Sennosides

编辑：丹青 结直肠癌（colorectal cancer，CRC）在中医范畴属“肠蕈”“积聚”“便血”等范畴，其发病机制与湿热蕴结、瘀血阻滞、正气亏虚密切相关[1]。《黄帝内经》有云：“百病生于气也”“积之成也，正气不足，而后邪气踞之”，指出CRC的发生发展是正气亏虚为本、湿热瘀毒为标的虚实夹杂过程[2]，临床治疗多以“清热利湿、化瘀解毒、健脾益气”为核心治法[3-4]，而大黄牡丹汤作为张仲景《金匮要略》中治疗“肠痈”的经典方剂，恰合此治则[5-6]。方中大黄泻热通便、凉血解毒、逐瘀通经，牡丹皮清热凉血、活血化瘀，二者相须为用，共奏清热利湿、化瘀解毒之功，历代医家多用于湿热瘀毒型CRC的治疗，疗效确切[7]。 中医药治疗肿瘤的核心优势在于“整体观念”与“辨证论治”，强调从机体整体出发，调节气血阴阳平衡，而非单纯针对局部病灶[8]。现代研究发现，中药方剂在煎煮过程中，其有效成分可通过氢键、疏水作用、π-π堆积等非共价相互作用自发形成纳米粒，这类天然纳米载体是中药“多成分、多靶点”协同作用的重要物质基础——它既能保护有效成分免受体内酶解，又能实现多种活性成分的同步递送，契合中医“协同施治”的配伍智慧[9-10]。然而，传统煎煮法受工艺局限，存在有效成分溶解分散不均、生物利用度不足等问题，导致中药临床疗效未能充分挖掘[11]。如何继承和发扬中药配伍优势，通过工艺改良提升制剂质量，成为中医药现代化面临的重要课题。 大黄-牡丹皮药对作为大黄牡丹汤的核心配伍，其配伍机制蕴含深刻的中医理论内涵：大黄苦寒，主入大肠经，善泻大肠之湿热瘀毒，为君药；牡丹皮辛苦微寒，入血分，能清血分之热、散瘀消肿，为臣药，二者一泻气分之实热、一清血分之瘀毒，气血同治、湿热瘀并除，完美契合CRC“湿热瘀毒互结”的核心病机[12]。现代药理学研究表明，大黄-牡丹皮活性成分大黄素、大黄酸与丹皮酚、芍药苷等，不仅存在明确的抑瘤效应，更具备天然的自组装潜力，可自发形成纳米尺度的聚集体（即自组装纳米粒）[13]。基于此，本研究立足中医“药对协同”理论，针对传统煎煮法的缺陷，改良制备工艺，采用微沉淀法构建大黄-牡丹皮新型自组装纳米粒（RheiRadixet Rhizoma-MoutanCortex novel self-assembled nanoparticles，RMN-SAN），旨在通过现代制药技术赋能传统中药配伍，提升制剂的均一性、生物利用度与疗效[14]。 本研究首先通过优化制备条件，以平均粒径、多分散性指数（polydispersity index，PDI）为评价指标，筛选最佳工艺参数；其次结合粒径分析、透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）、ζ电位测定等技术进行形貌学表征，揭示RMN-SAN的物理化学特性；然后利用UPLC-Q-TOF-MS鉴定RMN-SAN中的核心活性成分，借助傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）与UV光谱技术阐明RMN-SAN自组装形成机制，验证中医“药对协同”的物质基础[15]；最后通过体内外实验系统验证RMN-SAN的抗CRC活性，比较其与传统煎煮法制备纳米粒（RheiRadixet Rhizoma-MoutanCortex decoction self-assembled nanoparticles，RMD-SAN）的药效差异，探讨现代工艺如何强化中药的核心功效。本研究不仅为中药自组装纳米粒的制备工艺优化提供新思路，更致力于搭建中医药理论与现代制药技术的桥梁，让传统方剂的配伍智慧在纳米尺度下充分发挥，为CRC的中医药治疗提供高效、稳定的新型制剂，同时为中药复方的现代化开发与临床转化奠定科学基础。 1  仪器和材料 1.1  仪器 TCSSP8SR型激光共聚焦显微镜，德国徕卡（Leica）仪器有限公司；FACSVerse型流式细胞仪，美国BD公司；SQP-224-1CN型万分之一电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；UPS台上式型纯水仪，四川优普超纯科技有限公司；RE-2000型旋转蒸发仪，郑州科泰实验设备有限公司；SHZ-D（III）型循环水真空泵，上海力辰邦西仪器科技有限公司；Allegra®X-I5R型离心机，贝克曼库尔特（美国）股份有限公司；Spark型多功能微孔板测试平台，帝肯（上海）实验器材有限公司；BeNano 90 Zeta型纳米粒度及Zeta电位分析仪，丹东百特仪器有限公司；FD-1C-50型真空冷冻干燥机，博医康（北京）仪器有限公司；JEM1200X型透射电子显微镜，日本捷欧路公司；Q-6PS型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；Nicolet 6700/iS20型傅里叶近红外显微镜，美国Thermo Scientific公司；SynaptXS型高分辨液质联用分析仪，美国Waters公司；再生纤维素透析袋，截留相对分子质量（molecular weight cut-off，Mw）3 500，密理博中国有限公司（上海）。 1.2  药物与试剂 大黄（甘肃平凉市庄浪县，批号2502018）、牡丹皮（安徽铜陵市，批号2503027）饮片均购自四川省新荷花中药饮片有限公司，经成都中医药大学裴瑾教授鉴定，大黄为蓼科大黄属植物药用大黄Rheumofficinale Baill.