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protein A 配基改造策略用于治疗性抗体高通量纯化

2022-07-29

抗体

摘要：随着精准化医疗理念逐渐被认可，治疗性抗体：如单克隆抗体、双特异性抗体的研发成为各大制药企业追逐的热点。在抗体研发的过程中上游细胞培养的技术不断提升，在高密度培养技术的辅助下Titer可以达到10-15g/L,这个下游纯化工艺带来了巨大挑战。protein A亲和层析作为下游纯化捕获阶段的“金方法”，广泛应用于治疗性抗体纯化工艺。然而protein A填料价格高昂、动态结合载量低、循环使用次数有限，需要较低的pH进行洗脱使得终产物中聚集体的含量大大增加，难以实现较高通量的纯化，因此很大程度上提高了各大制药企业的研发成本。本文综述了将五年来各种工程化的技术策略用于提升protein A亲和层析可用性，以期望为治疗性抗体工业化纯化提供帮助。文章亮点1、总结了近年来主流的用于提高protein A填料耐碱性、动态结合载量以及洗脱pH的蛋白质工程策略，可以为层析填料制造方提供研发思路2、总结了近五年各大填料供应商中性质优良的protein A填料，可以为各大药企在治疗性抗体纯化工艺开发阶段提供理论指导。背景：治疗性抗体包括单克隆抗体、双特性抗体、以及抗体片段（Fabs、ScFv）逐渐占据了治疗性生物制品的半壁江山。各大药企的竞争也十分激烈，因此高效快速的研发出高质量的治疗性抗体就显得尤为重要。据统计表明抗体下游纯化工艺开发所需的时间平均占到治疗性抗体工艺开发的64.1%，投入经费也占到整个项目的55.8%。主流的抗体纯化通常包含三步层析、两步过滤、以及病毒灭活，以及浓缩换液（图1）。其中protein A亲和层析具有高特异性而广泛应用于抗体的捕获阶段。这一阶段对于整个抗体的纯化来说具有重要意义，然而由于动态结合载量低、循环使用次数有限，需要较低的pH进行洗脱，大大降低了治疗性抗体纯化过程中的通量。因此需要更好的技术开发来提高protein A的应用价值。本文综述了以及工程化的策略用于提升protein A的应用价值，以期望为治疗性抗体的工业化纯化提供依据。1、protein A结构以及亲和机制概述protein A 作为存在于金黄色葡萄球菌细胞表面蛋白，分子量为42KDa, 从结构上来看protein A由五个结合结构域（A、B、C、D、E）以及一个非结合结构域X所所构成。这五个结合域均由三个螺旋束所组成，包括三个a螺旋以及两个LOOP环结构。亲和层析过程中，protein A结合域中螺旋I和螺旋II通过氢键以及范德华力等作用力与抗体Fc端的相关位点进行结合（图2）。此外，Fab(抗体可变区)可以与protein A螺旋II和螺旋III的相关位点产生亲和力。当缓冲体系的pH在3.0-4.0之间时结合力消失，使得治疗性抗体得以洗脱下来。图2 protein A五个结合结构域2、工程化protein A用于提高洗脱pH在较低的pH条件下（pH<4.0）洗脱容易导致抗体发生可溶性聚集从而使得患者出现免疫原性反应，并且在较低的pH条件下还会出现不溶性的聚集体从而造成收率上的损失。因此提高纯化过程中洗脱pH具有较大的意义。有研究表明如下策略可以提高protein A亲和层析的洗脱pH:1.将protein A 与抗体可变区（Fab）亲和力较高的结构域截短可以提高洗脱pH。有研究表明protein A 的D、E两个结构域主要与IgG的Fab段相结合，因此将D和E两个结构域截短之后可显著提高洗脱pH。此外，当工程化的protein A 配基中仅含有B结构域时，洗脱的pH可由3.0-4.0提升到3.6-4.0。2、使用碱性氨基酸替换亲和力结合位点，可以适当降低亲和力，从而提高洗脱pH。当使用定点突变的手段将protein A螺旋I上的谷氨酰胺以及天冬酰胺替换为碱性氨基酸组氨酸时，洗脱pH由4.2提高到了5.6。3、对protein A 的Z结构域进行修饰，可进一步提高洗脱pH。Z结构域是在protein A 的B结构域进行了定点修饰，将29位甘氨酸替换成了丙氨酸。修饰之后配基耐碱性提升的同时，洗脱pH也得以相应提升。有研究表明在Z结构域插入甘氨酸片段可进一步提高洗脱pH，LOOPII中DPSQ序列替换为GGGG以及GGGGGG时洗脱pH由3.3提高到了4.5。