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靶向KRAS-G12S的抑制剂设计与发现

2022-08-01

抗体免疫疗法

KRAS基因突变作为最早被发现的致癌基因突变之一，已成为人类癌症中最常见的遗传性损伤。统计结果显示，每年全球约有100万人因KRAS基因突变而死亡。近年来，S-IIP变构口袋的发现和KRAS-G12C共价抑制剂的成功上市宣告了KRAS的“不可成药”性得到突破，KRAS突变体蛋白的抑制也展现出了显著的临床效果。然而，由于其他G12位点的突变氨基酸残基具有较半胱氨酸更低的亲核性，因此针对K-RAS的其他非半胱氨酸突变体的共价药物仍有待开发。KRAS-G12S突变作为G12位点的热点突变之一，占所有KRAS突变的4.4%，它将KRAS G12位点的甘氨酸替换成丝氨酸，从而导致KRAS更长时间处于GTP-bound的激活状态，促进肿瘤细胞的增殖。近日，来自美国加州大学旧金山分校的研究团队以Mirati公司开发的KRAS-G12C抑制剂adagrasib（MRTX849）为结构母核，引入能够共价靶向丝氨酸的β-内酯（β-lactone）结构，成功开发出了首个靶向KRAS-G12S突变体的选择性共价抑制剂。在测定化合物活性之前，研究人员首先探询了KRAS蛋白的12位上甘氨酸到丝氨酸的突变是否足以使其产生致癌信号。他们使用能够稳定表达KRAS-WT、KRAS-G12C和KRAS-G12S蛋白的Ba/F3细胞系和其特异性抗体进行了免疫印迹实验。结果显示，表达KRAS-G12S和KRAS-G12C的Ba/F3细胞中的磷酸化ERK和磷酸化AKT水平明显高于RAS-WT细胞，且将IL-3从培养液中去除后，表达KRAS-G12S和KRAS-G12C的细胞的增殖速率仍得以保持。这表明了KRAS p.G12S是一种致癌突变，其转化潜能与KRAS p.G12C相似。接着，研究人员成功解析了KRas-G12S•GDP的晶体结构，并发现其与野生型KRAS和KRAS-G12C具有相似的蛋白构象，且突变的丝氨酸与半胱氨酸的空间取向相似。除此之外，他们还对G12S突变对KRAS蛋白GTP水解率的抑制进行了探究。结果发现与KRAS-WT相比，KRAS-G12S的固有GTP水解率降低，且显著抑制了GTP酶激活蛋白（GTPase-activating protein，GAP）NF-1介导的GTP水解。为了设计靶向KRAS-G12S的化合物，研究人员借鉴了一系列包含β-内酯的天然化合物的结构特征，将β-内酯结构引入MRTX849母核，替换其中的丙烯酰胺共价靶头，设计、合成出了G12Si-1和G12Si-2，并使用whole-protein MS评估了它们在突变的丝氨酸残基上共价结合K-RAS-G12S的能力。结果显示，仅G12Si-1能够与KRAS-G12S•GDP形成共价加合物，在23℃下1h后修饰程度达到64%，12h后达到100%，而G12Si-2却不能与之共价结合。差示扫描荧光法（differential scanning fluorimetry, DSF）结果显示，加合物的形成明显增强了KRAS-G12S蛋白的热稳定性，将KRAS-G12S·GDP的熔融温度（Tm）提高了17.2℃。此外，研究还表明G12Si-1和G12Si-2无法与负载GppNHp的KRAS-G12S蛋白和野生型KRAS蛋白共价结合，体现了化合物的选择性。接着研究者们希望通过监测一类荧光标记的GDP类似物（BODIPY-GDP）与未标记的GDP的交换来评估G12Si-1是否影响K-Ras的核苷酸循环过程。结果显示，G12Si-1抑制了KRAS-G12S固有状态和SOS催化下的核苷酸交换，并降低了EDTA促进核苷酸交换的比率。为了探究与验证KRAS-G12S·GDP与G12Si-1相互作用的机制，研究人员对KRAS-G12S•GDP•G12Si-1复合物的进行了晶体衍射。