Science｜小分子特异性结合的从头蛋白质设计

2024-04-05

2024年4月4号，在Science正刊发表了一篇“使用结构生物信息学驱动的从头设计高亲和力药物结合的蛋白”的文章。总结：[1] 该文章虽然是对小分子药物从头设计特异性强的蛋白，其实工具还是使用已有的rosetta或者AF2，真正起关键作用的是开发的基于物理相互作用的方法。[2] MD方法在在深入分析设计蛋白质与小分子的构象方面依然非常有用，尤其在确认与水的相互作用方面；FEP方法也显示了强的亲和力相关性。[3] 迭代循环设计，同样适用于该COMS方法，直至找到合适的相互作用的蛋白。[4] vdM引导的氨基酸优化可能提供了一种亲和力优化的替代方法，同样适用于PPI分析。[5] 解决问题从来都不是一招鲜的东西，尤其在药物研发领域，需要结合各种方法[AI与CADD]与专家经验去解决。摘要人工智能实现的构象和序列空间采样与基于物理的模型无缝对接，设计了具有精确预定义的结合亲和力、特异性的蛋白质。该方法(结合位点聚合基序Convergent Motifs for Binding Sites[COMBS])，可以在寻找完成结合位点的特异性和方向性较差但能量有利的范德华和疏水相互作用之前，仅对能够形成这种相互作用的序列和结构进行采样。为了实现复杂极性分子的结合，对配体-蛋白质相互作用的有利几何形状进行采样是至关重要的。尽管vdMs和COMBS是与rosetta序列设计结合使用，但也可以很容易地用于改进各种最近开发的基于条件扩散模型的蛋白质设计算法的采样和/或评分。从头蛋白的MD模拟仅偶尔用于深入了解从头蛋白质设计。模拟使用了2ms，通过这种方法能够区分成功和不成功的设计，这表明在这个时间尺度上的模拟是有用的。自由能计算以前没有应用于设计的蛋白质。在本案例中，仅使用设计的模型作为输入结构，计算与实验测量的结合自由能相关性较高。说明可以通过使用完全理性的设计标准和“基于物理”的力场来评估复合物，设计对小分子具有高亲和力(Kd<5nM)的蛋白质。Rationale for design of high-affinity drug-binding proteins对极性基团的识别提供了一种很好的蛋白质设计，因为极性基团在与蛋白结合时必须失去大部分或全部与水分子的高度有利的相互作用。为了弥补水合作用的损失，小分子的极性基团必须与蛋白质中的原子基团形成高度定向和距离依赖的氢键和静电相互作用。这些极性相互作用不仅是亲和力所必须的，而且还提供了蛋白质对其底物的特异性，而不是其他形状形似的分子。COMBS使用van der Mers来搜索化学基团可以与氨基酸相互作用的优选空间位置。(A) 传统蛋白质设计策略与COMBS的工作流程。(B) vdM的定义。如果化学基团与蛋白质侧链或主链处于范德华接触，则该化学基团正在发生相互作用。与rotamer一样，vdM源自大量高质量蛋白质晶体结构。显示了Asp和甲酰胺(CONH2)的vdM。(C) vdM取决于 ψ、ψ 和 rotamer；Asp m-30 rotamer的top vdM说明了这一点，在主链N、Cα 和 C 原子精确叠加后，按 CONH 2的位置聚类。(D和E)根据PDB中的流行程度对vdM进行排名，并通过聚类得分C进行量化(聚类成员数(N-vdM)与聚类中骗局成员数之比的自然对数)。(D)中显示了第七大Asp/CONH2 vdM族的示例。vdM方法类似于rotamer的蛋白质结构单元--van der Mer(vdM)，它定义了配体中关键化学基团相对于接触残基主链原子的位置。(i) 识别于特定化学基团相互作用的某种类型的所有残基，(ii) 仅对主链和化学基团坐标进行逐对叠加(叠加时不考虑侧链，从而允许其构象发生一些变化)，以及(iii) 具有严格RMSD截断值的几何聚类。由此产生vdM显示主链 ψ 和 ψ 依赖性，并捕获主链和化学基团布局的补偿效应。此外，假设在聚类中未明确考虑侧链坐标，单个clusters可能包括多个rotamer。COMBS算法在给定的蛋白质骨架上找到多个位置，这些位置可以同时与目标小分子的化学基团形成有利的范德华、芳香和氢键相互作用，然后通过灵活的backbone序列设计填充序列的剩余的部分。COMBS在鉴定蛋白骨架和创建能够结合药物apixaban的位点方面显示了前景，在作者2020年的Science文章中，仅筛选了6个设计的序列找到了5微摩尔亲和力结合的蛋白质。吸取前面的工作中的经验，由于在序列和backbone优化的最后步骤中，侧链有时不会引入预期有利vdM。作者在2020年scirence文章方法的基础上做了三方面的改进：通过使用依赖于骨架φ的vdM和交替Rosetta flexible骨架序列设计的COMBS来改善结合效果。其次，结合亲和力可以通过预先组织受体的构象来优化，从而在结合时产生最小的构象熵。最初使用rosetta ab initio folding，现在使用AlphaFold2更可靠地确定序列是否能被采用。De novo desgin of high-affinity drug-binding proteins描述使用COMBS算法和其他计算工具进行蛋白质设计的过程使用COMBS算法生成的4-helix bundle蛋白家族中设计了Rucaparib结合位点。