的干燥根和根茎，牡丹皮为毛茛科芍药属植物牡丹Paeoniasuffruticosa Andr.的干燥根皮，均符合《中国药典》2025年版（一部）相关标准。 CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂盒（批号C0005）、活/死细胞染色试剂盒（Calcein AM/PI，批号C2025M），碧云天生物技术有限公司；青霉素-链霉素（批号234137）、DMEM培养基（批号6125503），美国Gibco公司；Annexin-V/FITC细胞凋亡检测试剂盒（批号20250814）、苏州四正柏生物科技有限公司；细胞周期试剂盒，批号E-CK-A351，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；结晶紫，批号P3512302，上海泰坦科技股份有限公司；戊巴比妥钠，批号MYM_MP0787，成都博奥派克科技有限公司；5-氟尿嘧啶，批号51-21-8，山东科源生化有限公司；无水乙醇，批号64-17-5，成都科隆化学品有限公司。 1.3  细胞 CT26细胞株购于中科院干细胞库。采用含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素（100 U/mL）的DMEM分别培养CT26细胞。细胞在37 ℃下含5% CO2的含水环境中培养[16]。 1.4  动物 SPF级雄性BALB/c小鼠，体质量18～22 g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，合格证号SCXK（京）2024-0001。小鼠购入后饲养1周，期间自由饮水进食；实验前禁食12 h，自由饮水。该实验研究获得成都中医药大学实验动物伦理委员会批准，批准号2024044[17]。 2  方法与结果 2.1  大黄-牡丹皮自组装纳米粒制备方案的筛选 2.1.1  传统煎煮法  取大黄、牡丹皮各10 g，剪碎，加10倍量超纯水，浸泡30 min，回流提取，趁热滤过；药渣加8倍超纯水回流提取30 min，趁热滤过；合并2次滤液，减压浓缩至0.2 g/mL，用0.45、0.22 μm的水系微孔滤膜滤过、梯度离心（4 ℃，6 000、8 000、10 000 r/min，各10 min）或以Mw 3 500的透析袋透析12 h，每4小时换水1次去除杂质，冻干后即得[18]。 2.1.2  醇提法取大黄、牡丹皮各10 g，剪碎，加10倍量70%乙醇，浸泡30 min，回流提取，趁热滤过；药渣加8倍70%乙醇回流提取30 min，滤过，得醇提液。合并2次提取液，600 r/min、25 ℃条件下磁力搅拌30 min，60 ℃旋转蒸发除醇，并浓缩至0.2 g/mL，用0.45、0.22 μm的水系微孔滤膜滤过、梯度离心（4 ℃，6 000、8 000、10 000 r/min，各10 min）或以Mw 3 500的透析袋透析12 h，每4小时换水1次，去除杂质，冻干后即得[18]。 2.1.3  微沉淀法取大黄、牡丹皮各10 g，剪碎，加10倍量超纯水，浸泡30 min，回流提取，趁热滤过；药渣加8倍70%乙醇回流提取30 min，滤过，得醇提液。合并2次提取液，600 r/min、25 ℃条件下磁力搅拌30 min，60 ℃旋转蒸发除醇，并浓缩至0.2 g/mL，用0.45、0.22 μm的水系微孔滤膜滤过、梯度离心（4 ℃，6 000、8 000、10 000 r/min，各10 min）或以Mw 3 500的透析袋透析12 h，每4小时换水1次，去除杂质，冻干后即得[18]。 2.1.4  筛选结果结果如表1所示，3种不同制备工艺下的纳米粒子呈现出不同的粒径分布。在相同条件下，粒径分布趋势整体上呈现传统煎煮法＞醇提法＞微沉淀法。同时，还考察了同一工艺下，不同的纳米粒子纯化分离方案，粒径分布整体趋势表现为离心法＞过滤法＞透析法，且受到滤膜孔径、离心转速和透析袋孔径的影响。尤其是微沉淀工艺下制备的纳米粒，经透析后粒径分别为（189±1.26）、（146.58±3.70）nm，符合纳米粒的最佳粒径（100～200 nm）区间。综上所述，以微沉淀法作为RMN-SAN的制备工艺，并进行后续工艺优化。 2.2  单因素实验考察RMN-SAN制备工艺 前期实验初步表明，微沉淀法提取之后，形成的RMN-SAN更集中，大小分布更均一。为进一步考察自组装纳米粒形成条件，以平均粒径、PDI为评价指标，对煎煮时间、磁力搅拌转速、透析时间进行单因素考察，初步筛选对RMN-SAN制备过程影响较大的实验因素[9]。 2.2.1  煎煮时间的考察  固定磁力搅拌转速600 r/min、磁力搅拌时间30 min、磁力搅拌温度25 ℃、旋转蒸发温度60 ℃和生药质量浓度0.2 g/mL，考察煎煮时间分别为30、60、120 min时对RMN-SAN平均粒径和PDI的影响。结果如表2所示，不同煎煮时间对纳米粒的平均粒径影响较大。当煎煮时间30 min时，纳米粒的平均粒径为（294.10±9.60）nm，且PDI为0.154±0.028，纳米粒整体分布均匀；当煎煮时间60 min时，平均粒径开始增大，为（379.90±16.00）nm，且PDI为0.199±0.057；当煎煮时间120 min时，平均粒径为（505.10±98.20）nm，PDI升高至0.242±0.083。且还检测到另1个信号峰。尽管纳米粒分布依旧较为均匀，但呈现扩大趋势。