QS-21

摘要：疫苗是人类历史上最重要的发明之一，已经彻底改变了全球健康。通常，疫苗通过触发先天免疫反应和刺激抗原呈递细胞，引发针对特定病原体抗原的防御性适应性免疫反应。作为关键要素，佐剂是经常作为添加剂使用的化学物质，用于提高疫苗的效力和免疫原性。90多年来，佐剂一直是许多人类疫苗的重要组成部分，通过增强、调节和延长免疫反应来提高其效力。在这里，我们提供了一份及时且全面的佐剂历史发展和当前状态的综述，包括它们的分类、作用机制以及在不同疫苗中的作用。此外，我们对当前的许可程序进行了系统分析，并重点介绍了涉及疫苗佐剂的临床试验中的显著例子。展望未来，我们预计该领域的未来趋势，包括新佐剂配方的开发、创新佐剂的创造以及它们在系统疫苗学和疫苗输送的更广泛范围内的整合。文章认为，对生物化学、材料科学和疫苗免疫学的更深入理解对于推进疫苗技术至关重要。预计这些进步将带来更有效的疫苗的未来开发，能够对抗新兴传染病和增强公共卫生。 1.引言：疫苗佐剂的历史 疫苗佐剂研究领域自20世纪初诞生以来已显著进步（图1）。随着传染病的日益流行，免疫接种已成为限制其传播和减少相关伤害的最有效方法。然而，早期的疫苗往往证明是无效的，因为纯化的抗原本身无法引发足够强大的免疫反应。为了克服这一挑战，引入了佐剂的概念。佐剂是添加到疫苗中以增强其免疫原性，从而提高其效力的物质。 图1.疫苗佐剂发展的重大事件时间线。这一时间线展示了疫苗佐剂的逐步发展，从RNA和DNA等天然成分演变到合成工程佐剂。 现代佐剂的发展一直是一个缓慢而具有挑战性的过程。研究人员旨在创造既能够引发强烈免疫反应又保持安全有效的疫苗。这涉及到选择性地结合明确定义的分子和配方，并探索天然和合成化合物。正如图1所总结的，佐剂的组成随时间演变。它从早期的天然成分发展到当代的合成化合物。 尽管佐剂开发面临挑战，但目前有超过30种不同制造商的许可疫苗含有佐剂。铝盐是最早发现的佐剂，已被发现能够增强针对乙型肝炎、破伤风、白喉、百日咳和人类乳头瘤病毒等疾病的疫苗的免疫反应。铝盐的有效性归因于它们在注射部位形成储库、诱导炎症以及激活树突细胞和T细胞的能力。尽管铝盐在疫苗中使用已有七十多年，但其确切的免疫机制仍未完全理解。 20世纪90年代后期的佐剂发展包括油包水乳液。这些乳液有助于在较长时间内缓慢释放抗原，激活先天免疫系统，并诱导体液和细胞免疫反应。这种乳液的首次使用之一是在Fluad，这是一种针对65岁以上成年人的许可季节性流感疫苗。其他FDA许可的佐剂包括MF59（一种含角鲨烷、生物可降解油和表面活性剂的油包水乳液佐剂，用于流感疫苗）和AS03（由α-生育酚、角鲨烷和表面活性剂组成，用于H1N1流感疫苗和一些大流行流感疫苗）。AS01（一种脂质体和单磷脂A的混合物）已在RTS,S/AS01疟疾疫苗和带状疱疹疫苗中使用。 尽管许多其他佐剂在临床前模型中显示出高效力，但由于安全或耐受性问题，大多数尚未获得人类使用的许可。此外，包括铝盐、MF59和佐剂系统AS0佐剂在内的现有佐剂在人类中的作用分子机制仍不完全清楚。 2.佐剂的益处和效果 总体而言，疫苗佐剂在提高疫苗的有效性和可及性，以及减少全球传染病负担方面发挥着关键作用。它们的用途和其他实际应用如下（见图2）： 图2. 佐剂的潜在益处 1.缓解有限的疫苗供应：佐剂增强免疫反应，允许较少的疫苗剂量实现完全保护。这减轻了卫生系统的负担，并增加了那些无法接受多次剂量的人的可及性。佐剂还可以降低疫苗中必要的抗原剂量，从而可能减少副作用并增加可用性。例如，重组疫苗提供了显著的制造优势，但通常自身免疫原性较弱。将佐剂与重组大流行流感蛋白结合，可以大幅减少实现目标抗体水平所需的抗原量，从而显著增加生产能力。例如，AS03是一种油包水乳液佐剂，已在H1N1流感疫苗等疫苗中使用。它已被证明可以改善免疫反应，并允许抗原节约，这意味着可以使用较小量的疫苗抗原，同时仍然产生强烈的免疫反应，这有助于延长可用的疫苗供应。 2.快速启动免疫反应：佐剂刺激对疫苗抗原更强、更持久的反应，提供更好的保护。例如，将AS04佐剂加入GlaxoSmithKline（GSK）的乙肝抗原Fendrix中，实现了三剂方案减为两剂。Advax是一种基于δ-菊糖的佐剂，已被证明可以加速免疫反应。它激活先天免疫系统，并促进细胞因子和趋化因子的产生，这有助于增强适应性免疫反应。 3.扩大抗体反应：佐剂扩大对具有显著抗原漂移或株变异的病原体的抗体反应，对于流感、人类乳头瘤病毒（HPV）和疟疾寄生虫等疾病至关重要。例如，MF59是一种油包水乳液佐剂，已被证明可以增强细胞和体液免疫反应，并显著增加抗体滴度，改善抗体反应的质量。 4.加强抗体反应的幅度和功能性：佐剂不仅增加了抗体反应的幅度，还增加了它们的功能性、亲和力或免疫系统产生的功能性抗体数量。例如，AS04是一种将铝盐与单磷脂酸脂A（MPLA）结合的佐剂，MPLA是一种Toll样受体4激动剂。AS04已被证明可以增强抗体反应的幅度和功能性。它促进了高质量抗体的产生，包括增加抗体滴度和改善抗体亲和力和亲和力。 5.加强T细胞反应：正在开发新的疫苗候选物以改善T细胞反应，现有的人类使用批准的佐剂不能有效诱导这些反应。目标是诱导更有效的T辅助细胞参与，以优化抗体反应的质量和持久性，或诱导可以针对和消除细胞内病原体的效果CD4+或CD8+ T细胞。因此，新疫苗可能包括Toll样受体（TLRs）和其他先天免疫受体的激动剂，以促进T辅助细胞反应的产生。这种方法旨在克服传统佐剂的局限性，创造更有效的疫苗，可以提供长期保护，对抗更广泛的病原体。通过改善T细胞反应，这些疫苗也可能为免疫系统较弱的个体或对传统疫苗反应不佳的人提供益处。例如，CpG ODNs是含有特定免疫刺激性序列的合成DNA分子，作为Toll样受体9（TLR9）激动剂，已被证明通过促进抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞的激活和分化来增强T细胞反应。它们诱导Th1型免疫反应，导致T细胞增殖、细胞因子产生和细胞毒性T细胞活性增加。 6.开发新疫苗：佐剂在开发传统疫苗无效的疾病疫苗中至关重要，增强免疫反应并针对多种病原体株。它们可以增强对疫苗的免疫反应，并帮助针对病原体的多种株。例如，在流感疫苗的情况下，已使用佐剂创建可以针对不同流感病毒株提供更好保护的疫苗。此外，佐剂可用于开发针对尚未有效疫苗可用的病原体引起的疾病的疫苗，如HIV或疟疾。开发能够刺激针对这些病原体的强大和针对性免疫反应的佐剂是一个重要的研究领域。例如，在病毒样颗粒（VLP）佐剂中，VLP是自组装结构，模仿病毒的整体结构但缺乏病毒遗传物质，使它们无传染性。VLP可以作为抗原和佐剂。它们已被用于新疫苗的开发，以增强免疫反应，提高疫苗效力，并扩大对不同病毒株或亚型的免疫反应。 7.提高安全性：通过增强免疫反应，佐剂可以降低疫苗相关不良事件的风险。这是因为免疫系统能够更好地针对和消除抗原，降低可能导致副作用的过度免疫反应的风险。因此，在疫苗中使用佐剂已成为提高疫苗效力、安全性和可及性的重要策略。例如，病毒体是将病毒蛋白（如流感血凝素）纳入其结构的类脂质体颗粒。它们已被用作疫苗中的佐剂以提高安全性。病毒体提供了病毒的抗原性质，但没有传染性遗传物质，降低了疫苗相关不良事件的风险。病毒体佐剂已在流感和甲型肝炎等疾病的疫苗中使用。 3.佐剂的类别及其作用机制  在这一部分，我们讨论了典型的疫苗佐剂，包括它们的组成部分、功能机制、在疫苗中的应用以及它们的优点和缺点，以及与它们相关的挑战。 图3. 疫苗佐剂的类型 3.1.铝盐类佐剂 通常被称为明矾的铝盐类佐剂是第一种在许可的人类疫苗中使用的佐剂，并且仍然是使用最广泛的佐剂。它们由氢氧化铝、磷酸铝或两者的组合组成，已知能在注射部位形成储库，随时间缓慢释放疫苗抗原，从而产生更强和更持久的免疫反应。它们已被证明能增强对包括乙型肝炎、人类乳头瘤病毒（HPV）和肺炎球菌病疫苗在内的广泛抗原的免疫反应。由于它们经过验证的安全性记录、增强免疫反应的广谱能力以及易于制造，它们仍然是疫苗开发中一个有吸引力的选择。然而，人们对铝盐可能引起的不良反应，如注射部位的局部反应和罕见的过敏反应，也存在一些担忧。使用铝盐作为疫苗佐剂的好处通常大于风险。 铝盐类佐剂的确切作用机制尚未完全理解，但有几种提出的理论（图4a）。明矾作为佐剂之所以受欢迎的一个关键原因是它们能在注射部位形成储库。这个储库随时间缓慢释放疫苗抗原，使免疫系统长时间暴露于抗原。这种长时间暴露有助于增强免疫反应，导致更强和更持久的免疫力。 图4. 疫苗佐剂的作用机制。a) 基于铝盐的佐剂。b) 乳液佐剂。c) 基于TLR激动剂的佐剂。 此外，明矾还被认为是通过在注射部位诱导炎症来激活先天免疫系统。这种炎症被认为是由炎症体的激活触发的，炎症体是一种在先天免疫反应中起关键作用的蛋白质复合物。激活的炎症体释放促炎细胞因子，这有助于吸引免疫细胞到炎症部位并激活它们。 铝盐类佐剂还被认为是通过诱导促炎细胞因子的释放来激活树突状细胞，这些是专门呈递抗原给T细胞的免疫细胞，负责识别和攻击外来入侵者。铝盐类佐剂通过诱导释放促炎细胞因子，如IL-1β和TNF-α，吸引树突状细胞到注射部位并激活它们。反过来，树突状细胞促进效应T细胞的分化，这些细胞在诱导免疫中起着关键作用。 明矾还被认为是通过刺激CD4+ T细胞的分化和诱导B细胞产生抗体来发挥作用，这对于诱导免疫至关重要。这一过程是通过树突状细胞产生的IL-1β和IL-18来介导的，它们促进效应T细胞的分化。储库中抗原的缓慢释放也有助于延长B细胞对抗原的暴露，这可以增强抗体的产生。 总之，铝盐类佐剂通过在注射部位形成储库、激活炎症体、诱导促炎细胞因子的释放、吸引树突状细胞到注射部位以及增强B细胞产生抗体的作用来发挥作用。这些机制共同作用，增强了疫苗中抗原的免疫反应，提高了对目标疾病的保护。 3.2.无机纳米颗粒基佐剂 无机纳米颗粒基疫苗佐剂，如纳米铝、层状双氢氧化物（LDH）和纳米/介孔硅、纳米金刚石、量子点，已被研究其增强疫苗免疫反应的潜力。无机纳米颗粒提供了一个多功能的平台，用于表面修饰，允许精确控制大小和形状参数。这种多功能性有助于设计旨在引发特定免疫反应的定制结构。