结果发现，G12Si-1结合的G12S的S-IIP变构口袋处，与已报道的G12C呈相似的取向。电子密度结果证实，RAS-G12S的Ser12被G12Si-1酰化，G12Si-1中具有较大张力的β-内酯结构被解开，最终形成由酯键连接的蛋白质-药物复合体。此外，研究者们还观察到由β-内酯开放产生的羟基能够与KRAS-G12S Gly10的主链羰基形成氢键，且一个水分子通过氢键将上述醇羟基和Gly10的主链N-H再次相连；Lys16与G12Si-1上酯键羰基形成的氢键被认为能够极大地提高抑制剂的反应活性。这些相互作用也很好地解释了结构相似的G12Si-1和G12Si-2之间活性具有较大差异的原因。接下来，研究人员根据最近报道的专利和文献对G12Si-1（Ki=97µM）进行了进一步的结构优化，得到了G12Si-3、G12Si-4、G12Si-5，其中G12Si-5表现出最好的抑制效果（Ki=26µM）。为了探究G12Si系列化合物能否在癌细胞系中靶向抑制KRAS-G12S，研究者们使用adagrasib和G12Si化合物分别处理KRAS p.G12S突变的A549细胞。结果表明，G12Si系列化合物均能在一定程度上共价修饰KRAS蛋白，降低KRAS•GTP的含量，并显著抑制细胞中的磷酸化ERK水平。其中，G12Si-5对A549细胞中KRAS信号传导具有剂量依赖性的最佳抑制效果，IC50约为3µM。随后，研究人员合成出了G12Si-5的末端含炔类似物探针，以便使用点击化学反应富集细胞中的共价修饰蛋白质，并进行LC-MS/MS分析。使用竞争性蛋白质组学方法，他们发现KRAS-G12S是G12Si-5的选择性靶点，且具有高比例的化学参与。实验还观察到另外三种蛋白（PLD3、TRMT61A和TRMT6）与探针6的高比例结合，可能是此类化学结构分子的潜在共同靶标。为了进一步研究和验证G12Si-5在细胞内的选择性，研究团队对4个KRAS p.G12S突变的细胞系进行了验证性实验。结果显示，在四个细胞系中G12Si-5的处理均能导致KRAS-G12S蛋白共价加合物的形成（凝胶迁移距离的改变）和磷酸化ERK水平的降低，且对野生型KRAS、KRAS p.G12C以及KRAS p.G12D细胞系中的相应过程无显著影响。最后，研究人员比较了G12Si-5和adagrasib对KRAS p.G12S突变的Ba/F3细胞和亲代Ba/F3细胞增殖的影响。结果表明，G12Si-5优先抑制KRAS-G12S细胞的生长（IC50=2.4µM，对亲代细胞的IC50为12.5µM），而adagrasib并没有表现出类似的选择性，在10µM时导致两种细胞系完全死亡。综上，这项工作使用以化学结构为导向的药物设计方法，在MRTX849母核中引入β-内酯结构，成功开发出了首个靶向KRAS-G12S突变体的选择性共价抑制剂，为临床上抑制KRAS-G12S突变的肿瘤细胞增殖提供了一个新的治疗方向。此外，本研究中靶向蛋白质丝氨酸的化学策略，也为日后其他丝氨酸靶向共价抑制剂的开发提供了一个新的选择。参考文献1. Zhang, Ziyang et al. “Chemical acylation of an acquired serine suppresses oncogenic signaling of K-Ras(G12S).” Nature chemical biology, 10.1038/s41589-022-01065-9. 21 Jul. 2022.2. Hallin, Jill et al. “The KRASG12C Inhibitor MRTX849 Provides Insight toward Therapeutic Susceptibility of KRAS-Mutant Cancers in Mouse Models and Patients.” Cancer discovery vol. 10,1 (2020): 54-71.