Ozoralizumab

截至2025年，多款基于纳米抗体（VHH）的产品已成功进入临床试验阶段，并获得监管机构的批准。其中，Cablivi成为首个获得监管批准的基于纳米抗体的药物，分别于2018年8月31日和2019年3月15日获得欧洲药品管理局（EMA）和美国食品药品监督管理局（FDA）的市场授权。在国内，恩沃利单抗作为首个纳米抗体药物于2021年获批，用于治疗MSI-H/dMMR实体瘤。2022年，又有两款基于纳米抗体的药物相继获批：Carvykti（Ciltacabtagene Autoleucel）和Ozoralizumab（Nanozora），进一步推动了该领域的进展。 图1 已上市纳米抗体药物研发时间线[1] 目前，全球纳米抗体药物的研发管线大约有238条，其中肿瘤领域占比最高，达35%；自身免疫疾病紧随其后，占25%；感染性疾病则占15%。这三大方向已成为纳米抗体药物研发的主要焦点。 从宏到微，化繁为简，瘦身不减效 目前，肿瘤免疫治疗主要依赖于传统全长抗体及其衍生物的药物，这些药物已在癌症免疫治疗中得到了广泛应用。然而，由于其体积较大、可能存在免疫原性反应、溶解性较差、分子结构复杂以及对肿瘤组织的穿透能力有限等问题，传统抗体在临床应用中仍面临诸多挑战。为克服传统单克隆抗体（mAb）在肿瘤治疗中的局限性，单链可变片段（scFvs）和纳米抗体（VHH）已成为研究最为广泛的两种抗体形式。 scFvs来源于单克隆抗体，保留了抗原结合的特异性和亲和力，同时具有较小的分子量（约30 kDa），这一特性使其在临床应用中表现出了显著优势，例如在CAR-T细胞疗法和双特异性T细胞衔接器（BiTEs）中的应用。然而，由于其鼠源性特征、较低的人类序列同源性以及潜在的免疫原性，scFvs的治疗效果受到了一定限制。长期以来，scFvs一直被认为是能够结合抗原的最小抗体片段，直到纳米抗体（VHH）的发现改变了这一观念。 图2 scFvs和VHH结构[2] 纳米抗体（VHH）是1993年Hamers-Casterman等人在骆驼血清中偶然发现了一种独特的重链抗体（HcAb），目前功能性的VHH主要从现存物种包括单峰骆驼、双峰骆驼、野生双峰骆驼、美洲驼、原驼、羊驼、秘鲁羊驼以及鲨鱼中获取。 VHH介绍 VHH抗体直径约为2.5 nm，长度约为4 nm，体积约15 kDa，也是目前已知最小的抗原结合片段。除了体积小之外，VHH还具备多种优异特性，其由四个保守骨架区域（FRs）和三个高度可变的互补决定区（CDRs）组成，其中CDR3特别长，赋予其高亲和力和特异性（图2）。通过三个CDRs结合抗原，而非传统抗体的六个CDRs，表现出凸形结合表面，能识别隐匿表位或空腔。除此之外，VHH与人类VH3域的序列同源性高达75-90%，具有降低免疫风险等优势，VHH真正做到了“瘦身不减效”的完美诠释。 图3 全长抗体和纳米抗体（VHH）优势[3] 广泛多样，潜力无限 VHH抗体被发现的短短三十年里，已在众多领域展现出广泛应用前景。VHH抗体因其独特的物理化学特性，在生物医学、诊断和治疗等领域具有重要价值，特别是在过去十年中，全球范围内的相关专利申请数量出现了迅猛的增长。 图4 纳米抗体相关专利[1] 在疾病治疗中的应用 VHH在肿瘤治疗、自身免疫病以及病毒性疾病中得到广泛应用。作为一类新型治疗性抗体，VHH相比传统抗体体积更小且稳定性更高，能够轻松穿透血管壁并在组织中扩散，从而有效到达肿瘤特异性抗原。纳米抗体疗法被视为一种重要的解决方案，能够改善药物递送效率、提升治疗效果，并实现对治疗反应的预测和监测，可以通过将治疗剂直接递送到肿瘤微环境（TME）中的特定部位，从而最优地影响靶细胞或强烈激活局部肿瘤区域的免疫反应 。 