此外，这些纳米颗粒通常表现出强大的化学和物理化学稳定性，确保在储存和运输过程中不需要冷藏即可长时间保存。这些属性对于实际的疫苗部署和分发场景至关重要，特别是在资源有限的环境中，使它们成为储备疫苗以应对未来紧急需求的理想候选者。 无机纳米颗粒基疫苗佐剂的作用机制涉及它们与免疫系统的相互作用，以增强和调节对疫苗中抗原的免疫反应。无机纳米颗粒作为抗原的载体，确保它们有效地传递给抗原呈递细胞（APCs）。纳米颗粒被设计为被APCs，如树突状细胞和巨噬细胞，有效摄取。这种摄取是通过纳米颗粒的大小、表面电荷和表面修饰来促进的。一些无机纳米颗粒佐剂，如基于铝的佐剂，会在注射部位引起局部炎症。这吸引免疫细胞到该部位，并促进APCs的招募。无机纳米颗粒佐剂有助于发展持久的免疫记忆。这确保了免疫系统“记住”遇到的抗原，在随后暴露于病原体时提供保护。 其中，具有纳米纤维形态的γ相氧化铝水合物纳米颗粒（γ-AlOOH）被制备并用作人结核杆菌水热提取物的传递系统。由于其独特的介孔纤维结构，合成的γ-AlOOH显著增强了巨噬细胞样细胞的细胞摄取，与商业明矾相比增加了约两倍。 介孔硅具有有序的多孔结构，孔径在介孔范围内（2至50纳米）。这种结构提供了大的表面积和可调节的属性，使其适合于各种应用，包括药物传递和疫苗佐剂。介孔硅的表面可以被修饰以定制其属性，用于特定的疫苗配方和应用。介孔硅也可以被用来封装免疫调节剂，进一步增强佐剂效果。例如，无定形硅可以用作疫苗佐剂以增强免疫反应。纳米级和微米级硅都促进了髓系细胞中NLRP3炎症体的激活，而只有纳米级硅在角质形成细胞中激活了炎症体。 层状双氢氧化物（LDHs）是一种具有正电荷的类水镁石层和层间阴离子的材料，为包括药物传递和免疫调节在内的各种应用提供了独特的结构。由于其层状结构，LDHs对抗原具有高负载能力。LDHs可以设计成以控制的方式释放抗原，促进持久和延长的免疫反应。LDHs还可以表面修饰以整合额外的功能，如靶向配体或免疫调节剂，以进一步定制其性能。 总之，无机纳米颗粒作为疫苗佐剂是一个活跃的研究领域，它们在疫苗开发中的应用有望增强免疫反应，提高疫苗的整体有效性。 3.3.乳液佐剂 当两种液体混合在一起时，如果它们不能形成均匀混合物，就会形成乳液。抗原包含在这些水滴中，油则作为储库，缓慢释放抗原，并通过减少清除时间和延长抗原暴露来增强免疫反应。乳液是另一种已开发用于增强疫苗免疫反应的疫苗佐剂。乳液由两种不相溶的液体组成，通常是一个油相和一个水相，由表面活性剂稳定。乳液通过在油相中形成小的抗原滴液，然后将它们分散在整个水相中。 最早获得人类疫苗批准的水包油佐剂之一是MF59，它包含角鲨烷、聚山梨醇酯80、三油酸山道醇酯和脱水柠檬酸钠。MF59诱导ATP释放，并上调细胞因子和趋化因子以增强疫苗接种部位的抗原特异性免疫反应。它已被证明是安全且耐受性良好的。另一种基于水包油乳液的佐剂是AS03，它包含表面活性剂聚山梨醇酯80和两种可生物降解的油，角鲨烷和DL-α-生育酚。欧洲委员会在2009年为AS03佐剂的Pandemrix授权上市，2013年FDA批准了AS03佐剂的流感A（H5N1）单价疫苗。AS03已越来越多地用于流感和疟疾疫苗。 乳液已被用于各种疫苗中，包括流感、乙型肝炎和人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗。它们提高了疫苗的效力，特别是在可能对传统疫苗反应不佳的人群中，如老年人或免疫功能低下的个体。乳液佐剂通过几种机制增强对疫苗的免疫反应。图4b提出了几种理解基于乳液的佐剂如何工作的机制： 一个主要机制是抗原的缓慢释放延长了时间。乳液滴液的小尺寸允许延长的表面积体积比，这增强了抗原的呈现和抗原呈递细胞的摄取。这种抗原的缓慢释放可以在更长的时间内激活免疫系统，从而产生更强大和更持久的免疫反应。 乳液佐剂还激活了先天免疫系统。乳液滴液被免疫系统识别为异物，导致激活如树突状细胞、巨噬细胞和单核细胞等抗原呈递细胞。然后这些细胞产生促炎细胞因子和趋化因子的复合物，如TNF-α和IL-1β，这进一步激活免疫系统并吸引免疫细胞到注射部位，并形成一个免疫能力环境，以增强抗原向引流淋巴结的运输。 乳液佐剂的另一个重要机制是它们能够诱导体液和细胞免疫反应。乳液滴液可以被抗原呈递细胞摄取，然后将抗原呈递给T细胞和B细胞。T细胞负责直接攻击感染的细胞，而B细胞产生可以中和病原体的抗体。乳液佐剂已被证明可以激活T细胞和B细胞，导致更全面的免疫反应。 总之，乳液佐剂已成为疫苗开发中的重要工具。它们通过几种机制增强对疫苗的免疫反应，包括缓慢释放抗原、激活先天免疫系统以及诱导体液和细胞免疫反应。 3.4.Toll样受体（TLR）激动剂 Toll样受体（TLRs）是一种模式识别受体，对入侵病原体的先天免疫反应至关重要。TLRs是跨膜受体，主要由先天免疫系统的细胞表达。这些受体分为两组：细胞表面TLRs（TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6）和细胞内TLRs（TLR3、TLR7、TLR8和TLR9），它们表达在内体膜上。每个TLR都包含一个跨膜域、一个富含亮氨酸的重复（LRR）段，该段识别病原体相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs），以及一个Toll/白介素-1受体（TIR）域，该域启动下游信号转导并诱导炎症反应。因此，TLRs是佐剂刺激有效免疫反应的有吸引力的靶点，提供对病原体的长期保护。Toll样受体（TLR）激动剂作为疫苗中的佐剂对生命威胁和复杂疾病（如癌症、艾滋病和疟疾）非常有前景。 CpG寡脱氧核苷酸（ODNs）是含有磷酸硫酯骨架的合成DNA分子，其中包含未甲基化的CpG基序。图4c描述了基于TRL的佐剂如何起作用：CpG ODN是一种有效的佐剂，诱导1型辅助T（Th1）反应，并促进细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的产生和干扰素-γ（IFN-γ）的分泌。CpG ODN通过TLR9激活增强了对抗原的特异性体液和细胞免疫反应。由于其独特的特性，CpG ODN可以作为通过肌肉注射、皮下、口服和鼻内途径的疫苗佐剂。作为有效的疫苗佐剂，CpG ODN可以促进抗原的免疫刺激效应，激活抗原呈递细胞（APCs），并加速免疫反应。CpG ODNs促进浆细胞样树突状细胞（pDCs）上主要组织相容性复合体（MHC）、CD40和CD86的表达，并增强抗原处理，导致强大和持久的免疫反应。 3.5.脂质体 脂质体是一种疫苗佐剂，由磷脂和胆固醇组成，是能够包裹抗原和其他免疫刺激性分子的小球形结构。它们是可生物降解的、生物相容的，并且允许进行多样化的结构修改，以实现可调节的特性和毒性。脂质体可用于将抗原传递给抗原呈递细胞，如树突状细胞，这些细胞可以激活免疫系统。此外，脂质体能够增强体液和细胞免疫反应，诱导对清除细胞内病原体和增强抗体反应至关重要的Th1偏向反应，使它们成为疫苗开发中具有吸引力的佐剂。脂质体的一个独特特性是它们能够被修改以针对特定的细胞类型。它们可以被修饰以带有针对树突状细胞上特定受体的抗体或肽，增加脂质体包裹的抗原的摄取。脂质体还可用于共同传递多种抗原或免疫刺激性分子，从而引发更强大的免疫反应，特别是对于可能需要多种抗原才能诱导保护性免疫反应的复杂病原体。 AS01是一种基于脂质体的佐剂系统，包含两种免疫刺激性剂，3-O-去酰基-4'-单磷脂A（MPL）和QS-212。使用AS01佐剂的疫苗包括新开发的疟疾疫苗RTS, S（Mosquirix），以及针对带状疱疹（HZ/su）、HIV和结核病的疫苗候选物。AS01可以促进产生抗原特异性抗体和抗原特异性CD4+ T细胞，这与其他佐剂不同。 3.6.其他佐剂 细胞因子——细胞因子是一类在免疫反应中起重要作用的信号分子。它们由免疫系统的各种细胞分泌，并作用于特定受体以介导一系列生物学功能，如炎症、细胞增殖和分化。根据它们的结构和功能，细胞因子可以分为不同的类别，包括白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子和趋化因子。 聚合物——另一方面，聚合物是由共价键连接的重复单元组成的化合物。它们可以是天然的或合成的，在材料科学、医学和生物技术中有广泛的应用。在疫苗方面，聚合物可以用作载体，创建缓慢释放的储库，在其大的交联结构中包含抗原和其他免疫调节剂。这导致持续的抗原呈现和免疫系统的激活，可以导致更强和更持久的免疫反应。 皂苷——皂苷是具有两亲性质的天然化合物，即它们既有亲水区也有疏水区。它们在传统医学中已被使用数百年，并且有许多潜在的药物应用，包括作为疫苗中的佐剂。皂苷可以通过刺激树突状细胞等抗原呈递细胞以及促进细胞因子和趋化因子的产生来增强免疫反应。皂苷基佐剂的一个例子是QS-21，它与MPL（单磷脂A）一起在AS01佐剂系统中使用。AS01是一种有效的佐剂，已用于开发针对疟疾、结核病和带状疱疹等疾病的疫苗。 病毒体——病毒体由磷脂和病毒包膜蛋白组成，通常来源于不引起人类疾病的病毒。病毒包膜蛋白提供了一个免疫原性表面，可以激活免疫系统，而磷脂有助于稳定病毒体结构并增加其被抗原呈递细胞的摄取。 4.各种疫苗及其佐剂的作用 在本节中，我们讨论了佐剂在各种疫苗中的作用。图5总结了目前主要的已确认疫苗和正在开发的方法。这些包括全病毒疫苗（如减毒活病毒、灭活病毒和病毒载体疫苗）、亚单位疫苗和核酸疫苗（包括pDNA和mRNA）。 图5. 各种疫苗及其佐剂的总结 4.1.灭活疫苗 灭活疫苗通常由病毒感染的细胞生产而成，并经过灭活处理，确保病毒不再具有传染性，但保留了其抗原特性，使其能够用于产生免疫反应。可以向灭活疫苗中添加佐剂以增强免疫反应。铝盐，如氢氧化铝和磷酸铝，是灭活疫苗中最常用的佐剂。它们通过将抗原吸附到其表面来增强免疫反应，这允许抗原缓慢释放，并在更长时间内刺激免疫系统。灭活疫苗中使用的其他佐剂包括MF59、AS03和AS04。MF59是一种油包水乳液，通过在注射部位创建抗原库以及刺激先天免疫系统来增强免疫反应。