Rucaparib Camsylate

基于合成致死(synthetic lethality)概念，在2014年，阿斯利康（AstraZeneca）开发的PARP抑制剂奥拉帕利（olaparib，英文商品名Lynparza）获得美国FDA的批准，成为首款上市的PARP抑制剂，用于治疗携带BRCA突变的晚期卵巢癌。如今，奥拉帕利已经获批治疗携带BRCA突变的乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌，展现出成为重磅药物的潜力。其它PARP抑制剂niraparib、talazoparib和rucaparib也获得FDA的批准，为合成致死概念的临床应用提供了更多验证。这篇文献系统性介绍了合成致死概论的发展历程，及讨论了未来研究方向。基因靶向癌症疗法一直是一个非常有趣的话题。合成致死性为治疗突变基因提供了一种新方法，这些突变基因以前被认为在传统的基因型靶向治疗中无法靶向。临床环境中越来越多的研究和应用使合成致死性成为一种有前途的抗癌治疗选择。在这里系统性介绍了合成致死性分类，根据其生物学机制的特异性程度，分为基因水平、途径水平、细胞器水平和条件合成致死性。此外，还将简要讨论临床实践中的合成致死靶向药物。最后，将探讨该分类的本质含义及其在消除现有挑战方面的前景以及合成杀伤的未来方向。背景合成致死最初起源于对果蝇的研究和酵母模型。SL的原始概念是基于两个或多个独立基因的表达异常同时发生，包括突变、过表达或基因抑制，导致细胞死亡; 而只有一个基因的异常不会影响细胞活力（图 1）。肿瘤细胞是正常细胞中基因突变或过度表达的结果。因此，靶向肿瘤细胞中突变或过表达基因的合成致死配对基因的抑制剂可以在不影响正常细胞存活的情况下杀死癌症。图 1. 合成致死分类。合成致死分为两大类，无条件合成致死和有条件合成致死。a. 无条件合成致死。（i）基因 A 或 B 的单个突变/过表达在肿瘤细胞中是存活的。（ii）在基因 A 或 B 突变/过表达的细胞中抑制基因 B 或 A 会导致合成致死。b. 有条件的合成致死。（ii）几种合成致死相互作用可能取决于某些内在条件，例如遗传背景、缺氧、高ROS等，或外在条件，例如DNA损伤剂和辐射。（i）如果没有这些条件，基因 A 和 B 突变/过表达的肿瘤细胞仍然可以存活。c. 综述中根据对其机制的研究程度，将非条件合成致死进一步分为基因水平、途径水平和细胞器水平。基因的星形代表突变；矩形代表基因过度表达；注射器代表抑制剂；活细胞被描绘为椭圆形；非活细胞以随机形状描绘。随着肿瘤研究的进步，癌症现在被广泛认为是基因组的一种疾病。各种潜在的肿瘤特征，如基因组不稳定性，会产生遗传多样性，促进其存活和炎症。因此，靶向致癌驱动基因、抑癌基因及其潜在机制是癌症治疗的适用方向。基因组测序的发展和对数千种人类肿瘤的分析导致了第一代基因靶向癌症疗法的发现。因此，已经采用了多种个性化或精确的基因型靶向癌症治疗，并在对标准疗法无反应的癌症患者中显示出有希望的结果。例如，多项研究表明，伊马替尼(Imatinib)是一种可有效治疗 KIT 突变胃肠道间质瘤患者的 KIT 抑制剂，反应率约为 50%，中位无进展生存期延长至 1.5 年。伊马替尼还靶向用于慢性粒细胞白血病患者的BCR-ABL融合酪氨酸激酶。有多项研究显示出成功的临床结果，例如在乳腺癌中靶向编码HER2的曲妥珠单抗(trastuzumab)，厄洛替尼(erlotinib)或奥希替尼(osimertinib)用于治疗非小细胞肺癌 （NSCLC） 的 EGFR 突变，以及克唑替尼(crizotinib)用于治疗 ALK 阳性肺癌等。尽管许多针对致癌基因或抑癌基因的小分子和抗体药物已被证明对具有某些基因突变的几种肿瘤有效，并非所有的癌基因或抑癌基因都可以被靶向，耐药性很常见，在这种情况下，鉴定和利用与原发癌基因或抑癌基因相互作用的第二个或几个其他功能基因为癌症治疗提供了一种替代方法。因此，SL最近越来越多地被探索，试图通过在模式生物和人类细胞系中进行大规模SL筛选来确定新的抗癌治疗靶点，如NSCLC、肝细胞癌和乳腺癌细胞中，通过CRISPR或RNA干扰（RNAi）技术等技术筛选。SL 中最具代表性的发现是 BRCA1/2 突变肿瘤细胞对聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）抑制剂响应。几种PARP抑制剂（PARPi）在临床实践中被FDA批准用于治疗乳腺癌和卵巢癌。此外，关于经典致癌驱动基因或抑癌基因，如TP53、KRAS、MYC等，稍后将详细讨论。随着我们对癌细胞信号转导网络复杂性的理解不断加深，越来越多的靶点被确定为潜在的合成致死候选药物。许多研究人员将几类SL定义为“剂量依赖合成致死（synthetic dosage lethality，SDL）”，“并行(collateral) SL”，而其他人则因其复杂性而有所不同，这与SL的原始概念不同。然而，这些扩展的概念是分散的，并且没有对已发现的各种SL进行全面的分类。此外，SL在临床上的应用仍面临诸多挑战。本综述将描述不同情况下SL的新颖和综合分类，以便更深入地系统理解。合成致死分类这种新颖的分类将SL分为不同的组，全面总结了近年来报道的SL所涉及的超出原始概念的不同情况。  