通过使用vdM来识别给定蛋白骨架上的多个位置，这些位置可以同时与靶小分子的化学基团形成有利地相互作用，从而引入键结合残基。PARPi蛋白结合剂的计算设计，从B到E表示总体设计策略A. PARPi类抑制剂。共同的化学特征用橙色表示，奥拉帕尼Olaparib在设计和结合测定中用作阴性对照。B和C首先定义了药效团，并使用COMBS对所选蛋白质主链上的vdMs进行采样。在设计之初，选择了当药物与结合位点结合时应形成氢键的化学基团。这些基团包括Rucaparib的吲哚-NH和羧酰胺基团(用橙色标记)。羧酰胺基团存在于vdM库中。数据库中吲哚-NH vdMs的例子相对较少，因此使用咪唑作为吲哚的吡咯烷的替代物(氧表示为红色，氮标记为蓝色)。使用COMBS在4-helix bundle模版的不同位置发现了侧链，这些侧链可以同时与药物的吲哚和羧酸酰胺化学基团上形成氢键。(COMBS算法对蛋白质主链上的vdM进行采样，然后将配体叠加到vdM的化学基团上；接下来，COMBS找到每个叠加配体上具有附近化学基团的所有的vdM；最后COMBS为每个配体计算vdM的特定组合，以优化得分，如vdM流行率或聚类得分。)发现了一种溶液，其中羧酸酰胺与Q54的侧链形成双齿氢键，并且药物的吲哚NH与N131有相互作用。C图中，蛋白质的侧链是绿色，rucaparib是橙色。COMBS发现的第二个与Q54的相互作用是D58是棕色的蛋白侧链。D. 使用柔性backbone序列设计的rosetta的脚本，同时修复了从COMBS中选的交互(rucaparib，紫色)。E. 根据上一个序列步骤(D)的设计输出再次搜索vdM。略有不同的主链现在在某些位置倾向于不同的dM(更高的聚类得分)，并产生了这些突变。基于COMBS结果，改变了29、90和131(深蓝色)的三个残基。最终的模型是基于多个标准选择的：(i)有利的vdM(最高的vdM聚类总分)；(ii) 满足蛋白质与配体中所有潜在的包埋的氢键供体和受体；(iii)rosetta能量低(选择1000个总设计中最低的50个)；(iv)避免与其他三种PARP抑制剂发生碰撞，这三种抑制剂在分子的胺端附近表现出结构变异性。选择得分最高的蛋白质作为PARPi结合剂。Structural and mutational validation of designs通过X射线晶体学和突变分析验证设计的蛋白质结构和功能使用X射线晶体学方法确定了设计的蛋白质PiB'与四种不同活性化合物结合时的结构。蛋白质的构象与AlphaFold2预测的模型非常吻合，尤其是在结合位点附近（周围60个残基的Cα RMSD为0.2到0.5 Å）。实验确定的结构与设计模型之间的一致性程度也非常接近（小于0.5 Å RMSD）。在第二轮的COMBS设计蛋白之后，经过三次残基的改变提高了结合亲和力。迭代的vdM成功地识别出了具有改进亲和力的相互作用。作者建议，vdM引导的氨基酸优化可能提供了一种有用的替代方法，用于其它亲和力优化方法。通过结构和突变验证，证实了该设计方法的成功性。并且能够通过计算方法预测和验证蛋白的结合性质。这些结果强调了在蛋白质设计中使用基于物理的方法的重要性。Computational prediction of binding thermodynamics使用分子动力学模拟和自由能来预测和分析蛋白质与药物分子的结合热力学。设计的4个蛋白，对设计的蛋白[不是在晶体上]进行了2微妙的全原子分子动力学模拟，发现其中两个骨架构象非常稳定且保持了rucaparib设计的结合pose稳定。分子动力学可以帮助理解预测复合物中相互作用如何贡献稳定性，并可能成为设计的有用工具。使用FEP来确定这些方法是否能够直接从分子动力学模拟结果中预测绝对结合自由能。使用计算设计的蛋白作为起始模型，结果与实验值非常吻合，观察到了正确的亲和力排序。这种一致性对使用FEP和物理路径基础的结合自由能评估全新小分子结合蛋白的潜在结合能非常有前景。Code:vdM samplinghttps//github.com/npolizzi/Combs2)Loop constructionhttps://github.com/lonelu/Rvrsprot to sample ligand-protein interactionsFlexible backbone sequence desgin：RosettaStructure predictionAlphaFold2 (https://github.com/sokrypton/ColabFold)参考文献：N. F. Polizzi, W. F. DeGrado, A defined structural unit enables de novo design of small-molecule-binding proteins. Science 369, 1227–1233 (2020).Science(2024)：De novo design of drug-binding proteins with predictable binding energy and specificity.