图5 基于VHH治疗所针对的肿瘤微环境的组成[3] 以乳腺癌为例，大多数研究聚焦于靶向人类表皮生长因子受体2（HER2），这一肿瘤标志物在乳腺癌细胞表面常表现为过表达。此外，纳米抗体还被广泛应用于淋巴瘤的靶向治疗，涵盖CD19、CD20和CD22等多个靶点。 图6 VHH在肿瘤疾病领域应用举例[1] 另一方面，VHH的独特能力——穿透血脑屏障，为神经退行性疾病的治疗开辟了新的可能性。在阿尔茨海默病的研究中，纳米抗体可以被精准引导至Aβ淀粉样生成位点，从而实现靶向干预。此外，纳米抗体还在神经炎症性疾病的治疗中展现出巨大潜力，通过靶向趋化因子配体（如CCL2、CCL5、CXCR7、CXCL11和CXCL12），调节免疫系统成分，抑制促炎性细胞因子或其受体，从而有效缓解炎症反应。 图7 VHH在神经疾病领域应用举例[1] 在诊断中的应用 由于良好的生物分布特性和对疾病生物标志物的高亲和力，VHH在诊断领域得到了越来越多的应用。VHH已被结合到多种成像模式中以实现体内成像，从而获得肿瘤的清晰可视化。例如，通过磁共振成像（MRI）探针对阿尔茨海默病进行检测，或者在动脉粥样硬化的研究中使用正电子发射断层扫描（PET）与MRI联合的放射性示踪剂。依据VHH稳定性好、易于生产且成本较低的优势，适合开发即时诊断（POCT）的工具，可以在现场快速检测疾病标志物，无需复杂的实验室设备。此外，还有报道指出，近红外VHH探针和荧光VHH能够揭示结肠癌或胰腺癌的致癌位点。这些应用提高了图像的细节质量，有助于更好地了解和监测疾病，并实现了更早期、更准确的诊断。 图8 VHH在疾病治疗及免疫诊断中的应用[3] 以单光子发射计算机断层扫描（SPECT）为例，利用放射性同位素（如99mTc和111In）发出的伽马射线进行成像。这种成像方式可以用于可视化多种目标，包括淀粉样蛋白沉积、免疫细胞类型以及特定疾病标志物。如标记了99mTc的抗HER2-VHH已被用于成像HER2阳性的肿瘤；而标记了99mTc的抗VCAM1-VHH则被用于检测动脉粥样硬化斑块[4]。 图9 VHH在诊断领域应用举例[1] 有效开发，技术拓新，未来可期 纳米抗体VHH的鉴定与开发技术已十分成熟，构建纳米抗体库及其高效的筛选技术（用于获取高亲和力的单克隆纳米抗体）涉及细菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统。这一流程通常始于对骆驼科动物（如羊驼、美洲驼或单峰骆驼）或转基因小鼠（携带VHH胚系基因及适应性恒定区基因）进行抗原免疫，以诱导产生仅VHH的免疫反应，并分离免疫动物血液中的淋巴细胞。随后，从这些淋巴细胞中提取RNA并转化为cDNA，以此为模板通过PCR扩增纳米抗体基因片段。扩增后的基因片段被连接到专门设计的筛选载体中，用于噬菌体展示或酵母展示。将这些载体转化到适当的宿主细胞后，通过噬菌体或酵母展示筛选出抗原特异性的纳米抗体。 图10 噬菌体展示技术筛选VHH流程[1] 目前，VHH技术已与其他生物技术相结合，例如CAR-T细胞疗法和ADC药物，以开发更具创新性的治疗手段。并且在纳米抗体应用过程中，提升其亲和力和稳定性可以显著改善其应用性能。因此，构建多价治疗性或诊断性纳米抗体已成为一项标准程序。 例如，在COVID-19疫情爆发后的几年中，针对SARS-CoV-2的双价和三价纳米抗体研究取得了显著进展，产生了大量高度成熟的纳米抗体结构。具体而言，与单体形式相比，具有更高效力的双价、四价、五价甚至十聚体纳米抗体结构已被成功开发。为了进一步增强纳米抗体的整体稳定性，研究人员还评估了将纳米抗体整合到高度稳定的蛋白框架（如铁蛋白支架）中的可行性。此外，计算方法和数据挖掘技术的进步也促进了合成或天然VHH库的开发，使研究人员能够基于现有的序列和结构信息设计合成库。这些纳米抗体库在无法对骆驼科动物进行免疫的情况下（例如由于抗原不可用或缺乏免疫原性），显得尤为重要。 ·与其他技术的融合 纳米抗体技术与基因编辑技术（如CRISPR）、RNA干扰技术或细胞治疗技术（如CAR-T）相结合，开发出更具创新性的治疗方法，用于精准医疗和个性化治疗。 图11 基于VHH的CAR细胞治疗作用机制[2] ·多价纳米抗体的开发 构建更高价态（如六价、八价甚至更高）的纳米抗体结构，以实现更强的效力和多功能性。这些多价纳米抗体可能在肿瘤治疗、免疫调节和其他复杂疾病领域发挥重要作用。 德国波恩大学Florian I. Schmidt等研究人员合作发现，结构指导的多价纳米抗体可阻断SARS-CoV-2感染并抑制突变逃逸[5]。研究人员开发了四个靶向SARS-CoV-2突刺蛋白受体结合域的中和纳米抗体。通过使用X射线晶体学和冷冻电子显微镜，研究人员定义了两个不同的结合表位。基于这些结构，研究人员设计了多价纳米抗体，其中和活性比单价纳米抗体提高了100倍以上。双特异性纳米抗体的融合抑制了逃逸突变体的出现。 图12 多价VHH融合增强了SARS-CoV-2的中和活性[5] ·新型递送系统的开发 除了现有的静脉注射、肌肉注射等传统方式外，纳米抗体的递送系统可能会向更便捷、更高效的方向发展，例如口服给药、吸入式给药或局部给药等，从而改善患者的依从性和治疗体验。 ·计算设计与人工智能的应用 随着计算生物学和人工智能技术的进步，可以通过计算机模拟和机器学习方法快速筛选和设计具有特定功能的纳米抗体，显著缩短研发周期并降低成本。 ·新型支架与融合蛋白的开发 将纳米抗体整合到其他高度稳定的蛋白支架中（如铁蛋白或其他天然或合成蛋白），可以进一步增强其稳定性和功能性，适用于更广泛的应用场景。 纳米抗体技术在近年来取得了显著进展，并在多个领域展现出广阔的应用前景。未来，随着更多创新技术和方法的出现，纳米抗体有望在医疗保健领域发挥更大的作用。 [1] Ting Yu, Fang Zheng, et al. Single domain antibody: Development and application in biotechnology and biopharma.Immunological Reviews. 2024;328:98-112. [2] Haixia Li1, Quan Zhou, et al.Nanobodies and their derivatives: pioneering the future of cancer immunotherapy.Cell Communication and Signaling (2025) 23:271. [3] Liudmyla Maksymova1, Yannick A. Pilger, et al.Nanobodies targeting the tumor microenvironment and their formulation as nanomedicines. Molecular Cancer (2025) 24:65. [4] Vaneycken I, Devoogdt N, Van Gassen N, et al. Preclinical screening of anti-HER2 nanobodies for molecular imaging of breast cancer. FASEB J. 2011;25(7):2433-2446. [5] Paul-Albert Koenig, Hrishikesh Das, et al. Structure-guided multivalent nanobodies block SARS-CoV-2 infection and suppress mutational escape.Science 371, 691 (2021).