SL一般分为两大类，无条件/原始SL和有条件SL（图 1a、b）。根据其生物学机制的特异性程度，无条件SL进一步分为基因水平、功能途径水平和细胞器水平（图 1c），同时我们在不同的合成致死类别下回顾了近年来SL的众多成就。现有的 SL 概念，即合成致死剂量、并行SL 和代谢 SL，均被讨论并相应地归入这一新的分类中。遗传学中的合成致死基因水平SL与上述SL的原始概念相对应（图1a），其中基因之间的相互作用构成了SL的基础。这一类别涵盖了大多数关于 SL 的研究，并且是下面提到的其他级别 SL 的基本。 在此，我们重点描述基因水平上与 SL 关的癌基因和抑癌基因的例子。表 1 详细列出了基因间合成致死相互作用的重要临床前发现。表1. 代表性的合成致死相互作用同源重组相关基因 BRCA1/2 和 PARP 之间的 SL 是一个经典例子，几个研究组在2005年首次报告，功能失调的BRCA1或BRCA2细胞对PARP抑制剂的敏感性明显高于具有正常BRCA功能的细胞。PARP1 是一种 DNA 修复蛋白，通过修复 DNA 单链断裂 （SSB） 和双链断裂 （DSB） 来调节细胞增殖和分化。PARP1 的抑制导致有害突变积累，导致 BRCA1/BRCA2 缺陷细胞凋亡。随后，进一步研究了这两个基因之间SL的具体机制，并将在稍后的通路水平上进行讨论。在PARP抑制剂证明其可行性、可接受的安全性和相当大的疗效后，PARP抑制剂的开发迅速增加，并在临床试验中评估了几种药物在各种实体瘤和血液系统癌症中的应用（表 2）。表2. 近期与合成致死相互作用相关的临床试验肿瘤抑制基因 TP53 是 SL 研究中的主要靶点，是癌症中最常见的突变基因。鉴定p53的合成致死伙伴是临床实践中的一种可行方法。一系列激酶编码基因被发现是p53缺陷肿瘤新药治疗的潜在靶点，包括polo样激酶1（PLK1）、细胞周期蛋白依赖性激酶16（CDK16）、受体样酪氨酸激酶（RYK）、aurora kinase A（AURKA）等。最近，越来越多的研究报道了p53的新合成致死伙伴，如ATM、ATR、WEE1、CHK1等（表 1）。此外，Pan 等人揭示了 p53 和 B 细胞淋巴瘤 2 (BCL-2) 之间不同的合成致死疗法，通过 MDM2 沉默和抑制 BCL-2 激活 p53，从而加速急性髓系白血病 (AML) 细胞的凋亡过程。这表明与之前的研究一样，将突变基因与其合成致死伙伴结合起来，可能会改善更多癌症的合成致死效应，而不仅仅是抑制伙伴基因。SL也可用于靶向肿瘤发生驱动基因，如KRAS和MYC。最近的研究已经确定了致癌基因KRAS的合成致死伙伴，传统化疗不认为KRAS是“可成药的”，通过使用大规模RNAi筛选。早期的一项研究表明，STK33对于 KRAS 驱动的肿瘤的活力是必不可少的; 然而，根据后来的一项研究，这一结果被认为是有争议的。先前的研究已经证明了这种合成对结肠癌（DLD-1、HCT-116、SW-480）、胰腺癌（PANC-1）、肺癌（A549）和其他细胞系的致死作用。然而，其中一些细胞系在后来的研究中没有得到验证。因此，两项研究中使用的细胞系和癌症类型的差异可能是导致相反结果的原因，这表明需要更多的研究来证实合成致死效应在同一癌症和不同癌症类型的各种细胞系中的应用。通过RNAi测定，Steckel等人进行了一系列研究，以阐明CDC6和GATA2与KRAS的合成致死相互作用。在NSCLC中进一步研究了GATA2的下游调控途径，这些途径将在下一节合成致死途径中描述。此外，SLC25A22已被确定为具有KRAS突变的结直肠癌细胞中的合成致死基因。PLK1 和 RhoA/Rho 激酶 （ROCK） 的抑制在 KRAS 突变癌症中具有协同作用，这是涉及这三个基因的遗传学中更复杂的 SL 状况。候选基因在MYC驱动的癌症中具有合成致死性。这些包括4EBP1、SAE1/2、AURKB、PIM1 和CDK9。此外，MAD2 与 PP2A 具有合成致死相互作用，其中 MAD2 过度表达肿瘤细胞中的 PP2A 抑制导致多种肿瘤的 SL，包括肺癌、肝癌和恶性淋巴瘤。同样，CKS1B 过表达肿瘤细胞中 PLK1 的抑制导致乳腺癌细胞死亡，TDP3 过表达细胞中HDAC或组蛋白脱乙酰酶 RPD1 的抑制可能会杀死纤维肉瘤和横纹肌肉瘤细胞。一些研究将这些相互作用称为 SDL(剂量依赖合成致死，synthetic dosage lethality，SDL）”，这是 SL 的一个扩展概念，其中一个基因的过度表达与另一个基因的功能丧失相结合，导致细胞死亡，因此可用于靶向具有过度表达、不可成药的癌基因的癌细胞。有趣的是，SDL 无疑从属于上述 SL 的基本概念（图 1）。合成致死途径中的分子和细胞水平各种途径对于正常细胞和癌细胞的存活都至关重要。蛋白质是作为多种基因表达的产物合成的，并构成了这些功能途径的基础。通过分析发现，在通路水平上建立的合成致死效应比以前在基因水平上报道的更具可重复性。因此，在鉴定出在肿瘤中具有合成致死相互作用的基因后，研究人员将进一步研究这些基因参与的这些重要途径所涉及的机制。本节将讨论 SL 在通路水平上的发现分类。单一合成致死途径功能相关的基因按顺序翻译成蛋白质，形成在细胞内执行基本功能的途径。在许多情况下，这些通路的几个组成部分是由多个基因的协同表达形成的复合物。