这些佐剂已在H1N1流感疫苗和人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗等疫苗中使用。在一项研究中，含铝佐剂的CoronaVac灭活疫苗对SARS-CoV-2显示出高效的中和效果。 4.2.减毒活病毒疫苗 减毒活病毒疫苗由于其在注射后能够在宿主系统中迅速扩增，从而实现有效的免疫接种，已成为一种成功的免疫策略。减毒活病毒疫苗是病毒的减弱形式，能够在体内复制但不会引起疾病。因此，它们能够引发强烈且持久的免疫反应。通常不与减毒活病毒疫苗一起使用佐剂，因为疫苗本身就是一种强烈的免疫刺激剂。然而，一些研究已经探索了在减毒活病毒疫苗中使用佐剂以可能增强其有效性。一个例子是使用油包水乳液MF59作为减毒流感疫苗的佐剂，已被证明可以改善老年人的免疫反应。然而，需要更多的研究来确定佐剂与减毒活病毒疫苗的安全性和有效性。 4.3.病毒载体疫苗 复制能力和非复制能力的腺病毒载体通常被用来表达其他病毒蛋白的抗原以进行免疫接种。可以与病毒载体疫苗一起使用佐剂来增强疫苗产生的免疫反应。例如，牛津-阿斯利康COVID-19疫苗是一种病毒载体疫苗，它使用一种弱化的黑猩猩腺病毒来传递SARS-CoV-2刺突蛋白的遗传物质。这种疫苗含有一种名为AS03的佐剂，这是一种由角鲨烷（一种天然油）、聚山梨醇酯80（一种洗涤剂）和维生素E组成的混合物。 4.4.病毒样颗粒疫苗 在这种策略中，结构病毒蛋白被共同表达以形成非感染性颗粒作为疫苗免疫原。它们类似于真正的病毒颗粒，但缺乏病毒基因组。在细胞中生产VLPs，然后进一步重建为稳定和免疫原性形式，是一个多阶段过程。可以在病毒样颗粒疫苗中使用佐剂来增强免疫反应并提高疫苗效果。病毒样颗粒疫苗中常用的佐剂包括铝盐、MF59（油包水乳液）和CpG寡核苷酸（TLR-9激动剂）。这些佐剂刺激免疫系统对VLP疫苗产生更强大和更持久的反应。在某些情况下，VLP本身可以作为佐剂，因为它已被证明可以通过多种途径刺激免疫系统。总的来说，在VLP疫苗中使用佐剂可以帮助增加其效力，减少所需剂量，并提高疫苗覆盖率。 4.5.DNA疫苗 DNA疫苗使用DNA质粒作为载体，将编码抗原的基因转移到宿主细胞中，特别是抗原呈递细胞。这些疫苗的基本原理依赖于将遗传物质传递到细胞核中，激活载体中的哺乳动物启动子，并通过宿主细胞机制启动目标基因的转录。然而，与其他疫苗类型相比，DNA疫苗通常具有有限的免疫原性，这可能限制了它们的有效性。佐剂可以帮助克服这一限制，通过增强对编码抗原的免疫反应。在DNA疫苗中已测试了各种佐剂，包括铝、CpG寡脱氧核苷酸（CpG ODNs）和脂质体。铝已被证明可以增强小鼠对DNA疫苗的免疫反应，但在人类试验中的成功有限。CpG ODNs是模拟细菌DNA的合成分子，可以通过与免疫细胞上的Toll样受体（TLRs）相互作用来激活免疫系统。脂质体是小的脂质囊泡，可以包裹DNA和佐剂，并将它们直接传递给抗原呈递细胞。基于脂质体的佐剂在DNA疫苗的临床前研究中显示出前景。 4.6.mRNA疫苗 mRNA疫苗涉及将mRNA分子直接注射到宿主细胞中，然后在细胞质中翻译成目标蛋白。这些疫苗通常包含一个带有3'聚腺苷酸尾部的开放阅读框（ORF），可以刺激细胞和体液免疫反应。与传统疫苗相比，mRNA疫苗提供了许多优势，如安全性、灵活性、可扩展性和成本效益。mRNA疫苗通常不需要佐剂，因为mRNA分子本身会刺激免疫系统。例如，针对COVID-19的mRNA疫苗使用脂质纳米颗粒传递系统来保护mRNA并促进其进入细胞，但这种传递系统在传统意义上不被视为佐剂。然而，一些研究正在进行中，以探索在mRNA疫苗中使用佐剂以增强其有效性，特别是对于可能对疫苗有较弱免疫反应的某些人群，如老年人。 4.7.基于蛋白质亚单位的疫苗 基于蛋白质亚单位的疫苗只包含来自病原体的特定蛋白质或蛋白质，而不是整个病原体。佐剂通常与基于蛋白质亚单位的疫苗一起使用，以通过增加对蛋白质抗原的免疫反应来增强其有效性。铝盐（如氢氧化铝）是用于基于蛋白质亚单位疫苗的最常用佐剂，因为它们已被证明可以增强对抗原的抗体反应。其他佐剂，如MF59（油包水乳液）、AS03（角鲨烷油包水乳液）和AS04（氢氧化铝和MPL），也已在基于蛋白质亚单位疫苗中使用，以提高其免疫原性。此外，正在研究使用Toll样受体激动剂等新型佐剂与基于蛋白质亚单位疫苗一起使用，以进一步增强其免疫反应。 5.疫苗佐剂的临床试验和许可 开发一种含有佐剂的疫苗是一项艰巨的任务，可能需要数年时间，因为必须确保疫苗的每个组成部分单独和组合时都是兼容的。美国食品和药物管理局下属的生物制品评估和研究中心（CBER）发布了一份指南，以促进新疫苗配方的开发，以应对开发针对传染病疫苗的迫切需求（见图6）。该指南建议从使用适当的动物模型进行临床前测试开始，以评估配方的安全性和免疫原性，包括佐剂对免疫反应的作用。必须包括仅含佐剂和抗原的对照组，以提供佐剂效应的证据。免疫原性评估可能包括体液和细胞反应，如果疾病有动物模型，则可以获得初步的保护效果信息。在临床前测试和疫苗配方的良好生产规范（GMP）生产之后，开始进行人体临床试验。 图6. 疫苗发展的演变阶段 第一阶段研究评估健康个体的安全性和剂量，并获得初步的免疫原性信息。第二阶段a试验涉及数百名志愿者，以评估免疫原性、耐受性和安全性。当测试进入第二阶段b/第三阶段时，重点是确定疫苗目标人群中的免疫原性和效力，随着涉及的志愿者人数增加，研究持续时间也会增加。 在确认疫苗的安全性和效力后，可以对其进行许可和市场推广。然而，配方在第四阶段进行上市后安全性监测，以评估其他罕见的不良反应。这些活动旨在确保根据安全监测结果采取适当的行动。监管机构严格应用药物警戒流程，以评估许可后出现的潜在安全信号。然而，尽管许可后有大量安全信息，但试图建立与疫苗接种的因果关系的评估研究可能是复杂的且结论不一。 曾有疫苗在许可后因证明疫苗与不良事件之间存在因果关系或效力不足而撤回，这改变了风险-效益比。尽管也有例子表明疫苗接种与不良事件之间的所谓因果关系被证明是没有根据的。疫苗制造商和监管机构在安全信号监测或报告新的重要不良事件时采取迅速行动。他们迅速将证据传达给医疗专业人员和公众，以便就当前的风险-效益概况做出明智的决策。 6.疫苗佐剂的临床试验示例 6.1.乳液 MF59是开发疫苗以引发针对HIV的特异性体液和细胞免疫反应的一个例子，这对于预防HIV感染是可取的。在第一阶段临床试验中，研究了使用DNA进行初步免疫，然后用MF59佐剂的重组包膜糖蛋白进行增强的组合疫苗方案，以研究该组合HIV疫苗方案在未感染HIV的成年人中的安全性和免疫反应。此外，灭活流感A/H9N2疫苗有无MF59佐剂在门诊成人中的第二阶段临床试验正在进行，以评估4种不同剂量的纯化单价表面抗原（SA）流感A/H9N2病毒疫苗有无MF59佐剂的安全性，并肌肉注射给门诊成人。Montanide ISA 51和Montanide ISA 720是两种已在临床研究中调查的水包油乳液佐剂。它们具有不同的油对水比例。Montanide ISA 51已在疟疾疫苗的第一阶段和流感疫苗的第二阶段研究中进行了评估，并已在古巴的肺疗疫苗中获得许可。Montanide ISA 720已在疟疾疫苗的第二阶段临床试验中进行了测试。这两种佐剂都已被证明可以促进有效的免疫反应，特别是增强特定的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。然而，观察到短暂的副作用，如发烧、头痛或类似流感的症状，尽管两者似乎都能很好地耐受。AS03佐剂在赛诺菲H1N1流感疫苗中的使用，在健康成人和老年人群的不同剂量水平下进行，以查看身体对不同强度的H1N1流感疫苗的反应，当它在有无“佐剂”的情况下给予时。这项研究还将比较年龄如何影响身体对H1N1流感疫苗的反应。 6.2.基于铝的佐剂 在第一阶段临床试验中，评估了默克0657nI金黄色葡萄球菌疫苗单剂量的安全性、耐受性和免疫原性，有无默克铝佐剂。此外，还评估了MN重组可溶性gp120/HIV-1（MN rsgp120/HIV-1）与QS21有无铝的安全性和免疫原性的扩展评估，在第一阶段试验中进行了评估。 6.3.基于脂质的佐剂 基于脂质的材料已被用作疫苗佐剂，因为其独特的囊泡结构被发现非常适合包裹各种生物活性物质，如DNA和脂肪酸。在早期，科学家们专注于脂质A，LPS的疏水锚，它被认为是一种有效的佐剂，可以显著增加体液和细胞免疫反应。然而，基于脂质A的佐剂由于其高毒性，被认为不适合人类疫苗。相反，GLA-SE和GLA-AF，都是脂质A类似物，已被发现在增强对H5N1的保护方面特别有效，毒性低，副作用有限。GLA-AF也已作为乳液在许多疫苗中作为替代品进行了测试，最值得注意的是在大流行流感中。 6.4.基于Toll样受体（TLR）激动剂的佐剂 TLR3激动剂Poly-ICLC已在黑色素瘤患者的疫苗佐剂安全性研究中进行了研究。这是一项TLR3激动剂Poly-ICLC作为NY-ESO-1蛋白疫苗佐剂治疗高风险黑色素瘤患者的第一阶段开放标签剂量递增研究。疫苗佐剂治疗的目标是训练内源性免疫系统识别和针对最小残留疾病。 6.5.皂苷 基于皂苷的OPT-821已在三价神经节苷脂中用于临床第三阶段试验中的三阴性肉瘤患者。如果三价疫苗能刺激患者的免疫系统产生抗体，识别并针对GM2、GD2和GM3糖，则患者的抗体可能会攻击并杀死任何剩余的肉瘤细胞，可能防止肉瘤复发。MatrixMTM也在大流行流感和RSV疫苗的第一阶段和第二阶段临床试验中进行了测试，并显示出安全和良好耐受性，增强了体液和细胞免疫反应。其他基于皂苷的佐剂，如QS-21，已在癌症疫苗和传染病疫苗的临床试验中进行了评估，并显示出诱导强烈的免疫反应和提高疫苗效力。然而，它们的复杂结构和可变组成可能会影响它们的一致性和可重复性，它们潜在的毒性和溶血活性需要在dLNs的临床前和临床研究中仔细评估。由MPL和QS-21组成的AS02正在进行疟疾疫苗的第二阶段试验。 6.6.核苷酸 CpG ODN、dsRNA和IL-12 DNA等佐剂成分是激活模式识别受体（PRRs）以刺激免疫反应的核苷酸基佐剂的例子。