经分析，煎煮时间过长可能会导致大量杂质溶出，影响原有效成分的自组装。故选择煎煮时间30 min。 2.2.2  磁力搅拌转速的考察  固定煎煮时间为60 min，磁力搅拌时间30 min、磁力搅拌温度25 ℃、旋转蒸发温度60 ℃和生药质量浓度0.2 g/mL，考察磁力搅拌转速为400、600、800 r/min时对RMN-SAN平均粒径和PDI的影响[9]。结果如表3所示，当磁力搅拌转速从400 r/min增至600 r/min时，平均粒径和PDI显著减小且分布更加均匀；继续增加磁力搅拌速度至800 r/min，平均粒径增加，并且均匀性降低。故选择磁力搅拌转速为600 r/min。 2.2.3  透析时间的考察  固定煎煮时间为60 min，磁力搅拌时间30 min、磁力搅拌转速600 r/min、磁力搅拌温度25 ℃、旋转蒸发温度60 ℃和生药质量浓度0.2 g/mL，考察透析时间分别为6、12、24 h对RMN-SAN平均粒径和PDI的影响。结果如表4所示，不同透析时间对纳米粒的平均粒径影响同样较大。当透析6 h时，平均粒径为（173.70±27.90）nm，且PDI为0.341±0.030；当透析12 h时，平均粒径减小，为（162.30±1.30）nm，且PDI为0.285±0.008；当透析24 h时，平均粒径为（125.60±0.40）nm，PDI升高至0.325±0.020。尽管透析24 h后纳米平均粒径最小，但其PDI更大，且期间需要多次更换透析介质，从制备层面考虑，其不如透析12 h工艺性价比更高（更加省时省力，且均匀度更强；工艺扩大及转化性更高）。故选择透析12 h。 2.3  优化工艺与验证 通过单因素分析优化了微沉淀法制备工艺，最终得出大黄-牡丹皮药对自组装纳米粒的最佳制备方法为取大黄、牡丹皮各10 g，剪碎，加10倍量纯水，浸泡30 min，回流提取30 min，滤过。药渣加8倍70%乙醇回流提取30 min，滤过。合并2次提取液，600 r/min、25 ℃条件下磁力搅拌30 min，60 ℃旋转蒸发除醇，并浓缩至0.2 g/mL，梯度离心（4 ℃，6 000、8 000、10 000 r/min各10 min）后以Mw 3 500的透析袋透析12 h，即得。 2.4  自组装纳米粒的表征与稳定性考察 2.4.1  粒径、PDI、ζ电位测定将所制备得到的纳米粒子注入粒度分析仪的样品池中，将测定温度设置为25 ℃，检测角度为侧向散射90°，以测定纳米溶液的粒径和PDI；将样品注入电泳池中，调整适当的电压测定ζ电位[19]。RMN-SAN的粒径分布如图1所示，可见，RMN-SAN的粒径分布较为均一，平均粒径为（109.30±4.20）nm，PDI为0.353±0.009，ζ电位为（−24.5±1.3）mV。RMD-SAN的平均粒径为（258.41±2.57）nm，PDI为0.376±0.013，ζ电位为（−15.3±0.6）mV。 2.4.2  TEM形貌观察  将自组装纳米粒样本分散在纯水中，取2 μL分散液滴加在铜网（带有碳膜）上，用吸水滤纸轻轻吸去多余液体，留下薄层样品。将样品在空气中自然干燥，确保含量测定纳米粒子不因溶剂残留而聚集。为了提高图像对比度，采用2 μL磷钨酸负染60 s，等待风干后即可将制备好的样品放入电镜样品架上，确保样品平整，避免倾斜和样品破损，设置合适的加速电压和放大倍率。通过调整显微镜的焦距、对比度等参数，获取高质量的图像，观察纳米粒子的形态、粒径分布以及是否存在聚集现象[19]。结果如图2所示，所制备的RMN-SAN和RMD-SAN粒径均在100～200 nm，形态完整，呈不规则的圆球形，分布较为均匀。 2.4.3  RMN-SAN的稳定性考察  为考察优化工艺后RMN-SAN的稳定性，将新鲜制备的RMN-SAN样品密封后置于4 ℃冷藏条件下保存，分别于制备后第1、2、3、4、5、6、7天取样，按照“2.4.1”项下的粒径、PDI及ζ电位测定方法，平行测定3份样品的相关指标，记录数据并计算平均值与标准偏差，系统考察RMN-SAN在7 d储存期内的物理稳定性变化情况。结果如表5所示，RMN-SAN在7 d储存期内的平均粒径、PD及ζ电位无显著性突变，表明其稳定性良好。 2.5  纳米粒自组装成分与机制剖析 2.5.1  成分鉴定采用UPLC-Q-TOF-MS对RMN-SAN与RMD-SAN进行非靶向成分鉴定。其质谱条件如下：采用电喷雾离子源，分别在正、负离子条件下扫描，通道扫描范围m/z 50～1 200，扫描时间0.3 s，检测时间30 min；低碰撞能量电压10 eV；高碰撞能量电压30 eV；正、负离子模式的毛细管电压2.5、2.0 kV；离子源温度150 ℃；锥孔电压40 V；辅助喷雾电离与去溶剂气体为N2；去溶剂化温度450 ℃；锥孔气体积流量50 L/h；去溶剂化气体积流量800 L/h。 在正、负离子模式下的总离子基础上，通过对比各组分的MS数据，同时与软件数据库中的化学成分进行对照分析[18]。RMN-SAN的UPLC-Q-TOF-MS正、负离子模式下的总离子流图如图3-A所示。结果（图3-B）表明，RMN-SAN中共鉴定出5种大黄-牡丹皮药对核心特征活性成分，包括大黄蒽醌类化合物（大黄酸m/z283.02 [M－H]−、芦荟大黄素m/z271.06 [M＋H]+）、大黄二蒽酮苷类化合物（番泻苷B m/z 861.19 [M－H]−）；牡丹皮单萜酚类化合物（丹皮酚m/z 167.07 [M＋H]+）、牡丹皮单萜苷类化合物（芍药苷m/z 481.19 [M＋H]+）。 