在通路上构成相同蛋白质复合物的两个或多个基因的异常可能导致细胞死亡。Fang等报道了，作为单一线性必需途径的组成部分的必需多蛋白复合亚基的合成致死效应是 SL 的一个条件。因此，这种综合致死效应主要集中在一条途径上（图 2a）。图 2. 合成致死单一途径。a. 单一通路概念。（i） 通路执行维持细胞存活的基本存活功能;由多个基因（S2、S1、S2等）联合表达形成的蛋白质复合物A3是该通路的重要因子。（ii） 复合物中两个或多个基因的异常（突变、过表达或抑制）导致细胞死亡，而复合物中只有一个突变基因是可行的。b. SWI/SNF复合体的例子。（i） SWI/SNF 复合物的 ARID1A 亚基突变可能会将正常细胞变成卵巢癌等癌症，而肿瘤细胞仍然存活。（ii） 抑制 SWI/SNF 复合物的另一个亚基 ARID1B 将导致复合物崩溃和合成致死。基因的星形代表突变;注射器代表抑制剂;活细胞被描绘成椭圆形;而无活力的细胞则被描绘成随机形状蔗糖不可发酵开关的染色质重塑复合物（SWI/SNF）由其多个亚基蛋白组装而成，如 SMARCA2/4、SMARCB1、ARID1A/B 和 ACTL6A。SWI/SNF复合物主要参与DNA复制和修复。ARID1A 的基因在多种人类癌症中经常发生突变。ARID1A突变卵巢细胞中的ARID1B敲除导致核心催化ATP酶亚基SMARCA4（或BRG1）解离，并减少SWI/SNF复合物中其他亚基的组合，观察到肿瘤的增殖受到抑制（图 2）。基于这一发现，ARID1A和ARID1B之间的SL可能会被扩展并应用于更多的ARID1突变肿瘤细胞，如肝细胞癌（HCC）和结肠癌。构成 SWI/SNF 复合物的另外两个亚基 SMARCA2 和 SMARCA4 具有类似的关系，因为SMARCA2对于在 SMARCA4 中具有功能突变的肿瘤细胞的存活至关重要。最近在胰腺导管腺癌（PDAC）中报道了通过途径产生合成致死效应的另一个例子。  SMAD4 的体细胞突变通常与 PDAC 相关。Dey 等人研究了 PDAC 中 SMAD4 位点的代谢基因苹果酸酶 2 (ME2) 同时缺失，导致依赖其旁系同源异构体 ME3。  ME2 和 ME3 都是氧化脱羧酶，在相同的代谢途径中表达，催化苹果酸转化为丙酮酸，其中 ME3 的抑制会导致 ME2 突变的 PDAC 细胞死亡。 有趣的是，上面提到的例子是同源基因，并参与并行SL。在并行SL中，编码特定复合物中亚基的基因突变或缺失通常会导致侧支或乘客基因变得脆弱。由该侧支基因翻译的亚基是同一复合物的组成部分。侧支基因的进一步抑制导致该复合物崩溃并导致细胞的侧支SL。并行SL与单通路SL一致（图 2）。因此可以归入SL的这一类。双重合成致死途径这种类型的SL涉及两个或多个基因和两个通路。具体来说，两条通路执行相同的存活功能来维持细胞存活，两个通路中两个或两个以上关键调控点的基因异常会引起肿瘤中的合成致死相互作用，而只有一条通路的基因异常维持存活（图3）。图 3. 合成致死双重途径。（i） 通路 1 和通路 2 执行相同的功能以维持细胞存活。（ii） 仅一条通路中两个或多个基因的异常（突变、过表达或抑制）可保持细胞活力。相反，在异常条件下，两条通路上的两个或多个基因会引起合成的致命相互作用。b. HR和NHEJ途径的例子。（i） 当 DSB 发生在正常细胞中时，BRCA1 正常表达并被募集到断裂位点，其与 53BP1 相互作用以抑制 CTIP/MRN 复合物上的 53BP1，从而促进末端加工，从而允许 HR 介导的 S 和 G2 期修复。而在 G0/G1 期，BRCA1 沉默，53BP1 被募集到 DSB 中以抑制 CTIP/MRN 活性，从而抑制 HR 并促进经典的 NHEJ 通路。（ii） 在 BRCA 突变的肿瘤中，BRCA1 不存在于 S/G2 期，并且 53BP1 抑制 CTIP/MRN 功能，导致断裂的末端处理受损、抑制 HR 和促进替代性 NHEJ 通路。在这种情况下，肿瘤仍然可以依靠替代的NHEJ通路来修复DSB并存活。（iii） 使用PARP（NHEJ通路中的功能基因）抑制剂将导致BRCA突变癌症的合成致死性。基因的星形代表突变;注射器代表抑制剂;活细胞被描绘成椭圆形;而无活力的细胞则被描绘成随机形状。DNA DSBs修复的两种主要通路同源重组（HR）通路和非同源末端连接（NHEJ）通路之间的合成致死相互作用，属于这一类。当 DBS 发生在正常细胞中时，BRCA1 响应 DNA 损伤而被激活，并在断点处被募集以抑制末端加工的 53BP1，从而促进复杂的 C 末端结合蛋白相互作用蛋白 （CTIP）/Mre11-Rad50-Nbs1 （MRN），从而允许 HR 介导的修复在细胞周期的 S 和 G2 期。相比之下，BRCA1 在 G0 和 G1 期沉默，53BP1 被募集到 DSB 中以抑制 CTIP/MRN 活性，从而抑制 HR 并促进经典 (c)-NHEJ 途径（图 3bi）。在 BRCA 突变的肿瘤中，BRCA1 不存在于 S 期或 G2 期，并且 53BP1 仍然游离地抑制 CTIP/MRN 功能，导致断裂的末端处理受损、HR 抑制和替代 （Alt）-NHEJ 通路的促进。在这种情况下，肿瘤可以依靠 （Alt）-NHEJ 通路来修复 DSB 并存活（图 3 bii）。