例如，dsRNA可以分泌IFN-a和IFN-c等细胞因子，通过TLR3、MDA-5和NLRP3炎症体信号传导，目前正在流感和狂犬病疫苗的临床试验中进行。用IL-12 DNA佐剂的DNA疫苗被引入以提供针对广泛HIV变体的高效保护，最近的试验表明它们耐受性良好，可以增强免疫反应。Pika佐剂是另一种核苷酸基佐剂，是dsRNA的合成类似物，用卡那霉素和钙稳定，促进干扰素、IL-2和IL-12的产生。这种佐剂可以将主要产生体液免疫的预防性疫苗转变为具有强大细胞免疫的治疗性疫苗。 6.7.细胞因子 在最近的研究中，分子佐剂已被证明能有效刺激免疫反应，特别是在亚单位疫苗中。例如，IL-2和GM-CSF细胞因子已在针对口蹄疫的疫苗中进行了研究，GM-CSF目前正在乙型肝炎和HIV疫苗中进行评估。其佐剂效应归因于其促进巨噬细胞分化和增殖的能力，以及激活抗原呈递细胞。同样，IL-12和IL-15已被作为HIV疫苗的佐剂在第一阶段临床试验中使用。这些细胞因子已证明能够刺激NK细胞和T细胞增殖。 6.8.病毒体 病毒体是包膜的病毒样颗粒，已在欧洲获得许可，用于针对甲型肝炎和流感的疫苗，并已在恶性疟和慢性丙型肝炎疫苗的临床试验中使用。 6.9.肽 肽，MUC1-poly-ICLC疫苗正在第二阶段试验中进行测试，旨在评估MUC1疫苗在增加患结直肠癌风险的受试者中的抗体和T细胞反应，这些受试者有晚期腺瘤的病史。MUC1-poly-ICLC疫苗正在开发中，以防止息肉发展成结肠癌，并防止息肉复发，这有助于体内免疫系统识别MUC1的变化，这些变化伴随着癌症的进展，并消除产生异常的细胞1。 6.10.其他 其他形式的佐剂也在临床试验中进行调查。一项针对研究性PIKA（基于聚肌苷酸-聚胞苷酸的佐剂）狂犬病疫苗的第一阶段临床研究，包括灭活和纯化的狂犬病病毒和PIKA佐剂，是为了评估疫苗组合在健康成年志愿者中的临床安全性，并根据加速疫苗方案评估疫苗的效力。Mayo Clinic与Agri-King Corporation合作开发了一种名为AKSB（Agri-King Synbiotic）的新型合生元。AKSB在65岁以上正常人类志愿者中进行的第一阶段安慰剂对照试验，旨在研究当患者同时接受流感疫苗时这种益生菌的安全性。磷酸钙，以羟基磷灰石的形式，已在法国获得许可，用于白喉、破伤风、百日咳和脊髓灰质炎疫苗。磷酸钙被认为是人体内的天然化合物，并且耐受性良好，使其成为可能替代铝佐剂的潜在替代品，后者可能有不良副作用。作为TLR5配体的细菌鞭毛蛋白也显示出佐剂效应，导致混合的Th1和Th2反应。在临床试验中，一种双价P. aeruginosa鞭毛蛋白佐剂疫苗帮助囊性纤维化患者降低了感染P. aeruginosa的风险。多糖是另一种可能的佐剂，可以增强疫苗的免疫反应，并促进细胞免疫、体液免疫和粘膜免疫。还有一些新型佐剂结合了上述几种佐剂，有效成分协同作用以产生最佳免疫反应。 7.针对COVID-19的疫苗佐剂 COVID-19大流行凸显了需要一种安全有效的疫苗来控制SARS-CoV-2病毒的传播。开发理想的疫苗需要广泛的研究和资源，以确保它满足当前情况的需求。疫苗旨在诱导保护性免疫反应，可以预防或减轻病毒感染的严重程度。 7.1.COVID-19疫苗中佐剂的好处 在COVID-19疫苗中使用佐剂有几个原因/动机：1)一个有效的COVID-19疫苗的主要要求之一是其能够刺激强大的免疫反应，能够产生高水平的中和抗体。为了实现这一点，疫苗可能需要多剂或佐剂。佐剂可以帮助减少疫苗中所需的抗原量，从而降低其成本。2)在SARS-CoV-2疫苗中加入合适的佐剂可以通过减少产生保护性免疫反应所需的抗原量来满足这些要求。疫苗的生产和分配应该是成本效益和可扩展的，以满足压倒性的需求。由于大流行影响了世界上大多数国家，因此迫切需要一种可以快速高效生产和分发的疫苗。3)此外，佐剂还可以通过提供持久的免疫反应和扩大其对不同病毒株的保护范围来增强疫苗的效力。因此，针对COVID-19的佐剂疫苗的研究和开发对于开发一种安全、有效和具有成本效益的疫苗以控制大流行至关重要。 7.2.针对Covid-19的许可佐剂和候选物。 NVX-CoV2373是由Novavax开发的有希望的疫苗候选物，用于预防COVID-19。它是一种基于蛋白质的疫苗，是使用导致COVID-19的SARS-CoV-2病毒的第一株的基因序列创建的。S蛋白是COVID-19疫苗的关键靶点，因为它是病毒附着和感染人类细胞的主要手段。为了增强免疫反应并刺激高水平的中和抗体，NVX-CoV2373与Novavax的专利皂苷基Matrix-M™佐剂配方。这种佐剂经过广泛测试，并已证明通过刺激抗原呈递细胞进入注射部位并在局部淋巴结中增强抗原呈递，从而增强免疫反应，具有强大且耐受良好的效果。这种基于蛋白质的疫苗候选物旨在教会免疫系统如何识别和对抗SARS-CoV-2病毒，提供针对COVID-19的保护。临床试验表明，NVX-CoV2373在预防COVID-19方面非常有效，总体有效率高达90%以上。获批后，NVX-CoV2373在抗击COVID-19中可能发挥关键作用，特别是在其他疫苗可能不太容易获得或有效的地区。世界上已经授权了几种COVID-19疫苗用于紧急使用，其中一些使用了佐剂。例如，AstraZeneca COVID-19疫苗使用MF59佐剂，这是一种角鲨烷油的水包油乳液，以增强疫苗的免疫反应。Sinovac COVID-19疫苗使用铝佐剂，这是一种帮助增强免疫反应的铝盐。 8.新型疫苗佐剂的发展 8.1.新型佐剂的设计原则 为了开发有效的佐剂疫苗，了解佐剂的工作原理并遵循一些设计原则非常重要。问题导向原则涉及考虑四个主要问题：(1)预防特定病原体引起的疾病所需的免疫反应类型，(2)能够诱导所需免疫反应的相关固有免疫细胞，(3)这些固有细胞亚群在体内的定位，以及(4)这些细胞上模式识别受体（PRRs）的表达。基于这些问题，在设计疫苗佐剂时需要考虑四个步骤。首先，应该确定疫苗效力在宿主中所需的免疫效应元素类型。这应该考虑到抗原类型、目标细胞亚群和表型、免疫途径，以指导选择传递系统和免疫刺激剂。由于PRRs是产生有效疫苗生成的关键靶点，因此在设计疫苗佐剂时，评估相关固有免疫细胞在体内的定位和目标细胞上的PRR表达非常重要。不同的PRR信号通路可能被用来开发针对不同侵略的定制响应。其次，合适的疫苗抗原的确定应该基于对免疫识别和保护的分子机制的理解。合适的抗原还应该能够在目标人群中实现疫苗诱导的响应。此外，疫苗必须向适当的细胞群体呈现足够数量的正确构象的抗原，以诱导免疫反应保护，同时考虑诱导的炎症反应的耐受性和安全性。第三，佐剂需要一个传递系统，无论是合成的还是天然的。这需要设计感兴趣的抗原的适当传递方式，结合相关的免疫刺激剂。第四，疫苗和佐剂的制备过程应该简单。例如，如果不需要特殊的乳化剂，生产过程就更加简单。如果佐剂与抗原的比例较低，可能会增加疫苗改进的范围。 8.2.新型疫苗的佐剂配方 已经为已获许可产品中包含的佐剂建立了几种配方方法。这些包括用作吸附剂的不溶性铝盐、易于注射的低油含量、油包水乳液和脂质体传递系统。虽然成分不同，但这些系统有一些显著的相似之处，因为它们都是作为纳米颗粒制造的。此外，这些系统可以作为抗原和免疫增强剂（包括TLR激动剂）的有效“传递系统”。适当选择佐剂的免疫刺激剂和配方组分对于诱导适当的免疫反应以控制目标病原体至关重要。同一免疫调节分子的不同配方可能会诱导大不相同的免疫反应，正如在疟疾疫苗计划中所证明的。例如，用AS02配方的RTS,S疫苗候选物保护了七个疫苗接种者中的六个免受感染，而相同的抗原与AS03或AS04分别只保护了七个中的两个或八个中的一个。为了构建改进的佐剂，确保每个组分都是必要的，并增加明确的价值，同时不引入重大的不合理责任至关重要。AS01目前在获许可产品中包含的最成功的佐剂，对带状疱疹的有效性>97%。AS01佐剂的开发基于两个关键组分，MPL和QS-21，当一起使用时会产生固有激活的协同作用。这种协同作用不能单独使用任一分子实现，并且开发了一种脂质体传递系统，将两种免疫增强剂共同传递给相同的免疫细胞群体。此外，脂质体配方在减少QS-21诱导显著局部和全身反应原性的潜力方面也是有效的。然而，新型系统疫苗学方法可以用来识别新的佐剂途径和配方，这些可以用来设计下一代佐剂。 8.3.推进系统疫苗学 Bali等人提出了一种基于系统疫苗学的跨学科方法，以加速临床中佐剂的发现和开发，该方法涉及早期使用人类研究来生成“组学”数据，这些数据可以用来制定关于候选佐剂如何刺激强大和持久的抗原特异性T和B细胞反应的新假设。然后可以在动物模型中重新测试这些假设，随之而来的机制见解可以用来设计新的佐剂概念。所提出的佐剂开发框架更加强调在它们的发展管道早期进行许多潜在佐剂概念的小型临床试验（0/I期），这可以快速测试新的佐剂并使用系统疫苗学方法获得机制见解。此外，系统疫苗学方法可以用来定义佐剂的作用机制，以及配方的作用基础机制，疫苗接种后不久发生的不良反应的潜在机制，以及疫苗传递的最佳配方的合理设计。总的来说，这种基于系统疫苗学的跨学科方法有潜力转变佐剂科学，并为疫苗中使用的新佐剂的开发注入活力。 8.4.非侵入性疫苗传递 非侵入性疫苗传递研究是一个关键焦点，可能对全球大规模疫苗接种活动产生重大影响。开发安全、有效、低成本的疫苗配方和佐剂，以产生期望的免疫反应和长期免疫，是一个优先事项。广泛的研究已经导致了几种新的佐剂的开发，这些佐剂目前正在临床试验中或已获许可。一个研究领域集中在开发安全并提高非侵入性传递疫苗效力的含脂佐剂。然而，需要更多关于佐剂分子刺激后细胞表面受体之间相互作用的信息，以及这些佐剂与现有或新型配方的兼容性。随着我们对免疫保护所涉及的分子机制的理解提高和合成化学中的新方法的发展，预计疫苗开发将取得突破。新的技术，如新的糖苷共轭方法、反向疫苗学和下一代测序技术，应该能够为带状疱疹病毒、百日咳毒素、莱姆螺旋体病和HPV等疾病带来新的疫苗策略，无论是否使用佐剂。研究界旨在通过引入新的免疫刺激剂和结合效力、持久记忆免疫反应和安全性的新型传递系统，确保高水平的广泛保护。这种新方法将不再仅仅依赖于结构疫苗学，因为目标表位的变异性和新病原体和肿瘤抗原的不断出现。 9.