Polyethylene glycol 3350

摘要长期以来，补体一直被视为先天免疫的重要效应系统，参与介导宿主防御与组织稳态。但持续增多的证据表明，补体在诸多基础生物学过程中同样发挥广泛作用，其功能边界早已超出传统的先天免疫范畴。补体在细胞外与细胞内空间均可与多条模式识别及信号传导通路发生复杂的串扰。除调节宿主—病原体互作外，这种串扰还可引导早期发育过程与不同的细胞命运轨迹，从而在不同生理系统中塑造组织的免疫代谢与再生程序。该文旨在为补体的系统性功能提供一份指南，重点呈现若干具有代表性的范式转变，这些转变重塑了研究者对补体病理生物学的理解，并以进化、中枢神经系统发育、组织再生及肿瘤免疫等领域为例加以阐释。尽管补体激活受到严格的时空调控，但这一过程仍可能发生偏离，进而驱动炎症性组织病理损伤。补体在疾病病理生理中的广泛参与，促使补体治疗学再度兴起，并带来一系列重大的临床进展，其中部分进展甚至挑战了长期以来的既有观点。因此，研究者进一步概述了补体临床干预中的主要治疗理念与关键里程碑。 引言 “唯一不变的，唯有变化”——Heraclitus of Ephesus 补体系统是先天免疫中一种反应迅速且高度多能的蛋白互作平台，可通过组装形成效应复合体，以应对无菌性或感染性炎症刺激。该系统作为高度保守的免疫“哨兵”，在广泛的病理生理情境下可与多种炎症回路相互交织并发挥作用。补体蛋白参与维持组织稳态，并对种类繁多的病原体实施免疫监视。补体还是最古老的先天免疫系统之一，在进化过程中广泛存在，其起源早于哺乳动物与人类，至少可追溯至9亿多年前。传统观点认为，补体主要与促进病原体吞噬清除、清除免疫复合物以及清除凋亡细胞碎片等过程相关；而如今，人们已认识到补体是一种全系统层面的生物学过程调控者，其作用范围超越了经典先天免疫学的边界。该文聚焦于补体生物学的新见解与范式转变，这些进展重塑了研究者对补体的认识，并为多种致残性人类疾病带来创新治疗策略的新机遇——在这些疾病中，补体失调在致病机制中具有关键作用。 补体系统概述 复杂蛋白水解级联中的蛋白互作 补体系统由50余种可溶性或膜结合的糖蛋白组成，这些成分参与多层级的蛋白—蛋白互作，进而促成酶复合物的组装与激活，并产生具有生物活性的裂解片段；这些片段通过与补体受体及调控因子结合，引发多样化的细胞反应（图1）。上述互作可促进微生物的先天识别或“改变的自我”识别（分别指微生物相关分子模式〔MAMP〕与损伤相关分子模式〔DAMP〕的识别）、调理与吞噬反应、炎症及免疫调节功能，并在不同组织中通过细胞外以及细胞内区室的串扰机制发挥作用。补体激活通过一条精细调控的蛋白水解反应级联推进，其初始环节涉及可溶性模式识别分子，随后促成由多蛋白组成的酶复合物——C3转化酶与C5转化酶——的组装。上述蛋白水解反应释放的生物活性片段可在表达补体受体的细胞上介导广泛的生物学功能（图1）。 补体系统可通过三条途径被激活——经典途径、替代途径与凝集素途径——其启动机制各不相同，但在多个关键节点相互沟通并汇合。每条途径的启动均依赖特异的模式识别步骤：经典途径由C1q与已结合其抗原的免疫球蛋白Fc段结合而触发；凝集素途径通过可溶性模式识别分子（如甘露糖结合凝集素、collectin或ficolin）与细菌或真菌细胞壁上的糖类特征结构结合，或与发生改变的宿主细胞上的损伤相关配体结合而被激活；替代途径既可由MAMP触发，也可由液相中C3在稳态条件下的自发水解（称为C3 tick over）所启动。后者使该途径维持在低水平持续激活状态，形成初始的替代途径C3转化酶，并使效应反应能够在靶表面实现快速放大。 基于冷冻电镜与X射线晶体学的研究阐明了活化的C1复合体C1q(C1s)₂(C1r)₂及其Fc结合组分C1q识别免疫复合物所依赖的关键结构决定因素。发现C1q可“锁扣”于由抗体分子之间相互的Fc–Fc作用稳定形成的六聚体抗体平台，这不仅揭示了经典途径模式识别的分子基础，也推动了基于改造抗体骨架的新一代生物治疗制剂研发：通过增强经典途径激活，提高针对肿瘤细胞的补体依赖性细胞毒作用。 无论初始触发因素为何，三条补体途径最终均汇聚于C3转化酶对循环中含量最丰富的补体蛋白C3的蛋白水解裂解（图1a）。C3激活会诱导其构象重排，生成两段裂解产物，其中较大的片段为调理素C3b，可在微生物等靶表面形成“标记”。C3b的调理作用依赖其暴露的硫酯键与靶表面上的氨基或羟基基团发生共价结合。与此同时，生成的较小C3裂解片段称为C3a过敏毒素，在免疫细胞与非免疫细胞中均具有多样的免疫调节功能。C3b在靶表面高密度簇集沉积可促进C5转化酶的组装；该复合体负责对C5进行蛋白水解裂解。C5激活产生具有强免疫调节效应的过敏毒素C5a，以及C5b；后者启动由多蛋白逐步组装而成、可穿孔细胞膜的C5b–C9复合体，即膜攻击复合物（MAC）。 图1｜补体级联反应的总体概览：拓扑结构、调控与关键效应功能 a，该图展示了补体反应在启动、放大与调控过程中涉及的主要蛋白—蛋白互作，以及其下游效应功能。图中同时呈现经典（canonical）与非经典（non-canonical）激活途径，包括补体驱动的关键互作在细胞外与细胞内空间的发生。经典激活经由经典途径、凝集素途径与替代途径进行，包含不同的模式识别起始步骤以及蛋白底物的序贯激活，最终形成多蛋白酶复合体——C3转化酶与C5转化酶。C3与C5转化酶分别裂解C3与C5，生成其具有生物活性的片段。非经典补体激活由凝血级联、接触激活级联与纤溶级联中的外源性丝氨酸蛋白酶介导，这些蛋白酶可裂解C3、C5与因子B，从而绕过传统转化酶的作用。此外，还存在若干与经典途径并行的“旁路（bypass）”通路，为组织免疫监视提供关键的信号冗余。下游信号传导涉及C3片段与过敏毒素与免疫细胞上表达的补体受体互作，从而引发广泛的免疫调节与效应功能。b，补体网络向多种细胞类型的细胞内空间延伸，揭示其与模式识别、免疫代谢以及炎症过程之间存在关键互作，这些互作在健康与疾病中共同塑造细胞命运决策。 Abbr：C1-INH，C1酯酶抑制剂；C4BP，C4b结合蛋白；CPN，羧肽酶N；CR，补体受体；CRIg，免疫球蛋白超家族补体受体；CTSL，组织蛋白酶L；DAF，衰变加速因子；desArg，去精氨酸化（脱去末端精氨酸）；FB，因子B；FD，因子D；FH，因子H；FHRs，因子H相关蛋白；FI，因子I；FP，备解素（properdin）；MASP，甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶；MBL，甘露糖结合凝集素；proFD，因子D前体（pro-factor D）。 非经典激活途径 补体激活也可通过非经典方式发生，即不依赖转化酶、以转化酶非依赖性（convertase-independent）的形式启动。激肽释放酶–激肽系统、凝血级联与纤溶级联中的多种蛋白酶（如纤溶酶、凝血酶、激肽释放酶以及凝血因子IIa、Xa和IXa）可裂解C3、C5或因子B，从而生成相应片段；这些片段既可能进一步组装成功能性C3转化酶，也可能直接参与下游效应反应（图1a）。组织富集型蛋白酶（如肾素）亦可通过裂解C3并生成C3a与C3b而促进非经典补体激活。事实上，某些能够裂解补体的酶具有组织“嗜性”（tropism），可能在与补体失调相关的肾小球疾病（如C3肾小球病）中形成重要的放大机制。此外，可能由凝血蛋白酶驱动的非经典C3激活途径，被认为与部分重症COVID-19患者的显著血栓—炎症（thrombo-inflammation）表型相关。进一步增加复杂性的是，溶酶体酶（如组织蛋白酶L）可在细胞内裂解C3，从而参与非经典补体激活途径（图1b）。近期研究还显示，接触激活途径可通过“活化的因子XIa裂解并中和替代途径调控蛋白因子H”的机制调节补体活性。此外，中性粒细胞来源或细菌来源的丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶（分别如弹性蛋白酶与gingipain）亦可裂解C3和C5，生成具有生物活性的片段。上述绕过转化酶的通路（convertase-bypass pathways）被认为可作为独立机制或放大机制促进补体激活。然而，其生理学相关性仍高度依赖具体情境，需结合疾病病理生理进行评估。例如，近期研究对凝血酶裂解天然C5的能力提出了质疑，显示该裂解仅在使用纯化C5蛋白且C5在pH依赖性构象改变后才会发生。 通路功能可塑性 除上述外源性补体激活途径外，补体三条主要启动途径之间还存在功能可塑性与“泄漏”（leakage）。凝集素途径与替代途径可通过共享酶介导的串扰而汇合，这些酶能够裂解任一途径的蛋白底物。以凝集素途径蛋白酶甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶3（MASP3）为例，其可激活前体因子D（pro–factor D），生成活性酶，进而介导替代途径C3转化酶C3bBb的形成（图1a）。此外，已有研究描述一种“MBL依赖的C2旁路途径”（C2-bypass pathway），该途径可支持由替代途径介导的C3激活，提示在某些补体缺陷状态（如C2或C4缺陷）下可能存在功能性代偿。类似地，肾缺血损伤后，collectin 11与受损肾小管细胞表面暴露的L-岩藻糖结合增强，可触发凝集素途径，并通过MASP2依赖性机制直接裂解C3，且该过程不依赖C2或C4。经典途径与替代途径之间亦被提示存在功能冗余：通过一种C2旁路机制形成“杂合型经典途径C3转化酶”，其中C2可被因子B所替代。尽管上述体外观察提示在三条途径交界处可能存在多种旁路机制，但仍需进一步在体内验证。 对转化酶形成机制的挑战 近年来，关于C3与C5激活过程中转化酶如何组装的传统认识受到挑战：有研究提示，三聚体C5转化酶（C3bBb3b）并非C5激活的必需前提。确实，在某些有利于强烈补体激活、并促使C3b或C4b在靶表面大量沉积的条件下，C5激活可通过一种“C3旁路”（C3 bypass）推进：高密度的C3b或C4b可使C5形成一种构象偏向状态，类似被“预激活”（primed）的C5。该“预激活”C5可能通过被C4b2b与C3bBb转化酶裂解而参与MAC形成，或直接采取一种类似C5b的构象从而促进MAC组装。