然而，PARP（NHEJ通路中的功能基因）抑制剂在BRCA突变的癌症中引起SL（图3 biii）。对HR通路的进一步研究表明，微同源介导的末端连接（MMEJ）通路也与其具有合成致死相互作用。Ceccaldi等人发现，在HR缺陷的上皮性卵巢癌中，敲除属于MMEJ通路的DNA聚合酶θ（Polθ，也称为POLQ）可增强细胞死亡。此外，p53和MAPKAP激酶-2（MK2）在两条通路之间也具有合成致死作用。CDK2 功能被 p21 的下游靶标 p53 抑制，p53 与细胞周期蛋白 A 和细胞周期蛋白 E 相互作用，通过参与 circ-Foxo21-p2-CDK53 三元复合物的形成促进正常细胞周期进入。该通路受 p53调节，p53通过诱导细胞周期停滞来激活细胞周期检查点，从而为 DNA 损伤修复提供时间。相比之下，p53缺陷的肿瘤特别依赖于p38 / MK2通路来延长G2 / M和G1 / S检查点以响应DNA损伤。因此，抑制MK2阻断p38/MK2通路可能在p53突变的NSCLC和胶质母细胞瘤细胞DNA损伤后产生合成致死作用。综上所述，可以调节细胞相同基本生存功能的两种途径之间的合成致死相互作用属于这一分类。多种合成致死途径除了如上所述仅涉及一种甚至两种通路的SL外，通过进一步研究确定了涉及多种通路的更复杂的合成致死相互作用。研究人员发现，与正常细胞相比，几种肿瘤更依赖于某些途径来生存，并且这些途径之间同时存在相当大的“串扰”。这些通路的网络维持着肿瘤中的重要功能。这些通路的共同抑制导致 SL，同时阻断单个通路或多个通路，但并非所有通路都不会。这种类型的SL涉及多通路，如图4所示。图 4. 合成致死多种途径。a 多通路途径概念。一些途径形成一个网络并执行其功能以维持细胞存活。而每个途径中存在异常（突变、过表达或抑制）基因会导致细胞死亡。然而，细胞仍然可以在几种但不是所有途径中以异常基因存活。b 示例：KRAS癌基因驱动的NSCLC的存活率取决于GATA2转录网络。在KRAS突变的NSCLC中，三种GATA2下游通路（蛋白酶体通路、Rho信号级联和NF-κB信号通路）和相关串扰对肿瘤的活力至关重要。硼替佐米（抑制蛋白酶体和NF-κB）和法舒地尔（抑制Rho信号级联反应）的联合使用会导致肿瘤死亡，而单一药物无法杀死肿瘤。基因的星形代表突变;注射器代表抑制剂;黑色实心箭头表示调节方向;虚线表示通路之间的串扰其中一个例子是 GATA2 转录网络在 KRAS 突变的 NSCLC 中的合成致死作用。Steckel 等人最初通过 RNAi 测定证明了转录因子 GATA2 是 KRAS 癌基因依赖性癌细胞所必需的。由于目前尚无针对GATA2的临床靶向药物，因此研究了GATA2的下游调控途径。蛋白酶体通路、Rho信号级联、NF-κB（活化B细胞的核因子κ轻链增强子）信号通路和相关串扰证明对KRAS突变的NSCLC活力至关重要。这个三通路网络的每个独立成员对于突变的NSCLC存活都不是必需的，因此仅抑制其中一条或两条通路不会导致肿瘤死亡。然而，所有三种途径的联合抑制将导致细胞死亡（图4b）。这种合成致死作用对正常肺细胞或非KRAS突变的NSCLC不起作用。因此，我们假设这种类型的SL可能是未来进一步研究的方向。识别更复杂的合成致死网络可能为抗癌治疗提供更多靶点。靶向细胞器合成致死性最近，许多研究人员探索了SL靶向细胞器，与基因或功能通路中的合成致死相互作用相比，这是一种更宏观的方法。这种类型的SL侧重于影响或利用细胞器的主要功能来引起肿瘤细胞死亡。目前，关于SL的各种实验都针对线粒体功能，线粒体功能属于一些科学家所说的“代谢性SL”类别。在这里，我们将主要描述线粒体靶向SL的具体例子，其突变的代谢酶会导致癌症。此外，还将讨论其他靶向细胞器的SL。琥珀酸脱氢酶 （SDH），也称为线粒体呼吸复合物 II，被认为是最有可能的线粒体连接合成致死靶点之一。SDH 不仅是三羧酸 （TCA） 循环中必不可少的线粒体酶，也是肿瘤发生的关键参与者。先前的研究表明，SDH在SDH突变的肿瘤中是无活性的。这通过缩短TCA周期和琥珀酸的异常积累来损害线粒体呼吸功能。尽管允许肿瘤细胞在SDH缺陷中存活的代谢适应尚不完全清楚，但最近的研究已经说明了SDH缺陷肿瘤细胞的几个重要特征。这些实验表明，SDH缺陷的肿瘤细胞比正常细胞使用更多的细胞外丙酮酸，因为它们的生物合成能力不足以满足这种氨基酸的需求。这些细胞产生草酰乙酸，这是维持天冬氨酸水平的基本因素，并且还转移葡萄糖衍生的碳用于天冬氨酸生物合成，这对细胞生长至关重要，通过优先使用丙酮酸羧化酶（PC）。此外，Cardaci 等人证明，PC 抑制不仅在体外减少了 SDH 缺陷肿瘤细胞的增殖，而且还削弱了这些细胞在体内形成肿瘤的能力。因此，PC与SDH具有合成的致死相互作用，PC抑制会扰乱TCA循环（图5)。图5图 5. 靶向细胞器的合成致死—线粒体。在 SDH 或 FH 突变癌症中，参与与线粒体相关的 SDH 和 FH 代谢重编程的主要代谢和信号通路如上所述。在 SDH 缺陷的肿瘤细胞中使用 PC 抑制剂或在 FH 突变的癌症中使用 HMOX1 会扰乱 TCA 循环，导致合成致死。黑色实心箭头表示单步代谢反应;黑色虚线表示间接转录级联;基因的星形代表突变;注射器代表抑制剂。