMSN 上脱落后，INF 更容易从 LMSN 中释放。此外，如图 S5 所示，LMSN 在模拟体液中 96 小时内逐渐降解， 这也将加速 INF 在体内的释放。INF 将被释放到固有层，以抑制巨噬细胞分泌的 TNF-α ，从而达到治疗结肠炎的效果。 这些摄取和运输特性有助于 INF 从 LMSN@GE 在病灶部位更高效的通透和释放，可能导致对 TNF-α 产生更高的抑制效果。 长期以来，一种能够将抗TNF-α药物特异性且专一地递送至炎症区域的载体系统一直是一项未满足的需求。这样的系统可以显著降低现有疗法的副作用。为了在体内确认LMSN@GE的结肠靶向递送，用Cy7标记INF（即Cy7-INF），并在给药后24小时使用活体成像系统（IVIS）分析组织中Cy7-INF的平均荧光强度（MFI）。 如图5a和5b所示，与静脉注射的Cy7-INF溶液相比，口服给予的Cy7-INF/LMSN@GE使炎症结肠中的平均荧光强度（MFI）显著增加至12.6倍。此外，与Cy7-INF/LMSN@GE组相比，另一口服给药组（Cy7-INF/LMSN）在肠道中观察到更多的Cy7-INF荧光信号，而在炎症结肠中较少，这表明LMSN的GE包衣实现了INF更好的结肠靶向递送。 而且，与口服给予的Cy7-INF/LMSN@GE相比，静脉注射的Cy7-INF溶液使心脏、肝脏、脾脏、肺部和肾脏中Cy7-INF的MFI分别增加至约30.7倍、52.7倍、43.7倍、58.3倍和60.5倍。为了进一步揭示体内释放的INF量，采用ELISA方法测定组织中的INF水平。如图5c所示，与口服给予的INF/LMSN或静脉注射的INF溶液相比，口服给予的INF/LMSN@GE在炎症结肠中表现出总体显著更高的INF水平。 此外，与静脉注射INF溶液的小鼠相比，口服给予INF/LMSN@GE的小鼠在心脏、肝脏、脾脏、肺部和肾脏中检测到28.7倍、52.3倍、16.5倍、35.3倍和49.7倍更高的INF。这些结果表明，口服给予的INF/LMSN@GE能够改变INF的体内分布，并显著降低INF的全身暴露，同时维持炎症结肠组织中相对较高的药物水平。  我们推测INF/LMSN@GE的靶向机制主要归因于GE包被层。 已有报道指出，口服给予的GDNPs（一种可食用的姜源外泌体样纳米颗粒）可以靶向结肠，并进一步表明，无论小鼠是否患有结肠炎，GDNPs均能被结肠上皮细胞和巨噬细胞高效摄取。 通过分析口服给予GDNPs后差异表达基因，鉴定出GDNPs的分子靶点，该靶点可能与急性结肠炎的减轻有关。该分子靶点碳酸酐酶1（CAR1）是一种表达于肠黏膜膜上的蛋白。经GDNPs处理后，CAR1的表达显著增加，最高达14倍。 最近有报道指出，CAR1存在于结肠肠上皮细胞表面，并且是与炎症性肠病（IBD）发病机制相关的主要盲肠抗原。 结肠靶向的另一种新兴机制可能是植物源外泌体独特的脂质双分子层，其富含磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰胆碱（PC）。研究表明，富含PE和PC的脂质双分子层通过网格蛋白依赖性途径和巨胞饮作用，引导植物源外泌体靶向分泌TNFα的固有层巨噬细胞。 鉴于其特异性表面蛋白和脂质双分子层膜，GE等植物源外泌体表现出高度选择性的归巢能力和特异性靶向能力，因此可能是IBD的理想药物纳米载体。 图 4 INF/LMSN@GE 的结肠靶向能力及其穿过肠上皮细胞从肠腔转运至固有层的进程。(a) 流式细胞术和 CLSM 分析 HT-29 细胞对 LMSN 和 LMSN@GE 的不同细胞摄取情况；LMSN 用 FITC 标记。比例尺，40 μm。(b) 流式细胞术分析 HT-29 细胞与 3T3 细胞对 LMSN@GE 的特异性摄取比较；LMSN 用 FITC 标记。 (c) 通过 CLSM 观察 LMSN@GE 在肠上皮细胞中转运时的细胞内去向，左图比例尺为 20 μm，右图比例尺为 100 nm。