尽管旁路机制在多大程度上驱动疾病病理生理仍不明确，这些机制性见解可能有助于解释：部分接受抗C5治疗的患者在遭遇强补体激活触发因素（如急性感染）时，仍会出现“突破性溶血”（breakthrough haemolysis）。此外，这些发现还提示：要获得抗补体治疗的充分疗效，未必需要将补体活性完全关闭；并且，在药理性抑制补体期间，旁路机制可能维持基础水平的补体活性以支持组织免疫监视，从而在一定程度上降低感染风险。 阐明补体通路与组分的系统发育轨迹，不仅展示了这一关键先天免疫系统的进化保守性（框1），也为理解其核心组分的模块化结构及其多样化互作奠定基础。在此方面，对补体蛋白的进化研究极大推动了蛋白结构解析工作，并为设计靶点特异性与物种特异性的抑制剂提供了重要依据。 补体的关键机制与功能要点 研究者概述补体生物学中的关键机制特征与概念性突破，重点强调其在先天免疫与适应性免疫交界面所发挥的稳态维持与免疫调控功能，以及控制补体激活幅度的调节机制。关于补体生物学更为详尽的阐述，可参见多篇系统性综述文献。 补体蛋白一项高度保守的功能，是能够感知并中和以“外源性非生物压力”（如生物材料）或“外源性生物压力”（如病原体）形式出现的潜在威胁，或来源于宿主自身但发生改变/患病的细胞。补体调理素C3与C4可结合于上述表面，从而对其进行标记，提示吞噬系统予以清除。所谓“调理作用”（opsonization），是指C3b或C4b与靶表面发生共价结合，继而触发表达β2整合素家族补体受体的吞噬细胞（如单核细胞、巨噬细胞与中性粒细胞）对这些被调理的表面进行结合与吞噬。该类受体包括CR3（亦称Mac-1，由CD11b与CD18链构成）与CR4（由CD11c与CD18链构成）。对iC3b或C3b包被的异物颗粒及细菌的吞噬，还可由另一种吞噬性补体受体完成，即免疫球蛋白超家族补体受体（CRIg）；该受体主要由肝脏驻留巨噬细胞（Kupffer细胞）表达。补体对细菌细胞的调理不仅指导吞噬细胞在血管内清除循环中的微生物，还可通过C3与自噬相关蛋白16样蛋白1（ATG16L1）的直接互作启动自噬，从而促进对侵袭性细菌的摄取与清除。 除介导吞噬外，CR3、CR4与CRIg等补体受体还承担重要的免疫调控功能。CR1（亦称CD35）被视为介导免疫复合物清除的原型受体：它通过与表达CR1的红细胞结合，促使C3b或C4b包被的免疫复合物附着于红细胞表面；随后，这些携带免疫复合物的红细胞被转运至肝或脾，由巨噬细胞吞噬处理。CR1还具有补体调控活性：一方面可加速C3与C5转化酶的衰变（decay），另一方面可作为丝氨酸蛋白酶因子I裂解C3b或C4b的辅因子。在这一意义上，CR1可调节个体对某些溶血性疾病、自身免疫性疾病或感染性疾病的易感性。例如，在吞噬过程中红细胞表面CR1可能因蛋白水解剪切与脱落而下降，从而导致免疫复合物清除受损、红细胞表面补体沉积失衡，进而增加自身免疫或疟疾相关并发症风险。CR1促进红细胞凝集并作为恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）进入红细胞的受体的能力，也可能参与其在相关疾病中的免疫调节作用。全基因组关联研究已将CR1的某些遗传变异与晚发型阿尔茨海默病易感性联系起来，但其在疾病病理生理中的精确功能仍未明晰。 CR2（亦称CD21）主要表达于B细胞、滤泡树突状细胞以及少量T细胞亚群。长期以来，CR2被认为是C3裂解片段（iC3b、C3dg与C3d）的同源信号受体，同时也是连接抗原呈递细胞与B细胞界面、桥接先天与适应性免疫反应的信号枢纽。20世纪90年代末的研究确立：当抗原与多个C3d拷贝结合时，可诱导CR2与B细胞受体（BCR）信号复合体发生共连接（co-ligation）；该复合体包括BCR及其信号伴侣CD19与CD81。CR2的参与可通过增强细胞内Ca²⁺通量并促进B细胞增殖，从而降低B细胞激活阈值。CR2作为“分子佐剂”增强对T细胞依赖性抗原的体液免疫应答，这一点在小鼠模型中反复得到验证，但在人类系统中仍存在争议。 在滤泡树突状细胞表面，CR2可捕获并保留与C3配体结合的抗原，从而可能延长其与生发中心B细胞的互作，促进抗体亲和力成熟与免疫记忆形成。此外，CR2信号还参与维持对自身抗原的免疫耐受；该受体的功能异常变体已被认为可能构成自身免疫性病理发生的易感因素。近期研究还显示，边缘区B细胞可通过一种称为“啃噬作用”（trogocytosis）的过程，从常规树突状细胞表面“挪用”MHC II–C3复合物。所谓trogocytosis，是指B细胞、T细胞或自然杀伤细胞从抗原呈递细胞表面主动转移或摄取细胞膜片段的过程。CR2能够识别与树突状细胞表达的MHC分子结合的C3片段，并触发这些复合物以trogocytosis方式转移至边缘区B细胞膜表面。通过CR2依赖的trogocytosis，B细胞可获得部分树突状细胞特性，并向辅助性T细胞呈递MHC结合的抗原。 补体另一项同样高度保守的功能，是触发免疫效应细胞向感染或炎症损伤部位的趋化性募集。强有力的趋化刺激来自C3a与C5a过敏毒素分别与其同源受体C3aR与C5aR1–CD88结合，这些受体分布于多种髓系与非髓系细胞。除趋化外，C3aR刺激还可在多类病理生理情境中发挥多样的免疫调节作用。但传统上认为C3a与C5a作为过敏毒素具有相似功能的观点，已被新的发现所挑战：在某些情况下，C3a–C3aR轴可拮抗免疫细胞的趋化信号。此外，C3a相较C5a对免疫细胞（如中性粒细胞）表现为“较弱”的活性，可能与C3a-desArg（由C3a C端精氨酸被切除，即去精氨酸化后生成的肽段）相对缺乏活性有关；而C5a-desArg则仍保持相对活性。C5a还可结合第二受体C5aR2（亦称C5L2）。该受体起初因不与异源三聚体G蛋白偶联而被认为是“诱饵受体”（decoy receptor）；如今，C5aR2被视为通过β-arrestin通路传导信号的免疫调节性受体，可对C5a反应进行精细调控，并常常限制C5aR1介导的促炎信号。C5aR2还可通过增强NLRP3炎性小体激活与HMGB1释放，并抑制Toll样受体、C型凝集素受体以及干扰素基因刺激蛋白（STING）通路信号，从而对巨噬细胞产生更广泛的免疫调节效应。但C3aR与C5aR1均被牵涉到造血干/祖细胞（HSPC）以及髓系—单核细胞的迁移与归巢调控：C3aR信号可提高HSPC对基质细胞衍生因子1（SDF-1）介导的归巢反应敏感性，并在肠道损伤背景下限制中性粒细胞动员；而C5aR1信号可增强小鼠HSPC动员。 多项研究还揭示了膜攻击复合物（MAC）除“经典”的细胞溶解（成孔）功能之外的新作用。细胞在暴露于亚溶解量（sublytic）的MAC时，可启动细胞内Ca²⁺依赖或非依赖性信号通路，影响细胞增殖、凋亡诱导、细胞运动性、炎性小体激活以及促炎性细胞因子信号传导。MAC经由内体区室内化后，可诱导巨噬细胞NLRP3激活并释放IL-1β与IL-18，从而为以“靶向MAC组装”为核心的治疗策略设计提供了新的理论框架。 补体调控机制的新认识 补体激活可在环境信号或微生物入侵刺激下迅速启动，而补体反应的放大——主要经由替代途径的放大环（amplification loop）——可引发强烈的促炎反应；若缺乏有效制衡，便可能造成“旁及性”的组织损伤。通常情况下，体液相与膜结合型调控蛋白通过协同作用形成一系列“检查点”，以防止补体活性持续或过度，从而避免不恰当的“自体指向性”补体反应。此类调控蛋白多数属于补体激活调控因子（regulators of complement activation，RCA）基因家族，该家族在染色体1q32.2区域形成一个相对独立的基因簇。RCA家族既包含可溶性调控因子，如因子H家族成员（全长因子H及6种高度相关蛋白，包括因子H样蛋白1〔factor H-like 1〕与因子H相关蛋白〔FHRs〕）以及C4b结合蛋白（C4BP）；也包含膜结合型调控因子，如CD46（亦称膜辅因子蛋白，MCP）、CR1与CR2，以及以糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定于膜的衰变加速因子（DAF，亦称CD55）（图1a）。 这些蛋白的调控活性根植于其模块化结构：由短共识重复序列（short consensus repeat，SCR）结构域串联重复构成（SCR亦称补体控制蛋白结构域）。RCA蛋白可通过多种机制发挥补体调控功能，包括：加速C3与C5转化酶解离（衰变，decay）（DAF、因子H与C4BP）；作为因子I介导C3b与C4b失活的辅因子（因子H、CR1与C4BP）；或抑制成孔复合物MAC的组装（CD59）。一系列精巧研究进一步揭示了这些调控因子作用方式的结构基础，包括CD59干预MAC组装的分子机制。 体液相中补体激活的幅度同样受到酶类的调控，例如羧肽酶N、R或B2可切除C3a与C5a末端精氨酸；此外，血浆蛋白C1酯酶抑制剂（C1-esterase inhibitor）可通过分别灭活C1r与C1s蛋白酶以及MASPs，从而抑制经典途径与凝集素途径（图1a）。在体液相中，替代途径最重要的调控因子是因子H。因子H为糖蛋白，含有20个SCR结构域，兼具衰变加速活性、辅因子活性以及宿主表面识别能力。因子H可识别的宿主“标志”包括沉积的C3b以及多阴离子分子，如糖胺聚糖与蛋白聚糖（例如硫酸乙酰肝素、肝素与硫酸软骨素）。因子H与脂质或蛋白过氧化所产生的“改变的自我”配体（例如丙二醛修饰表位）的结合能力，被认为与年龄相关性黄斑变性（AMD）等慢性炎症性疾病有关。作为AMD易感遗传因素的因子H多态性变体Y402H，其与宿主表面丙二醛修饰表位的结合能力下降，从而促进病变视网膜中替代途径的失调。 补体调控因子（如因子H或C4BP）之所以能够屏蔽自体补体激活，部分源于它们可与血管内皮结合，尤其是与糖萼（glycocalyx）中的糖胺聚糖结合。若遗传性或获得性改变干扰调控因子与糖萼的结合，便可能导致替代途径调控受损，使C3片段在内皮壁上的沉积失控，从而推动炎症与病理损伤。