原创 RING E3 连接酶(CBL-B)抑制剂筛选与设计

2024-03-30

细胞疗法蛋白降解靶向嵌合体免疫疗法

分享首款 RING E3 连接酶催化抑制剂NX-1607发现过程。NX-1607通过锁定分子在非活性状态，以分子内分子胶(Intramolecular Glue)的机制抑制CBL-B的E3 连接酶活性，以增强肿瘤免疫，治疗肿瘤。Part 1. CBL-B背景•CBL-B是一种E3泛素连接酶，在免疫系统的细胞中高度表达。•CBL-B调节T, B和NK细胞活化。•阻断CBL-B解除抑制型免疫系统。•CBL-B缺陷小鼠显示出强大的T细胞和NK细胞介导的抗肿瘤免疫。CBL-B基因（KO）和敲入（KI）连接酶失活突变的小鼠的T细胞在体外刺激下表现出IL-2分泌增加。敲入（KI）连接酶失活突变的小鼠表现出肿瘤生长抑制。Part 2. 苗头分子发现CBL-B存在”关闭“和“激活”两种状态，CBL-B的Y363位点被磷酸化后，可激活CBL-B的泛素化功能。通过泛素和TKB结构域的TR-FRET实验建立高通量筛选系统。通过对30万化合物库筛选，发现了唯一的HIT分子NRX-1，进一步确定活性构象分子NRX-3。通过E2 TR-FRET，SPR和化合物共结晶表明，NRX-3是CBL-B的一种特异性的、分子内分子胶型活性抑制剂。参考前期POASTER的高通量筛选流程如下图，DEL和Fragment并不理想。通过设计以下流程测试来识别最佳的T细胞激活剂。T细胞活化的细胞因子释放实验和小鼠体内实验，表明NRX-8以剂量依赖性激活T细胞分泌细胞因子。Part 3. 先导分子发现和优化优化得到酰胺系列的早期POC，并在体内验证了CBL-B抑制肿瘤生长的活性。酰胺环化解决了血浆稳定性问题。1,2,4-三唑是CBL-B亲和力的最佳杂环，强亲和力需要两个氢键受体.对亲和力和代谢稳定性的空间SAR分析。通过抑制剂与蛋白的共晶体结构，分析了一个新的亲和口袋，使用哌啶和吡咯烷基团能最佳地填补新的口袋。该系列化合物在CBL-B E2-Ub检测实验的活性约为~10 nM；探针位移试验约为~1 nM。通过SPR测定结合解离速率，并提出了抑制剂的机制假设：抑制剂结合降低的偏离速率，进而驱动了T细胞的活性。CBL-B的5个抑制剂结合的晶体结构叠合，没有填充或次优填充第二口袋（青色）显示了高度一致的蛋白质结构。6种取代基稍大的抑制剂晶体结构的叠加显示了pro-pro环（Gold）中有很大的运动。NX-1607的作用机制：分子内胶Part 4. 确定候选分子NX-1607此外，缩短的连接子提供了更高的活性，最终得到了临床候选分子(NX-1607)，其体外活性显示为0.46nM，晶体结构显示缩短的抑制剂还保持这关键的相互作用。通过与不同阶段分子酶活和抑制效率分析，可发现在改善分子性质的同时，酶的因子效力提高了超过10,000倍以上。Part 4. 候选分子临床前药效分析在多种模型(结直肠癌，乳腺癌和B细胞淋巴瘤，剂量为10-30mg/kg)中，NX-1607单药或者与PD1单抗联用可诱导抗肿瘤反应，抑制生长和转移，延长总体生存。Part 5. 体内PK、毒理分析在临床前跨物种模型和临床中期的PK和安全性测试结果显示，NX-1607具有良好的药代特性和安全性。临床前动物中清除率约为50%，低血浆结合率和中等或良好的口服生物利用度。CEREP&hERG测量的半抑制浓度值为>100X预测的患者有效游离药物浓度。对大鼠和NHP进行的28天毒性研究支持了临床试验的进展。更重要的是，NX-1607在早期临床中（5-50mg），结果显示PK呈线性关系，半衰期约6-8小时，还观察到了高效的抗肿瘤活性。Part 6. 总结通过一种新颖的HTS筛选方案，发现抑制CBL-B活性的苗头分子，并通过药效和药理特征优化得到临床候选分子NX-1607。证实NX-1607系列化合物为是一种分子内胶，稳定连接酶的封闭，不活跃状态。在临床前和早期临床数据表明其具有很好药效和药理性质。声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手觉得本文好看，请点这里↓