(d) 肠上皮细胞对 INF/LMSN@GE 细胞内摄取过程的示意图。(e) 通过 CLSM 观察炎症性结肠组织，以展示 LMSN@GE 从肠腔转运至固有层的过程，上图比例尺为 200 μm，下图比例尺为 20 μm。(f) 通过 TEM 观察炎症性肠上皮细胞，以展示 LMSN@GE 的细胞内去向。 左图比例尺为 1 μm，右图比例尺为 100 nm。 图5 INF/LMSN@GE经口服途径的体内结肠靶向递送效果。DSS诱导的结肠炎小鼠分别接受INF溶液（i.v.）、INF/LMSN（p.o.）和INF/LMSN@GE（p.o.）治疗。INF用Cy7标记。（a）给药后24 h三组结肠、肠道及其他器官（包括肝、心、肺、脾和肾）的代表性荧光图像。（b）这些组织的平均荧光强度。（c）通过ELISA测定的这些组织中的INF水平。数据为均值 ± SD（n = 3）。 ns表示无显著性差异，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。2.4 INF/LMSN@GE的体内治疗效果 随后，我们评估了INF/LMSN@GE在DSS诱导的结肠炎小鼠模型中的体内治疗效果。治疗在结肠炎诱导期结束后立即进行。研究共设六个组别：五个为DSS诱导的结肠炎组，一个为健康对照组。INF溶液通过静脉注射给予结肠炎小鼠，而GE、INF/LMSN和INF/LMSN@GE则通过口服灌胃给予结肠炎小鼠。 INF溶液、INF/LMSN和INF/LMSN@GE的浓度均设定为40 μg mL⁻¹，以确保每日给药量为10 mg kg⁻¹，且GE的用量与INF/LMSN@GE中GE的含量保持一致。健康小鼠和未处理小鼠分别作为阴性对照和阳性对照。所有小鼠在第16天处死以进行进一步检查，治疗方案如图S6所示。 体重减轻是评估结肠炎模型中制剂治疗效果的重要指标。 如图6a所示，与INF/LMSN组相比，INF/LMSN@GE组的体重减轻得到显著恢复，且在第16天时接近健康对照组小鼠的体重，表明口服给予的INF/LMSN@GE对IBD具有较高的治疗效果。 疾病活动指数（DAI）也被用于进一步评估制剂在DSS诱导的结肠炎小鼠中的治疗效果。接受INF/LMSN@GE治疗的小鼠的DAI在治疗组中最低（图6b），表明其对IBD的治疗效果最佳。与未治疗的阳性对照组相比，GE治疗组的DAI显著降低，这可能是由于GE中活性成分的抗炎特性所致。 然而，与未治疗的阳性对照组相比，接受INF/LMSN治疗的小鼠没有显著变化，这可能是由于口服INF在胃肠道（GIT）中被消化酶降解所致。 通过测量结肠长度来进一步评估制剂在结肠炎模型中的治疗效果。如图6c和d所示，每种制剂产生了不同的治疗效果。与未治疗的阳性对照组相比，INF/LMSN@GE治疗后结肠长度显著增加，达到健康对照组结肠长度的71.8%，甚至与INF溶液组（65.2%）的治疗效果相当，表明INF/LMSN@GE是IBD抗体治疗的有效口服递送系统。值得强调的是，INF/LMSN@GE的疗效显著优于INF/LMSN（50.7%），表明GE包衣在口服抗体的递送中发挥了重要作用。 我们还发现，与未治疗的阳性对照组相比，GE治疗组的结肠长度增加（分别为健康结肠长度的58.7%和44.9%），表明除了具有优异的口服结肠靶向递送能力外，GE对IBD还有明显的治疗效果。 苏木精-伊红染色切片进一步显示，未治疗的结肠炎小鼠结肠中存在大量斑片状、不连续且累及全层的炎性浸润（图 6e），而组织学正常的结肠组织则未表现出纤维化及炎性改变。与未治疗的对照组相比，INF/LMSN@GE 组小鼠的结肠显示出界限清晰的隐窝结构及炎性浸润。值得注意的是，在 GE 治疗组小鼠的结肠中观察到轻微的腺体化生及杯状细胞保留，这在一定程度上证实了该疗法对炎症性肠病（IBD）的治疗效果。 TNF-α 是 IBD 期间由活化的巨噬细胞产生的一种代表性促炎细胞因子。 因此，我们采用 ELISA 和免疫组织化学方法测定了结肠组织中 TNF-α 的水平。