此外，影响补体调控蛋白结构或功能的基因变异（突变以及常见或罕见的单核苷酸多态性）或获得性改变（如自身抗体），已被认为是“以替代途径失调为突出特征”的相关疾病的重要易感因素。例如，补体调控因子CD46、因子I、因子H或FHRs的罕见与常见变异，以及替代途径组分（如C3与因子B）的变异，均与一些罕见肾脏疾病（如C3肾小球病）以及具有肾脏表现的补体介导性血栓性微血管病（如非典型溶血性尿毒综合征，aHUS）的发病机制相关。尽管C3肾小球病与aHUS共享部分病理生理特征，但遗传学研究揭示二者也具有不同的补体基因特征谱。但与aHUS病理相关的因子H变异往往聚集于因子H C端的宿主识别模块；而在C3肾小球病中，相关变异则倾向于聚集于因子H N端的C3b结合与调控结构域，提示遗传风险因素对体液相C3调控的影响可能存在差异。 宿主与入侵病原体之间的进化“军备竞赛”，体现在病毒与细菌通过多种方式颠覆补体调控网络。若干病原体已进化出相应机制：或利用蛋白“诱饵”将因子H或因子I等补体调控因子“劫持”并富集到其表面；或编码具有辅因子活性或衰变加速活性的RCA蛋白病毒同源物。典型例子包括天花病毒（variola virus）的补体酶抑制剂SPICE（smallpox inhibitor of complement enzymes）以及牛痘苗病毒（vaccinia virus）的补体控制蛋白VCP（vaccinia virus complement control protein）。SPICE由4个SCR结构域组成，同时具有衰变加速与辅因子活性，与人CD46高度同源。VCP可结合C3b与C4b，加速由各条补体途径产生的C3转化酶的衰变，并支持因子I介导的C3b与C4b失活。包括疱疹病毒与腺病毒在内的多种病毒家族均已发展出补体逃逸策略。 备解素（properdin）是一种寡聚化的血浆糖蛋白，是目前已知唯一的补体激活正调控因子。它可稳定替代途径的C3与C5转化酶，并可作为模式识别分子，通过在collectin 12上的初始“对接”招募C3b至靶表面，从而启动替代途径C3转化酶的组装。除补体调控外，备解素还被赋予一些非补体的免疫调节功能，例如与自然杀伤细胞上激活性受体NKp46互作。 基于结构指导（structure-guided）的研究为补体调控因子的作用方式提供了独特洞见，揭示了转化酶形成与调控过程中分层互作的分子决定因素。这些结构学认识为理解疾病相关突变对病理生理的影响以及微生物免疫逃逸策略提供了重要框架。 细胞内补体的新兴版图 尽管早在20世纪80年代就有观察记录到淋巴细胞及其他细胞类型存在肝外补体蛋白合成，从而暗示这些蛋白可能具有非经典或细胞内功能，但直到2010年代，相关研究才重新审视这一概念，并显著拓宽了研究者对补体在细胞内空间如何运作的认识。不断累积的证据提示，补体片段及其受体具有在细胞外空间与细胞内部之间“穿梭转运”的能力，并可与其他免疫感知与模式识别平台形成双向互作，从而在多种细胞类型与不同病理生理情境中介导广泛的免疫调节功能。 细胞内病原体清除 病原体清除依赖于既发生于细胞外、也发生于感染细胞胞质与内体区室内的多重机制。机制研究揭示，对病毒颗粒与细菌的C3b和C4b调理可触发细胞内通路，从而介导病原体中和。C3b包被的腺病毒内吞后，可启动线粒体抗病毒信号（mitochondrial antiviral signalling）依赖性通路，并通过NF-κB、干扰素调控因子（interferon regulatory factor）及AP-1信号诱导促炎性细胞因子分泌；该过程似乎同时调控细菌与病毒的清除。另一方面，经典途径介导的C4b在腺病毒颗粒上的沉积可抑制衣壳解体，从而阻止病毒进入胞质并阻断其从内体逃逸；这一过程似乎不依赖于C3感知。IgG调理还能与胞质Fc受体信号协同，定向识别并降解细胞内病毒。确有近期研究显示，IgG3亚类在中和细胞内病毒方面更为卓越，其机制依赖其柔性的铰链区招募胞质Fc受体“含三联基序蛋白21”（tripartite motif containing 21）；该过程可能与C1与C4协同，通过直接灭活衣壳促进病毒颗粒的溶酶体降解。上述例证共同描述了：补体蛋白在细胞内发挥的功能，往往与起源于细胞外空间的效应反应相耦联。 调控T细胞生物学与稳态 针对CD4⁺T细胞的研究为理解“细胞内补体如何嵌入驱动细胞表型表达的免疫代谢程序”提供了机制性线索。有观点提出，C3(H₂O)的循环再利用通路可作为细胞内C3的来源；随后C3可被溶酶体酶（组织蛋白酶L，cathepsin L）裂解生成C3a与C3b（图1b）。细胞内生成的C3a与溶酶体膜上的C3aR结合，激活mTOR通路，从而促进T细胞稳态性存活。T细胞受体（TCR）激活还可调节细胞内C3激活片段向细胞膜转位；在膜上，C3b诱导的CD46信号与C3a诱导的C3aR信号共同触发mTORC1持续激活。这些分子事件增强糖酵解与氧化磷酸化，从而促进辅助性T细胞1型（TH1）表型的诱导。 人CD4⁺T细胞内存在C5的细胞内储备，尽管其确切来源仍存争议。TCR与CD46的联合刺激可触发细胞内C5a生成，并通过C5aR1依赖性机制诱导活性氧（reactive oxygen species）产生；继而增强NLRP3炎性小体驱动的IL-1β释放，从而维持TH1细胞的诱导。CD46的自分泌（autocrine）激活与IL-2受体信号协同，可促进IL-10产生，进而驱动TH1反应的稳态性收缩（homeostatic contraction）。 细胞内固有（cell-intrinsic）的C3信号不仅影响CD4⁺T细胞的免疫代谢信号与表型轨迹，也同样作用于CD8⁺T细胞。C3b生成及其引发的自分泌CD46信号，可与TCR及CD28共刺激协同，通过增强营养物质摄取与脂肪酸合成来调控最佳细胞毒活性与干扰素-γ分泌。CD8⁺T细胞内的C3激活似乎部分由组织蛋白酶L介导。与CD4⁺T细胞不同，CD8⁺T细胞中的CD46信号似乎与经典NLRP3炎性小体的形成“解耦”，从而揭示其与调控T细胞效应功能的免疫代谢通路之间存在差异性串扰 此外，在T细胞与单核细胞跨内皮迁移至外周组织过程中，免疫细胞上的整合素“淋巴细胞功能相关抗原1”（LFA-1）与内皮细胞上的细胞间黏附分子1（ICAM-1）互作，可诱导C3表达，提示整合素信号与补体生物学之间存在功能性串扰。与此一致的是，LFA-1表达缺陷的T细胞与单核细胞（例如来源于Ⅰ型白细胞黏附缺陷患者）显示效应功能受损，而提供细胞内C3可改善其功能。 介入髓系细胞生物学 除T细胞反应外，细胞内补体还可调控由无菌性炎症刺激触发的髓系细胞与基质细胞反应。巨噬细胞暴露于胆固醇结晶后，可在其线粒体膜上诱导C5aR1信号，从而增强活性氧生成与无氧糖酵解，最终导致促炎性IL-1β分泌。尽管在C5阳性巨噬细胞内观察到C3b与Bb的共定位染色，提示可能发生C3与C5转化酶组装，但在得出确定结论之前，仍需进一步开展生化与功能实验验证。 从“细胞内部”加剧组织炎症 炎症性组织预激（priming）可促成类风湿关节炎等慢性炎症性疾病的难治性。近期研究在滑膜成纤维细胞中鉴定出细胞内C3a–C3aR信号与NLRP3炎性小体之间新的机制性关联：自分泌C3aR刺激可上调mTOR与缺氧诱导因子-1α通路活性，导致成纤维细胞代谢重编程（氧化磷酸化与糖酵解增强），并诱导NLRP3炎性小体介导的IL-1β产生，从而维持持续的炎症反应并加重组织炎症。 总体而言，细胞内补体蛋白与多种受体及免疫信号复合体之间这些严格调控的互作，揭示了补体在T细胞稳态与生存中的新作用，并阐明其如何嵌入驱动T细胞效应功能以及基质细胞炎症预激的免疫代谢程序。 扩展免疫调节功能的边界 除C3片段、调控因子与过敏毒素受体之外，其他补体组分也可在细胞内空间贡献于经典与非经典功能，例如C1q与因子H在肿瘤细胞增殖、肿瘤微环境免疫抑制以及肿瘤进展中的作用。细胞内补体活性还被关联于胰岛自噬调控与胰岛素分泌。但人胰岛β细胞中胞质C3高表达，并可通过与自噬机器组分ATG16L1互作来抵御氧化应激。近期研究进一步从机制层面揭示细胞内C3的来源：可变翻译产生的、缺失信号肽的C3变体可在胞质内生成并被保留。胞质C3具有功能活性，能够在感染的上皮细胞内对侵袭性的金黄色葡萄球菌进行调理。类似地，在小鼠与人胰岛中还鉴定到CD59的细胞内剪接变体，其缺失C端GPI锚定信号；这些变体的表达可调节β细胞的胰岛素分泌，从而提示细胞内补体生物学与代谢调控之间存在新的联系。 尽管大量研究正不断赋予细胞内补体新的角色，但仍存在若干关键争议亟待解决，主要涉及：补体片段的精确来源、经典补体通路对细胞内激活的贡献程度，以及在酸性溶酶体等受限微环境中能否组装成功能性酶复合体等问题。 补体与微生物组的互作 数百万年的进化压力，使补体效应通路处于宿主免疫反应与其共生微生物群（无论是维持真生态〔eubiotic〕稳态的菌群，还是处于失衡状态的菌群〔dysbiotic microbiota〕）之间“动态平衡”的核心位置。此外，广谱的病原体（包括真菌、病毒、原虫与细菌）也进化出了多种免疫逃逸策略，旨在中和那些会导致微生物被清除的补体活性。以金黄色葡萄球菌（S. aureus）为例：一种共生的革兰阳性菌，但能够扰乱免疫稳态并引发侵袭性疾病；其携带多种毒力因子，可针对补体级联反应的各个阶段实施干预。其中，SCIN家族蛋白以及细胞外纤维蛋白原结合蛋白（Efb）主要靶向C3激活这一关键中心环节。SCIN蛋白可同时靶向经典途径与替代途径的C3转化酶，并通过稳定这些复合体将其“困锁”于催化失活状态。Efb的C端片段Efb-C在蛋白水解上更为稳定，可与C3、C3b及C3d结合，作为一种变构抑制剂诱导C3b构象变化，从而显著降低因子B的结合能力，进而削弱替代途径C3转化酶的形成。 炎症是一项重要的生态学驱动因素，可促使原本与健康相关的共生微生物群落重塑为具有致病性的失衡菌群，并使“致病共栖菌”（pathobionts）在群落中异常富集。在这一过程中，补体信号通路的激活及其与由MAMP触发的模式识别受体之间的串扰，可协同增强炎症反应，并选择性促进致病共栖菌的扩增；这些菌群可利用炎症性组织破坏产物所释放的营养物质获得生长优势（图2）。