而RMD-SAN经UPLC-Q-TOF-MS鉴定出儿茶素、表儿茶素、没食子酸、琥珀酸、柠檬酸等非特征性成分，这些成分普遍存在各类中药材中，结果如图3-C、D所示。综上，UPLC-Q-TOF-MS定性分析结果表明，微沉淀提取体系可同时检出大黄、牡丹皮特征蒽醌类、丹皮酚、芍药苷等药效成分，化学成分谱较为全面完整，所形成的RMN-SAN真实承载了药对的关键活性物质；反之传统提取仅能获得表儿茶素、没食子酸、琥珀酸等水溶性非特征性成分，导致大黄、牡丹皮关键药效物质大量丢失。成分组成的显著差异直接印证，RMN-SAN是由大黄-牡丹皮真正的活性成分通过自组装形成的纳米聚集体，而RMD-SAN更偏向水溶性小分子的物理聚集，不能代表药对的核心物质基础。 2.5.2  FTIR表征采用FTIR对RMD-SAN与RMN-SAN进行表征，以定性分析自组装过程中的分子间相互作用及体系聚集状态变化。具体方法：将1～2 mg样本与200 mg纯KBr混合。将混合物放入模具中，然后用油压机压成透明的薄片。使用傅里叶变换红外光谱仪对这些薄片进行分析，波数范围为4 000～400 cm−1，分辨率为4 cm−1，扫描次数为32次[20]，结果如图4所示。在3 500～3 000 cm−1羟基伸缩振动区，RMN-SAN的特征峰相较于RMD-SAN更趋平缓且宽化，表明大黄中蒽醌类成分的酚羟基、牡丹皮中芍药苷的糖苷羟基之间形成了分子间氢键，自由羟基数量减少，分子由分散态向缔合态转变。在2 000～1 500 cm−1羰基与苯环骨架振动区，RMN-SAN中羰基（C＝O）及苯环骨架振动峰强度明显降低、峰形趋于平缓，提示大黄蒽醌类的共轭羰基与丹皮酚、芍药苷中的苯环结构之间发生π‑π堆积作用，共轭体系电子云分布趋于平均化。在1 500～500 cm−1指纹区，RMN-SAN与RMD-SAN的谱图差异显著，RMN-SAN特征峰数量减少、峰形更为规整，表明体系由小分子自由分散的分子态转变为多成分有序结合的纳米聚集态。综上，FTIR结果定性证实，大黄与牡丹皮中的活性成分主要通过分子间氢键与π‑π堆积作用驱动自组装，最终形成稳定的纳米聚集体。 2.5.3  UV表征采用紫外全波长扫描表征自组装纳米粒形成机制。取适量RMD-SAN、RMN-SAN样品，分别装入两面透光的比色皿中，用紫外-可见分光光度计测其在190～400 nm的吸收曲线[20]。结果如图5所示，RMN-SAN和RMD-SAN二者吸收峰均集中于300 nm附近，对应大黄蒽醌类（大黄酸、芦荟大黄素）的π→π电子跃迁（蒽醌母核特征吸收区），也涵盖牡丹皮成分（如丹皮酚）的吸收区间，说明检测对象为体系核心活性成分。并且RMD-SAN吸光度峰值（≈5）高于微沉淀（≈4.5），源于成分存在形式的改变：RMD-SAN中成分以“分子分散态”存在，紫外吸收是单个分子独立电子跃迁的叠加；RMN-SAN中成分自组装为纳米粒（聚集态），分子间氢键、π-π堆积削弱了电子跃迁的吸收强度。 此外，RMD-SAN的峰更宽，是因为分子分散态下成分分子与水分子形成不同强度的溶剂化氢键，且单个分子存在多种构。这些“不同溶剂化状态、不同构象”的分子，电子跃迁能量存在细微差异，信号叠加后表现为峰更宽；而RMN-SAN的纳米粒聚集态中，分子通过有序相互作用形成稳定环境，电子跃迁能量分布更集中，因此峰更窄。该图谱峰宽和吸光度的双重差异，直接体现了成分从“分子分散”到“纳米粒聚集”的状态转变，与FTIR结果共同佐证了大黄-牡丹皮成分在微沉淀中发生自组装的结论。 2.5.4  分子对接研究  为从分子水平验证大黄-牡丹皮核心活性成分间的自组装驱动力，采用分子对接技术对RMN-SAN中5种关键成分（大黄酸、芦荟大黄素、丹皮酚、芍药苷、番泻苷B）进行两两对接分析，以结合能及非共价作用类型评价成分间结合能力。采用AutoDock Vina 1.2.3软件对从RMN-SAN中鉴定出的核心活性成分进行对接分析。从PubChem数据库获取各成分3D结构，经AutoDock Tools预处理加氢、添加电荷、定义可旋转键并保存为PDBQT格式；以全覆盖分子表面设置对接网格，穷尽度设为20，计算结合能与分子间作用力；选取结合能最低构象，采用PyMOL与Discovery Studio进行可视化，标记氢键及距离＜0.5 nm的π‑π堆积作用，以结合能与作用力类型评价成分间自组装相互作用[18]。 结果如图6所示，氢键与π‑π堆积为主要结合作用力，与FTIR及UV表征结论一致。各组对接结合能为−5.1～−2.4 kcal/mol（1 kcal/mol＝4.184 kJ/mol），其中大黄酸-芦荟大黄素结合能最低（−5.1 kcal/mol，即−21.34 kJ/mol），结合能力最强，二者可同时形成稳定氢键与π‑π堆积；大黄酸‑番泻苷B、芦荟大黄素-番泻苷B结合能均为−4.2 kcal/mol（−17.57 kJ/mol），属于中等强度结合；含丹皮酚的组合结合能普遍偏弱（−3.3～−2.4 kcal/mol）。分子对接结果从分子间作用力层面证实：大黄蒽醌类成分之间、蒽醌类与番泻苷B之间可通过强氢键与π‑π堆积优先组装，是RMN-SAN形成稳定纳米结构的核心分子基础；芍药苷、丹皮酚则通过弱相互作用参与组装，起到稳定与协同作用。该结果为自组装机制提供了直接的分子模拟证据。 2.6  体外抗CRC药效学作用 2.6.1  细胞毒性作用研究  将CT26细胞以8 000个/孔的密度接种于96孔板中，过夜贴壁后移除旧的培养基，分别加入不同质量浓度的RMN-SAN和RMD-SAN样本（质量浓度15.0～90.0 mg/mL，以生药量计），对照组给予等量不含药培养基。