如图 6f 和 g 所示，INF/LMSN@GE 治疗组小鼠结肠中的 TNF-α 水平降低至与健康小鼠相当的水平，且显著低于 INF 溶液治疗组及 INF/LMSN 治疗组，表明 LMSN@GE 是 IBD 口服抗体疗法的高效递送系统。 值得注意的是，GE 治疗组小鼠结肠中的 TNF-α 水平也有所降低，但仍高于 INF/LMSN@GE 治疗组。综上所述，这些发现表明 LMSN@GE 有望作为口服抗体的有效药物递送平台，从而提高 IBD 的治疗效果。 图 6 口服 INF/LMSN@GE 在 DSS 诱导的结肠炎小鼠中的体内治疗效果。(a) 经 2% DSS 诱导结肠炎后，分别用生理盐水、INF 溶液（i.v.）、GE（p.o.）、INF/LMSN（p.o.）和 INF/LMSN@GE（p.o.）处理的小鼠体重。健康对照组小鼠在治疗期间未进行处理。数据为均值 ± SD (n = 5)。(b) 治疗期间不同处理组小鼠的疾病活动指数 (DAI) 曲线。数据为均值 ± SD (n = 5)。 (c) 治疗结束时不同处理组小鼠结肠的照片及 (d) 结肠长度。数据为均值 ± SD (n = 5)。(e) 不同处理组小鼠结肠组织的 H&E 染色。比例尺，60 μm。(f) 不同处理组小鼠结肠组织中通过 ELISA 测定的 TNF-α 水平。数据为均值 ± SD (n = 5)。(g) 不同处理组小鼠结肠组织中 TNF-α 的免疫组织化学染色。比例尺，60 μm。 ns 表示无显著性差异，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。2.5 GE的抗炎机制 除了递送功能外，GE 在我们先前的研究中也表现出优异的抗结肠炎特性。阐明这种新型姜源产物在炎症治疗中的药理学机制，将有助于推动 GE 在未来药物递送及其他炎症相关疾病治疗方案中的应用。据报道，核苷酸结合域和富含亮氨酸重复序列家族、含吡啉结构域 3（NLRP3）炎症小体是固有免疫反应的关键调节因子，其异常激活与阿尔茨海默病、2 型糖尿病和炎症性肠病（IBD）等多种疾病的发病机制有关 。 靶向 NLRP3 炎症小体有望对抗这些复杂疾病，但特异性抑制 NLRP3 炎症小体的疗法尚未开发用于患者治疗。 根据既往研究，姜源纳米颗粒（GDNPs）可降低结肠炎模型中促炎细胞因子（TNF-α、IL-6 和 IL-1β）的水平，并升高抗炎细胞因子（IL-10 和 IL-22）的水平，提示 GDNPs 具有在减轻损伤因子的同时促进愈合效应的潜力，这主要归因于 GDNPs 含有更高浓度的姜活性成分 6-姜酚和 6-姜烯酚。 然而，GDNPs 的抗炎机制至今尚不明确。 在本研究中，为了探究 GE 基疗法对抗炎症性肠病（IBD）的机制，我们对细胞增殖标志物 NLRP3、caspase-1 和 IL-1β 进行了免疫组化检测。如图 7a 和 7b 所示，与生理盐水处理组小鼠相比，GE 处理组小鼠结肠中 NLRP3、caspase-1 和 IL-1β 阳性细胞的比例显著降低。在 GE 处理组小鼠的结肠中，NLRP3、caspase-1 和 IL-1β 阳性细胞的平均百分比分别为 40.5%、43.3% 和 39.7%。 这些结果可能解释了 GE 如何抑制结肠炎小鼠结肠中炎症因子的产生。数据表明，GE 可能是一种新型且强效的抑制剂，能够阻断 NLRP3 炎症小体的组装和激活（图 7c）。此外，与生理盐水处理组小鼠相比，INF/LMSN@GE 组小鼠结肠中 NLRP3、caspase-1 和 IL-1β 阳性细胞的比例也显著降低，表明 GE 基纳米颗粒同样具有阻断 NLRP3 炎症小体组装和激活的功能。 GE 的独特特性，包括靶向递送和抗炎活性，应有助于开发针对疾病状态下 NLRP3 炎症小体的 GE 基疗法。 图 7 基于 GE 的纳米颗粒对 NLRP3 炎症小体激活的影响。