ACO（乌头酸酶）;CS（柠檬酸合酶）;FH（富马酸水合酶）;HMOX1（血红素加氧酶1）;IDH（异柠檬酸脱氢酶）;KEAP1（Kelch 样 ECH 相关蛋白 1）;MDH（苹果酸脱氢酶）;NRF2（核因子红系2相关因子）;2-OG（2-氧代戊二酸）;OGDH（氧戊二酸脱氢酶）;PC（丙酮酸羧化酶）;PDH（丙酮酸脱氢酶）;SCS（琥珀酰辅酶A合成酶）;SDH（琥珀酸脱氢酶）此外，线粒体酶的突变，如富马酸水合酶（FH）和异柠檬酸脱氢酶（IDH）也参与SL。FH是TCA循环的一种酶，可催化富马酸水合为苹果酸。血红素加氧酶 1 （HMOX1） 的抑制导致富马酸水合酶 1 缺陷肿瘤细胞的生长显着减少，但对正常细胞影响很小或没有影响。因此，HMOX1 和 FH1 之间存在靶向线粒体功能的合成致死作用（图 5）。Chan等人进行的一项研究表明，BCL-2抑制剂ABT-199联合IDH突变对AML治疗有相当大的影响，这是SL通过线粒体代谢的又一例证。除TCA循环外，糖酵解是与线粒体相关的另一个不可或缺的过程和可行的靶点。例如，天然产物恩格列素A（EA）被证明可以激活蛋白激酶C-θ（PKCθ），从而诱导胰岛素抵抗。此外，EA同时激活转录因子热休克因子1（HSF1），这是一种葡萄糖依赖的诱导剂。因此，通过促进葡萄糖成瘾并同时限制肿瘤细胞对葡萄糖的摄取，EA影响线粒体的糖酵解和代谢，对高度糖酵解肿瘤具有合成致死作用。除了靶向线粒体功能的SL外，最近的研究集中在靶向其他细胞器的SL上。Zhao等人发现，SU11274（MET抑制剂）和吉非替尼（EGFR抑制剂）的联合使用可以通过降低核糖体蛋白S6（RPS6）的水平来协同影响核糖体的功能，从而减少三阴性乳腺癌（TNBC）的增殖。此外，Cordani等人通过形成自噬囊泡证明了自噬激活，其中它们通过mTOR抑制剂与溶酶体融合可以抑制p53缺陷的肺癌细胞、乳腺癌和胰腺癌细胞的生长。有条件的合成致死众所周知，SL 与情境依赖关系(context-dependent)。这种情境依赖关系是指在SL的原始概念下，合成致癌配对基因和抑癌基因。然而，除了合成致死基因的异常外，肿瘤细胞的异质性、其微环境和外部干扰也会影响遗传相互作用，导致条件依赖性遗传相互作用。因此，在没有特定条件下，前面提到的几种合成致死作用（在基因、功能通路和细胞器水平上）将较弱或无法实现。在早期的研究中，这种复杂的现象被称为情境特异性或情境性SL(context-specific or contextual)，和最近研究中的条件性 SL。条件性SL是对肿瘤细胞的一种特殊的合成致死作用，还取决于内部或外部环境（特定的遗传背景、缺氧、高ROS、使用DNA损伤剂等）。（图 1）条件性SL可以解释在同一癌症类型的不同肿瘤细胞或不同细胞系中观察到合成致死效应的变化。当对合成致死肿瘤靶向药物产生耐药性时，条件性SL可以为如何解决这个问题提供见解。综上所述，条件性SL比无条件/原发性SL更进一步，未来在治疗各种复杂疾病的肿瘤方面具有广阔的前景。不同的遗传特性可以抑制合成的致死相互作用，导致治疗耐药性。如上所述，PARP抑制剂的使用可以通过破坏两个主要的DSB修复途径HR和NHEJ来引导BRCA突变肿瘤细胞向SL迁移。然而，53BP1 的缺失会抑制使用 PARP 抑制剂对 BRCA1/2 突变乳腺癌的合成致死疗法。Bouwman等人在53BP1缺失细胞中证明，BRCA1/2突变癌症中53BP1的缺失可能导致对PARP抑制剂或铂类药物的治疗耐药性。此外，ATR、ATM 和 RAD51 也与 BRCA1/2 突变癌症的 PARP 抑制剂耐药性相关。尽管在使用 PARP 抑制剂后 BRCA1/2 突变细胞中 53BP1、ATR、ATM 或 RAD51 丢失的 HR 通路恢复的潜在机制仍存在不确定性，但很明显，这些基因是 BRCA 和 PARP 的合成致死作用所需的不可或缺的内部条件。同样，由缺陷的 DNA 错配修复 （MMR） 引起的微卫星不稳定性 （MSI） 也是几种癌症中 SL 的特殊且必不可少的遗传背景。最近的研究表明，靶向WRN解旋酶对微卫星不稳定性高（MSI-H）的生存能力具有合成致死作用，但对微卫星稳定（MSS）结直肠癌和子宫内膜癌细胞系没有作用。其他内部条件在条件性SL中也起着重要作用。最近的一项研究发现，细胞微环境中的急性和慢性缺氧可能会降低 HR 蛋白的表达及其功能，从而使细胞对 PARP 抑制敏感。这一发现可用于治疗对PARP抑制剂耐药的BRCA1/2突变肿瘤细胞。此外，PARP抑制剂的使用可以扩展到没有BRCA突变的肿瘤细胞，因为大多数实体瘤含有缺氧细胞。同样，通过对条件性SL的进一步研究，其他内部条件，如蛋白毒性应激和代谢应激，可能被证明会增加合成致死相互作用的范围。除内部条件外，还研究了外部因素对肿瘤的影响，例如放疗和化疗药物。当暴露于DNA损伤剂和电离辐射时，肿瘤细胞对参与DNA损伤修复的PARP的依赖性增强。因此，在这些特定条件下，具有突变基因的肿瘤细胞是PARP的合成致死伙伴，对PARP抑制剂更敏感。例如，Bailey 等人发现粘连蛋白成分 STAG2 在胶质母细胞瘤中与 PARP 具有合成致死作用。同时，当使用替莫唑胺（一种 DNA 损伤药物）时，STAG2 突变的胶质母细胞瘤细胞更容易被 PARP 抑制剂破坏。临床阶段的合成致死靶向药物随着SL领域临床前研究的增加，SL靶向药物在临床实践中已经开发出来。