结论和展望 佐剂在疫苗开发中发挥了近一个世纪的关键作用，增强了免疫原性。最初，佐剂的选择主要是经验性的，但最近的进展导致了更有针对性和合理的方法。对免疫系统的更深入理解使更有效的疫苗配方的开发成为可能。本综述概述了疫苗中使用的佐剂，从传统到COVID-19疫苗，重点关注它们的类型、对免疫反应的作用机制，以及它们在疫苗配方中的作用。这些见解为选择适合传统和冠状病毒疫苗的佐剂奠定了基础。 了解各种佐剂对免疫反应的影响、它们与不同类型的抗原和疫苗平台的协同作用，以及对这些佐剂的全面分析，将有助于选择提供必要免疫保护的佐剂。像基于铝的盐、TLR激动剂、乳液和其他新型选择的佐剂具有独特的理化性质，显著影响免疫反应的强度、持续时间和类型。这些新型佐剂已经增强了流感疫苗和乙型肝炎和HPV疫苗。 随着COVID-19等新兴疾病的持续挑战以及寻找更明确的治疗方法，开发安全有效的疫苗至关重要。更有信息的佐剂和抗原选择不仅可以增强对传统疫苗反应不佳的人群的保护，还可以开辟预防应用之外的新途径。这种方法在应对当前和未来的全球健康挑战中可能至关重要。 为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。 名称：2024第三届新型疫苗研发峰会 时间：2024年8月16-17日（周五-周六） 地点：苏州（酒店定向通知） 主办单位：四叶草会展、生物制品圈 媒体支持：药时空、抗体圈、细胞基因研究圈 会议费用：点击二维码即可查询。 报名方式：扫描下方二维码→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，免交报名费，承担一定工作任务）！ 转发分享福利：疫苗研发企业、科研院校和监管机构人员，前30位报名人员转发分享会议信息可免费参会（不含餐饮）报名后，扫描下方二维码加工作人员微信后，发送截图即可。 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请，最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 大会日程 已经确定的报告人 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：大多数疫苗都是通过肌肉接种。皮肤含有大量的抗原提呈细胞，被认为是疫苗接种更具免疫原性的部位。皮内接种已被批准用于提高流感疫苗的效力和节省流感疫苗剂量。为了应对最近暴发的猴痘疫情，皮内接种也被批准通过延长有限的猴痘疫苗剂量，以免疫更多有风险的人。疫苗佐剂的加入有望进一步提高皮内接种效力，节省更多疫苗剂量。然而，与肌肉接种相比，皮内接种与更显著的局部反应有关。因此，适合于皮内接种的佐剂应具有良好的局部安全性，而不会引起明显的局部反应。本文介绍了目前已批准用于人类疫苗中的佐剂及其皮内给药的相对反应原性、具有良好局部安全性可用于皮内接种的新型化学和物理佐剂，同时对开发物理佐剂的合理性、物理佐剂的类型以及物理佐剂用于皮内接种的独特优势也进行了介绍。1.皮肤结构皮肤覆盖全身，具有重要的生理功能，如防止热量和水分流失，防止环境病原体感染。皮肤可分为3层：角质层(SC)、表皮层和真皮层。SC层位于皮肤的最外层，由角质细胞组成，是终末分化的角质细胞，并且具有高度的亲脂性。SC层承担皮肤的主要屏障作用。表皮位于SC层之下，主要由角质细胞（90%）组成，中间散布着朗格汉斯细胞（LC，3-5%），作为免疫哨兵）。表皮层还含有黑色素细胞，可根据其密度和黑色素含量赋予皮肤特殊的颜色。表皮层下面是真皮层，它比SC层和表皮层包含更多的解剖结构。真皮层中含有汗腺和毛囊，以及血液和淋巴管网和神经纤维。真皮层还包含多种类型的细胞，包括成纤维细胞和先天性免疫细胞，如树突状细胞（DC）、巨噬细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞。有趣的是，皮肤还含有大量的T淋巴细胞，其中大部分是表皮和真皮层中皮肤驻留记忆T细胞。皮肤先天性免疫细胞是抵御病原体感染的第一道防线，也有助于诱导病原体或疫苗特异的适应性免疫应答。图1显示了带有常驻天然免疫细胞的简化皮肤模型。图1.皮肤结构和固有免疫细胞的图解：皮肤包含3个主要层：角质层、表皮和真皮。表皮含有朗格汉斯细胞，真皮含有树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞为主的天然免疫细胞。2.皮内疫苗接种及其好处由于肌肉注射的便利性，仅需要简单培训即能操作，因此大多数疫苗都是通过肌肉接种进行免疫。过去20-30年的大量研究发现，将疫苗接种途径从肌肉途径改为皮内途径可以诱导更有效的免疫反应。免疫原性更强的皮内接种在很大程度上可以归因于皮肤而不是肌肉中存在丰富的抗原提呈细胞，如表皮LC和真皮DC。抗原提呈细胞(主要是真皮DC)负责真皮内疫苗抗原在主要组织相容性复合体(MHC)I或II分子上的摄取和递呈，然后迁移到引流淋巴结，引发抗原特异性T和B细胞应答。皮内接种疫苗还可以激活局部先天性免疫细胞来分泌细胞因子和趋化因子，并招募循环中的先天免疫细胞，从而促进疫苗引起的局部反应。皮内接种有望能提高疫苗功效并节省疫苗剂量。最近的一项综述研究发现，在老年人中，皮内递送流感疫苗通常比肌内或皮下注射更具免疫原性。另外，在年轻人中，皮内接种低剂量流感疫苗（6或9µg）与肌肉注射全剂量疫苗（15µg）引起的免疫反应相当。除了流感疫苗外，皮内接种也能有效增强其他疫苗诱导的免疫反应，例如狂犬病疫苗和乙型肝炎疫苗。由于近期猴痘疫情暴发以及猴痘疫苗短缺，美国食品和药物管理局(FDA)授权皮内接种猴痘疫苗，以扩大疫苗剂量，让更多高危人群获得免疫接种。3.皮内接种的局限性皮内接种虽然提高了疫苗的免疫原性，但提高的程度相对较弱。皮内接种只能节省40-60%的流感疫苗剂量。在老年人中，皮内接种仅能将H1N1株的血清转换率从40%提高到52.3%，将H3N2株的血清转换率从49.1%提高到61.3%，将B型株的血清转换率从56.4%提高到61.3%。另一项研究也发现了类似的结果，即通过皮内接种流感疫苗，老年人的血清转换率仅略有增加。疫苗佐剂的加入有望进一步提高疫苗效力并节省更多的疫苗剂量。然而，添加佐剂的皮内疫苗面临着诱发严重局部反应的风险。研究一致发现，与肌肉接种疫苗相比，不含佐剂的皮内接种疫苗会诱发更频繁、更严重的局部不良反应。皮肤中存在的各种类型的先天性免疫细胞（如LCs、DCs、巨噬细胞）可以解释这种情况。这些细胞有助于增加抗原摄取和更有效的适应性免疫，同时通过合成和释放细胞因子和趋化因子以及招募外周中性粒细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞而引起局部不良反应。因此，用于皮内接种的佐剂需要比用于肌肉注射的佐剂具有更好的局部安全性。本综述侧重于介绍用于预防传染病疫苗的皮内接种佐剂，尽管这种途径对其他疾病（例如过敏和恶性肿瘤）的疫苗接种也很有吸引力。本综述还重点介绍佐剂如何增强皮内蛋白和亚单位疫苗诱导的免疫反应。此外，具有佐剂效应的疫苗/佐剂制剂（如聚合物纳米颗粒、脂质体）（至少有一部分是由二者联合引起的），不包括在本综述中。4.已获批准的佐剂及其皮内反应原性疫苗佐剂在开发新型疫苗和改良疫苗方面发挥着关键作用，因此在21世纪受到越来越多的关注。美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）于2008年启动了"佐剂开发计划"，以支持新型佐剂的筛选、鉴定和临床前/临床开发。随着对这一领域的兴趣和投资不断增加，在过去二十年中，有五种佐剂被批准用于人类，而在过去八十年中，只有两种佐剂被批准用于人类（表1）。有趣的是，所有这些佐剂都被批准用于肌肉接种。如果没有皮内反应原性数据，则根据其肌肉注射后的局部不良反应来预测其皮内给药后诱发局部不良反应的可能。局部不良反应可能是皮肤红斑、肿胀、变色或组织学变化，如组织坏死或细胞死亡，或局部炎症反应，或细胞因子和趋化因子释放及免疫细胞浸润等。表1.目前批准的佐剂及其皮内反应原性l明矾佐剂明矾佐剂是一种铝盐类佐剂。临床上明矾佐剂主要以氢氧化铝为基础，由于纤维状纳米颗粒（图2A）或磷酸铝形成板状纳米颗粒的聚集而形成广泛的微米结构（0.5-10微米）。明矾佐剂是全球使用最广泛的佐剂，它已被用于多种儿童疫苗，如百白破（破伤风、白喉和百日咳）、乙型肝炎、乙型流感嗜血杆菌疫苗，明矾佐剂主要增强Th2细胞的抗体反应，但诱导细胞介导免疫反应的能力较弱。将明矾佐剂注射到肌肉组织中会引起明显的组织应激和细胞死亡。腹膜内注射明矾佐剂后也能观察到类似的现象。肌内注射明矾佐剂会诱导细胞因子/趋化因子的大量释放并快速募集中性粒细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞。研究发现，在小鼠皮肤中皮内注射Imject（一种实验性明矾佐剂）可诱导高密度炎症细胞浸润，并持续至少四天。由于明矾佐剂会诱发严重的组织应激和炎症，因此在皮内注射后很有可能诱发严重的局部反应。lAS04佐剂AS04佐剂是通过将MPL（3-O-去酰基-4'-单磷酰脂质A）吸附在氢氧化铝佐剂上制备的组合佐剂（图2B）。MPL是一种Toll样受体(TLR)4激动剂。MPL/TLR4结合激活骨髓分化初级反应88(MyD88)和下游信号通路，导致核因子-κB(NFκB)和激活蛋白(AP)-1激活以及促炎细胞因子基因表达。AS04被批准用于增强人乳头瘤病毒疫苗的效力。研究发现，与明矾佐剂疫苗相比，AS04佐剂疫苗可在局部注射部位诱导更高水平的细胞因子和趋化因子，并在引流淋巴结中募集更多数量的单核细胞和DC。研究发现，与不含佐剂的疫苗相比，含有AS04佐剂的疫苗会引起更频繁的局部反应，例如疼痛、发红和肿胀。局部不良反应可在几天内消失。研究发现AS04佐剂可诱导更平衡的辅助性T细胞1(Th1)/Th2免疫反应。我们之前的研究发现。皮内注射MPL/明矾佐剂会引起皮肤真皮组织红斑和肿胀，并伴有大量炎症细胞浸润。这些数据表明AS04佐剂在皮内递送后诱发严重局部反应的风险很高。