LNP-mRNA免疫抑制型T细胞离体工程，治疗自身免疫性疾病

2023-11-01

信使RNA免疫疗法细胞疗法

自身免疫性疾病影响着世界上大约5-7%的人口，已成为全球最普遍的慢性疾病之一，常见包括I型糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等。自身免疫性疾病是机体免疫系统功能异常导致机体攻击自身组织的疾病，具有全身性病理学特征，随病情发展可累及多个器官系统。基于调节性T细胞（Regulatory T cell，Treg）的过继细胞疗法主要通过转录因子Foxp3激活Treg细胞介导免疫抑制。然而，该疗法存在几个关键障碍：1）Treg细胞仅占循环外周血单核细胞的5-10%，又缺乏特异性表面标志物，使得细胞获取、纯化、培养困难重重；2）有研究尝试通过将Foxp3蛋白递送至CD4 T细胞实现Treg免疫抑制细胞激活制备，但由于Foxp3蛋白复杂的三级结构和过大尺寸，难以穿过细胞膜；3）使用慢病毒和腺相关病毒（AAV）来转导T细胞或对Foxp3位点进行基因编辑的尝试显示出有限的荷载能力、脱靶基因组整合和遗传毒性等不良反应。2023年10月31日，宾夕法尼亚大学Mitchell Lab在Nano Lett.上发表了题为“mRNA Lipid Nanoparticles forEx Vivo Engineering of Immunosuppressive T Cells for Autoimmunity Therapies”的研究论文。Mitchell Lab开发了一个新的可电离脂质纳米颗粒（LNP）平台，可以有效将编码Foxp3蛋白的mRNA递送至CD4 T 细胞，在体外工程化Foxp3-T（FP3T）细胞。这些FP3T细胞可瞬时表现出免疫抑制表型，并抑制效应T细胞的增殖。来源：参考资料[1]Michael J. MitchellIntroductionMichael J. Mitchell 从本科阶段就一直从事生物医学方面的研究，2009 年本科毕业于史蒂文斯理工学院，2014 年博士毕业于康奈尔大学，2014-2017 年在麻省理工学院科赫综合癌症研究所Robert Langer实验室进行博后期间的训练。目前，在宾夕法尼亚大学工程与应用科学学院生物工程系担任副教授，同时，还担任宾大RNA创新研究所脂质纳米颗粒递送系统组组长。Mitchell Lab 主攻脂质纳米颗粒递送系统，并且，将其研究成果和开发的技术应用于一系列疾病的治疗，包括癌症治疗、免疫治疗、基因组编辑、心血管疾病和再生医学。2023年9月，Mitchell Lab在Cellular and Molecular Bioengineering发表文章：“siRNA Lipid-Polymer Nanoparticles Targeting E-Selectin and Cyclophilin A in Bone Marrow for Combination Multiple Myeloma Therapy”，开发了一种新型的治疗多发性骨髓瘤的RNA纳米颗粒疗法，被该杂志（BMES下属官方杂志）评为“细胞与分子生物工程年轻创新者”。Biomedical Engineering Society (生物医学工程学会)，简称 BMES，是生物医学工程领域的研究者和行业从业者的专业协会。前不久，Mitchell Lab前往2023 BMES大会，实验室成员共做了17次学术报告，主要涉及纳米颗粒递送系统在癌症免疫治疗、基因编辑、胎盘递送、干细胞重编程、多发性骨髓瘤、肝外递送等方向的应用。（本段转自公众号BioFactory）LNP库的设计与表征为构建能有效递送mRNA至CD4 T细胞的LNP文库，研究团队采用了SN2反应机理，通过将六个含有醚或烷基间隔物的多胺核心（图1B）分别与三种不同长度的环氧化物封端烷基链之一（图1C）反应，合成了18种独特的可电离脂质，用于构建LNP，并使用具有交错人字形混合结构的微流控装置将它们与mRNA结合，以配制用于筛选的LNP文库。图1. 构建免疫抑制FP3T细胞工程的mRNA-LNP平台。