(a) 不同组别结肠组织中 NLRP3、caspase-1 和 IL-1β 的免疫组织化学染色。(b) 不同处理组炎症性结肠组织中细胞增殖率。(c) GE 抑制炎症性结肠组织中 NLRP3 炎症小体激活机制的示意图。3 结论 综上所述，我们开发了一种具有姜源囊泡和无机框架双重特性的仿生纳米复合材料，用于治疗性蛋白质的口服结肠靶向递送。LMSN@GE 纳米复合材料为 INF 货物提供了有效的保护，使其免受酸性环境和蛋白酶消化的影响，并防止其在胃肠道中的过早释放。在仿生 LMSN@GE 的辅助下，INF 在炎症结肠中实现了高蓄积，且全身暴露量较低。此外，INF 的跨细胞递送显著抑制了 TNF-α 在结肠固有层中的分布，并在治疗结肠炎小鼠方面取得了与静脉注射 INF 相当的疗效。 在此递送过程中，GE 通过阻断炎症上皮细胞中 NLRP3 炎症小体的组装和激活，表现出优异的抗炎活性。该系统易于进行大规模生产开发，最终可能代表一种预防和治疗 IBD 的有效治疗策略。总之，我们的工作不仅提出了一种用于口服递送抗体以治疗 IBD 的有前景的平台，还为开发利用纳米草药通过口服途径递送蛋白质的药物递送策略开辟了新途径。附录：补充实验方法材料与试剂 正硅酸乙酯（TEOS）、异硫氰酸荧光素（FITC）、四甲基罗丹明（TRITC）、磺基-花青7（Cy7）、L-赖氨酸以及3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）购自阿拉丁（上海，中国）。DMEM（高糖，Gibco；Thermo Fisher Scientific, Inc.）。FBS（Bioind 胎牛血清）。INF 购自 BioChemPartner（上海，中国）。 TNF-α ELISA 试剂盒购自 Adanti Biotechnology Co., Ltd.。所有转运抑制剂购自大连美仑生物技术有限公司。所有细胞器探针购自 Beyotime Biotechnology Co., LTD.。Transwell（直径 12 mm，孔径 0.4 μm，Costar®，Corning Costar Co.，美国马萨诸塞州剑桥市）。用于 HPLC 分析的所有化学品均为分析纯，购自山东玉王工业有限公司。其他化学品均为所需分析纯。GE的分离与纯化 生姜清洗三次，最后一次清洗后，去皮生姜在冷室中榨汁，收集的汁液用PBS稀释，然后在4°C下进行差速离心（3000 g离心30分钟，13000 g离心30分钟，17000 g离心60分钟）。为纯化GEs，加载不连续蔗糖梯度（8%、30%和60% [g/v]）以形成垫层。将悬浮液小心转移至蔗糖垫层顶部，避免扰动界面，并在4°C下以100,000 × g超速离心1.5小时。收集8%/30%层之间的条带，然后将沉淀物用PBS悬浮以获得GEs。 使用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度来确定GEs的浓度。通过SDS-Page确认GEs的鉴定。使用日立HC-1电子显微镜通过常规程序评估GEs的形态。GEs储存在-20°C以备后续使用。LMSN的合成与表征 预LMSN按照先前方法合成。在典型操作中，将0.5 g CTAB溶解于由70 mL H₂O、0.8 mL氨水（NH₄OH，30%）、20 mL乙醚和10 mL乙醇组成的乳液体系中。在4 °C下以1000 rpm的磁力搅拌速率剧烈搅拌混合物0.5 h后，迅速将2.5 mL TEOS倒入上述混合物中。所得混合物在4 °C下以1000 rpm的磁力搅拌速率剧烈搅拌4 h。随后，停止反应，并将锥形瓶在室温下放置24小时。 通过11000 rpm离心5 min获得白色沉淀，并用乙醇和纯水洗涤三次。随后，通过在70 °C下用乙醇盐酸（120 mL乙醇中的15 mL HCl（37%））处理产物搅拌36 h，进行CTAB模板提取。制备的预LMSN通过APTES进行氨基丙基功能化，所得样品命名为LMSN。INF/LMSN的制备 INF被用作模型蛋白药物。