以牙周炎等由菌群失衡驱动的炎症性疾病为例，帮助研究者理解补体在推动多微生物群落向失衡、致病方向转化中的关键作用。除塑造有利于微生物生长的炎症性营养环境外，补体还会被牙周炎相关细菌操纵以实现免疫逃逸。例如，牙周“关键致病菌”（keystone pathogen）牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）能够在吞噬细胞中劫持C5aR1与Toll样受体串扰信号，使抗微生物免疫（细胞外杀伤与吞噬）受损，同时增强炎症通路；这种将“细菌清除”与“炎症反应”脱耦的机制，可整体提升失衡菌群的适应度。由补体驱动的炎症与菌群失衡因此可能形成相互强化的作用网络，产生一种自我维持的正反馈环路，从而支撑疾病的慢性化（图2）。 一系列在啮齿类与非人灵长类模型中开展的遗传学与药理学干预研究（包括结扎诱导、P. gingivalis驱动或自然发生的牙周炎模型）已经确立：C3激活及其下游C5aR1信号在推动牙周炎症与牙槽骨吸收方面发挥关键作用。在重度自然牙周炎的老年非人灵长类中，局部应用compstatin类似物Cp40对C3进行调控，可显著降低关键促炎细胞因子（IL-1β、IL-6与IL-17）以及RANKL等破骨生成标志物。值得注意的是，失衡菌群驱动的TH17细胞扩增及其伴随的中性粒细胞在牙周组织内聚集，可在人体与实验性小鼠牙周炎中共同驱动免疫病理与炎症性组织破坏。在此背景下，由失衡牙周微生物群诱导的补体激活，是促成致病性TH17细胞扩增所必需的条件之一，其机制依赖于关键TH17诱导性细胞因子IL-6与IL-23的产生（图2）。其中，IL-6的产生依赖于牙龈上皮内MAMP激活的Toll样受体信号与C3a–C3aR信号通路之间的协同作用。 综上，补体激活位于口腔黏膜“菌群失衡—炎症”恶性循环的核心，通过耦联Toll样受体信号、调节细胞因子谱并促进TH17细胞扩增，驱动慢性炎症性组织损伤与牙槽骨破坏。同时，补体驱动的炎症性组织崩解又会反过来维持并加剧微生物失衡与生长，从而进一步放大微生物组诱导的补体激活（图2）。 图2｜补体在微生物失衡驱动的炎症性疾病中的作用 牙周炎是微生物失衡驱动炎症性疾病的典型例证：失衡的微生物组与宿主炎症反应之间形成相互强化的双向作用。某些牙周致病菌（如牙龈卟啉单胞菌Porphyromonas gingivalis）通过破坏补体功能而促进微生物群落失衡，这在一定程度上源于免疫监视受损，使“致病共栖菌”（pathobionts）得以扩增。P. gingivalis 表达Toll样受体2（TLR2）配体，并利用精氨酸特异性gingipain蛋白酶作用于C5，产生高水平C5a。因此，P. gingivalis 可在中性粒细胞中共同激活补体C5aR1与TLR2–TLR1复合体，由此产生的信号串扰导致TLR2衔接蛋白MYD88发生泛素化并被蛋白酶体降解；而MYD88本应触发抗微生物反应以控制该菌及其他病原体。与此同时，C5aR1–TLR串扰还可通过MYD88样衔接蛋白MAL激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）。被激活的PI3K抑制RHOA GTP酶及其介导的肌动蛋白聚合，从而损害吞噬作用。P. gingivalis 利用上述功能整合的信号通路，使整个微生物群落获益：一方面削弱先天免疫监视，另一方面维持炎症（为细菌提供营养来源）。补体介导的炎症通过产生过敏毒素与趋化因子放大炎性髓系细胞募集，并通过产生IL-6与IL-23在牙周组织内诱导分泌IL-17的CD4⁺ T细胞（TH17细胞）局部扩增。上述炎症事件导致结缔组织降解与牙槽骨吸收，同时也为失衡微生物群的持续存在创造了营养有利环境，因为炎症性组织破坏产物可被嗜炎性致病共栖菌选择性利用为营养来源。图示的连接“微生物失衡—炎症”的正反馈环路可自我维持，并促成牙周病的慢性化。 这些研究为理解补体信号与模式识别受体及先天免疫通路之间的复杂串扰提供了基础性认识；以牙周炎为例，揭示了驱动菌群失衡相关炎症性疾病的关键机制，并可能对口腔菌群失衡相关的全身性炎症紊乱的调控具有更广泛的启示意义。 走向对补体的新认知 作为第一道防线，补体过去主要与靶细胞调理、吞噬作用以及病原体清除相关联。然而，日益增长的证据表明，补体蛋白能够以精细而复杂的方式调控多种生物学过程，其作用范围远远超出对病原体的免疫监视与宿主防御。本节概述支撑关键机制性见解的概念框架，这些见解推动了研究者对补体生物学认知不断演进中的若干范式转变。 在组织再生与发育中的作用 补体C3与C5的激活及其下游信号通路（C3aR与C5aR1）被认为是驱动低等脊椎动物与哺乳动物组织再生程序的关键因素。C3与C5信号在有尾类两栖动物的肢体与晶状体再生程序中发挥核心作用，而这些再生过程能够高度逼真地重演早期形态发生、组织图式建立（patterning）、转分化（transdifferentiation）以及组织可塑性等发育事件。补体对组织再生的影响还可扩展至不同组织与不同物种：例如，C3a可通过激活STAT3依赖性的促炎细胞因子释放，在不依赖成纤维细胞生长因子（FGF）的条件下促进鸡胚视网膜再生。类似观察也在哺乳动物肝脏再生模型中得到较大程度的再现。C3与C5均是Kupffer细胞促炎细胞因子信号的重要驱动因素，分别以C3aR依赖性与C5aR1依赖性方式发挥作用，并激活由NF-κB与STAT3驱动的转录程序，从而促进肝细胞存活、细胞周期再进入及再生（图3）。在小鼠缺血–再灌注损伤模型中，对C3进行遗传学或药理学干预显示，补体激活需要达到一定“阈值”，且涉及C5aR2信号；该阈值可能决定补体所致肝损伤与肝再生之间的精细平衡。 与补体在发育过程中的保守作用相一致，啮齿类与两栖类动物研究提示：C3激活及C3aR信号可编排胚胎发育所依赖的形态发生过程，例如多能干细胞——神经嵴细胞——的定向或集体迁移。早期肠道发生过程中肠神经嵴细胞的迁移即为一例，它揭示了C3aR信号与N-钙黏蛋白（N-cadherin）依赖性的细胞–基质黏附之间的串扰如何促进早期哺乳动物发育。神经祖细胞与未成熟神经元表达C3aR与C5aR1；在这些细胞中，C3aR信号可在啮齿类模型中促进基础水平及缺血诱导的神经发生。此外，C5a可调节胚胎期神经祖细胞极性；而在胚胎发生期短暂抑制C5aR1会导致脑发育异常与行为缺陷。 图3｜补体在进化尺度上塑造组织再生反应 在哺乳动物肝再生过程中，补体激活通过以协调方式促使静止状态肝细胞重新进入细胞周期并增殖，从而恢复原有肝脏质量。早期“预激（priming）”事件包括：Kupffer细胞中的C3aR与C5aR1信号，以及NF-κB依赖性释放的IL-6与TNF；二者共同通过STAT3与NF-κB驱动的转录程序，使肝细胞进入细胞周期。肝实质内补体激活还促进自然杀伤T细胞（NKT细胞）募集；NKT细胞释放IL-4，在再生期间维持较高的血浆IgM水平。IgM在肝脏的沉积进一步促进补体激活，从而形成维持补体活化的正反馈调控环路，促进肝脏存活、组织修复与再生。Abbr：LPS，脂多糖；PI3K，磷脂酰肌醇3-激酶；ROS，活性氧。 在肿瘤免疫与免疫治疗中的作用 数十年来，补体激活曾仅被视为一种辅助机制：它通过补体依赖性细胞毒作用（complement-dependent cytotoxicity，CDC）增强肿瘤特异性抗体的细胞溶解效应。该效应机制建立在治疗性抗体“固定”C1复合体并触发经典途径激活的能力之上，最终通过成孔的MAC组装导致肿瘤细胞破坏。事实上，这一机制已被多种获批免疫治疗药物用于多类血液系统恶性肿瘤。对C1q与免疫复合物结合的结构指导研究揭示了经典途径活性的关键分子决定因素，并据此推动了新型抗体免疫治疗策略的设计，以更有效地利用“肿瘤靶向的CDC”。此类策略的治疗潜力在于：可压制肿瘤细胞进化出的补体逃逸机制，例如上调因子H、DAF、CD46或其他MAC调控因子等补体调控蛋白的表达。 然而“补体激活仅引发肿瘤细胞毒反应”的长期教条在2010年代末受到挑战。在宫颈癌模型中，针对C3的遗传学与药理学干预显示：肿瘤微环境中的C3信号可维持免疫抑制性生态位，其特征为髓源性抑制细胞（MDSCs）浸润增加以及CD8⁺T细胞效应反应减弱（图4）。研究进一步将C5aR1信号确定为驱动肿瘤免疫抑制的关键效应通路。随后研究不断细化并丰富了补体在抗肿瘤免疫中的多重面向：C3a与C5a通过其同源受体C3aR与C5aR1介导的信号，被牵涉到肿瘤细胞增殖、新生血管生成与肿瘤转移。因此，靶向这些受体可在多种肿瘤模型中增强针对PD-1或PD-L1的免疫检查点阻断疗法的治疗效应。促肿瘤的中性粒细胞C3aR信号还可与促凝通路交织，诱导肿瘤微环境中中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成，从而促进肠道肿瘤发生。 C3信号以及C3a与C5a还通过涉及CD4⁺与CD8⁺T细胞调控的免疫抑制机制，与肿瘤进展相关；同时，还可通过与浸润性髓系细胞（MDSCs、巨噬细胞与中性粒细胞）及基质细胞（即癌相关成纤维细胞）的互作推动肿瘤进展。这些互作决定肿瘤干性（stemness）、M2样巨噬细胞极化以及对免疫治疗的耐受（图4）。在鳞状细胞癌中，阻断C5aR1可通过逆转T细胞免疫抑制提高化疗疗效；在自发性与移植性肉瘤模型中，阻断C3aR可增强抗PD-1治疗的疗效。与此一致，肉瘤患者中若人源同源基因集合在转录层面呈现与小鼠“C3缺失特征”相对应的高富集评分，则预后与总体生存更佳；这一结果提示，在某些皮肤肿瘤中，C3aR靶向可能成为具有前景的免疫治疗策略。将C3aR阻断与放疗联合，还可在胰腺癌模型中增强基于自然杀伤细胞的免疫治疗效果，从而为肿瘤中的补体调控开辟新的机会。事实上，真菌菌群失衡可与补体形成正反馈环路：通过凝集素途径介导的补体激活以及促肿瘤的C3aR信号，驱动胰腺癌进展。肾细胞癌与肺腺癌均与“过度活化”的补体转录组特征相关，并可预测较差的患者预后。提供机制层面的解释，近期研究记录了因子H在肾癌中具有细胞内、非经典的作用，可促进促肿瘤通路。此外，在透明细胞型肾细胞癌中，局部经典途径激活以及表达C1q的肿瘤相关巨噬细胞可促进肿瘤免疫抑制，并可作为患者分层的潜在预后标志物。 