蛋白水解靶向嵌合体技术(Proteolysis-targeting chimeras, PROTACs)利用恰当的连接子将目标蛋白(Protein of Interest, POI)配体与E3连接酶配体相连,使POI与E3连接酶之间形成蛋白-蛋白相互作用后被进一步泛素化标记,最后通过泛素-蛋白酶体途径将POI降解1。该技术自2002年诞生以来经历了二十多年的发展,已有多个分子进入临床试验阶段,如Arvinas公司的ARV-471等2。然而,尽管目前已发现超过600种E3连接酶,仅有少数连接酶能够用于PROTACs的设计与开发,如VHL(∼30%) 与 CRBN(∼60%)3。由于CRBN 与VHL 在不同细胞或组织中的特异性表达差异,以及相应配体较大的分子量造成PROTACs分子类药性较差,PROTACs的开发受到限制。此外,度胺类配体潜在的致畸副作用也限制了它的应用4,因此目前亟需寻找新型降解信号来对PROTACs技术进行优化。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer , NSCLC)是最常见的肺癌类型之一,其分子特征复杂且容易产生耐药性,治疗过程往往面临着极大的挑战。ALK 重排和 EGFR 突变是NSCLC中两个最关键的致癌驱动因素5,尽管目前已有多种ALK和EGFR酪氨酸激酶抑制剂成功问世,通过与目标激酶的持续结合发挥作用,但这种持续性结合也容易导致细胞产生获得性耐药性,限制了疗效的长期维持。
南方科技大学的饶海教授课题组针对这一问题,基于三种能够触发N-末端降解途径的氨基酸(甘氨酸、脯氨酸与赖氨酸)为E3连接酶配体分别设计了能够降解EML4-ALK 和突变型 EGFR的全新PROTACs分子,也被称为AATacs。近日,该项研究工作发表在了美国化学会出版的药物化学核心期刊Journal of Medicinal Chemistry上(J. Med. Chem. 2024, ASAP)6。
N-末端降解技术的核心在于不稳定的蛋白N-末端残基容易被修饰或加工从而暴露出来,随后被不同的E3连接酶识别后经泛素-蛋白酶体途径降解7。研究人员首先通过聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)连接子将三种氨基酸残基(Pro、Gly 和 Lys)和ALK酪氨酸激酶与 EGFR 激酶的抑制剂Brigatinib相连设计合成了AATacs分子。他们基于ALK与Brigatinib的共晶结构(PDB: 6MX8)将配体分子位于溶剂区的甲基哌嗪-哌啶基团替换为哌嗪基,合成了Brigatinib的类似物(BA),并调整了PEG连接子的数量(1-4)以探索最佳连接子长度(图1)。
图1、AATacs的设计思路
研究人员随后在H3122(EML4-ALK)与H1975(EGFR-L858R/T790M)细胞中评估了基于 Pro 的不同连接子长度的AATacs的降解能力。尽管连接子长度不同,这些化合物均能在高于1 μM的浓度下使H3122细胞中EML4-ALK蛋白或H1975细胞中EGFRL858R/T790M蛋白含量显著下调。其中Pro-PEG3-BA活性最优,表明PEG3为最佳连接子长度。研究人员随后固定了连接子,并将Pro替换为Lys与Gly进行进一步的改造。WB结果表明在H3122与H1975细胞中Lys-PEG3-BA与Gly-PEG3-BA均保留了对POI的降解活性。此外,研究人员还通过蛋白质组学分析证明了经Pro-PEG3-BA处理的H3122细胞中ALK蛋白含量降低最为明显,进一步表明了该AATacs分子具有良好的选择性(图2)。
图2、AATacs的降解活性与蛋白质组学分析
研究人员进一步评估了这些AATacs的降解能力,结果显示Pro-PEG3-BA、Lys-PEG3-BA、Gly-PEG3-BA在H3122细胞中对EML4-ALK蛋白的DC50值分别为0.42 μM、1.32 μM、0.50 μM,且Dmax均大于90 %。而在H1975细胞中AATacs对EGFR L858R/T790M 蛋白的降解能力则显著降低,DC50值均高于10 μM(图3)。此外,CCK-8细胞毒性实验显示在H3122 细胞中Pro-PEG3-BA具有比原药BA更强的抑制细胞增殖的活性,表明PROTAC化改造能够提升化合物的抗肿瘤活性。同时,Pro-PEG3-BA在正常细胞中没有表现出毒性,表明其安全性良好。蛋白酶体抑制剂MG132的引入也证明了AATacs分子经由蛋白酶体途径进行降解。
图3、AATacs的降解能力评估
为了进一步探究AATacs的作用机制,研究人员首先对参与 AATac 介导降解的 E3 连接酶进行鉴定。通过对H3122 和 H1975 细胞中GID4、ZYG11B和ZER1蛋白分别进行敲低或沉默,研究人员证明GID4介导了Pro-AATacs的泛素化降解,ZYG11B和ZER1介导了Gly-AATacs的降解,Lys-AATacs的媒介E3连接酶则尚不明确。研究人员利用流式细胞术评估了Pro-PEG3-BA对细胞周期以及凋亡的影响,结果表明,Pro-PEG3-BA能以剂量依赖的形式使H3122和H1975细胞停滞在G1期,同时显著增加了早凋与晚凋细胞的比例(图4)。
图4、Pro-PEG3-BA对细胞周期以及凋亡的影响
最后,研究人员评估了Pro-PEG3-BA的药代动力学性质,以2 mg/kg的剂量静脉给药的半衰期(T1/2)为2.9小时,而腹腔50 mg/kg给药时的T1/2约为5.2小时,表明该分子代谢较为缓慢,能够提高患者依从性。同时该分子的生物利用度较好,约为53.2 %(图5)。进一步的H3122异种模型的PD实验中,以10 mg/kg腹腔给药能显著降低肿瘤组织中ALK的水平,体现出该分子良好的抗肿瘤活性。
图5、Pro-PEG3-BA的PK与PD研究
小结:能够用于PROTACs开发的E3连接酶数量少、潜在副作用风险大与类药性差是PROTACs设计的难点与痛点;使用激酶抑制剂治疗非小细胞肺癌NSCLC产生的获得性耐药也严重影响了药物的疗效。作者运用N-末端降解技术,以Pro、Lys、Gly这些小分子量的氨基酸为配体招募新的E3连接酶,结合ALK与 EGFR抑制剂Brigatinib开发了基于氨基酸的AATacs分子,其中Pro-PEG3-BA展现出了良好的降解活性与药动学性质。该研究不仅为NSCLC的治疗提供了全新策略,也展现了PROTACs在癌症治疗中的广阔前景。
【参考文献】:
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