在载药过程中，采用2:1（w/w）的蛋白与载体比例制备载蛋白LMSN纳米颗粒。载药操作是将5 mg LMSN分散于蛋白溶液中（20 mL磷酸盐缓冲液（PBS），pH 6.8中含10 mg蛋白），并在4 ℃下轻柔搅拌4 h。在适当的时间间隔，将悬浮液样品以4500 g离心5 min。通过测定从样品中去除的上清液中的蛋白量来确定蛋白含量。上清液中的INF含量使用标准校准曲线计算。载药效率（%）按以下公式计算： 载药效率（%）＝（INF总量 − 游离INF量）÷（LMSN总量 ＋ INF总量 − 游离INF量）INF/LMSN@GE的制备与表征 INF/LMSN@GE按照先前方法合成。将分离得到的GEs与INF/LMSN按1:1~3（w/w）的质量比均匀混合。将混合物通过微型挤出机（Avanti, 610007-1Ea PC Membranes 0.4μm）至少挤出11次。随后，在4°C下将混合物离心（12000 g，10 min）以去除空GEs。沉淀物用冷PBS洗涤并再次离心。将沉淀物（INF/LMSN@GEs）重悬于PBS中，并在-80°C下储存备用。 使用Nicomp 380粒径分析仪（Particle sizing systems, USA）测量LMSN@GE的Zeta电位和粒径，并通过TEM观察LMSN@GE的形态。LMSN@GE的验证通过SDS-Page确认（由Servicebio Biotechnology Co., Ltd.提供支持）。INF、LMSN和GE的荧光标记 如先前报道，首先基于INF的伯氨基与TRITC的异硫氰酸酯基团之间的反应合成了TRITC标记的INF（T-INF）。采用与TRITC标记INF相同的方法，使用TRITC标记的INF制备了Cy7标记的INF。    将5 μg FITC悬浮于3 mL乙醇中。加入20 mg LMSNs后，悬浮液在25°C下搅拌24小时。通过11000 rpm离心5分钟收集FITC标记的LMSNs（FITC-LMSNs），并用乙醇和纯水各洗涤三次以去除残留的FITC分子。 其他荧光染料（Dir、Did）稀释于1 mL PBS中，然后采用与FITC标记LMSN相同的方法制备荧光标记的GEs。荧光共振能量转移（FRET）分析 为进一步研究LMSN与GE之间的相互作用，进行了FRET分析。FITC和TRITC被用作FRET对。使用上述程序制备了TRITC标记的GE（T-GE）和FITC标记的LMSN（F-LMSN）。    荧光强度通过荧光分光光度计（Shimadzu RF-5301，日本）测量，激发波长为440 nm，发射光谱记录范围为500至600 nm。FRET效率（E）和供体与受体之间的距离（R）按以下方程计算： E ＝ 1 − F_DA / F_D；R ＝ R₀ × (1/E − 1)^(1/6)。其中F_DA为存在受体时的荧光强度，F_D为不存在受体时的荧光强度；R₀为转移效率达到50%时的Förster距离。对于FITC–TRITC，原文给出的R₀为55 nm。纳米颗粒稳定性 评估了GEs在模拟胃液（SGF，pH 1.2）和模拟肠液（SIF，pH 7.4）中的体外稳定性。SGF的制备参照文献，包含1%胃蛋白酶、2.0 g/L NaCl，并在pH 1.2下加入7 ml/L浓HCl以模拟胃部环境。SIF由10%胰酶（pH 7.2）配制而成，其中1 L溶液包含50 ml 0.1 mol/L NaH₂PO₄和42.5 ml 0.1 mol/L NaOH，以模拟肠道环境。 SGF和SIF储备液在使用前经0.22 μm Millipore滤膜过滤。进行稳定性研究时，将GEs转移至相应介质中，并在37°C下孵育。在选定的时间点，通过检测粒径分布、Zeta电位和TEM图像来评估GEs的稳定性。体外药物释放 在模拟胃液（SGF）和模拟肠液（SIF）中进行了INF从LMSN和LMSN@GE的释放曲线测定。