图4｜补体在肿瘤生物学与免疫治疗中的情境依赖性作用 新机制证据提示，补体并非仅通过直接机制（膜攻击复合物，MAC）以及间接机制（经由Fc受体〔FcR〕与抗体依赖性效应机制）对肿瘤发挥细胞溶解性杀伤作用；相反，在肿瘤微环境中，补体失调可通过多种彼此独立或相互重叠的免疫抑制机制促进肿瘤发生发展。总体而言，这些机制对理解补体在肿瘤免疫中的作用具有更广泛意义，并可为设计治疗策略以提升肿瘤免疫治疗疗效提供依据。 支持补体在肿瘤中具有“情境依赖性”作用的证据还包括：在特定条件下，肿瘤基质中的补体激活可促进抗肿瘤免疫。C3d–CR2信号可在化疗诱导的免疫原性细胞死亡后增强B细胞应答；而C3a与C5a也可在放疗后支持效应T细胞反应。这些研究凸显了补体参与肿瘤发生发展的复杂性：其效应方向可能随肿瘤类型、恶性程度阶段、免疫细胞组成以及治疗方案而显著不同。补体在肿瘤进展中的作用还取决于补体反应在肿瘤基质与远端组织中的激活幅度、反应质量以及严格的时空调控方式。 在中枢神经系统发育与神经退行性变中的作用 传统观点认为，脑内补体活性主要与凋亡细胞清除、组织修复以及抵御感染性损伤相关。如今，人们越来越认识到：补体蛋白是脑内神经炎症回路的重要组成部分，这些回路既参与发育过程，也参与病理过程（图5）。补体蛋白可由中枢神经系统（CNS）的神经元与胶质细胞（星形胶质细胞、小胶质细胞与少突胶质细胞）共同产生，进而构建复杂的信号网络，影响神经元存活、轴突损伤或脱髓鞘过程，以及星形胶质细胞—小胶质细胞的活化。新近研究还揭示，神经元与胶质细胞中可能存在自分泌式补体功能（例如C5a–C5aR1轴），其不仅支持神经元稳态信号传导，也可能介导CNS功能障碍。C1q与C3可选择性标记神经元突触，并指令表达CR3的小胶质细胞对其进行吞噬性清除；这一发现阐明了补体在CNS中的新型稳态功能：在出生后发育期精细化突触回路，同时在成人脑内调控突触可塑性与神经发生。 然而，多种疾病中补体过度表达以及补体—小胶质细胞—星形胶质细胞轴的异常再激活，已被证实可推动神经炎症与神经退行性变。C3激活及其下游CR3信号可驱动异常的胶质细胞反应，并在阿尔茨海默病模型中介导早期突触丢失与认知下降（图5）。在缺血性卒中后的CNS恢复过程中，C3aR信号似乎具有相反效应：急性期有害，而后期可能有益。与此一致，小鼠在卒中后亚急性期经鼻给予C3a可加速功能恢复，提示卒中后的治疗性C3aR调控必须置于严格的时间窗语境下加以考虑。 图5｜补体在中枢神经系统发育与神经退行性变中的作用 补体蛋白在健康与疾病状态下共同塑造脑内突触回路。胶质细胞与神经元的局部补体表达、小胶质细胞介导的吞噬作用以及星形胶质细胞活化三者之间的精密互作，共同构成神经炎症通路的基础，进而引导中枢神经系统（CNS）在发育过程中受调控的突触精细化（synaptic refinement）。在神经退行性变过程中，补体—小胶质细胞—星形胶质细胞轴的异常激活可错误清除突触并引发神经毒性，从而在神经炎症性与神经退行性疾病中促进认知下降与记忆丧失。 神经侵袭性病毒感染同样可触发补体与小胶质细胞的激活；对C3或C3aR进行调控可减轻病毒诱导的突触末梢丢失与认知损害。在人群中，C4A基因同型的拷贝数变异与精神分裂症风险升高相关。近期遗传干预研究进一步显示：在小鼠中过表达人体C4A基因会介导小胶质细胞对突触的异常吞噬，导致认知与行为异常，并在表型上重现精神分裂症特征，从而为“补体激活在精神分裂症中具有因果作用”提供了证据。除CR3之外，C3aR也被认为是神经退行性疾病中异常胶质反应的重要驱动因素。反应性星形胶质细胞过表达C3，与C3aR阳性小胶质细胞之间的双向互作可促进tau病理并推动神经原纤维缠结的累积；这一发现揭示了C3a–C3aR信号与胶质细胞STAT3激活之间新的机制性联系。另有近期研究将补体生物学与阿尔茨海默病发病过程中的一氧化氮信号耦联，阐明了一种具有性别差异的机制，从而部分解释该病在女性中更为常见的现象：在女性阿尔茨海默病患者脑内，C3异常翻译后修饰——S-亚硝基化——更为显著，并在β-雌二醇调控下促进人小胶质细胞异常增强的突触吞噬。 这些研究表明该领域进展迅速，不仅提供了新的机制性洞见，也扩展了研究者对“基于补体的CNS疾病治疗策略”开发路径的理解。 补体的“暗面” 补体在先天免疫识别、危险信号感知以及组织免疫监视中具有关键作用，但当其被错误激活或发生失调时，也可能造成广泛的旁及性损伤。这种不恰当的补体反应可导致异常的血栓—炎症激活、免疫失衡、血管内皮炎症以及器官损伤。如前所述，补体反应可在激活表面附近迅速放大并产生不利后果；然而在稳态条件下，宿主组织表达的一系列膜结合型或体液相调控因子可促进C3b裂解为无活性片段，并加速C3与C5转化酶解体，从而限制补体激活幅度及由此造成的组织损伤。若补体调控蛋白发生遗传性或获得性改变，则可能破坏组织稳态，导致体液相与细胞表面均出现失控的C3激活、持续的C3b调理、替代途径放大，并引发一系列有害后果，如MAC介导的细胞溶解、氧化性组织损伤以及长期不消退的持续性炎症。补体失调可推动眼部、肾脏、血液系统与神经系统等多个系统的免疫介导性与炎症性疾病发生发展。 将以若干疾病领域为例概述补体介导的病理生理过程。这些领域已有大量研究确立补体在疾病发病机制中的参与，并且补体抑制剂的治疗概念验证已得到支持——相关药物要么已获临床批准，要么正推进至人体后期临床试验阶段（图6–8）。 血液系统疾病 TA-TMA见其他综述 阵发性睡眠性血红蛋白尿（paroxysmal nocturnal haemoglobinuria，PNH）是一种罕见的血液系统疾病，其特征为携带获得性体细胞突变的造血干细胞克隆性扩增。该突变发生于PIGA基因——该基因编码磷脂酰肌醇N-乙酰葡萄糖胺转移酶A亚基（phosphatidylinositol N-acetylglucosaminyltransferase subunit A），该酶是合成糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定结构所必需。上述遗传异常导致循环中出现PIGA缺陷的红细胞；这些红细胞缺乏以GPI锚定于膜表面的补体调控蛋白DAF与CD59。基于其病因学特征，PNH可视为补体介导性疾病的典型范例（图6）。PNH红细胞易因自体补体攻击而发生自发性破裂，并出现由膜攻击复合物（MAC）介导的血管内溶血。替代途径失调在PNH病理生理中占主导地位，使PNH成为评估新型补体治疗药物的“试验平台”。但靶向C5的治疗药物临床开发不仅针对并解决了血管内溶血机制，还揭示了一种长期难以捉摸、且在抗C5治疗下多呈治疗抵抗的病理机制，即C3介导的血管外溶血。PNH细胞在接受抗C5阻断时，由于缺乏C3调控因子DAF，其细胞表面仍会持续沉积C3b。这些被C3b调理的红细胞随后被转运至肝脏与脾脏，并被表达CR3的巨噬细胞吞噬，从而造成贫血。以compstatin家族C3抑制剂开展的概念验证研究显示，C3调控在PNH中具有更广泛的获益，可同时减轻血管内与血管外溶血。 图6｜补体失调驱动PNH的病理过程 替代途径受两种以糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定于细胞膜的补体调控因子——衰变加速因子（DAF）与CD59——所调控。阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）患者存在一种遗传异常，导致红细胞表面GPI锚定的DAF与CD59缺失。其结果是替代途径激活失控，并通过形成膜攻击复合物（MAC）引发血管内溶血。使用抗C5药物治疗可保护PNH细胞免受MAC介导的血管内溶血，但由于缺乏DAF，红细胞表面仍会发生C3b调理（opsonization）。这将导致C3介导的血管外溶血：肝脏与脾脏中CR3⁺巨噬细胞吞噬这些被C3b调理的红细胞。在C3抑制剂存在时，可阻止C3b调理，从而保护PNH红细胞免于血管内与血管外两种溶血。 除PNH外，血管内溶血亦是多种疾病的共同特征，包括溶血、镰状细胞病的延迟性溶血性输血反应，以及伴肾脏表现的罕见血栓性微血管病（如非典型溶血性尿毒综合征，aHUS）。近期研究提示，除同种抗体介导的经典途径激活外，延迟性溶血性输血反应中还存在显著的替代途径激活贡献，其机制与游离血红素（cell-free haem）依赖的C3激活有关。在aHUS中，微血栓所致血管内溶血后血红素释放，可能在既往存在遗传易感性的背景下促进替代途径调控失衡。在镰状细胞病小鼠模型中，血管内溶血与血红素释放可在体内触发补体激活并导致C3沉积；同时，在镰状细胞病患者的肾活检中观察到明显的C3与C5b–C9沉积。这些发现为在该临床情境下评估补体抑制治疗提供了理论依据。 血红素作为替代途径失调的“次级触发因素”还可能通过其他机制发挥作用：其一，血红素可直接与因子I互作并抑制因子I介导的C3b降解；其二，血红素可下调血管内皮细胞上调控因子CD46与DAF的表达。此外，血红素还能诱导内皮细胞以Toll样受体4依赖性方式表达P-选择素；而P-选择素可作为支架，将C3(H₂O)或C3b锚定于被修饰的内皮表面，并通过替代途径放大环进一步增强C3沉积。上述机制性洞见为理解补体失调在一系列溶血性与血栓—炎症性疾病中的更广泛作用提供了概念平台：补体不仅可介导红细胞的直接破坏（血管内溶血），还可编排多种组织破坏过程；这些过程可被血红素或红细胞微囊泡等次级触发因素放大，并在补体调控能力下降、处于炎症与促栓状态的血管内皮背景下持续加剧。 眼部疾病与年龄相关性黄斑变性（AMD） 年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种慢性炎性视网膜疾病，也是工业化国家老年人不可逆视力丧失的主要原因之一。其早期或中期阶段以视网膜色素上皮下方（亚视网膜上皮）空间出现富含蛋白与脂质的致密沉积物为特征，这些沉积物称为玻璃膜疣（drusen）。早期AMD可进展为两种晚期类型：其一为“干性”AMD，即地图样萎缩（geographic atrophy），表现为脉络膜血管退变所致的感光细胞进行性丢失以及视网膜色素上皮（RPE）细胞死亡；其二为更为进展的“湿性”或新生血管性AMD，主要由血管内皮生长因子（VEGF）诱导的新生血管形成驱动，该过程促进炎性损伤并导致RPE萎缩与视力丧失。 