来源：参考资料[1]使用动态光散射（DLS）测量LNP流体动力学尺寸（直径）和多分散指数（PDI），获得的LNP直径范围为56.74-108.77 nm，PDI范围为0.10-0.27，表明配制的LNPs相对较小且具有均匀的尺寸分布。mRNA包封效率均在70%以上，pKa测量值在5.7-7.2范围内，可在酸性内体环境中稳定电离，促进内体逃逸。经体外转染筛选后发现，使用C14-A1可电离脂质构建的LNP是体外递送mRNA到CD4 T细胞的最佳配方。优化Foxp3 mRNA及给药方案值得注意的是，研究团队并未直接选用编码Foxp3的mRNA，而是使用了在Treg细胞中发现的Foxp3的剪接变体，Foxp3转录变体2 。一般情况下，全长Foxp3蛋白包含核定位信号（NLS）和核输出信号（NES），Foxp3转录变体2 缺乏NES，允许Foxp3蛋白更好停留在核内，从而促进其作为转录因子的主要功能。经m1ψ修饰的Foxp3转录变体2 mRNA在C14-A1包封后没有发现LNP理化特征的显著变化，在冷冻电镜下未发现结构形态的改变（图2A,B）。在此基础上，研究团队使用共聚焦荧光显微镜确认了原代人CD4 T细胞对Foxp3 mRNA-LNP的摄取，并进一步检测0、0.5、4和24小时不同时间点的LNP摄取解离动力学。在0.5小时和4小时观察到LNP的内化和摄取，细胞内存在DiI标记的LNP，在24小时仍可观察到最小DiI-LNP信号，表明LNP能够在更长的时间尺度上成功从内体逃逸（图2C,D）。图2. 原代人CD4 T细胞对Foxp3 mRNA-LNP的摄取解离研究来源：参考资料[1]此后，研究团队以0-500ng的mRNA剂量处理每组10万个细胞并通过流式细胞术及核内染色来测量、评估Foxp3蛋白表达。其中，100-500 ng mRNA范围内的Foxp3表达具有统计学意义的显著增加，超过45%的细胞在350 ng mRNA的剂量下表达Foxp3（图2E）。细胞毒性分析表明，高于200 ng的剂量导致细胞活力的降低，350和500 ng处理分别获得80%和71%的平均细胞活力。基于离体T细胞工程研究，80%的细胞活力是可以接受的。在表达动力学上，转染后1天表达最高，大约50%的细胞表达Foxp3。在转染后3天衰减并趋于稳定，约18%的细胞表达Foxp3（图2G）。FP3T细胞抑制效应T细胞增殖研究团队将FP3T细胞与CD4、CD8效应T细胞（Teff）进行了共培养抑制实验，并跟踪6天内Teff细胞的增殖。通过染料稀释分析对T细胞增殖进行定量，增殖增加导致 MFI 值降低，增殖减少导致 MFI 值升高。共培养6天后，FP3T细胞共培养组观察MFI值高于单一Teff细胞组，表明FP3T细胞对效应T细胞增殖的抑制作用（图3C）。图3. FP3T细胞免疫抑制验证来源：参考资料[1]使用ELISA进一步测量分泌的抑制和增殖/炎性细胞因子的水平。与未经处理的Teff组相比，FP3T细胞组观察到明显的TGF-β1和IL-10水平升高，两者均为Treg释放的免疫抑制细胞因子。TGF-β1在共培养6天内稳步增加，而IL-10在共培养1天后激增（图3D）。总结在这项工作中，Mitchell Lab开发的LNP 平台可在体外将Foxp3 mRNA有效递送至 CD4 T细胞，工程化获得免疫抑制FP3T细胞。尽管本研究停留在体外实验阶段，但给未来开发基于LNP-mRNA的体内工程化细胞疗法治疗自身免疫性疾病提供了有意义的证据。参考资料[1]Thatte AS, Hamilton AG, Nachod BE, Mukalel AJ, Billingsley MM, Palanki R, Swingle KL, Mitchell MJ. mRNA Lipid Nanoparticles for Ex Vivo Engineering of Immunosuppressive T Cells for Autoimmunity Therapies. Nano Lett. 2023 Oct 31. doi: 10.1021/acs.nanolett.3c02573.