在选定的时间点，将样品于4°C下离心（10000 rpm，1 min），取出上清液进行ELISA分析，并补充等体积的新鲜缓冲液。根据相应缓冲液的标准曲线计算INF浓度。INF的构象稳定性 采用圆二色性（CD）光谱仪（Bio-Logic MOS 450，法国）测量了负载于LMSNs中及从LMSNs中释放的INF相对于天然态的二级构象变化。测试前，样品用PBS（pH = 6.8）稀释至蛋白浓度为0.2 mg·mL⁻¹。在25°C下，以1 nm的分辨率采集190至260 nm范围内的光谱。使用所用PBS进行了基线校正。细胞毒性测定 HT29细胞购自上海细胞生物学研究所细胞库。细胞在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中，使用补充有10%胎牛血清和1%抗生素溶液（Gibco, Invitrogen, 美国）的Dulbecco's改良鹰氏培养基（DMEM）进行培养。通过MTT法分析GE、LMSN和LMSN@GE对HT29细胞的细胞毒性。将细胞以每孔10⁴个细胞的密度接种于96孔板中，并在37 °C下孵育过夜。随后，将不同浓度的纳米颗粒（NPs）加入孔中，与细胞共同孵育24小时。 之后，按照方案通过MTT法检测细胞活力。细胞摄取 将HT29细胞和3T3细胞接种于六孔板中（每孔2 mL培养基中含3 × 10⁵个细胞），培养24 h。随后，分别向孔中加入FITC-LMSN和FITC-LMSN@GE（FITC-LMSN浓度为200 ng·mL⁻¹），并在37°C下孵育4 h。接着，用胰酶消化细胞，用冷PBS洗涤三次，重悬于500 μL PBS中，然后使用流式细胞术（Becton Dickinson, USA）检测FITC信号。以未处理细胞的自发荧光作为对照。 结果使用FlowJo Version 7.6软件（Flowjo, USA）进行分析。所有实验均重复三次，结果展示了三次独立实验的代表性数据。    将2 × 10⁴个HT29细胞接种于带有细胞显微镜载玻片的24孔板中，培养24 h。将FITC-LMSN@Dir-GE（FITC-LMSN浓度为200 ng·mL⁻¹）加入细胞显微镜载玻片，与HT29细胞在37°C下孵育4 h。 用PBS洗涤后，用4%多聚甲醛固定细胞10 min，随后用Hoechst 33342染色。使用Olympus FV1000S-SIM/IX81共聚焦激光扫描显微镜（CLSM, Olympus, Japan）观察FITC-LMSN@Dir-GE在HT29细胞中的分布。LMSN@GE在肠上皮细胞中的透射电镜观察 使用日立H7650显微镜对经LMLN@GE治疗的结肠炎小鼠结肠组织切片进行成像。切片处理步骤如下：首先用3%戊二醛和1%四氧化锇固定，随后用递增浓度的乙醇脱水，最后包埋于环氧树脂中。从聚合的环氧树脂块上切取超薄切片，并对切片进行1%醋酸铀和Reynolds柠檬酸铅染色。本观察工作由Servicebio Biotechnology Co., Ltd.提供支持。结肠炎模型 结肠炎模型按照既往方法建立。通过给雌性C57BL/6小鼠（辽宁长生生物科技有限公司，中国，6周龄，18-22 g）饲喂2% DSS 6天诱导结肠炎。生物分布与炎症结肠靶向 将结肠炎小鼠随机分为三组，分别给予Cy7-INF（静脉注射）或Cy7-INF/LMSN（口服）以及Cy7-INF/LMSN@GE（口服）。所有组别中INF的剂量保持一致，均为10 mg/kg。给药后24 h处死小鼠。收集组织与器官，并在IVIS成像系统（PerkinElmer）下观察。图像使用Living Image®软件进行分析。结肠炎治疗 如图S1所示，在DSS溶液饲喂结束后，将结肠炎小鼠随机分为六组。所有组别中INF的剂量保持一致，均为每日10 mg/kg。 第(I)组：未接受治疗的正常小鼠；第(II)组：接受生理盐水治疗的DSS诱导结肠炎小鼠；第(III)组：接受INF溶液（i.v.）治疗的DSS诱导结肠炎小鼠；第(IV)组：接受GE（p.o.）