37 ℃培养箱中孵育24 h后，实验终点，移除培养基，并向每个孔中加入含10 μL CCK-8溶液的培养基。在37 ℃孵育2 h后，使用多功能酶标仪测定细胞活力[21]。结果如图7所示，给药48 h后，对照组CT26细胞密度超过90%，说明CT26细胞状态良好且处于对数生长期。给药后，RMD-SAN和RMN-SAN对CT26的毒性作用随着浓度的增加而增强，其细胞密度在质量浓度≥22.5 mg/mL后具有明显的细胞毒性。与RMD-SAN［半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）＝46.7 mg/mL］相比，RMN-SAN（IC50＝30.0 mg/mL）对CT26有更显著的杀伤作用，其细胞密度在质量浓度≥45.0 mg/mL后显著降低且形态更圆（大量漂浮，接近死亡状态），推测这样的现象是因为RMN-SAN由大量粒径小于200 nm的自组装纳米粒子组成，更容易被肿瘤细胞摄取而发挥更强的肿瘤细胞杀伤作用。 同时，使用细胞活/死染色试剂盒评估RMN-SAN和RMD-SAN样本对癌细胞的毒性作用。Calcein-AM是一种常用于活细胞荧光标记的染料，能发出绿色荧光，可以穿过活细胞膜。一旦进入细胞，Calcein-AM（在未被激活时不发荧光）会被细胞内的酯酶水解，转化为极性分子Calcein，这一转化使其无法穿透细胞膜，从而被滞留在细胞内并发出明亮的绿色荧光。 碘化丙啶（propidine iodide，PI）不能穿透完好的活细胞膜，仅能穿过死细胞膜的破损区域，进入细胞核并结合DNA，从而发出红色荧光。因此，PI可用于标记死细胞。根据上述原理，取对数期CT26细胞以8 000个/孔的密度接种于96孔板中，将质量浓度为30.0 mg/mL（以生药量计）的RMN-SAN和RMD-SAN溶液分别和CT26细胞共孵育24 h后，弃去培养基，使用PBS轻柔洗涤2遍后，每孔加入100 μL Calcein AM/PI检测工作液，37 ℃避光孵育30 min后于荧光显微镜下观察拍照（AM为绿色荧光，标记活细胞；PI为红色荧光，标记死细胞），整个过程注意避光操作[22]。结果如图8所示，当质量浓度为30.0 mg/mL时，RMN-SAN对CT26细胞的杀伤作用显著强于RMD-SAN。 2.6.2  对细胞凋亡的影响  将CT26细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔板中，贴壁过夜后弃去旧培养基，将质量浓度为30 mg/mL（以生药量计）的RMN-SAN和RMD-SAN溶液分别和CT26细胞共孵育24 h后，小心吸取细胞培养液转移至干净离心管后，加入胰蛋白酶消化细胞，在1 000×g、4 ℃下离心5 min；然后用移液器小心吸除上清后，加入约1 mL 4 ℃预冷的1×PBS缓冲液重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清；用1×结合缓冲液重悬细胞，将细胞密度调节至1～5×105个/mL；取100 μL的细胞悬液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin-V/FITC，用移液器轻柔吹吸混匀，室温避光孵育5 min；加入10 μL PI，并加400 μL 1×PBS缓冲液，1 h内用FCM检测细胞凋亡情况[23]。 结果如图9和表6所示，30 mg/mL的RMD-SAN处理CT26细胞24 h后，可使（90.84±0.76）%的细胞发生凋亡［早期凋亡率（87.02±0.02）%、晚期凋亡率（3.82±0.02）%］；而RMN-SAN处理CT26细胞24 h后，可使（99.96±0.04）%的细胞发生凋亡［早期凋亡率（16.71±0.04）%、晚期凋亡率（83.25±0.04）%］，表明RMN-SAN具有更强效的CT26细胞凋亡诱导作用。 2.6.3  对细胞周期的影响  将CT26细胞分别以5×105个/孔的密度接种于6孔板中，贴壁过夜后弃去旧培养基，将质量浓度为30 mg/mL（以生药量计）的RMN-SAN和RMD-SAN溶液分别和CT26细胞共孵育24 h后，弃上清，用胰蛋白酶消化细胞，预冷PBS将细胞洗涤2次，然后在1 000×g下离心5 min，小心吸除上清（可以残留约50 μL），轻弹离心管以适当分散细胞，避免细胞成团。加入1.2 mL的−20 ℃无水乙醇，充分混匀后置于−20 ℃冰箱中过夜；300×g离心5 min，弃上清，加入1 mL的PBS重悬细胞，室温放置15 min；300×g离心5 min，弃上清，加入100 μL的RNase A Reagent并充分悬浮细胞，37 ℃水浴30 min；加入400 μL的PI Reagent（50 μg/mL）并充分混匀，2～8 ℃避光孵育30 min后于FCM测定[24]。结果如表6和图10所示，30 mg/mL的RMN-SAN处理CT26细胞后能增强性诱导细胞G1期阻滞。由于对G1期的阻滞增强，导致G2期的细胞数量减少，从而更加显著地降低CT26细胞的增殖速率。 2.6.4  对细胞迁移的影响  使用细胞划痕实验评估RMN-SAN和RMD-SAN样本对细胞迁移能力的影响。将CT26细胞以合适的密度接种于6孔板中，培养细胞至单层融合度为80%左右，使用无菌200 μL移液枪头在细胞中央垂直划线，形成划痕。