2005年Ashworth和Helleday证明了PARP抑制剂在BRCA1/2缺陷肿瘤中的合成致死相互作用后，几种基于SL的抑制剂用于癌症靶向治疗已应用于临床实践。同时具有 BRCA1 和 BRCA2 突变的患者通常会终生患乳腺癌和卵巢癌。最初，PARP抑制剂在临床试验中作为低剂量rucaparib和全剂量替莫唑胺（temozolomide, 一种DNA烷基化剂）的联合疗法应用。在涉及BRCA1/1突变患者的2期奥拉帕尼(olaparib)临床试验中，与常规化疗方案相比，接受奥拉帕尼治疗的患者中有63%表现出临床获益，副作用最小。随后，包括 BRCA1/2 突变卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌患者在内的 2 期和 3 期临床试验证明了奥拉帕尼提供的临床益处。基于这些临床试验，FDA于2014年首次批准奥拉帕尼用于治疗晚期BRCA1/2突变卵巢癌。随后，奥拉帕尼被批准用于处于CR或PR状态的晚期复发性卵巢癌患者 分别于 2017 年和 2018 年接受铂类化疗和既往接受过化疗的转移性 HER2 阴性、BRCA1/2 突变乳腺癌患者。 表2和图6列出了FDA批准其他PARP抑制剂的临床试验和进展。除了PARP抑制剂外，针对癌基因或抑癌基因的潜在合成致死伙伴的药物，如TP53、KRAS、MYC也有经临床试验（表 2）。图 6. 合成致死研发时间轴：合成致死性在癌症中的里程碑式发现和进展。合成致死率发展的几个关键事件。在原来的SL之外，不断提出了几个扩展的概念。相比之下，在 Ashworth 和 Helleday 证明了 PARP 抑制剂在 BRCA1/2 缺陷肿瘤中的合成致死性后，许多关于 SL 在癌症中的研究显着增加，并且几种抑制剂，尤其是基于 SL 的 PARPi，已应用于临床实践。结论和未来展望自从合成致死的概念首次提出以来，关于该主题的研究数量显着增加，并且提出了许多SL的扩展概念。此外，许多合成致死药物，特别是FDA批准的几种PARP抑制剂，已经取得了重大的临床突破（图 6）。 首先，鉴定基因间SL相互作用是SL在基因水平上的首要步骤。当务之急是识别多种癌症中不同基因之间的更多合成致死效应，以开发合成致死基因数据库。此外，验证基因合成对同一癌症和不同癌症类型的不同细胞系的致死作用也很重要。它可以解释前人研究中的争议，例如上述STK33和KRAS之间的合成致死效应，并为使用条件SL理论进一步研究更复杂的条件提供基础。合成致死性筛查技术，包括药物筛查，RNAi筛选，生物信息学筛选，CRISPR筛选，以及这些方法的组合，为遗传学家提供了实现这一目标的可能性。在基因水平上，以前的许多研究都集中在确定两个基因之间的合成致死关系上。如上所述，三个基因（PLK1、ROCK 和 KRAS）之间的合成致死作用示例，表明未来可以开发多个基因之间的合成致死相互作用。同样，以前的研究也集中在寻找癌基因的合成致死伴侣上，而最近的研究倾向于靶向肿瘤抑制基因，如p53。识别肿瘤抑制基因的合成致死伴侣可能具有更大的探索潜力。此外，虽然靶向常见突变和“不可成药”的致癌基因和抑癌基因是无效的，但从激活p53和抑制BCL-2杀死AML的例子来看，与先前研究中仅抑制伴侣基因相比，靶向这些基因与其合成致死伙伴基因相结合可能会显着放大对肿瘤的致死作用，这可以扩大合成致死作用在靶向癌症治疗中的应用。其次，对于致力于肿瘤靶向治疗的研究人员和临床医生来说，SL通路也提供了许多未来的视角。在蛋白质或通路水平上鉴定出合成致死伴侣基因后，他们可以进一步研究那些在特定癌症中异常表达的基因，同时参考三种合成致死通路条件。由于SL尚未应用于大多数癌症，因此报道的合成致死途径的机制可以应用于研究较少的具有相同突变致癌基因或抑癌基因的癌症，例如神经癌、皮肤癌、骨肿瘤和胆道癌。此外，多种途径的合成致死效应是未来的一个重要方向。识别困难的合成致死效应可以导致对与这些困难靶标相关的通路网络的进一步研究。如前所述，Downward 等人发现 GATA2 下游网络（三种通路）对 KRAS 突变的 NSCLC 存活率具有与 GATA2 相同的影响。因此，在每种途径中都更有可能找到临床抑制剂的靶点。此外，FDA批准的抑制剂被用于阻断三通路网络，从而有效地杀死KRAS突变的NSCLC。由此，SL的研究成果可以更好地应用于临床实践。此外，细胞器靶向SL，即破坏线粒体、核糖体、溶酶体和其他细胞器的合成致死效应，也是未来研究的一个更宏观的方向。最后，条件性SL可以为SL在抗癌治疗靶点中的局限性提供解释和未来方向。SL在临床实践中面临的最大挑战是耐药性。此外，在一种癌症中起作用的合成致死相互作用有时在另一种癌症中无效。根据条件SL，对癌症的合成致死作用需要特定的内部和外部设置，这有助于解释这些问题。因此，探索相同癌症在不同条件或不同癌症类型下所需的具体情况对于解决耐药性和扩大SL的应用具有重要意义，这可以通过多方面的测试框架来解决。总之，尽管SL只是一个简单的遗传概念，但它对癌症研究的影响一直在增加。这种对SL的新分类，以及上述每种类型对SL的多项发现，不仅提供了对该领域的系统理解，也为未来的研究方向提供了更多的参考依据和启示。我们坚信，SL值得未来在癌症治疗领域进一步研究和应用。引用: https://www.nature.com/articles/s41392-020-00358-6声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