治疗的DSS诱导结肠炎小鼠；第(V)组：接受INF/LMSN（p.o.）治疗的DSS诱导结肠炎小鼠；第(VI)组：接受INF/LMSN@GE（p.o.）治疗的DSS诱导结肠炎小鼠，(n=7)。 每日记录体重，并在第16天评估小鼠结肠炎的严重程度。 严重程度通过DAI（0-16）进行评估，包括体重减轻（1，1-5%；2，5-10%；3，10-15%；4，15-20%）、直肠出血（0，正常；1，半正常；2，隐血试验阳性；3，粪便中可见血迹；4，明显直肠出血）以及粪便性状（0，正常；1，半正常；2，稀便；3，稀便粘附于肛门；4，水样便粘附于肛门）。处死小鼠后收集结肠并测量其长度。H&E染色与免疫组化 在从治疗后的小鼠中采集组织后，组织立即在4 °C下用福尔马林固定48小时。测试服务由Servicebio Biotechnology Co., Ltd.提供。ELISA法检测TNF-α RAW264.7细胞购自上海细胞生物学研究所细胞库。细胞在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中，使用补充有10%胎牛血清和1%抗生素溶液（Gibco, Invitrogen, USA）的Dulbecco's Modified Eagle's培养基（DMEM）进行培养。将细胞以每孔5×10⁴个细胞的密度接种于24孔板中，并在37 °C下过夜孵育。向细胞中加入100 ng·mL⁻¹的LPS以激活巨噬细胞。 使用GE、Free INF、INF/LMSN、INF/LMSN@GE以及从经SIG处理的INF/LMSN和INF/LMSN@GE中获得的INF来抑制LPS诱导的TNF-α产生。所有组中INF的浓度为20 μg·mL⁻¹。收集细胞培养上清液，并在4°C下以5000 r/min离心。收集上清液并储存在-80 °C。按照说明书使用ELISA试剂盒（Adanti Biotechnology Co., Ltd.）检测TNF-α。 称量处理组小鼠的结肠，并在含有蛋白酶抑制剂混合物的冷PBS（w/v = 1:10）中匀质20分钟。匀浆在4°C下以5000 r/min离心。收集上清液并储存在-80 °C。按照说明书使用ELISA试剂盒（Adanti Biotechnology Co., Ltd.）检测TNF-α。统计分析 所有数值均以均值 ± 标准差表示。比较两个独立组时，采用双尾P值的非配对Student’s t检验确定统计学差异；使用SPSS软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA）及Student-Newman-Keuls检验。差异在*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001时被认为具有统计学显著性。附录：补充图 图S1 纳米颗粒在模拟胃液（SGF）中2小时及在模拟肠液（SIF）中6小时的稳定性。 图S2 GE在SGF和SIF中48小时内的PDI和Zeta电位变化。 图S3 与GE、LMSN和LMSN@GE孵育48 h后HT29细胞（a）和Raw 264.7细胞（b）的细胞活力。（n=5）。 图S4 (a) 流式细胞术分析HT-29细胞对LMSN和LMSN@GE的不同细胞摄取情况，LMSN用FITC标记。(b) 流式细胞术分析HT-29细胞与3T3细胞对LMSN@GE的特异性摄取比较，LMSN用FITC标记。(n=3)。 图S5 模拟体液对LMSN的降解速率。比例尺，50 nm。 图S6 结肠炎治疗的时间表。附表与原文入口 表S1｜LMSN与LMSN@GE的结构参数。内容包括BJH孔径、BET比表面积和累积孔容。补充材料 d1nr06015e1_suppl.pdf（PDF，第9页），可从下方原文页面进入并下载。 DOI：10.1039/d1nr06015e 原文与补充材料入口：https://doi.org/10.1039/d1nr06015e 如有侵权，请联系删除。

