共递送ATP提升mRNA-LNP细胞内蛋白表达水平数十倍

2023-09-07
信使RNA基因疗法
Owen S. Fenton 教授在麻省理工学院 Daniel Anderson 和 Robert Langer 教授实验室完成博士及博士后期间的科研训练,目前,任职于美国北卡罗来纳大学(UNC)埃谢尔曼药学院,其课题组聚焦基因药物的开发,特别是 RNA 疗法。照片来自 Anderson Lab 实验室聚餐,大佬云集,盲猜左二是 Owen 。2023 年 5 月 15 号,Owen 团队在 Jounal of the American Chemical Society 发表文章,首次发现氧浓度会对 mRNA-LNP 在细胞内的蛋白表达水平产生影响。在缺氧条件下 mRNA-LNP 蛋白表达水平要比正常氧浓度条件下发生显著降低。而且,他们发现在缺氧条件下,细胞中 ATP 浓度要低于正常浓度条件下,因而,怀疑可能是 ATP 浓度的差异导致 mRNA-LNP 在在缺氧条件下蛋白表达水平的降低,因为 mRNA 翻译蛋白的过程是一个耗能的过程。正是基于此前的结果,2023 年 9 月 1 号,Owen 团队再次在 Jounal of the American Chemical Society 发表篇思路属实奇特的文章:A Unified Strategy to Improve Lipid Nanoparticle Mediated mRNA Delivery Using Adenosine Triphosphate,简单来说,他们找到了一种提升 LNP 递送效率的奇特且通用的方法,那就是在 LNP 成分中加入 ATP。与没有添加 ATP 的 mRNA-LNP 相比,共递送 ATP 的 mRNA-LNP 能够将 mRNA 的蛋白表达水平提升几十倍。更重要的是,这种共递送 ATP 的 LNP 策略对于不同 LNP 成分,不同类型的细胞,有氧或者无氧,体内或体外,分泌蛋白或者胞内蛋白表达均完全适用,具有普遍性,蛋白表达水平的提升效果绝佳,同时,耐受性也非常好,关键还非常简单,不用费力去开发新型脂质。为测试共递送 ATP 对于 LNP 递送效率的影响,Owen 团队制备了 4 种不同类型的 LNP,主要区别在于两点:第一,可电离脂质不同,SM102 或者 ALC-0315;第二,是否添加 Tannic acid(单宁酸)。这种 4 不同类型的 LNP,又各自分为共同包封 ATP 或者不含有 ATP。分析 4 种不同类型的 LNP 理化特征分析,发现一个很奇怪的现象: FLuc mRNA 包封效率可达到 64-85%,然而,ATP 包封效率只达到 18%-29%。这个很难理解,因为在 LNP 制备的时候,水相中 mRNA 浓度为 0.26 mg/mL,ATP 浓度为 2 mg/mL,而且,ATP 要远远小于 mRNA,那包封的时候,难道不应该是 ATP 被包封进 LNP 更多嘛。Owen 团队对此作出的解释是 mRNA 分子上带负电荷的磷酸骨架与 ATP 分子上的负电荷相互排斥可能导致 ATP 包封效率不高,因此,他们未来会在 LNP 中加入额外的带中性或者正电荷的物质来消弱 mRNA 与 ATP 之间的静电排斥作用,提升 ATP 包封效率。在 3 种不同类型的细胞中,利用 4 种不同类型的 LNP,在共递送 ATP 或者不含有 ATP 的情况下,转染 Fluc mRNA 或者 EPO mRNA。结果发现,在正常氧气浓度条件和缺氧条件下,共递送 ATP 均能够显著提升 Fluc 蛋白(胞内蛋白)或者 EPO 蛋白(分泌蛋白)表达水平,尤其是 LNP1 和 LNP4 效果最为显著。共递送 ATP 对于蛋白表达水平的提升不受限于 LNP 类型、氧气浓度、细胞类型及蛋白类型。当然,我们还应该注意到同一种 mRNA 的递送效率和表达水平会受到蛋白表达类型、LNP 成分、细胞类型及氧气浓度等多种因素的影响,并不是仅仅受到单一因素的限制。此外,共递送 ATP 的 LNP 和不含有 ATP 的 LNP 转染细胞后,细胞内 ATP 浓度不存在差异。这里比较奇怪,按理说,相比没有包封 ATP 的 LNP,LNP 中要是有 ATP,转染细胞后,细胞内 ATP 浓度应该更高,不然,没法解释包封进去的那么多 ATP 去了哪里?