截至2025年，多款基于纳米抗体（VHH）的产品已成功进入临床试验阶段，并获得监管机构的批准。其中，Cablivi成为首个获得监管批准的基于纳米抗体的药物，分别于2018年8月31日和2019年3月15日获得欧洲药品管理局（EMA）和美国食品药品监督管理局（FDA）的市场授权。在国内，恩沃利单抗作为首个纳米抗体药物于2021年获批，用于治疗MSI-H/dMMR实体瘤。2022年，又有两款基于纳米抗体的药物相继获批：Carvykti（Ciltacabtagene Autoleucel）和Ozoralizumab（Nanozora），进一步推动了该领域的进展。 图1 已上市纳米抗体药物研发时间线[1] 目前，全球纳米抗体药物的研发管线大约有238条，其中肿瘤领域占比最高，达35%；自身免疫疾病紧随其后，占25%；感染性疾病则占15%。这三大方向已成为纳米抗体药物研发的主要焦点。 从宏到微，化繁为简，瘦身不减效 目前，肿瘤免疫治疗主要依赖于传统全长抗体及其衍生物的药物，这些药物已在癌症免疫治疗中得到了广泛应用。然而，由于其体积较大、可能存在免疫原性反应、溶解性较差、分子结构复杂以及对肿瘤组织的穿透能力有限等问题，传统抗体在临床应用中仍面临诸多挑战。为克服传统单克隆抗体（mAb）在肿瘤治疗中的局限性，单链可变片段（scFvs）和纳米抗体（VHH）已成为研究最为广泛的两种抗体形式。 scFvs来源于单克隆抗体，保留了抗原结合的特异性和亲和力，同时具有较小的分子量（约30 kDa），这一特性使其在临床应用中表现出了显著优势，例如在CAR-T细胞疗法和双特异性T细胞衔接器（BiTEs）中的应用。然而，由于其鼠源性特征、较低的人类序列同源性以及潜在的免疫原性，scFvs的治疗效果受到了一定限制。长期以来，scFvs一直被认为是能够结合抗原的最小抗体片段，直到纳米抗体（VHH）的发现改变了这一观念。 图2 scFvs和VHH结构[2] 纳米抗体（VHH）是1993年Hamers-Casterman等人在骆驼血清中偶然发现了一种独特的重链抗体（HcAb），目前功能性的VHH主要从现存物种包括单峰骆驼、双峰骆驼、野生双峰骆驼、美洲驼、原驼、羊驼、秘鲁羊驼以及鲨鱼中获取。 VHH介绍 VHH抗体直径约为2.5 nm，长度约为4 nm，体积约15 kDa，也是目前已知最小的抗原结合片段。除了体积小之外，VHH还具备多种优异特性，其由四个保守骨架区域（FRs）和三个高度可变的互补决定区（CDRs）组成，其中CDR3特别长，赋予其高亲和力和特异性（图2）。通过三个CDRs结合抗原，而非传统抗体的六个CDRs，表现出凸形结合表面，能识别隐匿表位或空腔。除此之外，VHH与人类VH3域的序列同源性高达75-90%，具有降低免疫风险等优势，VHH真正做到了“瘦身不减效”的完美诠释。 图3 全长抗体和纳米抗体（VHH）优势[3] 广泛多样，潜力无限 VHH抗体被发现的短短三十年里，已在众多领域展现出广泛应用前景。VHH抗体因其独特的物理化学特性，在生物医学、诊断和治疗等领域具有重要价值，特别是在过去十年中，全球范围内的相关专利申请数量出现了迅猛的增长。 图4 纳米抗体相关专利[1] 在疾病治疗中的应用 VHH在肿瘤治疗、自身免疫病以及病毒性疾病中得到广泛应用。作为一类新型治疗性抗体，VHH相比传统抗体体积更小且稳定性更高，能够轻松穿透血管壁并在组织中扩散，从而有效到达肿瘤特异性抗原。纳米抗体疗法被视为一种重要的解决方案，能够改善药物递送效率、提升治疗效果，并实现对治疗反应的预测和监测，可以通过将治疗剂直接递送到肿瘤微环境（TME）中的特定部位，从而最优地影响靶细胞或强烈激活局部肿瘤区域的免疫反应 。 