lAS01佐剂AS01是一种含有MPL和QS21的脂质体制剂，QS21是从肥皂树（Quillajasaponaria）中纯化的皂苷成分（图2C）。AS01佐剂已被批准用于提高疟疾RTS,S疫苗的功效。研究发现AS01佐剂可诱导Th1为主的免疫反应，而对Th2反应的诱导较弱。研究发现肌肉注射AS01佐剂被快速清除，3h时AS01水平显著降低，24h后几乎检测不到AS01水平。AS01诱导细胞因子的短暂表达，该表达在24h内达到峰值，然后迅速消退。AS01还诱导中性粒细胞和单核细胞迅速聚集到注射佐剂的肌肉中。考虑到AS01含有MPL，预计局部细胞因子和趋化因子的刺激至少部分是由TLR4和下游MyD88信号通路的刺激引起的。研究发现MPL和QS21能协同激活驻留淋巴结的自然杀伤细胞(NK)和CD8+T细胞并促进早期干扰素(IFN)γ产生，该细胞通过白细胞介素(IL)-18分泌通过荚膜下的巨噬细胞控制白细胞介素(IL)-18分泌，并得到IL-12支持。MPL和QS21的协同作用以及对局部炎症的强烈诱导表明，AS01佐剂在皮内给药后诱发显著局部反应的风险很高。这种作用由巨噬细胞通过白细胞介素（IL）-18的分泌来控制，并得到IL-12的支持。MPL和QS21的协同作用以及对局部炎症的强烈诱导表明，AS01佐剂在皮内给药后诱发显著局部反应的风险很高。lMF59和AS03佐剂MF59和AS03是基于角鲨烯水包油型纳米乳液佐剂。角鲨烯是一种天然三萜油，作为动物和人类胆固醇合成过程中的一种生化中间体。角鲨烯的可生物降解性使其成为佐剂配方中的安全成分。MF59和AS03分别由Novartis和GlaxoSmithKline（GSK）开发，化学成分略有不同（图2D）。MF59的主要油相成分是角鲨烯，而AS03的油相中含有角鲨烯和α-生育酚（维生素E）。α-生育酚还具有可生物降解性和免疫调节功能。关于表面活性剂，MF59含有两种表面活性剂（Tween80和Span85），而AS03仅含有聚山梨醇酯80（Tween80）。MF59最初被批准用于提高欧洲老年人接种季节性流感疫苗功效。MF59最近在美国被批准用于增强老年人季节性流感疫苗（FluadQuadrivalent）的效力以及大流行前H5N1疫苗（Audenz）的效力。AS03最初被批准用于增强欧洲2009年甲型H1N1流感大流行期间的2009年甲型H1N1大流行流感疫苗(Pandemrix)效力，后来被批准用于增强美国大流行前H5N1疫苗的效力。研究发现MF59和AS03佐剂可诱导偏向Th2的免疫反应，而对Th1反应的诱导较弱。肌内注射MF59佐剂会诱导组织应激和细胞死亡。此外，MF59的清除不依赖于抗原，在肌肉中的清除半衰期为42h。研究发现，尽管时间招募模式相同，但发现肌内注射MF59比肌内注射明矾更能有力地募集中性粒细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞。与肌内注射后的明矾佐剂相比，肌肉注射MF59佐剂可诱导多种细胞因子和趋化因子释放模式。皮内注射MF59样AddaVax佐剂可强烈诱导中性粒细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞，注射后4d，中性粒细胞和单核细胞水平显著升高。皮内注射AddaVax佐剂还可诱导各种细胞因子和趋化因子的延长表达至少4d。这些数据表明MF59佐剂在皮内递送后诱发严重局部反应的风险很高。研究发现，肌内注射AS03佐剂可持续诱导至少7d的细胞因子表达（例如C-C基序趋化因子配体2(CCL2)、IL-1β）。AS03比明矾佐剂诱导更强的细胞因子表达。AS03佐剂中的α-生育酚可通过激活巨噬细胞和单核细胞显著增加细胞因子的表达,AS03佐剂可诱导脂质代谢快速且短暂的下调，导致细胞内脂质水平升高，诱导内质网(ER)应激并激活未折叠蛋白反应途径。此外，消耗髓系细胞中ER应激激酶传感器肌醇需要的跨膜激酶内切核糖核酸酶-1α(IRE1α)会减少AS03佐剂诱导的细胞因子表达和高亲和力抗体的诱导。局部炎性细胞因子和趋化因子以及ER应激的强烈诱导表明AS03佐剂也可能在皮内递送后诱导显著的局部反应。lMatrix-M佐剂Matrix-M佐剂由两种独特的40nm颗粒配方制成，来自皂苷提取物的两种组分（组分A和C）（图2E），并已被纳入最近批准的基于蛋白质的Novavax新冠疫苗（NVX-CoV2373），用于新型冠状病毒肺炎大流行期间的紧急使用。每种纳米颗粒制剂均由皂苷A或C部分以及胆固醇和磷脂制成。Matrix-M佐剂被发现可诱导偏向Th1的免疫反应。研究发现，含有Matrix-M佐剂的新冠疫苗与无效对照剂相比更容易引起局部反应（第一剂：57.6% vs 17.9%；第二剂：79.6% vs 16.4%）。大多数局部不良反应为轻度或中度，并在3天内消失。Matrix-M佐剂可刺激猪单核细胞和淋巴细胞表达IL-1β和C-X-C基序趋化因子配体8(CXCL8)，但不表达肿瘤坏死因子α(TNFα)或IL-6。猪体内肌肉注射Matrix-M佐剂可诱发以中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞浸润为特征的急性炎症。局部不良反应还包括大多数猪的出血和部分猪的坏死。Matrix-M佐剂组比生理盐水对照组出现发红的频率更高。与对照相比，Matrix-M佐剂显着增加了384个基因表达并降低了162个基因表达。al,2012).在上调最多的基因中，23个中有10个与干扰素调节基因(IRGs)有关。尽管迄今为止还没有研究探索Matrix-M在促进皮内疫苗接种方面的有效性和安全性，但一项研究发现在猪模型中皮内给药脂质体中的QS-2（另一种基于皂素的佐剂）会剂量依赖性地诱发局部不良反应，如红斑、肿块和结痂。人类受试者肌肉注射免疫后出现较频繁的局部不良反应，至少一些猪出现强烈的局部炎症反应、出血和坏死，以及与之密切相关的QS-21佐剂皮内递送后诱发局部不良反应的剂量依赖性，都表明Matrix-M佐剂皮内递送后诱发严重局部反应的风险很高。lCpG 1018CpG 1018是一个未甲基化的含CpG基序的寡核苷酸。CpG 1018可激活TLR9和MyD88信号通路，从而激活各种转录因子，如NFκB、AP-1和干扰素调节因子（IRF），并控制细胞因子的表达，如TNFα、IL-1β、I型干扰素和IL-12。CpG1018刺激偏向Th1的抗体反应和细胞介导的免疫反应。CpG 1018已被纳入最近批准的乙肝疫苗。添加CpG 1018佐剂的乙肝疫苗被发现比添加明胶佐剂的乙肝疫苗诱导更有效的免疫反应。与物种特异性CpG寡核苷酸不同，CpG 1018在啮齿动物、非人类灵长类动物和人类中具有广泛的响应，从而在临床前和临床研究中不需要改变CpG序列。研究发现皮内注射小鼠特异性CpG只会诱发轻微的局部反应和低水平的免疫细胞招募。CpG 1018预计具有较低的皮内反应原性，有望安全地促进皮内疫苗接种。 图2.目前批准的颗粒状佐剂:A.氢氧化铝佐剂。B.AS04佐剂是由MPL吸附在氢氧化铝助剂上制备的。C.用脂质体包裹MPL和QS21制备AS01佐剂。D.角鲨烯纳米乳剂MF59和AS03佐剂。E.由两种皂素提取物(组分A和C)制成的两种纳米颗粒制剂组成的Matrix-M佐剂总之，大多数已批准的佐剂在皮内给药后诱发严重局部反应的风险很高。有趣的是，预测皮内反应原性较高的化学佐剂本质上都是自然界中微粒（表1），它们会强烈激活局部先天性免疫系统并诱发明显的局部反应。CpG1018可能是个例外，因为它能诱导轻微炎症，而不会引起明显的局部反应（图3A）。图3.皮内接种安全佐剂的化学结构A.CpG 1018。DNA骨架进行硫代修饰以提高佐剂的稳定性。B.具有六个14碳侧链的合成GLA。C.咪喹莫特。D.Poly(I：C)。E.cGAMP。F.PCPP聚合物。5.用于安全皮内接种的其他化学佐剂由于担心已获批准的佐剂具有较高的局部反应原性，人们还探索了其他化学佐剂的安全性和有效性，以促进皮内疫苗接种。其中几种佐剂已进入临床试验阶段。由于疫苗佐剂在皮内给药后有可能诱发明显的局部反应，因此本综述不包括未报告局部安全性数据的佐剂。lGLA-AF佐剂几种已获批准的佐剂，如AS01和AS04，都含有MPL作为提升疫苗接种效果的主要成分。虽然MPL还没有被批准作为一种独立的佐剂，但我们在小鼠模型中发现MPL皮内注射引起了轻微的炎症，没有明显的局部不良反应。Carter等人评价了一种合成的TLR4激动剂(GLA-AF)(图3B)以促进雪貂和人类皮内接种H5N1疫苗，并发现GLA-AF对于皮内接种H5N1疫苗在雪貂中诱导单针保护和在人类中诱导血清保护至关重要。此外，在人类临床研究中，加入GAL-AF的H5N1疫苗没有在豚鼠体内引起体温上升或体重下降，并没有引起一过性红斑和其他明显的不良反应。这项研究表明GLA-AF和其他可能的TLR4激动剂用于皮内接种的有效性和安全性。l外用咪喹莫特佐剂FDA批准外用咪喹莫特乳膏(5%阿尔达拉)用于治疗各种疾病，如光化性角化病、浅表性基底细胞癌和外生殖器疣。咪喹莫特是一种TLR7激动剂(图3C)并激活TLR7-MyD88信号通路，导致NFκB和IRF7的激活以及促炎细胞因子和I型干扰素基因的表达。有趣的是，外用咪喹莫特乳膏的载体也可能有助于观察到的疗效，因为在没有咪喹莫特的情况下，诱导激活炎症小体、角质细胞死亡和IL-1释放。在一项双盲、随机对照的临床试验中，在皮内接种流感疫苗前局部应用咪喹莫特乳膏可以获得更高的疫苗病毒株血清转换率和更好的非疫苗病毒株血清转换率。最常见的局部不良反应是1级红肿，尽管与其他组没有统计学差异，但局部应用咪喹莫特组红肿发生率更高。在炎症性肠病(IBD)患者中，外用咪喹莫特乳膏后皮下注射乙型肝炎疫苗的血清保护率明显高于外用水乳膏后肌肉注射疫苗的血清保护率。虽然局部咪喹莫特组引起更频繁的瘙痒和肿胀，但各组之间的局部不良反应无明显差异。这些结果表明，外用咪喹莫特乳膏可显著提高皮内疫苗的疗效，且总体上具有良好的局部安全性。lPoly(I:C)佐剂聚肌胞苷酸(Poly(I:C))是双链RNA(dsRNA，图3D)的合成类似物，可根据位置激活两种不同的信号通路。