此外，Ca离子依赖型protein A配基实现了在温和条件下进行洗脱，有研究人员将有Ca离子亲和力的LOOP环插入到Z结构域的LOOPII和LOOPIII之间形成Zca结构域，改造之后的protein A 配基在EDTA存在的条件下可以在pH5.5的情况下洗脱抗体。3、工程化protein A用于提高耐碱性在抗体纯化过程中，使用NaOH进行消毒去除生物制品内毒素等具有重要的意义，然而天然的protein A配基不具备耐碱性，长期接触碱性环境会造成配基脱落从而降低填料循环使用次数。因此使用工程化技术提高protein A配基耐碱性具有重要意义。目前主流提高protein A 配基耐碱性的方法是采用Z结构域配基。已有研究表明protein A的 B结合域中天冬酰胺-甘氨酸序列对碱处理较为敏感，因此将第29位甘氨酸替换为丙氨酸后，耐碱性有了较大幅度的提升，该修饰过后的结构域被称为Z结构域。Z结构域可以0.5M NaOH中孵育7.5小时后仍然可以保持72%以上的动态结合载量。2、对Z结构域进一步修饰，可以更好提高配基的耐碱性。首先在Z结构域结合位点处引入苏氨酸可以进一步提高耐碱性。将Z结构域中位于LOOPI以及第LOOPII的天冬氨酸（Asn23）替换为苏氨酸后在0.5M NaOH中孵育27小时后仍然可以保持91%以上的动态结合载量。类似地,Z结构域突变体Zvar(Q9A,E47T)在引入苏氨酸突变体后，在0.5MNaOH中循环1000分钟仍然可以保持80%以上的动态结合载量。3、C结构域改造可提升配基耐碱性。当C结构第29位甘氨酸替换为丙氨酸后可以在0.5M NaOH中孵育25小时保持稳定。综上所述，第29位甘氨酸是改良配基碱稳定性的关键位点。4、工程化protein A用于提高动态结合载量动态结合载量作为影响下游纯化通量的关键因素，是筛选填料的关键因素。通常传统protein A亲和层析的载量仅在20-30g/L左右纯化通量较低。较高的动态结合载量，可以减少装柱体积，节省填料降低成本。目前主流的策略是在不同结构域中添加连接子（Linker），从而减少空间位阻从而提高动态结合载量。目前商业化的protein A填料，如JSR Life Sciences公司的AmsphereTM A3，以及Cytiva公司的MabSelectTM PrismA动态结合载量均在50g/L以上。5、商业化Protein A亲和填料概览目前各种主流商业化Protein A亲和层析填料信息如下表（表一），目前商业化的protein A填料如cytiva公司的MabSelectTMPrismA以及默克公司的Eshmuno A填料均展现出较好的动态结合载量以及耐碱性。然而进口填料价格高昂，大大提高了下游纯化的研发成本。因此开发可替代性国产填料成为各大新型技术公司研发热点，如纳微科技的UniMab EXE填料，采用单分散PMMA微球以及葡聚糖涂层相结合的技术，完美融合了软胶以及硬胶的优势，因此有更高的载量以及耐碱性，此外博格隆公司的AT Protein A Diamond Plus填料动态载量可以达到60mg/ml以上。随着越来越多性质优良的国产填料上市，可大大降低国内制药企业研发成本，为企业提质增效，也有利于生物类似药的降低价格惠及民生。表1 各种主流商业化Protein A亲和层析填料总结：作为治疗性抗体下游纯化的金方法，protein A层析具有重要的意义。然而天然的protein A配基具有耐碱性差，动态结合载量低，需要低pH洗脱等缺陷使得抗体下游纯化的通量较低。本文综述了提高protein A耐碱性、动态结合载量以及洗脱pH的分子修饰策略，此外本文还总结几种主流的商业化protein A填料的特征性，因此可以为抗体工业化纯化工艺开发阶段提供基础信息。参考文献：1.Amritkar V , Adat S , Tejwani V , et al. Engineering Staphylococcal Protein A for high-throughput affinity purification of monoclonal antibodies[J]. Biotechnology advances, 2020:107632.2.[Ramos DDP, Ana M, González-Valdez, José, . Protein A chromatography: Challenges and progress in the purification of monoclonal antibodies[J]. Journal of Separation Science, 2019.