全基因组关联研究显示，补体相关基因（如C3、CFB、CFI与C9）中的常见与罕见多态性与AMD易感性相关。发现因子H常见多态性变体Y402H会显著增加AMD发生风险，推动了对其病理生理机制与靶向治疗干预的深入研究。Y402H位于因子H的SCR6–8区域，该区域参与宿主组织识别，主要通过与细胞表面糖胺聚糖结合实现；因此，Y402H变体可能改变因子H与多阴离子表面的结合能力，导致视网膜组织中替代途径失调。Y402H变体还可能通过其他致病机制发挥作用，例如阻碍由血小板反应蛋白1（thrombospondin 1）介导的、CD47依赖性的吞噬细胞从视网膜下腔隙清除过程，从而促成不消退的持续性炎症（图7）。此外，表达Y402H变体的RPE细胞表现出C3周转增加、组织蛋白酶D（cathepsin D）向类drusen沉积物渗漏以及溶酶体功能受损；而这些异常可通过C3抑制得到恢复。 除经典的补体调控活性外，因子H似乎还可调节RPE细胞中关键的免疫代谢与炎症过程。例如，下调细胞内固有（cell-intrinsic）的因子H可通过NF-κB信号失调促进炎症性细胞因子表达，并提高C3与因子B水平；同时还会损害RPE的糖酵解、线粒体呼吸与溶酶体周转。总体而言，因子H功能受损似乎会对视网膜产生广泛影响，使RPE更易遭受氧化性损伤（如脂质过氧化），并促使这些细胞进入代谢失衡状态，从而可能促进AMD的发生发展（图7）。 新近证据提示，AMD的病理生理图景可能更为复杂：包括FHRs（如FHR4）在内的血浆补体蛋白可在脉络膜毛细血管层（choriocapillaris）与Bruch膜中聚集，可能通过与因子H竞争表面结合位点以及竞争性调控C3b裂解，从而促进眼部替代途径失调。关于视网膜中“系统性补体储备”与“局部补体生物合成”在AMD中的相对贡献，目前仍存在较大争议；但已有证据支持二者均可参与AMD的发病机制，并且这一过程可能由血–视网膜屏障受损所推动，使系统性因子得以“渗漏”至脉络膜–RPE界面。 图7｜补体失调在眼部炎症性疾病中的致病作用 因子H（FH）的多态性变异Y402H会增加年龄相关性黄斑变性（AMD）的发生风险。FH Y402H变体与脂质氧化标志物（丙二醛，MDA）以及多阴离子表面标志物（糖胺聚糖，GAGs）的结合能力受损，从而促成替代途径失调。该FH变体还可阻断视网膜下腔隙中吞噬细胞的CD47介导性清除，进而促进不消退的炎症并损伤视网膜色素上皮（RPE）与感光细胞。最后，细胞内固有（cell-intrinsic）的FH Y402H还会影响RPE细胞的免疫代谢与炎症过程，从而倾向于促进AMD的发生发展。 COVID-19 COVID-19大流行重塑了研究者对宿主免疫反应与SARS-CoV-2（具有强大免疫逃逸能力的病毒性病原体）之间互作的理解。重症COVID-19与一种适应不良的宿主炎症反应相关，该反应动员多种先天免疫机制与模式识别通路。补体失调被认为是驱动血栓—炎症（thrombo-inflammation）的关键因素之一，其可扰乱多器官血管内皮功能，并增强血小板—中性粒细胞互作与中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成，从而推动COVID-19免疫血栓形成（immunothrombosis）（图8）。已有多种机制被提出用于解释COVID-19期间补体失调的发生。经典途径可能由“广谱反应性自身抗体”或针对SARS-CoV-2编码表位的抗体所触发；凝集素途径则可能由甘露糖结合凝集素（MBL）或MASPs直接识别病毒核衣壳蛋白与刺突蛋白上的糖类特征结构而启动。替代途径不仅可放大上述反应，还可通过另一机制被触发：病毒刺突蛋白与因子H竞争结合细胞表面糖胺聚糖（如硫酸乙酰肝素），从而增强替代途径C3转化酶活性。除细胞外通路外，细胞内C3信号与C3aR刺激也被牵涉进疾病过程：病毒触发肺上皮细胞的干扰素受体信号，激活JAK1–JAK2–STAT1通路，继而上调C3与因子B的转录，从而增强C3激活、C3a–C3aR介导的白细胞募集以及肺部炎症。 其他器官特异性病理 补体失调主要由体液相或组织定向的替代途径过度激活所驱动，并叠加多条触发通路的贡献，已被关联于多种肾脏病理状态，包括C3肾小球病、aHUS、IgA肾病、免疫复合物介导的肾小球肾炎、抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）相关性血管炎以及狼疮性肾炎。补体抑制治疗已显著改变aHUS的治疗格局（C5抑制），并在ANCA相关性血管炎中带来临床获益（C5aR1阻断）；但在其他肾脏疾病（如C3肾小球病或狼疮性肾炎）中，补体阻断剂迄今疗效不一或相对有限。这种“疗效缺口”很可能反映了相关疾病复杂的病理生理、临床表型异质性以及对强有力的、以生物标志物指导的患者分层策略的迫切需求。 器官移植领域也在理解补体参与多环节病理方面取得显著进展，包括供体器官保存、缺血–再灌注损伤、急性抗体介导性排斥反应以及移植物功能延迟。近期研究亦为补体激活在需要重症监护治疗的某些病理状态中的致病作用提供了新认识，例如伴多器官衰竭的急性多发创伤，以及横纹肌溶解所致急性肾损伤。 此外，在一些慢性炎症与自身免疫性疾病中也获得了新的机制性洞见；补体在这些疾病中长期被认为是促病或加重病情的因素，例如系统性红斑狼疮、抗磷脂综合征与类风湿关节炎。尽管类风湿关节炎的临床前模型显示补体调控具有潜力，但迄今尚未在临床实践中实现有效转化。更深入理解驱动滑膜炎症与疾病复发（flare）的早期免疫事件与炎症过程，有助于阐明：局部与系统性补体因素对类风湿关节炎病理生理的相对贡献、其在炎性滑膜中的时空分布，以及其与患者疾病活动度与治疗反应的相关性。这些新的机制与转化研究，才刚刚揭示补体治疗性调控的新机遇领域。 补体的治疗性调控 除在人体病理生理中的核心作用外，补体还因其可作为炎症、衰老相关及免疫介导性疾病的治疗调控靶点而备受关注。当前，补体治疗药物的临床“武器库”已包含多种获批药物，它们靶点、作用机制与给药途径各异，已显著改变某些罕见的血液、肾脏与神经系统疾病，以及直到近期仍缺乏有效治疗手段的较常见眼部炎症性疾病的治疗格局（见框2）。 全身性补体调控 补体级联反应存在多个可供治疗干预的节点，具体取决于各靶点在疾病病理生理中的不同作用。若在经典途径或凝集素途径“启动端”进行干预，其优势在于：可阻断早期组分（如C1q、C2与MASP2）的促病作用，同时保留级联反应的核心功能及其多种下游效应分子。若在末端通路的C5水平实施抑制，则可同时应对促炎性的C5a信号与MAC介导的细胞溶解；而针对C5a–C5aR1轴的定向阻断，可在抑制C5aR1信号的同时保留C5aR2的免疫调节作用，并保留在补体调理表面（如微生物）组装MAC的能力。与C5抑制相比，治疗性C3调控具有更广泛的活性谱：C5抑制主要作用于末端通路，阻断C5a生成与MAC形成；而C3调控可同时防止各类下游效应片段生成，并阻断影响免疫调节与效应性B细胞、T细胞功能的C3信号。与此一致，在非人灵长类“致敏”的肾移植排斥模型中，使用Cp40类似物进行C3抑制可表现出多维度治疗效应：既可预防抗体介导性排斥反应，又可对B细胞与T细胞活性产生有利调节。尽管经典途径被认为是驱动自身免疫性肾小球疾病——膜性肾病——中补体激活的主导通路，但肾活检中可检测到来自三条途径的补体片段，提示其致病机制更为复杂。在膜性肾病小鼠模型中，靶向C3的治疗可减轻肾小球损伤并降低疾病严重度，从而验证了“在补体多通路参与的疾病中，C3调控可能提供更广覆盖”的观点。 鉴于多条补体通路共同参与COVID-19免疫病理，靶向核心蛋白C3的治疗性调控可构成更为全面的策略，以同步阻断所有下游促炎效应物的生成。该策略还可截断NET驱动的血栓—炎症过程，后者可促进类似血栓性微血管病的病理后遗症（图8）。在重症COVID-19患者中，C3调控较抗C5阻断更能显著降低血浆NETosis水平。转化研究揭示了C3失调与中性粒细胞—血小板互作之间的关键机制联系；该互作导致NET释放增强并推动免疫血栓形成。针对重症ARDS（SARS-CoV-2感染后所致）的患者，研究评估了C3调控的II期随机对照试验：采用基于compstatin的C3治疗药物AMY-101进行C3抑制，与临床结局改善趋势相关，并引发快速的抗炎反应，同时伴随NETosis减弱。此外，即便在药物水平达到靶点饱和，仍有少数无应答者存在残余C3活性，且其与促凝活性增强相关；这可能支持外源性蛋白酶介导的C3激活，并为COVID-19中非经典C3激活途径提供了体内概念验证证据。 图8｜补体失调支持COVID-19相关免疫血栓形成 在重症COVID-19中，宿主适应不良的血栓—炎症反应被认为是驱动血栓性微血管病与多器官衰竭的关键因素。SARS-CoV-2通过三条途径触发补体激活，导致C3片段释放、C5a生成以及膜攻击复合物（MAC）组装；这些过程共同促成内皮细胞持续活化、血管损伤与免疫血栓形成。血栓性微血管病由信号串扰与正反馈环路所推动，其中包括被激活的血小板、中性粒细胞与炎症性内皮之间的互作。补体C3信号可增强携带组织因子（tissue factor）装饰的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成，并在重症COVID-19中产生广泛的血栓—炎症效应。 另一种C3治疗药物（APL-9）在轻至中度ARDS患者中的II期试验，在中期分析阶段未观察到相较标准治疗对死亡率的有意义降低。考虑到该试验缺乏公开的药代—药效（PK–PD）数据、入组患者数量较少、纳入标准在疾病严重度方面存在差异，以及AMY-101可能较体积更大的PEG化化合物APL-9具有更高的组织穿透性，上述因素均可能构成混杂并限制结果可解释性，进而影响临床结局。尽管靶向C5a的阻断在机械通气患者中降低了死亡率，但在相似患者队列中，C5aR1抑制未显示临床疗效，提示C5a–C5aR1轴内靶点之间可能存在知识缺口与功能冗余。