内质多聚体(I:C)激活TLR3并诱导IL-12和I型IFN产生，而胞质多聚体(I:C)可激活视黄酸诱导基因I(RIG-I)和黑色素瘤分化相关蛋白5(MDA-5）并增强I型干扰素的产生。Poly(I:C)还用于皮内或透皮疫苗接种，以诱导针对各种类型传染病的有效免疫反应。Weldon等人发现，当在小鼠模型中将Poly(I:C)佐剂亚单位流感疫苗涂覆在微针表面时，可引发与单独的亚单位疫苗类似的免疫反应和保护佐剂效果不明显，可能与该研究中使用的Poly(I:C)剂量相对较低有关（1µg）。在另一项研究中，Bardel等人发现25µg Poly(I:C)可以显著增强皮内HIV-1gp140或HSV-2gD糖蛋白诱导的全身和粘膜抗体反应以及在HSV-2攻击研究中对小鼠模型的保护作用，而不会明显增强小鼠模型中对皮肤反应原性的保护作用。这项研究表明，皮内接种添加Poly(I:C)佐剂的HIV-1gp140或HSV-2gD糖蛋白疫苗具有良好的安全性和效力，可诱导有效的粘膜免疫。Du等人发现，将白喉毒素（DT）和Poly(I:C)封装到脂质体中，然后以空心微针为基础进行皮内给药，与单独以空心微针为基础进行皮内单独接种DT相比，可显著增强DT特异性IgG2a抗体反应。有趣的是，该研究中使用了相对较低的poly(I:C)剂量（0.31µg），但并未观察到总IgG或IgG1抗体反应的显著增强。最近，在一项1期临床研究中测试了用聚-L-赖氨酸稳定的poly(I:C)与光化学内化（PCI）相结合增强人乳头瘤病毒多肽疫苗接种的效果，光化学内化是一种通过光诱导过程促进内吞抗原的胞体释放，从而促进诱导细胞介导的免疫反应的技术。尽管没有研究基于poly(I:C)佐剂在增强人乳头瘤病毒多肽疫苗接种方面的效力，但研究发现，当光敏剂剂量低于一定阈值时，整体对研究对象是安全的。上述研究表明，poly(I:C)佐剂用于加强皮内接种具有良好的安全性。lcGAMP佐剂2′3′-环GMP-AMP（cGAMP，图3E）是细胞内干扰素基因刺激物（STING）通路的刺激物，可导致NFκB和IRF3激活以及促炎细胞因子和I型IFN基因表达。cGAMP及其类似物，如cdAMP和cdGMP，已被探究为诱导Th1免疫应答对抗传染性疾病和癌症的有效佐剂。研究发现，在小鼠和猪模型中，皮内注射cGAMP与H5N1流感疫苗或2009年大流行H1N1疫苗可显著增强疫苗诱导的免疫反应，而不会引起明显的局部不良反应。此外，在小鼠模型中，cGAMP被发现是一种比CpG或MPL更有效的佐剂，可增强皮内对H5N1免疫。最近，Hernandez-Franco等人探索了cdAMP和一种以植物为基础的阳离子α-D-葡聚糖纳米粒(Nano-11)增强小鼠和猪皮内OVA免疫的安全性和有效性，发现cdAMP佐剂的皮内OVA免疫在注射后24小时诱发一过性变色，14天后消失，而Nano-11佐剂的皮内OVA免疫则不会诱发明显的不良反应。这些研究支持STING激动剂作为安全的佐剂来促进皮内疫苗接种。lPCPP佐剂微针是将疫苗递送至皮肤的一种极具吸引力的技术。疫苗可以涂布在金属或不可溶解聚合物微针的表面，或封装在可溶解聚合物微针结构中。考虑到微针通常会诱导与肌肉注射给药相当的免疫反应，人们探索了安全的佐剂来促进基于微针的皮内疫苗接种。Andrianov等人发现，PCPP（图3F）是一种合成的、水溶性、可生物降解的聚磷嗪聚合物，在药物输送和组织工程中有着广泛的应用，是一种安全的佐剂，可促进猪的基于微针的皮内乙型肝炎疫苗接种。此外，PCPP可作为一种关键的微针疫苗制造材料，以减少对表面活性剂的依赖。在这项研究中，只观察到轻微的皮肤红痕，没有发现严重的不良反应。除PCPP外，研究还发现一种新型聚磷腈聚合物PCEP可安全促进仔猪皮内接种H1N1流感疫苗，尽管对H3N2病毒缺乏异种亚型保护。总之，皮内反应原性低的化学佐剂通常是水溶性的或制成水性制剂，以便于从局部给药部位快速清除。这些佐剂大多基于病原体相关分子模式（PAMPs）或其合成类似物，可激活模式识别受体（PRRs），如TLR3、TLR4、TLR7、TLR9和STING，从而在不过度激活先天性免疫系统的情况下发挥佐剂作用。虽然PCPP不是PAMP，但研究发现PCPP可通过TLR3、TLR4和TLR9直接激活免疫细胞。这些研究表明，某些PRR激动剂作为皮内接种佐剂是安全的。6.安全用于皮内疫苗接种的物理佐剂除了注射化学佐剂，人们还探索了在皮内注射疫苗前在皮肤表面短暂施加物理能量，以促进皮内疫苗接种。l开发物理佐剂的合理性由于缺乏对佐剂作用原理的了解，过去的佐剂开发主要依赖于经验或试错方法，尤其是那些非PAMP型佐剂，如明矾、MF59和QS21。这些佐剂没有特定的细胞受体来介导其佐剂效应，因此不会直接激活先天性免疫细胞，如直流电和巨噬细胞。相反，这些佐剂更有可能刺激组织应激和细胞死亡，从而释放内源性危险信号或损伤相关分子模式（DAMPs）来介导其佐剂效应。20世纪90年代，Matzinger和她的同事提出了"危险理论"，证明免疫系统是由受压或受损细胞释放的危险信号激活的。"危险理论"解释了在没有外来病原体入侵的情况下诱导适应性免疫，如移植排斥、某些化疗诱导的全身性抗肿瘤免疫激活。在过去的二三十年中，人们发现了各种类型的DAMPs，其中包括尿酸和ATP等小分子化学物质以及dsDNA等大分子物质，它们能够根据"危险理论"调节免疫系统的功能。这些物质在生理条件下被封闭起来，无法被免疫系统识别，但在组织应激或细胞死亡时会释放出来，激活免疫系统。研究发现，明矾佐剂可刺激尿酸释放，从而激活NOD-、LRR-和含吡啶结构域蛋白3（NLRP3）炎性小体和Caspase-1激活，部分介导其促炎症反应。明矾佐剂还能刺激宿主DNA的释放，从而诱导IgG1抗体的产生和IgE类的转换，并延长DC和CD4+T细胞的相互作用。MF59佐剂可刺激ATP释放，从而增强疫苗接种的免疫反应。这些进展表明，刺激组织应激或细胞死亡的物理模式可能会诱导内源性危险信号的释放，从而促进疫苗接种。l物理佐剂类型研究最多的两种疫苗佐剂物理能量是激光和射频。图4总结了各种类型的激光佐剂和射频佐剂。图4.不同类型的物理佐剂。简要说明不同类型的激光佐剂(全表面、非消融部分、消融部分)和射频佐剂l激光佐剂激光发出窄波长的光，可被特定的组织发色团吸收。可见光主要被黑色素和血红蛋白吸收，而近红外光主要被组织水吸收。激光在美学和医学方面有着独特的应用。由于其超细的光束，高能激光已被用于无刀片激光辅助原位角膜磨镶术(LASIK)，术后并发症最少。激光还被用于低强度激光治疗，以刺激伤口愈合和缓解疼痛。激光还被用于皮肤表面处理、胎记和皱纹去除。已经探索了几种激光来促进皮内疫苗接种。Onikienko等人探索了一种发射两种波长(510nm和578nm)的铜蒸气激光，通过诱导持续的局部炎症来增强疫苗诱导的免疫反应，类似于化学佐剂。我们探索了非侵入性Q开关Nd：YAG532nm激光治疗来增强皮内疫苗诱导的免疫反应，并发现非侵入性激光治疗可以显著增强模型抗原OVA和流感疫苗诱导的小鼠模型的免疫反应，而不会导致可见或组织学皮肤损伤。激光治疗几乎没有诱导细胞因子的表达或免疫细胞的招募。进一步的研究发现，非炎症性激光治疗显著促进了MHCII+细胞(如巨噬细胞和DC)在皮肤内的迁移。MHCII+巨噬细胞和DC的局部运动增强可能有助于增强抗原摄取和增强获得性免疫。我们进一步发现，激光佐剂可以通过促进DC进入淋巴管和迁移到引流淋巴结来增强基于DC的抗肿瘤免疫治疗。激光佐剂被发现还能增强皮内尼古丁疫苗诱导的抗尼古丁抗体的产生。研究人员还开展了1064纳米近红外激光(NIR)增强疫苗皮内接种效果的研究。结果发现，无组织损伤的近红外治疗可以瞬时诱导一组明确的趋化因子，如CCL2和CCL20的表达，并增加表皮和真皮中DC的浓度。近红外激光治疗被发现显著提高皮内卵白蛋白和流感疫苗诱导的小鼠模型的免疫反应。进一步研究发现，近红外激光增加并激活皮肤中的Lang+和CD11b-DC亚群，并促进DC迁移到引流淋巴结，以增强疫苗诱导的免疫反应。与这项研究一致的是，皮肤中的CD103+DC亚群被发现在近红外佐剂效应中发挥关键作用。初步临床研究探索了近红外治疗在人类中的最大耐受量，并发现近红外激光促进CD1a+LC和CD11c+DC在真皮中的迁移。与非侵入性全表面激光治疗不同的是，非消融性部分激光(NAFL)也被用于增强皮内接种效果。NAFL发射高能微激光，并在皮肤表面形成微温区。在低温区域的死亡细胞招募浆细胞样树突状细胞(PDC)，它可以被局部咪喹莫特激活以增强皮内流感疫苗接种效果。NAFL治疗后皮内接种流感疫苗，然后局部注射咪喹莫特，在NAFL或局部咪喹莫特存在的情况下，比皮内接种流感疫苗产生更好的免疫反应，而在AddaVax佐剂存在的情况下，肌肉接种流感疫苗产生类似的免疫反应。有趣的是，NAFL/咪喹莫特佐剂的组合流感疫苗在小鼠和猪模型中显示出良好的局部和系统安全性。另一项研究发现，在小鼠模型中，与在NAFL或单独使用咪喹莫特的情况下皮内接种疱疹病毒多肽相比，局部应用咪喹莫特和NAFL治疗，然后皮内接种疱疹病毒多肽疫苗，可以诱导最有效的疫苗特异性CD4+和CD8+T细胞反应，并对生殖器疱疹病毒感染提供最显著的保护。上述研究表明，NAFL的使用顺序、局部应用咪喹莫特和皮内接种并不是该组高免疫原性的关键，只是在皮内接种疫苗之前使用NAFL以避免疫苗抗原的潜在热灭活。进一步研究发现，NAFL刺激死亡细胞释放dsDNA，并激活STING和IRF途径来介导其佐剂作用。NAFL还被发现在小鼠和猪模型中安全地加强基于微针的流感疫苗接种。关于激光疫苗佐剂更详细分类可参考其他综述。除了仅将激光用作佐剂外，最近开发了基于激光的粉末递送系统(LPD)，用于无需外部佐剂的无针经皮疫苗递送和辅助植入。LPD是基于消融部分激光(AFL)治疗产生皮肤微通道，然后局部应用粉末疫苗涂层阵列贴片，通过AFL产生的皮肤微通道将疫苗输送到皮肤。研究发现，能量为10mJ、覆盖率为10%的超脉冲CO2 AFL在促进OVA皮内免疫方面具有强大的佐剂作用。此外，基于AFL的粉末注射流感疫苗比皮内注射相同剂量的流感疫苗产生更强的抗体反应。