难道是因为共递送 ATP 时,细胞蛋白表达水平的提升消耗掉了递送进入细胞内的外源 ATP?这好像也解释不通,因为在培养基中添加游离的 ATP,细胞会吸收 ATP,导致胞内 ATP 浓度升高,那么蛋白表达水平是不是就应该会升高呢?结果发现,用不含有 ATP 的 LNP 递送 mRNA 到细胞内,蛋白表达水平不会受到培养基中 游离ATP浓度的影响。有意思的是,如果增加包封进 LNP 中的 ATP 浓度,转染细胞后,会普遍提升胞内蛋白表达水平,也就是包封有 ATP 的 mRNA-LNP 在细胞内的蛋白表达水平与 包封进LNP里面的ATP 浓度存在非常明显的剂量效应。研究人员证实在小鼠体内,不同成分的 LNP,不同类型的表达蛋白,共递送 ATP 均会提升 mRNA-LNP 在体内的蛋白表达水平。相比不含有 ATP 的 mRNA-LNP,共递送 ATP 会提升mRNA-LNP在肝脏中的蛋白表达水平。测试不同类型的 LNP,是否共递送 ATP,均不会影响 LNP 主要聚积在肝脏和脾脏中的天然属性。那么,共递送 ATP,导致 mRNA-LNP 在细胞内蛋白表达水平背后的机制是什么呢?Owen 团队从三个角度出发进行分析:首先,不管 LNP 中是否含有 ATP,添加缺氧诱导因子(HIF)抑制剂并不会普遍对蛋白表达水平造成影响,这就说明共递送 ATP 对于 mRNA-LNP 蛋白表达水平的提升与 HIF 相关的代谢过程无关;第二,共递送 ATP 会增强细胞对于 LNP 内化过程(cell association);第三,共递送 ATP 会增强 LNP 内体逃逸。值得关注的是,对于不含有单宁酸的 LNP1 来说,添加 ATP,会导致细胞内分布更多的钙黄绿素信号,相反,对于含有单宁酸的 LNP4 来说,添加 ATP 与否,细胞内分布的钙黄绿素信号没有差异。使用 V-type ATPase 抑制剂阻断质子和氯离子泵入内体或者溶酶体,会减少细胞内分布的钙黄绿素信号(Calcein),这说明共递送 ATP-LNP 的内体逃逸机制可能与质子泵相关。总的来说,这项研究找到了一种方便且通用的增强 mRNA-LNP 在体内外递送效率,提升蛋白表达水平的方法—共递送 ATP,这种递送增强策略背后的机制在于在 LNP 中添加 ATP 有助于增强 LNP 内化和胞内体逃逸过程,从而表现为蛋白表达水平的提升。今年是COVID-19大流行趋于稳定后的第一年,人民生活逐渐走向正轨,经济也在缓慢但有力的复苏之中,而各抗体企业也依然在不断奋进、不断突破、不断超越,使抗体领域蓬勃发展,硕果累累。为促进抗体行业的交流与创新,2023年10月14-15日第六届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台,有助于推动抗体产业的进一步发展。会议内容时间:2023年10月14-15日地点:苏州(酒店定向通知)规模:600-800人主办单位:生物制品圈、抗体圈指导单位:康维讯生物夏尔巴生物会议费用:免费FREE!(仅收取50元报名定金,含参会学习、茶歇、会议手册,定金概不退还),9月15日报名定金提高到100元,先到先得,报完即止,超过9月20日预登记将收取会议费!报名方式:扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功(报名志愿者,承担一定工作,请慎重考虑,免交定金)!组委会获得报名信息后,根据报名信息进行初筛,并进一步与报名者沟通确认,实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群(严格审核通过)。日程安排更多嘉宾仍在邀请中。。。。。。识别微信二维码,添加生物制品圈小编,符合条件者即可加入生物制品微信群!请注明:姓名+研究方向!版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的,且明确注明来源和作者,不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com),我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点,不代表本站立场。
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