2024年4月4号，在Science正刊发表了一篇“使用结构生物信息学驱动的从头设计高亲和力药物结合的蛋白”的文章。总结：[1] 该文章虽然是对小分子药物从头设计特异性强的蛋白，其实工具还是使用已有的rosetta或者AF2，真正起关键作用的是开发的基于物理相互作用的方法。[2] MD方法在在深入分析设计蛋白质与小分子的构象方面依然非常有用，尤其在确认与水的相互作用方面；FEP方法也显示了强的亲和力相关性。[3] 迭代循环设计，同样适用于该COMS方法，直至找到合适的相互作用的蛋白。[4] vdM引导的氨基酸优化可能提供了一种亲和力优化的替代方法，同样适用于PPI分析。[5] 解决问题从来都不是一招鲜的东西，尤其在药物研发领域，需要结合各种方法[AI与CADD]与专家经验去解决。摘要人工智能实现的构象和序列空间采样与基于物理的模型无缝对接，设计了具有精确预定义的结合亲和力、特异性的蛋白质。该方法(结合位点聚合基序Convergent Motifs for Binding Sites[COMBS])，可以在寻找完成结合位点的特异性和方向性较差但能量有利的范德华和疏水相互作用之前，仅对能够形成这种相互作用的序列和结构进行采样。为了实现复杂极性分子的结合，对配体-蛋白质相互作用的有利几何形状进行采样是至关重要的。尽管vdMs和COMBS是与rosetta序列设计结合使用，但也可以很容易地用于改进各种最近开发的基于条件扩散模型的蛋白质设计算法的采样和/或评分。从头蛋白的MD模拟仅偶尔用于深入了解从头蛋白质设计。模拟使用了2ms，通过这种方法能够区分成功和不成功的设计，这表明在这个时间尺度上的模拟是有用的。自由能计算以前没有应用于设计的蛋白质。在本案例中，仅使用设计的模型作为输入结构，计算与实验测量的结合自由能相关性较高。说明可以通过使用完全理性的设计标准和“基于物理”的力场来评估复合物，设计对小分子具有高亲和力(Kd<5nM)的蛋白质。Rationale for design of high-affinity drug-binding proteins对极性基团的识别提供了一种很好的蛋白质设计，因为极性基团在与蛋白结合时必须失去大部分或全部与水分子的高度有利的相互作用。为了弥补水合作用的损失，小分子的极性基团必须与蛋白质中的原子基团形成高度定向和距离依赖的氢键和静电相互作用。这些极性相互作用不仅是亲和力所必须的，而且还提供了蛋白质对其底物的特异性，而不是其他形状形似的分子。COMBS使用van der Mers来搜索化学基团可以与氨基酸相互作用的优选空间位置。(A) 传统蛋白质设计策略与COMBS的工作流程。(B) vdM的定义。如果化学基团与蛋白质侧链或主链处于范德华接触，则该化学基团正在发生相互作用。与rotamer一样，vdM源自大量高质量蛋白质晶体结构。显示了Asp和甲酰胺(CONH2)的vdM。(C) vdM取决于 ψ、ψ 和 rotamer；Asp m-30 rotamer的top vdM说明了这一点，在主链N、Cα 和 C 原子精确叠加后，按 CONH 2的位置聚类。(D和E)根据PDB中的流行程度对vdM进行排名，并通过聚类得分C进行量化(聚类成员数(N-vdM)与聚类中骗局成员数之比的自然对数)。(D)中显示了第七大Asp/CONH2 vdM族的示例。vdM方法类似于rotamer的蛋白质结构单元--van der Mer(vdM)，它定义了配体中关键化学基团相对于接触残基主链原子的位置。(i) 识别于特定化学基团相互作用的某种类型的所有残基，(ii) 仅对主链和化学基团坐标进行逐对叠加(叠加时不考虑侧链，从而允许其构象发生一些变化)，以及(iii) 具有严格RMSD截断值的几何聚类。由此产生vdM显示主链 ψ 和 ψ 依赖性，并捕获主链和化学基团布局的补偿效应。此外，假设在聚类中未明确考虑侧链坐标，单个clusters可能包括多个rotamer。COMBS算法在给定的蛋白质骨架上找到多个位置，这些位置可以同时与目标小分子的化学基团形成有利的范德华、芳香和氢键相互作用，然后通过灵活的backbone序列设计填充序列的剩余的部分。COMBS在鉴定蛋白骨架和创建能够结合药物apixaban的位点方面显示了前景，在作者2020年的Science文章中，仅筛选了6个设计的序列找到了5微摩尔亲和力结合的蛋白质。吸取前面的工作中的经验，由于在序列和backbone优化的最后步骤中，侧链有时不会引入预期有利vdM。作者在2020年scirence文章方法的基础上做了三方面的改进：通过使用依赖于骨架φ的vdM和交替Rosetta flexible骨架序列设计的COMBS来改善结合效果。其次，结合亲和力可以通过预先组织受体的构象来优化，从而在结合时产生最小的构象熵。最初使用rosetta ab initio folding，现在使用AlphaFold2更可靠地确定序列是否能被采用。