轻轻用PBS清洗2次，以去除刮离的细胞碎片。使用含血清培养基，分别配制质量浓度为30 mg/mL（以生药量计）的RMN-SAN和RMD-SAN溶液处理细胞，含血清培养基处理组作为对照，将细胞培养于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中，分别在0、12、24 h使用显微镜拍摄细胞划痕区域的图像，比较不同处理组之间的细胞迁移能力[25]。结果如图11所示，RMN-SAN处理12、24 h后，CT26细胞的愈合率分别为15.75%、20.61%，而RMD-SAN的愈合率为29.42%、45.72%。划痕后愈合率越低，其对肿瘤细胞的迁移抑制率越强。该结果证实，RMD-SAN和RMN-SAN能有效抑制CT26细胞的迁移，但RMN-SAN迁移抑制作用更优于RMD-SAN。 2.7  体内抗CRC药效学作用 2.7.1  造模小鼠适应性喂养后，通过在小鼠一侧前肢腋部皮下接种CT26细胞，并构建CRC皮下移植瘤模型。具体操作：选取对数生长期的CT26细胞，消化后制成单细胞悬液，密度为1×108个/mL，于每只小鼠一侧前肢腋窝处注射100 μL的细胞悬液。待肿瘤体积增长至50～100 mm3，将小鼠随机分组后开始实验[26]。 2.7.2  分组及给药  荷瘤小鼠随机分为模型组、阳性组［5-氟尿嘧啶，20 mg/(kg∙d)］、RMD-SAN组［3.0 g/(kg∙d)］、RMN-SAN低剂量组［1.5 g/(kg∙d)］、RMN-SAN中剂量组［3.0 g/(kg∙d)］和RMN-SAN高剂量组［（6.0 g/(kg∙d)］6组，每组6只。实验组小鼠隔日ig给药；模型组小鼠每日ig给予等体积生理盐水，阳性组ip给药。给药7次后进行动物标本取材，检测[27]。 2.7.3  移植瘤体积与体质量测量  实验期间定期测量小鼠瘤体的长径（a）和短径（b），测量频率为2 d/次。每次测量后，依据公式肿瘤体积＝ab2/2计算移植瘤的体积[28]。给药结束后剥离肿瘤组织，测定肿瘤的最终体积，并拍照记录，直观地展示抗CRC疗效，结果如图12和表7所示。首次给药治疗时，各组小鼠肿瘤体积无显著性差异（P＞0.05），表明分组恰当。之后，模型组小鼠肿瘤体积随时间变化迅速增长。与模型组相比，各实验组小鼠肿瘤均得到了抑制。RMN-SAN高剂量组、RMN-SAN中剂量组和阳性组抑制效果较为明显。尤其是最后一次治疗后，RMN-SAN高剂量组小鼠肿瘤体积为（334.31±42.10）mm3，显著低于模型组小鼠肿瘤体积［（1 405.22±240.75）mm3，P＜0.05］，表明高剂量的RMN-SAN对CRC荷瘤小鼠具有明确的抑瘤作用。同时，对小鼠体质量进行监测，结果如表8所示。首次给药治疗时，各组小鼠体质量无显著性差异（P＞0.05），表明分组恰当。模型组、RMD-SAN组和RMN-SAN低剂量组荷瘤小鼠体质量自治疗第5天起明显降低；而RMN-SAN高剂量组和阳性组体质量，在给药后13 d内均呈显著增加（P＜0.05、0.01），表明RMN-SAN能够有效改善荷瘤小鼠的身体状况。 2.7.4  动物取材  完成给药后，采用1%戊巴比妥钠麻醉并处死小鼠，收集小鼠血液，离心后取血清，并通过ELISA法测定白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、γ干扰素（interferon γ，IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-6用以分析RMN-SAN的抗CRC效果[28]。结果如表8所示，RMN-SAN通过上调TNF-α、IFN-γ等抗肿瘤细胞因子水平，同时下调IL-1β、IL-6等促肿瘤炎症因子的表达（与模型组相比具有显著性差异，P＜0.05、0.01、0.001）进而发挥抗CRC作用。其作用趋势与图12和表7相符。 2.8  统计分析 通过SPSS 21.0软件将均匀设计的结果进行多种回归分析，求得多元回归方程。使用Student’t检验来分析2组数据之间的差异，实验数据用表示，采用单因素方差比较分析；多组间两两比较采用最小显著性差异（LSD）法检验[18]。 3  讨论 中医药现代化的核心命题之一，是通过现代科学技术解码传统配伍的智慧，实现疗效与制剂质量的双重提升。中药自组装纳米粒作为天然形成的“多成分载体”，其结构与功能天然契合中医“多成分、多靶点”的治疗特点，已成为中药制剂创新的重要方向[14,29]。本研究以大黄-牡丹皮药对为对象，通过微沉淀法改良制备工艺，构建RMN-SAN并从工艺逻辑、组装机制、药效价值3个维度展开深入分析，结合现有研究成果探讨其科学内涵与未来方向，以期为中药纳米制剂的开发提供更具深度的参考。传统煎煮法是中药制剂的经典工艺，但其“一锅煮”的模式易导致有效成分溶出不完全、纳米粒聚集不均，本质上未能充分释放药对“相须为用”的配伍潜力。本研究筛选的微沉淀法，通过“水提-醇提-除醇”的分步策略，实现了制剂质量的显著提升，其工艺逻辑具有科学依据：水相提取优先溶出大黄蒽醌、芍药苷等极性活性成分，醇相提取则促进丹皮酚等中等极性成分释放，二者协同使药对中各类型成分充分暴露，为“相须”发挥疗效提供更全面的自组装物质基础[9]。后续旋转蒸发除醇过程调节体系极性，恰好模拟了中药配伍的动态平衡，推动成分通过非共价作用有序聚集，最终形成粒径均一、稳定性强的纳米粒。