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【JMC】中国药科大学杨鹏教授团队报道靶向EGFR C797S突变的新型PROTACs

2024-06-01

蛋白降解靶向嵌合体

2024年4月27日，中国药科大学药学院杨鹏教授团队以“Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Novel EGFR PROTACs Targeting C797S Mutation”为题在线发表在药物化学领域国际顶级期刊Journal of Medicinal Chemistry上。作者在团队前期开发的第四代EGFR抑制剂D51的基础上，运用PROTAC技术，成功获得了一系列可高效降解含有C797S突变的EGFR蛋白的PROTAC分子，其中活性最好的化合物C6 DC50 = 10.2 nM，在H1975突变型细胞株中IC50 = 10.3 nM，C6也展现出对其他EGFR突变蛋白的降解效果，并在体内外都发挥出良好的抗NSCLC活性，该研究为克服新一代EGFR耐药突变提供了有效的方法。图1 PROTAC C6结构及其动物实验结果肺癌作为全球高发的癌症，死亡率和死亡人数极高，对人民生命安全造成严重威胁，其中又以NSCLC（非小细胞肺癌）占比最高。EGFR是已被广泛证实与肺癌发生发展密切相关的重要靶点，目前已开发上市了三代EGRF抑制剂，用于NSCLC的治疗。其中Osimertinib（奥希替尼）作为第三代EGFR抑制剂的代表性药物，可以克服二代EGFR抑制剂中出现的T790M突变。但可惜的是针对奥希替尼也已经出现了新的C797S突变，但是目前针对该突变的第四代EGFR抑制剂还没有上市。PROTAC是一种异双功能小分子，由E3连接酶的配体、靶蛋白结合配体（POI）和连接两者的连接体组成，促进靶蛋白和连接酶的相互作用，导致靶蛋白的泛素化及降解。这项技术可能为EGFR抑制剂耐药的情况带来新的解决方向。目前针对已上市的三代EGFR抑制剂均有相应的PROTACs开发，但是对于最新出现的C797S耐药突变的EGFR蛋白开发的PROTAC寥寥无几，一方面也是因为没有已上市的第四代EGFR抑制剂作为基础。作者团队前期开发了针对奥希替尼C797S耐药的高亲和力EGFR抑制剂D51，将D51作为弹头前体，进一步改造得到便于连接linker的弹头化合物6；选择理化代谢性质更好的CRBN配体来那度胺，简单的探究linker的种类与长度，得到了一系列针对C797S突变EGFR蛋白的PROTAC分子。通过变换linker碳链长度，得到了化合物C1-C10，在携带C797S的H1975-TM细胞中测定EGFR蛋白的降解能力。结果显示链长为7的化合物C6降解活性最好（DC50 = 10.2 ± 4.8nM），C6 linker为纯碳链，一端以胺连接，另一端以酰胺连接。简单的将linker一端胺连接换成酰胺连接，得到化合物C11-C15，可惜这些化合物降解活性大幅降低，对标C6，将纯碳链换成PEG链得到化合物C16，其降解活性高于双酰胺连接的化合物C11-C15，但仍低于C6。同时对这些PROTAC分子进行抗增殖活性测试，得到的结果趋势与其降解蛋白能力一致（C6 IC50 = 10.3 ± 1.8 nM）图2 PROTAC C1-C16在H1975-TM中降解EGFR的能力综上所述，选择化合物C6进一步活性评价和作用机制研究。C6针对EGFR的降解特征将C6的来那度胺部分甲基化即得到阴性对照C17，在H1975-TM细胞中，C6可以浓度依赖的降解EGFRL858R/T790M/C797S蛋白，且弹头化合物6以及阴性对照C17没有降解作用。C6可以实现在24h内EGFR突变蛋白的几乎完全降解（100 nM）。洗脱实验表明C6作用24h后，EGFRL858R/T790M/C797S会缓慢回升，但48h内不能恢复到初始水平，表明C6的降解作用快速且长效。在挽救实验中，加入蛋白酶体抑制剂或泛素化抑制剂均大大减弱C6的降解活性，单独加入来那度胺也可抑制C6的降解能力，但C6仍表现出240.2nM的亲和力值。综上所述，C6发挥降解EGFR作用是通过泛素化-蛋白酶体通路实现的。图3 C6在EGFRL858R/T790M/C797S突变的H1975-TM中降解特性在其他EGFR突变型中C6也能发挥良好的降解活性，在含有EGFRDel19/T790M/C797S, EGFRL858R/T790M, EGFRDel19突变蛋白以及EGFR野生型蛋白的NSCLC细胞中，C6的DC50分别为36.5, 88.5, 75.4以及大于300 nM。图4 C6在其他EGFR突变NSCLC细胞株中的降解活性C6在降解EGFR突变蛋白的同时，也影响很多肿瘤发生相关蛋白如CDK12, CDK16, UTP11等等，可能是由于C6阻断了EGFR信号通路，下调了其下游相关蛋白。C6三元复合物的结合模型分析作者通过分子对接和分子动态模拟实验，揭示了C6-EGFR-CRBN三元复合物的作用力，在C6招募CRBN 100 ns后形成稳定三元复合物，其中C6 与EGFR的Met793残基形成两个氢键，同时与CRBN的His378/Trp380残基形成两个氢键。C6的体外抗肿瘤活性评价在含有EGFRL858R/T790M/C797S突变的H1975-TM细胞中，验证了C6可以浓度依赖的抑制集落形成，在33nM浓度下几乎可以完全抑制集落形成（效果远好于阳性对照布加替尼及弹头前体D51）；C6将H1975-TM细胞阻滞在G0/G1期，并加强了细胞凋亡。通过WB实验对EGFR信号下游蛋白分析，结果表明C6浓度依赖的抑制EGFR的磷酸化和ERK/ATK的活化。上述结果表明C6具有良好的体外抗肿瘤活性。图5 C6的体外抗肿瘤活性评价C6的体内抗肿瘤活性在H1975-TM异种移植模型中，口服给药的低剂量组（25mg/kg）和高剂量组（100mg/kg）的肿瘤生长抑制剂分别为48.1和66.4%，31天给药中小鼠体重与对照组相比无明显变化，组织切片染色观察小鼠主要器官无明显损害，综上所述C6在体内也发挥出良好的抗肿瘤活性且无明显毒性。图6 C6的体内抗肿瘤活性C6的药代动力学性质因为PROTACs分子量较大，所以药代动力学性质是开发难点。静注给药Cmax, AUC0-∞, T1/2分别为 4598 ng/mL, 1800 h*ng/mL, 38.0 h，但口服给药Cmax, AUC0-∞, T1/2 分别为 57.8 ng/ mL, 750 h*ng/mL, 10.9 h。基于此，下一步的研究方向可能集中于引入更刚性的linker来提升PROTAC的PK性质。总结本文探究开发了一类靶向C797S突变的EGFR蛋白RPOTAC分子，其中活性最好的分子C6具有优秀的降解蛋白活性/选择性和体内外抗肿瘤活性，并经过机制验证其确实通过蛋白酶体-泛素化发挥生物功能，这为治疗三代EGFR抑制剂奥希替尼 EGFR抑制剂奥希替尼带来的C797S耐药突变提供了新的治疗方向。原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.4c00107声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手觉得本文好看，请点这里↓