COVID-19大流行期间已有超过10种补体特异性药物进入临床试验，迄今结果不一，且在临床终点上缺乏一致的疗效信号。这些结果支持“补体在重症COVID-19中的作用更为复杂”的观点，并提示需要考虑更早期的治疗介入与联合治疗策略。此类联合治疗可覆盖多种免疫治疗手段，以共同针对异常激活的先天免疫通路，从而打破重症COVID-19患者中驱动恶性血栓—炎症循环的病理机制。 在PNH中C3抑制剂应用成功、以及替代途径失调在相关疾病病理生理中具有统摄性作用的背景下，新一代“替代途径特异性”补体抑制剂（靶向丝氨酸蛋白酶因子B或因子D）在近期完成的II期临床试验中已在血液系统适应证中显示临床疗效。与需静脉或皮下注射的生物制剂相比，这类口服小分子抑制剂有望在慢性疾病中提高患者依从性；但给药剂量仍需谨慎，因为即使极少量残余酶活性也可能足以驱动替代途径激活。 治疗策略的持续迭代与完善——以有效应对新出现的病理生理要点——在PNH中C3抑制剂的近期获批中得到充分体现：部分PNH患者在接受抗C5治疗后仍存在残余性贫血并依赖输血，从而促使研究者发现了C3介导的血管外溶血；此外，部分PNH患者因C5基因变异而呈现对治疗抵抗的表型，也推动了寻找替代治疗选择。针对这些新致病机制的需求，促进了C3靶向与替代途径治疗药物的发展，使其成为新的、疗效更广的治疗方案。类似地，经典途径对冷凝集素病免疫复合物驱动临床表现的致病贡献，为开发经典途径特异性抑制剂（如sutimlimab）提供了理论依据。 补体的局部调控 尽管全身性补体调控在血液系统与肾脏疾病中已显示疗效，但在那些补体失调主要局限于特定组织或器官的疾病中，局部补体调控提供了一条极具前景的治疗路径。在这一背景下，靶向C3、C5或替代途径的抑制剂正被开发为眼部炎症性疾病（如地图样萎缩，geographic atrophy）的局部治疗方案。C3抑制剂pegcetacoplan（Syfovre）在地图样萎缩患者的Ⅲ期临床试验中显示出临床疗效，并已于近期获得美国FDA批准，成为该致残性眼病首个且目前唯一可用的治疗药物。以合成C5靶向RNA适配体avacincaptad pegol（Zimura）进行C5调控，也在两项近期地图样萎缩Ⅲ期研究中表现出相近疗效。需要注意的是，这两种药物均携带聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）连接臂；在长期治疗背景下，组织内慢性累积所导致的高PEG负荷可能带来一定风险。因此，这一点以及这类新型免疫调节药物在严格临床试验情境之外的长期结局影响，都需要在后续随访研究中持续监测。 为寻求更符合患者依从性的方案并在慢性病程中降低给药频率，研究者正在探索基于腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体的基因治疗平台，以定向在病变组织表达补体调控分子（如CR2–因子H与CR2–Crry）。已有概念验证研究在啮齿类模型中报道该策略的可行性，包括脉络膜新生血管诱导的视网膜损伤以及AMD样病理模型。 由菌群失衡驱动的牙周炎症凸显了补体在“调控微生物组”以及“调节宿主免疫与炎症反应”两方面的作用，这意味着补体抑制并非单纯的抗炎策略，也可在一定程度上通过重塑失衡生态间接发挥抗微生物效应。基于近期概念验证研究的有力证据，基于compstatin的治疗药物AMY-101已在该类伴系统性并发症的口腔炎症性疾病中首次进入Ⅱ期临床评估。局部C3调控可显著减轻牙周炎症的临床指标，并降低组织破坏标志物（基质金属蛋白酶）水平，从而带来持久的治疗效应。C3调控在治疗窗之外仍能维持的持续疗效，提示其可能具有更广泛的免疫调节作用，能够在口腔微生物群与更受控的宿主免疫反应之间重新建立平衡。 此外，还开发了“正交”（orthogonal）的靶向策略，用于在已被调理的宿主表面处理补体失调，从而避免对循环补体蛋白进行系统性阻断。此类策略使补体调控蛋白（如因子H）能够以融合蛋白形式进行组织靶向递送：融合构建体通常包含一个“靶向基团”（如CR2或抗C3d片段），用于结合被C3片段（iC3b、C3b与C3dg）装饰的表面。类似的融合抑制剂还可将补体调控因子（如同时调控C3与C5转化酶的Crry）与识别缺血性新表位（ischaemic neoepitopes）的抗体片段结合，以定向作用于受损组织。采用上述策略的研究在脑缺血损伤、视网膜变性以及心肌缺血–再灌注损伤模型中均显示出令人鼓舞的结果。 借鉴病原体免疫逃逸策略，近期研究还着力开发“包被/涂层”策略，以保护生物材料或移植细胞免受补体攻击。这些方法利用蛋白或肽类“诱饵”从循环中捕获可溶性调控因子（如因子H），并显示出在血液透析管路或体外循环手术操作（如体外循环旁路与移植）中抑制补体激活不良后果的潜力。 除合成小分子抑制剂、表面定向调控剂或较大分子生物制剂外，研究者还基于结构启发开发了“内源性调控因子的小型化版本”作为治疗药物。例如，mini–factor H是一种融合构建体，由因子H的SCR1–4与SCR19–20组成，既保留母体蛋白的调控活性，也保留宿主表面识别能力；在PNH的离体（ex vivo）模型中，其治疗效应优于全长因子H。 新的临床适应证与挑战 依库珠单抗（eculizumab）获批用于乙酰胆碱受体抗体阳性的重症肌无力，以及水通道蛋白4抗体阳性的视神经脊髓炎谱系疾病，进一步点燃了在神经系统疾病领域开发补体调控策略的研究热潮。鉴于越来越多证据将补体失调与神经炎症性病理联系在一起，能够穿越血–脑屏障并有效“归巢”进入脑组织的补体抑制剂的设计正在加速推进。在这一方向上，明确系统性补体储备与局部补体储备对复杂CNS病理的相对贡献，并确定最佳的治疗介入时机，仍是该领域的核心挑战。利用可诱导的条件性C3表达进行遗传学研究，已为阿尔茨海默病中C3信号的时间窗调控与治疗潜力提供了初步数据。未来研究有望为CNS靶向补体治疗药物向临床阶段推进奠定更坚实的证据基础。 毋庸置疑，补体研究已开启了一个全新的发现时代，阐明了补体病理生理在多种生物系统中的深远影响。借助高通量多组学技术（包括单细胞RNA测序、空间转录组学等）开展的机制学与转化研究所积累的大量数据，使研究者以前所未有的精细度得以解析补体在健康与疾病状态下所调控的生物学过程。即便是补体在抗微生物免疫与吞噬性清除中的“经典角色”，也正在被新的机制性见解不断充实——这些见解从更广义、系统层面的视角，同时纳入细胞内固有（cell-intrinsic）与全身性补体反应的贡献。研究者当前面临的挑战，是如何将这些令人着迷的基础发现转化为人体干预研究，并进一步发展为面向患者的创新治疗模式。 补体治疗学的复兴在极短时间内显著改变了临床格局，但也带来了亟待应对的新挑战。随着若干补体靶向药物获批、更多候选药物处于研发阶段，个体化补体治疗正日益接近现实；然而，其实施必须建立在严格的诊断算法基础之上，并依赖可靠且具有疾病特异性的生物标志物进行指导。由一组罕见或常见多态性共同驱动的补体基础活性细微差异——统称为“complotype”（补体基因型/补体表型组合）——可决定个体对炎症性疾病的易感性，并可能影响患者分层与治疗反应。如今已普遍认识到，年龄、性别与代谢状态等因素会影响个体间补体活性的差异，从而导致不同的疾病易感性。药物给药途径与治疗持续时间（短期/一过性 versus 长期/慢性）也应根据具体疾病进行个体化调整，包括复杂的中枢神经系统（CNS）病理状态。 此外，全身性与局部补体调控的影响孰轻孰重，仍是该领域富有讨论空间的重要议题。例如，近期在肺炎诱导的肺损伤模型中显示，即便实施系统性C3抑制，黏膜屏障处仍可能保留局部具有保护作用的C3活性。鉴于细胞内补体生物学的不断涌现，开发可透细胞的补体抑制剂，作为解析相关机制的新型工具，正获得越来越多关注。临床研究还应在药代动力学—药效学（pharmacokinetic–pharmacodynamic，PK–PD）数据报告方面提高透明度，以便对不同靶向策略的疗效进行可靠对标与比较。 总之，鉴于目前已获批的补体治疗价格极其昂贵，其中部分原因在于孤儿药领域的市场独占性，研发成本更低、能够被更广泛患者群体所获得的治疗方案——尤其是面向低收入国家的可及性——应始终作为研究者、临床医生与立法者的优先事项。 声明： 本文仅分享和解读公开的研究论文及其发现，以作临床启发用；不代表本公众号的观点和对研究结果或文章的认可。随着对疾病的研究不断深入，新的证据有可能会对既往研究有进一步更新

1.吐温在生物制品中的应用 聚山梨酯常被称为吐温，通常用作表面活性剂。聚山梨酯是一类两亲性非离子型表面活性剂家族，其中聚山梨酸酯80和20（吐温80和20）是生物药物制剂中使用最广泛的表面活性剂，其亲水部分帮助表面活性剂在水相中分散，而疏水部分则与油相或疏水性分子相互作用，能够有效保护蛋白质，防止其在储存和运输过程中发生变性、聚集、表面吸附以及絮凝现象。吐温能够降低表面张力，减少蛋白质在液体中的聚集，帮助维持蛋白质的生物活性1。 对131个商业化产品的分析显示，大多数生物制剂的处方中含有吐温，其中吐温80占63%，共计82个产品；吐温20占24%，共计32个产品。Poloxamer 188出现在4种产品中，PEG 3350出现在1种产品中，12个产品则不含表面活性剂。初代制剂产品中，吐温80的使用更为普遍。然而，由于吐温80的不稳定性和易氧化性，后续项目逐渐转向使用吐温20，例如曲妥珠单抗和雷马珠单抗。 在膜工艺开发过程中，吸附是指所过滤料液中的某些成分粘附在滤膜上的过程，这可能会影响料液的成分和浓度。一个过滤器中的吸附性材料不仅包括滤膜，还包括硬件和支撑材料。吸附试验的条件应根据实际生产情况进行确定，流速、过滤时间、料液浓度、防腐剂浓度、温度和pH值等因素均可能影响吸附效果。在一个过滤器中，滤膜对聚山梨酯（吐温）存在一定的非特异性吸附现象。大多数生物制剂中吐温的含量较低，通常在0.1%以下，最低可达0.001%。因此，低浓度吐温溶液的膜吸附研究至关重要2。 点击查看大图 图1- 聚山梨酸酯80和20 结构示意图 点击查看大图 表1-已上市生物产品表面活性剂浓度 2.