值得注意的是，微沉淀法制备的RMN-SAN经透析后粒径为（109.30±4.20）nm，集中于100～200 nm的最佳粒径区间，显著优于传统煎煮法与单纯醇提法。这一结果证实，工艺改良并非对传统的否定，而是通过现代技术手段，让中医配伍的“协同效应”在纳米尺度下得到更精准的实现[30]。 中药自组装纳米粒的形成并非成分的随机聚集，而是基于成分结构特性的选择性相互作用，这一过程与中医“药有个性之特长，方有合群之妙用”的配伍理论高度契合[31]。本研究通过UPLC-Q-TOF-MS鉴定出RMN-SAN中的5种核心成分，涵盖大黄蒽醌类、二蒽酮苷类及牡丹皮单萜类、单萜苷类，其结构特性为自组装提供了分子基础：大黄酸、芦荟大黄素的酚羟基与芍药苷的糖苷羟基形成分子间氢键，大黄蒽醌的共轭羰基与丹皮酚、芍药苷的苯环结构发生π-π堆积，这2种非共价作用共同驱动了纳米粒的形成。该类作用力虽相对温和，但可通过多位点协同作用显著提升组装体的结构稳定性。FTIR与UV光谱的特征变化均预示了这一机制。值得注意的是，本研究未出现新的化学键特征峰，表明该自组装属于弱相互作用驱动的物理聚集，而非化学结构改变，这更贴近中药汤剂天然自组装的真实状态，也为其体内温和的、多成分协同起效的治疗模式提供了合理解释[32]。 分子对接结果从分子水平直观证实大黄酸、芦荟大黄素、番泻苷B可形成强结合构象，与FTIR、UV结果相互印证，共同阐明自组装分子机制。此外，体内外药效结果显示，RMN-SAN可浓度相关性抑制CT26细胞增殖、诱导凋亡并将细胞阻滞于G1期，同时显著抑制细胞迁移；且高剂量组抑瘤效果显著优于传统煎煮组，且可上调IFN‑γ、TNF‑α表达，下调IL‑1β、IL‑6表达。上述趋势均与纳米粒更小、更易被细胞摄取的理论相符。 尽管本研究取得了阶段性成果，但仍存在一定局限性。其一，成分鉴定仅聚焦于5种特征化合物。RMN-SAN中可能还存在其他参与自组装与抗肿瘤作用的微量成分，需进一步通过非靶向代谢组学技术全面解析。其二，抗CRC作用机制的研究尚未深入到分子靶点层面。RMN-SAN如何调控凋亡、周期、迁移相关信号通路，如磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路（phosphatidylinositol 3-kinase/ protein kinase B signaling pathway，PI3K/Akt）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）等，仍需后续验证。其三，体内实验仅采用皮下移植瘤模型，未考察其对CRC转移模型的治疗效果，且缺乏长期毒性评价数据。其四，本研究尚未开展独立的RMN-SAN体外释放行为或溶出评价。 与单一化学药物不同，中药自组装纳米粒是由多种活性成分通过氢键、π-π堆积等非共价作用形成的超分子聚集体，其体内药效的发挥更倾向于“纳米粒整体摄取‑胞内逐步解离‑多成分协同作用”的递药模式。研究表明，蒽醌-多酚类自组装体的解离速率受pH值、离子强度及酶环境调控。传统透析法测得的累计释放率难以区分游离成分与纳米结合态，且单一指标无法反映多成分的同步释放行为，目前，尚缺乏适用于中药自组装纳米粒的标准释放评价方法。 针对上述局限性，未来研究可从以下方向展开：一是采用qRT-PCR、Western blotting、免疫荧光等技术，深入阐明RMN-SAN中核心成分协同抗CRC的分子机制；二是构建CRC原位移植瘤与转移模型，系统评价其体内靶向性与长期治疗效果；三是建立基于荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）或LC-MS/MS多组分同步检测的释放测定方法，并结合荷瘤小鼠的药动学研究，系统阐明RMN-SAN的体内释药规律与作用模式；四是开展RMN-SAN制剂的长期毒性评价，为其临床转化提供更全面的科学依据。同时，可基于中医辨证论治思想，针对不同证型的CRC患者，优化RMN-SAN的成分比例，实现“个体化制剂”的开发，让传统中医理论与现代纳米技术的结合更为紧密。 综上，本研究通过工艺改良构建的RMN-SAN，不仅实现了制剂质量与药效的双重提升，更重要的是揭示了“中医理论-工艺优化-组装机制-药效价值”的内在逻辑关联：工艺改良是手段，核心是通过现代技术释放中医配伍的协同潜力；自组装机制是桥梁，将中药成分的结构特性与中医“相须为用”的理论内涵相连接；药效价值是目标，实现了多成分协同抑瘤、调节免疫炎症、改善机体状态的整体效应。这一研究模式为中药纳米制剂的开发提供了新的范式，即“以中医理论为指导，以工艺优化为突破，以现代技术为支撑，以临床价值为导向”，最终推动中医药从“经验医学”向“精准医学”的跨越。未来，随着研究的不断深入，中药自组装纳米粒有望成为中西医结合治疗肿瘤的重要载体，为中医药的现代化与国际化提供更坚实的科学依据。 利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突 参考文献（略） 来  源：李  杰，薛亮亮，刘汉静，陈士林．大黄-牡丹皮新型自组装纳米粒的构建及其抗结直肠癌作用  [J]. 中草药, 2026, 57(13): 5002-5016. END 文章内容仅供思路参考，不代表本刊观点，非中医药专业人员请勿试药 文章来源：中草药杂志社，本草全球转载仅为传播行业信息，不做商业用途。若转载不当，请联系：28331285@163.com删除，感谢原作者的辛劳付出。文中插入广告与本公众号无关。 本草全球服务内容  包括但不限于:  中药新药、经典名方、配方颗粒、中药CMC、美国FDA IND、中药保护品种临床试验申报、中药上市再评价、药物经济学评价、新药研发及中药类注册备案全过程咨询与委托服务;可为有关单位疑难问题提供解决方案与技术支持、开展内训等服务。凡提交至本草全球的疑难问题,均可协助解决。  联系人:田先生 13801667235