De novo desgin of high-affinity drug-binding proteins描述使用COMBS算法和其他计算工具进行蛋白质设计的过程使用COMBS算法生成的4-helix bundle蛋白家族中设计了Rucaparib结合位点。通过使用vdM来识别给定蛋白骨架上的多个位置，这些位置可以同时与靶小分子的化学基团形成有利地相互作用，从而引入键结合残基。PARPi蛋白结合剂的计算设计，从B到E表示总体设计策略A. PARPi类抑制剂。共同的化学特征用橙色表示，奥拉帕尼Olaparib在设计和结合测定中用作阴性对照。B和C首先定义了药效团，并使用COMBS对所选蛋白质主链上的vdMs进行采样。在设计之初，选择了当药物与结合位点结合时应形成氢键的化学基团。这些基团包括Rucaparib的吲哚-NH和羧酰胺基团(用橙色标记)。羧酰胺基团存在于vdM库中。数据库中吲哚-NH vdMs的例子相对较少，因此使用咪唑作为吲哚的吡咯烷的替代物(氧表示为红色，氮标记为蓝色)。使用COMBS在4-helix bundle模版的不同位置发现了侧链，这些侧链可以同时与药物的吲哚和羧酸酰胺化学基团上形成氢键。(COMBS算法对蛋白质主链上的vdM进行采样，然后将配体叠加到vdM的化学基团上；接下来，COMBS找到每个叠加配体上具有附近化学基团的所有的vdM；最后COMBS为每个配体计算vdM的特定组合，以优化得分，如vdM流行率或聚类得分。)发现了一种溶液，其中羧酸酰胺与Q54的侧链形成双齿氢键，并且药物的吲哚NH与N131有相互作用。C图中，蛋白质的侧链是绿色，rucaparib是橙色。COMBS发现的第二个与Q54的相互作用是D58是棕色的蛋白侧链。D. 使用柔性backbone序列设计的rosetta的脚本，同时修复了从COMBS中选的交互(rucaparib，紫色)。E. 根据上一个序列步骤(D)的设计输出再次搜索vdM。略有不同的主链现在在某些位置倾向于不同的dM(更高的聚类得分)，并产生了这些突变。基于COMBS结果，改变了29、90和131(深蓝色)的三个残基。最终的模型是基于多个标准选择的：(i)有利的vdM(最高的vdM聚类总分)；(ii) 满足蛋白质与配体中所有潜在的包埋的氢键供体和受体；(iii)rosetta能量低(选择1000个总设计中最低的50个)；(iv)避免与其他三种PARP抑制剂发生碰撞，这三种抑制剂在分子的胺端附近表现出结构变异性。选择得分最高的蛋白质作为PARPi结合剂。Structural and mutational validation of designs通过X射线晶体学和突变分析验证设计的蛋白质结构和功能使用X射线晶体学方法确定了设计的蛋白质PiB'与四种不同活性化合物结合时的结构。蛋白质的构象与AlphaFold2预测的模型非常吻合，尤其是在结合位点附近（周围60个残基的Cα RMSD为0.2到0.5 Å）。实验确定的结构与设计模型之间的一致性程度也非常接近（小于0.5 Å RMSD）。在第二轮的COMBS设计蛋白之后，经过三次残基的改变提高了结合亲和力。迭代的vdM成功地识别出了具有改进亲和力的相互作用。作者建议，vdM引导的氨基酸优化可能提供了一种有用的替代方法，用于其它亲和力优化方法。通过结构和突变验证，证实了该设计方法的成功性。并且能够通过计算方法预测和验证蛋白的结合性质。这些结果强调了在蛋白质设计中使用基于物理的方法的重要性。Computational prediction of binding thermodynamics使用分子动力学模拟和自由能来预测和分析蛋白质与药物分子的结合热力学。设计的4个蛋白，对设计的蛋白[不是在晶体上]进行了2微妙的全原子分子动力学模拟，发现其中两个骨架构象非常稳定且保持了rucaparib设计的结合pose稳定。分子动力学可以帮助理解预测复合物中相互作用如何贡献稳定性，并可能成为设计的有用工具。使用FEP来确定这些方法是否能够直接从分子动力学模拟结果中预测绝对结合自由能。使用计算设计的蛋白作为起始模型，结果与实验值非常吻合，观察到了正确的亲和力排序。这种一致性对使用FEP和物理路径基础的结合自由能评估全新小分子结合蛋白的潜在结合能非常有前景。Code:vdM samplinghttps//github.com/npolizzi/Combs2)Loop constructionhttps://github.com/lonelu/Rvrsprot to sample ligand-protein interactionsFlexible backbone sequence desgin：RosettaStructure predictionAlphaFold2 (https://github.com/sokrypton/ColabFold)参考文献：N. F. Polizzi, W. F. DeGrado, A defined structural unit enables de novo design of small-molecule-binding proteins. Science 369, 1227–1233 (2020).Science(2024)：De novo design of drug-binding proteins with predictable binding energy and specificity.