中科院24年mRNA纯化最新研究：IVT mRNA硫酸铵纯化法
2024-03-08
信使RNA临床1期疫苗
导读：分离和纯化是生产mRNA疫苗和治疗药物的重要过程，对其安全性和有效性至关重要。与传统的重组蛋白疫苗相比，mRNA经由多个酶促反应生成。在IVT过程中，产生mRNA和副产物（如dsRNA、RNA截短片段）的同时，酶、质粒DNA模板以及NTP底物作为杂质也被留下。在RNA聚合酶存在下，残留的NTP和DNA模板可能会继续反应，产生更多的副产物，严重损害mRNA疫苗的有效性和安全性，如通过降低翻译效率并产生炎症反应和免疫应激反应。同时，由于mRNA非常不稳定、极易降解。因此，必须尽快将mRNA与反应体系分离。2024年1月，中国科学院过程工程研究所张松平老师作为通讯作者在JCR 1区TOP期刊Separation and Purification Technology上发表题为“Rapid and high recovery isolation of mRNA from in vitro transcription system by ammonium sulphate precipitation at room temperature”的文章。这项研究以体外转录（IVT）混合物中mRNA的分离纯化为重点，探索了硫酸铵（AS, ammonium sulphate）沉淀mRNA的可行性，并利用实验设计（DoE）对硫酸铵工艺进行了优化。一、mRNA分离纯化现状色谱纯化、膜过滤是研究最广泛的mRNA分离技术，Moderna 和 BioNTech已将前两种技术用于生产COVID-19 mRNA 疫苗。而在实验室研究中，mRNA纯化分离也会用氯化锂（LiCl）沉淀法来实现，回收率可达74%，但样品中残留的锂盐有一定的中枢神经系统毒性，难以通过药品监管部门的评估。此外，LiCl沉淀必须在-20°C下进行，在生产放大中会导致高昂的能源成本以及设备高要求。但不可忽视的是，沉淀法作为反应后分离步骤，不仅具有操作简单、速度快等优点，而且mRNA产物以沉淀形式存在更稳定，甚至可以作为中间产物储存。作为沉淀剂，硫酸铵可以根据目标蛋白与杂质之间的溶解度差异，选择性地沉淀不同原料的蛋白质。由于其高溶解度和生物安全性，硫酸铵沉淀剂已被广泛用于大规模蛋白质分离，通常作为层析前的单元操作。此外，硫酸铵与氯化锂相比不仅经济，而且生物相容性更高。二、硫酸铵沉淀mRNA的可行性与条件优化为了研究硫酸铵沉淀mRNA的可行性，文章首先研究了硫酸铵纯化时mRNA的沉淀和再溶解速率，以及三种主要杂质（DNA、T7聚合酶和NTP）在不同浓度硫酸铵下的沉淀情况。如图1 A所示，当硫酸铵浓度高于1M时，mRNA开始沉淀，硫酸铵浓度增加至1.8 M，mRNA的沉淀率已经超过95%，而当硫酸铵浓度进一步升高时，mRNA的沉淀速率无显著差异。除了沉淀率外，再溶解率也是一个非常重要的评价指标，它决定了mRNA的最终回收率。结果表明，在室温硫酸铵浓度高于1.8 M时，沉淀物可在3 min内迅速溶解在不含RNase的水中，再溶解率达到90%以上。而根据图1B的结果，硫酸铵对DNA、T7聚合酶和NTP的沉淀效率较低。为了获得mRNA沉淀和再溶解的最佳条件，文章进一步利用DOE响应面设计法对硫酸铵浓度、溶液pH、温度、沉淀时间指标进行了综合探索，共设计进行了29次实验。根据实验结果，上述指标中各影响因素的重要性排序为：硫酸铵浓度>温度>沉淀时间>溶液pH，并得到mRNA沉淀的最佳条件为缓冲液pH值为7.0，硫酸铵浓度为2 M，沉淀温度为20℃，沉淀时间为2h。图1 硫酸铵沉淀mRNA的可行性结果对上述最佳工艺参数的实验验证结果如下图。在图2A中，沉淀后在上清液的HPSEC色谱图中发现了DNA模板和NTP的明显峰，而mRNA的峰几乎消失了，mRNA和NTP的沉淀率分别约为94.03 %和0.59 %（图2B），表明硫酸铵沉淀可高产率地从IVT产物中分离mRNA，高效去除NTP。而与之相反的是，沉淀后虽然DNA模板与T7聚合酶在上清液中有所保留，但仍分别有约20.91%和93.02% DNA与mRNA共同沉淀（图2B-2C），这与单组分体系结果并不一致（图1B）。图2 pH 7.0,20°C,2M 硫酸铵,沉淀2h条件下从IVT中纯化mRNA三、T7聚合酶和DNA模板沉淀差异的机制及改进纯化策略为了探究硫酸铵纯化过程中T7聚合酶和DNA模板共沉淀比例较高的原因，文章中设置了与IVT的组分系统（MIS），并在其中立即加入2M 硫酸铵，以终止IVT反应。结果显示，单组分和MIS体系中的DNA模板表现出非常低且相似的沉淀率，但在IVT体系中，其沉淀率较高，约为20.91%，这表明DNA模板的沉淀主要与IVT过程有关。T7聚合酶在单组分体系中以沉淀较少，在MIS中部分沉淀，在实际IVT体系中几乎完全沉淀。这些结果表明，T7聚合酶与IVT体系中的物质之间可能存在一些相互作用，尤其是mRNA 的存在导致 T7 聚合酶沉淀显著增加（图3D）。图3 T7聚合酶和DNA模板沉淀行为差异探索IVT 过程包括起始、链伸长和终止三个步骤。RNA聚合酶首先与DNA模板上游的启动子序列结合以启动转录。