共递送ATP提升mRNA-LNP细胞内蛋白表达水平数十倍

2023-09-07

信使RNA基因疗法

Owen S. Fenton 教授在麻省理工学院 Daniel Anderson 和 Robert Langer 教授实验室完成博士及博士后期间的科研训练，目前，任职于美国北卡罗来纳大学（UNC）埃谢尔曼药学院，其课题组聚焦基因药物的开发，特别是 RNA 疗法。照片来自 Anderson Lab 实验室聚餐，大佬云集，盲猜左二是 Owen 。2023 年 5 月 15 号，Owen 团队在 Jounal of the American Chemical Society 发表文章，首次发现氧浓度会对 mRNA-LNP 在细胞内的蛋白表达水平产生影响。在缺氧条件下 mRNA-LNP 蛋白表达水平要比正常氧浓度条件下发生显著降低。而且，他们发现在缺氧条件下，细胞中 ATP 浓度要低于正常浓度条件下，因而，怀疑可能是 ATP 浓度的差异导致 mRNA-LNP 在在缺氧条件下蛋白表达水平的降低，因为 mRNA 翻译蛋白的过程是一个耗能的过程。正是基于此前的结果，2023 年 9 月 1 号，Owen 团队再次在 Jounal of the American Chemical Society 发表篇思路属实奇特的文章：A Unified Strategy to Improve Lipid Nanoparticle Mediated mRNA Delivery Using Adenosine Triphosphate，简单来说，他们找到了一种提升 LNP 递送效率的奇特且通用的方法，那就是在 LNP 成分中加入 ATP。与没有添加 ATP 的 mRNA-LNP 相比，共递送 ATP 的 mRNA-LNP 能够将 mRNA 的蛋白表达水平提升几十倍。更重要的是，这种共递送 ATP 的 LNP 策略对于不同 LNP 成分，不同类型的细胞，有氧或者无氧，体内或体外，分泌蛋白或者胞内蛋白表达均完全适用，具有普遍性，蛋白表达水平的提升效果绝佳，同时，耐受性也非常好，关键还非常简单，不用费力去开发新型脂质。为测试共递送 ATP 对于 LNP 递送效率的影响，Owen 团队制备了 4 种不同类型的 LNP，主要区别在于两点：第一，可电离脂质不同，SM102 或者 ALC-0315；第二，是否添加 Tannic acid（单宁酸）。这种 4 不同类型的 LNP，又各自分为共同包封 ATP 或者不含有 ATP。分析 4 种不同类型的 LNP 理化特征分析，发现一个很奇怪的现象: FLuc mRNA 包封效率可达到 64-85%，然而，ATP 包封效率只达到 18%-29%。这个很难理解，因为在 LNP 制备的时候，水相中 mRNA 浓度为 0.26 mg/mL，ATP 浓度为 2 mg/mL，而且，ATP 要远远小于 mRNA，那包封的时候，难道不应该是 ATP 被包封进 LNP 更多嘛。Owen 团队对此作出的解释是 mRNA 分子上带负电荷的磷酸骨架与 ATP 分子上的负电荷相互排斥可能导致 ATP 包封效率不高，因此，他们未来会在 LNP 中加入额外的带中性或者正电荷的物质来消弱 mRNA 与 ATP 之间的静电排斥作用，提升 ATP 包封效率。在 3 种不同类型的细胞中，利用 4 种不同类型的 LNP，在共递送 ATP 或者不含有 ATP 的情况下，转染 Fluc mRNA 或者 EPO mRNA。结果发现，在正常氧气浓度条件和缺氧条件下，共递送 ATP 均能够显著提升 Fluc 蛋白（胞内蛋白）或者 EPO 蛋白（分泌蛋白）表达水平，尤其是 LNP1 和 LNP4 效果最为显著。共递送 ATP 对于蛋白表达水平的提升不受限于 LNP 类型、氧气浓度、细胞类型及蛋白类型。当然，我们还应该注意到同一种 mRNA 的递送效率和表达水平会受到蛋白表达类型、LNP 成分、细胞类型及氧气浓度等多种因素的影响，并不是仅仅受到单一因素的限制。