图5 基于VHH治疗所针对的肿瘤微环境的组成[3] 以乳腺癌为例，大多数研究聚焦于靶向人类表皮生长因子受体2（HER2），这一肿瘤标志物在乳腺癌细胞表面常表现为过表达。此外，纳米抗体还被广泛应用于淋巴瘤的靶向治疗，涵盖CD19、CD20和CD22等多个靶点。 图6 VHH在肿瘤疾病领域应用举例[1] 另一方面，VHH的独特能力——穿透血脑屏障，为神经退行性疾病的治疗开辟了新的可能性。在阿尔茨海默病的研究中，纳米抗体可以被精准引导至Aβ淀粉样生成位点，从而实现靶向干预。此外，纳米抗体还在神经炎症性疾病的治疗中展现出巨大潜力，通过靶向趋化因子配体（如CCL2、CCL5、CXCR7、CXCL11和CXCL12），调节免疫系统成分，抑制促炎性细胞因子或其受体，从而有效缓解炎症反应。 图7 VHH在神经疾病领域应用举例[1] 在诊断中的应用 由于良好的生物分布特性和对疾病生物标志物的高亲和力，VHH在诊断领域得到了越来越多的应用。VHH已被结合到多种成像模式中以实现体内成像，从而获得肿瘤的清晰可视化。例如，通过磁共振成像（MRI）探针对阿尔茨海默病进行检测，或者在动脉粥样硬化的研究中使用正电子发射断层扫描（PET）与MRI联合的放射性示踪剂。依据VHH稳定性好、易于生产且成本较低的优势，适合开发即时诊断（POCT）的工具，可以在现场快速检测疾病标志物，无需复杂的实验室设备。此外，还有报道指出，近红外VHH探针和荧光VHH能够揭示结肠癌或胰腺癌的致癌位点。这些应用提高了图像的细节质量，有助于更好地了解和监测疾病，并实现了更早期、更准确的诊断。 图8 VHH在疾病治疗及免疫诊断中的应用[3] 以单光子发射计算机断层扫描（SPECT）为例，利用放射性同位素（如99mTc和111In）发出的伽马射线进行成像。这种成像方式可以用于可视化多种目标，包括淀粉样蛋白沉积、免疫细胞类型以及特定疾病标志物。如标记了99mTc的抗HER2-VHH已被用于成像HER2阳性的肿瘤；而标记了99mTc的抗VCAM1-VHH则被用于检测动脉粥样硬化斑块[4]。 图9 VHH在诊断领域应用举例[1] 有效开发，技术拓新，未来可期 纳米抗体VHH的鉴定与开发技术已十分成熟，构建纳米抗体库及其高效的筛选技术（用于获取高亲和力的单克隆纳米抗体）涉及细菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统。这一流程通常始于对骆驼科动物（如羊驼、美洲驼或单峰骆驼）或转基因小鼠（携带VHH胚系基因及适应性恒定区基因）进行抗原免疫，以诱导产生仅VHH的免疫反应，并分离免疫动物血液中的淋巴细胞。随后，从这些淋巴细胞中提取RNA并转化为cDNA，以此为模板通过PCR扩增纳米抗体基因片段。扩增后的基因片段被连接到专门设计的筛选载体中，用于噬菌体展示或酵母展示。将这些载体转化到适当的宿主细胞后，通过噬菌体或酵母展示筛选出抗原特异性的纳米抗体。 图10 噬菌体展示技术筛选VHH流程[1] 目前，VHH技术已与其他生物技术相结合，例如CAR-T细胞疗法和ADC药物，以开发更具创新性的治疗手段。并且在纳米抗体应用过程中，提升其亲和力和稳定性可以显著改善其应用性能。因此，构建多价治疗性或诊断性纳米抗体已成为一项标准程序。 例如，在COVID-19疫情爆发后的几年中，针对SARS-CoV-2的双价和三价纳米抗体研究取得了显著进展，产生了大量高度成熟的纳米抗体结构。具体而言，与单体形式相比，具有更高效力的双价、四价、五价甚至十聚体纳米抗体结构已被成功开发。为了进一步增强纳米抗体的整体稳定性，研究人员还评估了将纳米抗体整合到高度稳定的蛋白框架（如铁蛋白支架）中的可行性。此外，计算方法和数据挖掘技术的进步也促进了合成或天然VHH库的开发，使研究人员能够基于现有的序列和结构信息设计合成库。这些纳米抗体库在无法对骆驼科动物进行免疫的情况下（例如由于抗原不可用或缺乏免疫原性），显得尤为重要。 ·与其他技术的融合 纳米抗体技术与基因编辑技术（如CRISPR）、RNA干扰技术或细胞治疗技术（如CAR-T）相结合，开发出更具创新性的治疗方法，用于精准医疗和个性化治疗。 图11 基于VHH的CAR细胞治疗作用机制[2] ·多价纳米抗体的开发 构建更高价态（如六价、八价甚至更高）的纳米抗体结构，以实现更强的效力和多功能性。这些多价纳米抗体可能在肿瘤治疗、免疫调节和其他复杂疾病领域发挥重要作用。 德国波恩大学Florian I. Schmidt等研究人员合作发现，结构指导的多价纳米抗体可阻断SARS-CoV-2感染并抑制突变逃逸[5]。研究人员开发了四个靶向SARS-CoV-2突刺蛋白受体结合域的中和纳米抗体。通过使用X射线晶体学和冷冻电子显微镜，研究人员定义了两个不同的结合表位。基于这些结构，研究人员设计了多价纳米抗体，其中和活性比单价纳米抗体提高了100倍以上。双特异性纳米抗体的融合抑制了逃逸突变体的出现。 图12 多价VHH融合增强了SARS-CoV-2的中和活性[5] ·新型递送系统的开发 除了现有的静脉注射、肌肉注射等传统方式外，纳米抗体的递送系统可能会向更便捷、更高效的方向发展，例如口服给药、吸入式给药或局部给药等，从而改善患者的依从性和治疗体验。 ·计算设计与人工智能的应用 随着计算生物学和人工智能技术的进步，可以通过计算机模拟和机器学习方法快速筛选和设计具有特定功能的纳米抗体，显著缩短研发周期并降低成本。 ·新型支架与融合蛋白的开发 将纳米抗体整合到其他高度稳定的蛋白支架中（如铁蛋白或其他天然或合成蛋白），可以进一步增强其稳定性和功能性，适用于更广泛的应用场景。 纳米抗体技术在近年来取得了显著进展，并在多个领域展现出广阔的应用前景。未来，随着更多创新技术和方法的出现，纳米抗体有望在医疗保健领域发挥更大的作用。 [1] Ting Yu, Fang Zheng, et al. Single domain antibody: Development and application in biotechnology and biopharma.Immunological Reviews. 2024;328:98-112. [2] Haixia Li1, Quan Zhou, et al.Nanobodies and their derivatives: pioneering the future of cancer immunotherapy.Cell Communication and Signaling (2025) 23:271. [3] Liudmyla Maksymova1, Yannick A. Pilger, et al.Nanobodies targeting the tumor microenvironment and their formulation as nanomedicines. Molecular Cancer (2025) 24:65. [4] Vaneycken I, Devoogdt N, Van Gassen N, et al. Preclinical screening of anti-HER2 nanobodies for molecular imaging of breast cancer. FASEB J. 2011;25(7):2433-2446. [5] Paul-Albert Koenig, Hrishikesh Das, et al. Structure-guided multivalent nanobodies block SARS-CoV-2 infection and suppress mutational escape.Science 371, 691 (2021).