在致命的病毒攻击后，流感疫苗的LPD也比皮内注射提供更显著的保护。AFL治疗诱导了显著的细胞因子和趋化因子的释放，并将中性粒细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞招募到微通道周围的组织中。由于消融了一小部分皮肤和靠近皮肤微通道的局部炎症反应，AFL治疗的皮肤没有明显的不良反应，并在几天内完全恢复。AFL的佐剂作用被认为是由于旁观者的光热效应。由于激光的脉冲宽度较长，在激光消融过程中产生的热量会扩散到周围组织，并导致周围一层薄薄的微通道组织的热损伤。dsDNA被发现从低温区域释放并诱导细胞因子表达。研究发现AFL还能激活NLRP3炎症体和Caspase1，导致IL-1β的活性释放。有趣的是，dsDNA、NLRP3炎症体和IL-1β对于激光佐剂效应是非必需的，而MyD88对激光佐剂有重要作用。与光热应激不同的是，在微针疫苗接种过程中施加的机械压力也被发现可以增强疫苗诱导的免疫反应。Ng等人发现，增加微投影阵列应用能量来诱导机械压力和细胞死亡增强疫苗(包被在微针表面)诱导的免疫反应，而不加入化学佐剂。这种方法被发现可以诱导与肿瘤坏死因子α和核因子-κB信号通路相关的基因表达。这些开创性的研究支持开发自佐剂疫苗递送技术，以便在不注射针头或化学佐剂的情况下进行更具免疫原性的疫苗接种。l射频佐剂射频(RFs)是交变电磁波。中高频(0.3-10MHz)的射频可产生组织加热，在美学和医学上有着广泛的应用。由于其热效应，RFs已被用于肿瘤治疗中的肿瘤组织消融或在皮肤表面修复中诱导新的胶原合成。为了寻求替代的物理能量来促进皮内疫苗接种，我们探索了在皮内疫苗注射之前对一小块皮肤进行双极射频治疗的潜在佐剂效果。射频治疗受到控制，以诱导显著的加热效应，但不会对皮肤造成损害。我们发现，非侵入性RF治疗诱导了一过性、低水平的局部炎症，而化学佐剂，如明矾、AddaVax和MPL，则诱导了持久且更强烈的局部炎症。RF治疗被发现显著增加真皮CD103+和CD11b-DC亚群的抗原摄取，并促进真皮DC向引流淋巴结的迁移。此外，射频治疗显著增加了引流淋巴结中传统DC和PDC的成熟。RF治疗显著增加了OVA诱导的抗体反应，佐剂效果与AddaVax相当，也增强了OVA特异性细胞免疫反应，佐剂效果与CpG佐剂相当。此外，研究发现，与0.06μg疫苗剂量的AddaVax佐剂疫苗相比，0.3μg疫苗剂量的RFA同样增强了2009年H1N1流感大流行疫苗诱导的抗体应答和保护作用。低剂量下的RFA效果较好，提示其具有优良的剂量节约效应。为了验证这一点，我们研究发现RFA可以帮助毫微克H3N2疫苗在小鼠模型中诱导有效的免疫反应和保护。考虑到先前的激光佐剂效果主要是与相对较弱的明矾佐剂进行比较，RFA是第一个与广泛使用的化学佐剂(类似MF59的AddaVax)相比的物理佐剂，可以增强流感疫苗接种。由于RFA能够帮助蛋白质或亚单位疫苗诱导细胞免疫反应，我们进一步探索了RFA在基于重组核蛋白(NP)和基质蛋白1(M1)的通用流感T细胞疫苗开发中的作用。通用流感T细胞疫苗主要针对保守的病毒细胞内抗原，如NP和M1。佐剂提供了一种方便的策略来帮助NP和M1诱导CD8+T细胞反应。我们发现RFA可以增强真皮内NP和M1诱导的CD8+T细胞反应。在小鼠模型中，在RFA存在的情况下，皮内NP/M1免疫对致死性病毒攻击具有显著的保护作用。在加强NP/M1免疫方面，RFA显示出与AddaVax相似的佐剂作用。最近发现，RFA还可以扩大流感疫苗诱导的针对异源病毒的免疫反应。这种交叉保护免疫可能是由于它诱导了交叉保护的细胞毒性T淋巴细胞。RFA还有效促进了雄性和雌性小鼠的H5N1流感疫苗皮内免疫。含有RFA的H5N1流感疫苗皮内接种(RFA/ID)诱导的血清血凝抑制(HI)效价和免疫球蛋白抗体效价显著高于单独皮内疫苗(ID)。在致死性病毒攻击后，RFA/ID组而不是ID组显示出显著的肺病毒滴度降低。有趣的是，与ID组相比，RFA/ID组攻击后肺组织中分泌肿瘤坏死因子α和干扰素γ的CD4+和CD8+T细胞显著增加。RFA/ID组对体重减轻也有显著的保护作用。RFA/ID组小鼠不分性别全部存活，ID组部分小鼠存活(雌鼠占25%，雄鼠占75%)。有趣的是，在这项研究中，与AddaVax佐剂相比，RFA对促进H5N1流感疫苗接种的作用较弱。比较组织蛋白质组学最近被用来鉴定RFA治疗后独特表达的蛋白质。我们发现，与化学佐剂处理(MPL、AddaVax、Alum、MPL/Alum)相比，RFA诱导了14种唯一表达的蛋白质。在唯一表达的蛋白质中，热休克蛋白70(HSP70)在RFA效应中发挥了关键作用。验证研究发现，与野生型小鼠相比，HSP70基因敲除小鼠显著降低了促进OVA和pdm09疫苗接种的RFA效应。有趣的是，这项研究发现RFA引起的局部组织蛋白质组变化最小，而AddaVax佐剂引起的局部组织蛋白质组变化最大。RFA对局部组织蛋白质组的最小变化与其诱导的一过性和低水平的局部炎症是一致的。l物理佐剂的优点物理佐剂将物理能量短暂地应用于皮肤表面，然后皮内注射疫苗，以增强疫苗诱导的免疫反应(图5)。物理佐剂主要由医疗器械输送，可在室温下保存，无需冷链储存。这与化学佐剂不同，化学佐剂通常与疫苗一起保存，并需要冷链储存。物理佐剂设备可以重复使用，每次应用的成本可能类似于化学佐剂。物理佐剂不需要与疫苗混合，因此不需要改变或修改疫苗制造或给药过程。物理佐剂不太可能引起显著的全身性或长期副作用，这可能是化学佐剂的一个问题。这是因为物理佐剂的作用主要局限于治疗部位，而化学佐剂可以迁移到引流淋巴结，甚至到达体循环，从而广泛激活免疫系统。物理佐剂可诱导良好控制的组织应激(例如，热)，并允许皮肤快速恢复，而不会产生持久的影响。物理佐剂经常引起短暂的、低水平的局部炎症，而化学佐剂往往引起持续的、更强烈的局部炎症。物理佐剂主要是改变局部环境以增加DC的运动性，诱导内源性危险信号的释放以增强抗原摄取和DC成熟，或促进DC迁移到引流淋巴结以增强疫苗诱导的免疫反应(图5)。经过适当的开发，物理佐剂的效果可以与化学佐剂一样强大。图5.化学佐剂和物理佐剂在皮内接种中的不同作用机制。皮内给药后，化学佐剂通过与PRRs结合直接激活DC，诱导DC成熟，诱导DC释放细胞因子/趋化因子，招募天然免疫细胞，或促进DC向引流淋巴结迁移，以增强疫苗诱导的免疫应答。物理佐剂传递激光或射频能量，诱导组织应激释放危险信号，刺激DC成熟，诱导DC释放细胞因子/趋化因子，并招募先天免疫细胞。物理佐剂还可以增加DC在真皮组织中的运动性，并促进DC迁移到引流淋巴结，以增强疫苗诱导的免疫反应。7.专家评论皮肤已被公认为疫苗接种的高免疫原性部位。与肌肉接种相比，皮内接种疫苗通常能诱导更强的免疫反应，在提高疫苗效力或节省疫苗剂量方面有很大作用。事实上，已有几种疫苗获得了皮内接种的许可，其中包括流感疫苗、狂犬病疫苗和最近的猴痘疫苗。然而，皮内接种面临着诱发严重局部反应的风险。目前获批的大多数佐剂都不适合皮内接种，因为它们具有诱发严重局部反应的高风险。我们需要新型佐剂来安全地增强皮内接种效果，同时避免皮肤出现明显的反应。最近的研究发现了几种有可能安全增强疫苗皮内接种效果的化学佐剂，包括CpG1018、GLA-AF、局部咪喹莫特、poly(I:C)、cGAMP和PCPP。CpG1018已被授权用于促进肌肉接种乙型肝炎疫苗，而GLA-AF和局部咪喹莫特已在临床试验中用于增强皮内接种流感疫苗。由于这些佐剂在人体中的安全性已得到证实，因此可随时用于皮内疫苗接种。poly(I:C)已在临床试验中被用于增强肿瘤内、肌内或皮下注射后的抗肿瘤免疫力。poly(I:C)其总体良好的耐受性支持对其进行评估，以增强皮内疫苗接种。皮内接种佐剂疫苗的好处是可以进一步提高疫苗效力，节省更多疫苗剂量，并有可能诱导交叉保护性免疫。流感疫苗可作为测试皮内佐剂接种的良好目标，以解决疫苗失配问题，因为疫苗失配会大大降低疫苗效力，或通过节省疫苗剂量来解决每年流感疫苗生产的负担。在批准皮内佐剂疫苗供大众使用时，需要仔细评估其效益/风险比。除化学佐剂外，人们还探索了不同类型的物理佐剂（激光、射频），以安全地促进皮内疫苗接种。物理佐剂是一种相对较新的佐剂类型，它利用物理能量诱导组织应激以促进皮内接种。虽然物理佐剂提高人类疫苗效力的潜力仍有待探索，但最近发现内源性危险信号在化学佐剂效应中发挥关键作用（如明矾、MF59），这支持了物理佐剂的发展，以诱导组织应激和释放内源性危险信号来促进疫苗接种。最近在临床前动物模型中研究了物理佐剂的概念及其增强皮内疫苗接种的安全性和有效性。这些研究支持物理佐剂在促进皮内疫苗接种方面具有良好的安全性和有效性。尽管取得了这些令人鼓舞的成果，但物理佐剂在人类使用方面仍面临着一些挑战。首先，物理佐剂是依靠设备的。目前，还没有指导物理佐剂开发和审批的指导方针。其次，物理佐剂的开发需要设备制造商和疫苗公司的共同努力，还需要引入佐剂开发和医疗设备审批方面的监管机构。多方的参与可能会给物理佐剂的开发带来新的挑战。第三，使用目前的物理佐剂进行皮内接种需要两个步骤：物理佐剂处理和皮内接种。与化学佐剂结合疫苗接种相比，两步接种过程需要花费更多时间，而且公众对这种新型疫苗接种的接受程度还有待进一步探讨。佐剂的开发在21世纪受到极大关注。在批准新佐剂供人类使用和阐明疫苗佐剂的内在机制方面取得了重大进展。所有这些努力都有望促进安全的化学和物理佐剂的开发，从而增强皮内接种疫苗的效果。参考来源：Chen X. Emerging adjuvants for intradermal vaccination. Int J Pharm. 2023 Feb 5;632:122559. doi: 10.1016/j.ijpharm.2022.122559. Epub 2022 Dec 28. PMID: 36586639; PMCID: PMC9794530.推荐学习：疫苗佐剂概述：发展现状和未来展望基于TLR激动剂佐剂的设计疫苗佐剂：选择标准、与免疫应答相关的作用机制和未来方向识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。