文献简介 2026 年6月，上海中医药大学葛广波、邹立伟、金强团队在Biosensors and Bioelectronics（IF=11.8）发表题为Rational engineering of a large stokes shift fluorogenic sensor for sensing Notum in living systems and inhibitor screening的研究论文。 Notum是丝氨酸水解酶，负责调控 Wnt/β-catenin 通路，其异常激活与结直肠癌（CRC）发病密切相关。本研究基于半花菁荧光母核理性设计、迭代优化得到高性能荧光传感器 Oc-HNBI；该探针具备高选择性、快响应、大斯托克斯位移（142 nm）、高量子产率优势，可实现细胞、肿瘤组织、活体小鼠多维度 hNotum 原位荧光成像；依托该探针建立高通量筛选体系，从天然产物中筛选得到番泻苷A，证实其为强效hNotum竞争性抑制剂，体内动物模型验证其显著抗结直肠癌活性，为Wnt通路相关肿瘤诊断工具开发与天然抗肿瘤药物研发提供全新工具与候选分子。 研究思路 1.理性设计、筛选最优 hNotum 荧光传感器 Oc-HNBI荧光母核筛选：设计合成 8 种半花菁荧光骨架，综合吸收发射光谱、斯托克斯位移、荧光量子产率筛选HNBI作为报告基团；酶识别底物优化：结合hNotum晶体结构与催化口袋特征，合成 9 条不同酯链修饰的HNBI衍生物；通过分子对接、分子动力学、酶活动力学实验筛选出Oc-HNBI；体外分析性能验证：Oc-HNBI仅被 hNotum 特异性水解，对其他水解酶选择性≥30倍；线性检测范围0–0.125 μg/mL，米氏动力学符合经典米氏方程；生物体系内氨基酸、金属离子无明显干扰，细胞毒性极低，适用于活细胞检测。 2.Oc-HNBI 实现多场景活体 hNotum 原位荧光成像：细胞与3D肿瘤球成像：可清晰标记SW620结直肠癌细胞、3D细胞球内hNotum活性，荧光信号可被已知hNotum抑制剂剂量依赖性抑制，时空分辨率优异；组织切片成像：可区分人结直肠癌、子宫内膜癌病变组织与正常组织，肿瘤区域荧光显著更强；活体动物成像：SW620 荷瘤裸鼠尾静脉给药后，肿瘤部位特异性荧光富集，抑制剂预处理可显著降低肿瘤荧光，实现活体无创可视化 hNotum 活性。 3.基于 Oc-HNBI 建立高通量筛选平台，发现天然抑制剂番泻苷 A：筛选体系搭建：以商业化抑制剂ABC99、LP922056为阳性对照，建立稳定荧光高通量筛选方法；天然产物筛选：对118种天然产物（生物碱、黄酮、蒽醌等）进行筛选，得到活性分子番泻苷A；抑制机制：番泻苷A为 hNotum竞争性抑制剂，IC₅₀=123.0±13.92 nM，Ki=108.5 nM；分子对接显示其通过与His389发生π-π堆叠、与 Glu125 形成氢键结合酶活性中心；肝微粒体代谢稳定性优于多数天然小分子。 4.体内动物模型验证番泻苷A抗结直肠癌药效与安全性：荷瘤小鼠药效：低 / 高剂量腹腔注射番泻苷A可剂量依赖性抑制SW620异种移植瘤生长，显著降低肿瘤体积与重量；组织分布：药物主要富集于肿瘤与肾脏，给药后4 h肿瘤内仍维持有效暴露浓度；生物安全性：给药期间小鼠体重无明显下降；心、肝、脾、肺、肾主要脏器H&E染色无病理损伤；肿瘤组织Ki67增殖标记显著下调，肿瘤细胞大量凋亡，无明显系统毒性。 示例图1. hNotum 荧光传感器的设计与整体应用研究示意图 图1. Oc-HNBI人源Notum荧光传感器的构建与体外性能表征 图2. 共聚焦显微成像检测三维肿瘤球与人结直肠癌切片中hNotum活性 图4. 天然hNotum抑制剂筛选及番泻苷A体内抗结直肠癌药效与安全性研究 文献总结 现有 hNotum 荧光探针存在发射波长短、成像分辨率低、背景干扰大等缺陷。本研究通过对半花菁荧光母核与酶识别位点协同优化，开发出大斯托克斯位移多功能荧光传感器 Oc-HNBI，可在细胞、组织、活体动物中动态可视化 hNotum 酶活性，弥补现有工具成像短板。依托该探针建立高通量筛选平台，首次发现天然产物番泻苷A为强效hNotum竞争性抑制剂，体外酶学、细胞实验、体内荷瘤模型均证实其良好的抗结直肠癌活性与生物安全性。 该研究不仅提供了一款可用于Wnt通路机制研究、肿瘤早期荧光诊断的高性能分子工具，同时为靶向Notum的天然抗肿瘤先导化合物开发奠定理论基础；后续将拓展临床原代肿瘤样本验证，并进一步优化抑制剂体内成药性。 文献链接 原名：Rational engineering of a large Stokes shift fluorogenic sensor for sensing Notum in living systems and inhibitor screening 译名：大斯托克斯位移荧光传感器构建用于活体Notum 检测及抑制剂筛选 DOI：10.1016/j.apsb.2025.10.012 期刊：10.1016/j.bios.2026.118544 IF：11.8 发表时间：2026年 通讯作者：葛广波、邹立伟、金强 文字：陈滢如 编辑：董海都 扫描二维码获取 更多精彩 神农尝道