滤膜的蛋白吸附研究 在膜工艺步骤中，由于聚合物微孔膜的内表面积是正面表面积的100到600倍，膜材料可能导致蛋白质的非特异性结合（NSB），这可能会影响产品的收率。默克实验室研究了两种蛋白质的吸附特性：牛血清白蛋白（BSA）和羊免疫球蛋白G（IgG）。研究采用了静态暴露期间的伽马计数和动态无菌过滤法进行分析。在实验中，比较了四种膜材料：聚偏二氟乙烯（PVDF）、尼龙、聚醚砜和混合纤维素酯，并与这四种参考蛋白质进行了对比。其中尼龙膜和纤维素混合酯膜对蛋白的吸附较大，PVDF和PES膜的吸附略小，PVDF在几种膜材中吸附最小3。其次，不同的铸膜工艺对膜吸附能力有较大影响，默克研究了不同PES 膜材的吸附情况，如图2所示。 点击查看大图 表2-种常见膜材的蛋白吸附 点击查看大图 图2-不同膜材的IgG吸附研究 （由上至下分别为默克Express® PES膜材，默克PVDF膜材，其他PES膜材，醋酸纤维素膜材，尼龙膜） 3.滤膜的吐温吸附研究 在抗体行业中，吐温80（PS-80）被广泛用于第一代抗体药物，如Remicade。同时，PS-80也被用作气雾剂配方中的稳定剂。实验证据表明，PS-80能够有效防止蛋白质颗粒的形成。然而，由于其分子内的不饱和双键，PS-80比吐温20（PS-20）更容易被氧化。因此，后来的单克隆抗体治疗药物，包括Herceptin和Xolair，选择使用PS-20作为其配方成分。常用的表面活性剂PS-20（Tween-20）的临界胶束浓度在5.5×10⁻⁵ M（0.007%）至5.9×10⁻⁵ M（0.0077%）范围内（分子量：1227.54）。或许正因如此，许多抗体候选药物和治疗药物的浓度通常在0.007%以下。 美国Amgen公司4研究了低浓度吐温20（低于0.007%）在不同膜材料中的非特异性结合吸附和吸附饱和情况。在本研究中，使用含有0.004% PS-20的不同蛋白浓度的抗体制剂，通过PES双层膜滤器进行过滤。过滤后发现PS-20的水平显著降低，这种减少可能是由于滤器的吸附作用所致。 为了确认未来过滤研究中使用配方缓冲液的可行性，实验中降低了吐温20的浓度，使用含有0.004% PS-20的溶液进行了相同方式的测试，考察PES和PVDF滤器对PS-20的吸附情况。结果显示，在吐温浓度为0.004%的条件下，PES膜的非特异性吸附较大，吸附了73%的吐温；而PVDF膜的吸附较少，仅吸附了14%的吐温。 点击查看大图 表3- PES和PVDF的吐温吸附 为了进一步评估不同膜材料滤器的吸附情况，实验还进行了PS-20的动态结合曲线研究。测试对象包括尼龙膜、Durapore® 滤器（PVDF膜）、Express® SHC滤器（PES双层膜）以及其他品牌的PES滤器，所使用的缓冲液中PS-20的浓度在0.0045%至0.0065%之间。如图3所示，横坐标为过滤载量，纵坐标为PS-20浓度。在初始阶段，膜部分吸附了PS-20，导致浓度较低；随着吸附的饱和，PS-20浓度趋于平稳。研究发现，Durapore® PVDF滤器的最小吸附饱和点（MSP）最低，估计为10 L/m²，而Express® SHC（PES双层膜）的MSP约为40 L/m²。相比之下，友商PES的MSP所需的时间最长，估计大于50 L/m²。 点击查看大图 图3-不同膜材的IgG吸附研究 为了进一步确定膜材料对PS-20的非特异性吸附的绝对值，分别使用了两种PES双层膜滤器和Durapore® PVDF滤器进行测试。采用过饱和吸附和冲洗的方法，以确保每个膜样本都被PS-20分子饱和，并提取膜片中的PS-20进行三次重复测定（n = 3）。 结果如图4所示，Durapore® PVDF滤膜的结合量显著低于所有其他滤器，仅为9.57 µg/cm²。在PES膜滤器中，Express® SHC（PES双层膜）滤膜的PS-20结合量为36.33 µg/cm²，而友商的PES双层膜则为68.80 µg/cm²。Durapore®滤器由单层PVDF膜制成，而Express® SHC和友商的PES滤器则由双层PES膜组成。换算得知，Durapore® PVDF滤膜的吐温吸附量为9.57 µg/cm²，Express® PES滤膜的吐温吸附量为18.17 µg/cm²，友商PES滤膜的吐温吸附量为34.4 µg/cm²。从膜材料的角度来看，PVDF材质的吸附量最低，其次是PES。然而，由于不同厂家的膜材料铸膜工艺不同，吸附能力会存在差异。 点击查看大图 图4- 不同滤膜上PS-20非特异性结合量（n = 3） （第1列为阴性对照；第2列为Durapore®膜（单层PVDF膜）；第3列为友商（双层PES膜）；第4列为SHC膜（双层PES膜）；第5列为SHC单层结合量（第4列的值除以2）。 4.滤膜吸附吐温差异性可能原因 从滤膜的结构来看，PES（聚醚砜）由于具有多个苯基环作为骨架，其疏水性比聚偏二氟乙烯（PVDF）更强，而PVDF的骨架则由多个二氟碳单位组成。推测非特异性疏水结合能力，亲水化修饰工艺等因素可能导致这些滤器在吸附PS-20方面表现不同。 为了考察蛋白质的疏水性对吐温吸附的影响，测试选择了三种不同的抗体分子，包括mAb A、mAb B和mAb C，浓度均为70 g/L，基于它们的不同疏水性进行测试（A蛋白疏水性 < B蛋白疏水性 < C蛋白疏水性）。将含有0.004% PS-20的配方缓冲液中的蛋白样品应用于PES滤器，过滤时分段收集，以测试PS-20的吸附情况。 如图5所示，三种蛋白分子的PS-20动态结合曲线和吸附饱和点特征相似，没有受到蛋白质疏水性质的影响。在低吐温浓度的制剂缓冲液中，初始过滤阶段会吸附吐温，导致吐温浓度降低。吐温在制剂配方中起到保护作用。在本实验中，C蛋白的疏水性非常强，稳定性差，常温环境下数小时内会产生沉淀。遇到此类蛋白时，吐温的吸附可能对蛋白质产生较大影响。 点击查看大图 图5- 3种不同抗体分子PS-20吸附动态结合曲线 5.如何改善吐温吸附现象？ 如果PS-20浓度较低（如低于0.007%），可以通过在料液过滤前对滤器进行预饱和冲洗来克服滤膜的微量吸附。此外，可以通过预先提高吐温的浓度进行补偿，过滤后再搅拌混匀，以弥补吐温的吸附。在生产过程中，还可以排出一些初始过滤的料液，以减少膜吸附带来的影响。 在生物药领域，通常采用预饱和冲洗的方式来润洗滤器，以减少吸附的影响。在实验中，首先使用PS-20制剂缓冲液在40 L/m²的条件下对Express® SHC滤器进行冲洗，然后排空滤器后再进行料液的过滤。值得注意的是，这种操作应尽量选择死体积较小的滤器，以最小化药物的稀释效应。建议生产过程中选择2倍的MSP进行冲洗，确保更大的安全边际。 点击查看大图 图6- PS-20饱和冲洗示意图 6.吐温对除菌滤器气泡点的影响 非离子表面活性剂如吐温通过可逆吸附与PES（聚醚砜）膜强烈结合，降低了膜的表面张力，从而降低了泡点。默克的内部研究表明，由PES膜组成的Millipore Express® SHF（0.29 m²）和Millipore Express® SHC（0.23 m²）设备在经过17-18小时的吐温接触后，其气泡点降低了16%-19%。为了去除吐温的吸附影响，需要更多的水进行润洗，Millipore Express® SHC和Millipore Express® SHF的水冲洗体积分别为170 L/m²和120 L/m²，这样泡点才能恢复至初始值的≥95%。默克提供全面的完整性测试解决方案，如客户在吐温完整性测试中遇到问题，可以联系当地技术支持。 点击查看大图 图7-吐温接触后对PES滤器泡点影响 本文结论汇总 a) 如果制剂配方缓冲液中吐温的含量非常低，滤器可能会非特异性地结合PS-20，这可能导致药物产品中PS-20的分布不均，从而影响制剂中的蛋白稳定性。 b) 使用不含蛋白的低浓度PS-20配方缓冲液进行吸附研究，观察到的PS-20吸附效果与含有蛋白样品的结果相似，PS-20的吸附率不易受到蛋白浓度、温度和流速的影响。 c) Durapore® PVDF滤膜的吐温吸附量为9.57 µg/cm²，Express® PES滤膜的吐温吸附量为18.17 µg/cm²。从膜材料的角度来看，PVDF材料的吸附量最低，其次是PES。然而，由于不同厂家的膜材料铸膜工艺不同，吸附能力可能存在差异，这需要在工艺开发过程中进行考虑。 d) 可以在料液过滤前对滤器进行预饱和冲洗，以克服滤膜的微量吸附，但在初期阶段需要测试最小吸附饱和点（MSP）。如果采用PVDF滤器进行过滤，由于其吸附较小，可以不进行预冲洗步骤。然而，缓解措施应集中在改善无菌过滤过程中的产品均匀性，尽量搅拌混匀，以减少初始过滤阶段的PS-20吸附。 e) 对于其他低浓度物质，如低浓度重组蛋白、低浓度辅料氨基酸和低浓度P188等辅料，可能存在相似的吸附行为。因此，在工艺开发中，不仅应测试载量，还建议进行除菌过滤的吸附实验。 参考文献： 1. Surfactant-Stabilized Protein Formulations: A Review of Protein-Surfactant Interactions and Novel Analytical Methodologies. 2. A review of formulations of commercially available antibodies. 3. Non-specific Protein Binding of microporous membranes Merck in house test. 4. Non-specific binding and saturation of Polysorbate-20 with aseptic filter membranes for drug substance and drug product during mAb production. 关于默克工艺解决方案 默克工艺解决方案，凭借可信赖的产品、丰富的制药工艺专业知识和卓越的法规支持，为制药客户提供全方位支持，以应对各种工艺挑战。 微信公众号矩阵 工艺解决方案 工艺服务平台 微信生态 微网站 视频号 默课堂 服务平台 自媒体矩阵 小红书 抖音 SAFC® Millipore®