合成∼10个多核苷酸后，RNA聚合酶离开启动子，进入延伸期；在此期间，T7 聚合酶、DNA 模板和新生的 mRNA 形成稳定的复合物。在终止过程中，RNA 聚合酶与 DNA 模板解离，同时释放 mRNA 转录本。从理论上讲，大多数mRNA转录本处于自由状态（图4I），其中一小部分可能与聚合酶结合（图4II），一些不完全转录的mRNA可能与RNA聚合酶和DNA模板复合。当将 2 M 硫酸铵 添加到 IVT 体系中时，所有这三种类型的 mRNA 都会沉淀。同时，与mRNA相互作用的聚合酶将发生显著的共沉淀。需要注意的是，在混合IVT体系中，由于2 M 硫酸铵对DNA模板与T7聚合酶结合的抑制作用较强，无法发生转录反应，T7聚合酶的沉淀率仍然较高。这表明 T7 聚合酶-mRNA 相互作用不能被 2 M 硫酸铵抑制。而对于DNA模板，仅在IVT体系中观察到明显的沉淀，表明DNA模板-聚合酶-mRNA复合物的形成是沉淀的主要原因（图4III）。因此，这种复合物的存在进一步增加了T7聚合酶的沉淀。图4 2M硫酸铵诱导IVT沉淀过程的示意图由于IVT体系中的mRNA-T7聚合酶相互作用被认为是硫酸铵共沉淀的主要机制，文章也对此步纯化进行了改进。具体为：（1）在加入2 M 硫酸铵之前调整IVT体系的pH值，从而可能改变mRNA和T7聚合酶之间可能的静电相互作用和氢键；（2）预热IVT体系，改变mRNA的二级结构，破坏mRNA与T7聚合酶的氢键相互作用；（3）在IVT体系中加入强变性剂，破坏蛋白质和核酸的二级和三级结构，使一些非共价力，如氢键和范德华力在这些生物大分子之间和内部受到干扰，从而改变它们的溶解度。实验结果如图5A-5B所示，通过调整pH和温度对纯化的改进不大。而在加入强离液剂，盐酸胍、SDS和尿素时（图5C）均有效减少T7聚合酶的沉淀。在4 M盐酸胍或2 M尿素下，T7聚合酶的沉淀率降低至约20%，但mRNA的沉淀率也分别下降到约56.09%和71.83%，SDS效率略差。图5 优化T7聚合酶与mRNA的共沉淀探索四、硫酸铵沉淀和LiCl沉淀方法的比较最后，文章综合比较了硫酸铵和LiCl沉淀法对mRNA总体回收率和杂质的去除率。如图6A所示，两种方法对NTP的去除率均高于99.0%，硫酸铵和LiCl沉淀的DNA模板去除率分别约为82.08%和85.88%。就T7聚合酶的去除效率而言，硫酸铵沉淀法则弱于LiCl。而采用硫酸铵沉淀法总mRNA回收率可达84.87%，显著优于LiCl沉淀法的74.59%（图6C），硫酸铵沉淀法接近Oligo dT亲和层析纯化的水平，且无需特殊设备，为从IVT体系或后续下游工艺中快速分离mRNA提供了理想的选择。而对于残留量相对较高的T7聚合酶，则可通过蛋白酶K消化后进行TFF膜过滤实现，该技术已应用于BioNtech的COVID-19 mRNA生产。图6 硫酸铵和LiCl沉淀方法比较文章同时也比较了两种沉淀方法在共转录加帽体系中分离加帽mRNA的能力。结果如图7A-7C显示，两种方法的纯化水平基本与未加帽IVT体系一致，同时均可去除约90%的dsRNA，硫酸铵和LiCl沉淀后残留的dsRNA含量分别为0.15%和0.2%，均低于0.5%。最后，作者也证实了硫酸铵沉淀得到的mRNA具有良好的完整性、活性以及免疫原性（图7D-7G）。图7 通过硫酸铵和LiCl沉淀从共转录加帽体系中纯化 mRNA五、结语综上所述，文章证实了通过硫酸铵沉淀纯化mRNA的可行性，且与LiCl沉淀法相比更具有优势。与必须在-20°C下操作的LiCl沉淀法不同，硫酸铵沉淀法可以在室温温度下运行，不需要额外的低温设备和能耗，在生物安全性和经济性方面表现出显著优势。此外，根据响应面方差分析结果，mRNA沉淀在很宽的范围内对pH值、时间和温度不敏感。2M 硫酸铵可以在室温下快速沉淀mRNA，实现了约80%的总mRNA回收率，同时去除了IVT体系中99.0%的NTP和约70∼80%的DNA模板，且具有高效率和高转染活性。硫酸铵沉淀法操作稳健性，为大规模快速采集和预处理mRNA提供了一种很有前途的方法，有利于mRNA的工业化生产。参考文献[1] Xue Feng, Zhengjun Li, Zhiguo Su, Shiyi Che, Baiqian Dai, Yuan Cheng, Songping Zhang. Rapid and high recovery isolation of mRNA from in vitro transcription system by ammonium sulphate precipitation at room temperature. Separation and Purification Technology. Volume 336, 2024, 126331. doi: 10.1016/j.seppur.2024.126331.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。
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