保存时间：一年纯度：95%+状态：固体/溶液/粉末用途:仅用于科研包装：mg以及g级产地：西安德而塔生物可提供 引言 在化学生物学领域，光交联标记技术已成为研究生物分子相互作用的重要工具。其中，Me-Diazirine-Amine（甲基重氮甲烷-胺）凭借其独特的反应特性，在蛋白质相互作用、核酸标记及药物靶点鉴定等研究中展现出应用潜力。本文将从其作用机制、理化特性、应用方向及操作优势等方面展开介绍，旨在为相关领域的研究人员提供参考。 一、Me-Diazirine-Amine 的结构与反应机理 Me-Diazirine-Amine 是一种含有重氮基（diazirine）和伯胺（-NH2）官能团的双功能交联试剂。其结构中，重氮基团在紫外光（通常为 365 nm）照射下会分解生成高活性卡宾（carbene），该卡宾能够与邻近的 C-H 键、N-H 键、O-H 键等发生插入反应，形成稳定的共价键。同时，分子中的伯胺基团可作为化学手柄，用于后续的连接反应（如与 NHS 酯、羧基等反应）或作为亲和标签的锚点。 值得注意的是，卡宾的高反应活性使其能够在极短的时间内（纳秒级）与目标分子发生交联，从而实现对瞬时相互作用的捕获。 二、Me-Diazirine-Amine 的核心特点 1. 光控性：Me-Diazirine-Amine 仅在紫外光照射下才激活，因此可通过控制光照时间和区域，实现时间与空间上的精准标记。2. 高选择性：卡宾中间体倾向于插入 C-H 键，这一特性使其能够标记多种氨基酸残基，尤其适用于无偏见的相互作用分析。3. 化学稳定性：在无光照条件下，该试剂在生理缓冲液中较为稳定，便于实验操作和储存。4. 双官能团设计：重氮基负责光交联，胺基则便于后续的富集、检测或偶联，极大增强了实验的灵活性。 三、Me-Diazirine-Amine 的储存条件与稳定性 为确保试剂的活性，Me-Diazirine-Amine 应在低温、避光、干燥条件下储存。通常建议 -20°C 保存，并避免反复冻融。此外，由于重氮基团对光敏感，操作时应在暗处进行，防止提前分解。在正确的储存条件下，该试剂的保存期限可达一年（见产品规格）。 1. 蛋白质相互作用研究 通过将 Me-Diazirine-Amine 引入目标蛋白（如通过胺基与蛋白表面羧基反应），在紫外光照射下，卡宾可与相互作用的邻近蛋白发生交联，进而通过质谱鉴定交联肽段，揭示蛋白-蛋白相互作用网络。 2. 核酸-蛋白质相互作用 该试剂同样适用于 DNA/RNA 与蛋白质的相互作用分析。光照后卡宾可插入核酸碱基或糖骨架，从而捕获核酸结合蛋白。 3. 配体-受体结合位点鉴定 在药物研发中，Me-Diazirine-Amine 可用于标记小分子配体，通过光交联确定其在受体上的结合口袋，为合理药物设计提供信息。 4. 活细胞标记 由于该试剂具有良好的细胞渗透性（取决于具体衍生物），可用于活细胞内原位标记，研究动态过程。 五、Me-Diazirine-Amine 在实验中的优势 相比传统的交联剂（如甲醛、DSS），Me-Diazirine-Amine 具有以下显著优势：- 时间分辨率高：光激活可在毫秒内完成，能捕获弱且瞬时的相互作用。- 背景低：未照射区域不发生交联，有效降低非特异性背景。- 兼容性好：产物稳定，可耐受后续的裂解、纯化和质谱分析。 六、使用注意事项 尽管 Me-Diazirine-Amine 功能强大，但在使用时仍需注意：- 光照条件需优化（波长、能量、时间），以避免过度交联或损伤样品。- 胺基可能与其他活性基团发生副反应，需根据实验设计进行保护或偶联。- 该试剂仅供科研使用，不可用于人体或动物实验。 结语 Me-Diazirine-Amine 作为一种光交联标记试剂，以其光控性、高选择性和双官能团特性，在生物大分子相互作用研究中展现了广泛的应用前景。通过合理设计和优化实验条件，该试剂有望在化学生物学、药物发现及分子诊断等领域发挥重要作用。