此外，共递送 ATP 的 LNP 和不含有 ATP 的 LNP 转染细胞后，细胞内 ATP 浓度不存在差异。这里比较奇怪，按理说，相比没有包封 ATP 的 LNP，LNP 中要是有 ATP，转染细胞后，细胞内 ATP 浓度应该更高，不然，没法解释包封进去的那么多 ATP 去了哪里？难道是因为共递送 ATP 时，细胞蛋白表达水平的提升消耗掉了递送进入细胞内的外源 ATP？这好像也解释不通，因为在培养基中添加游离的 ATP，细胞会吸收 ATP，导致胞内 ATP 浓度升高，那么蛋白表达水平是不是就应该会升高呢？结果发现，用不含有 ATP 的 LNP 递送 mRNA 到细胞内，蛋白表达水平不会受到培养基中游离ATP浓度的影响。有意思的是，如果增加包封进 LNP 中的 ATP 浓度，转染细胞后，会普遍提升胞内蛋白表达水平，也就是包封有 ATP 的 mRNA-LNP 在细胞内的蛋白表达水平与包封进LNP里面的ATP 浓度存在非常明显的剂量效应。研究人员证实在小鼠体内，不同成分的 LNP，不同类型的表达蛋白，共递送 ATP 均会提升 mRNA-LNP 在体内的蛋白表达水平。相比不含有 ATP 的 mRNA-LNP，共递送 ATP 会提升mRNA-LNP在肝脏中的蛋白表达水平。测试不同类型的 LNP，是否共递送 ATP，均不会影响 LNP 主要聚积在肝脏和脾脏中的天然属性。那么，共递送 ATP，导致 mRNA-LNP 在细胞内蛋白表达水平背后的机制是什么呢？Owen 团队从三个角度出发进行分析：首先，不管 LNP 中是否含有 ATP，添加缺氧诱导因子（HIF）抑制剂并不会普遍对蛋白表达水平造成影响，这就说明共递送 ATP 对于 mRNA-LNP 蛋白表达水平的提升与 HIF 相关的代谢过程无关；第二，共递送 ATP 会增强细胞对于 LNP 内化过程（cell association）；第三，共递送 ATP 会增强 LNP 内体逃逸。值得关注的是，对于不含有单宁酸的 LNP1 来说，添加 ATP，会导致细胞内分布更多的钙黄绿素信号，相反，对于含有单宁酸的 LNP4 来说，添加 ATP 与否，细胞内分布的钙黄绿素信号没有差异。使用 V-type ATPase 抑制剂阻断质子和氯离子泵入内体或者溶酶体，会减少细胞内分布的钙黄绿素信号（Calcein），这说明共递送 ATP-LNP 的内体逃逸机制可能与质子泵相关。总的来说，这项研究找到了一种方便且通用的增强 mRNA-LNP 在体内外递送效率，提升蛋白表达水平的方法—共递送 ATP，这种递送增强策略背后的机制在于在 LNP 中添加 ATP 有助于增强 LNP 内化和胞内体逃逸过程，从而表现为蛋白表达水平的提升。今年是COVID-19大流行趋于稳定后的第一年，人民生活逐渐走向正轨，经济也在缓慢但有力的复苏之中，而各抗体企业也依然在不断奋进、不断突破、不断超越，使抗体领域蓬勃发展，硕果累累。为促进抗体行业的交流与创新，2023年10月14-15日第六届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。会议内容时间：2023年10月14-15日地点：苏州（酒店定向通知）规模：600-800人主办单位：生物制品圈、抗体圈指导单位：康维讯生物、夏尔巴生物会议费用：免费FREE!（仅收取50元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），9月15日报名定金提高到100元，先到先得，报完即止，超过9月20日预登记将收取会议费！报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。日程安排更多嘉宾仍在邀请中。。。。。。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。