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随着双抗出海升温，研发管线以双抗为主的宜明昂科-B，股价自9月12日以来累计涨幅高达约100%。 资本市场的加持，加之双抗管线达成大额BD交易，下一代Biotech龙头正在浮出水面。 01 商业化近在咫尺 对于带“B”标签的Biotech，投资者最关心的问题就是：什么时候能实现扭亏为盈？ 随着越来越多Biotech凭借管线出海实现盈利，宜明昂科也紧跟这一趋势，达成了大额BD交易。 8月1日，宜明昂科发布公告称，把IMM2510（VEGFxPD-L1双抗）和IMM27M（CTLA-4抗体）大中华区以外的权益授予instil bio公司，将获得5000万美金的首付款及近期付款，以及超过20亿美金的后续里程碑付款，及一定比例的销售提成。 当然，除了大额BD交易，宜明昂科也在加速冲刺产品管线，其中首发管线IMM01已有3项适应症处于III期临床，距离商业化已经不远。 IMM01的研发进度 图片来源：宜明昂科官网 IMM01（替达派西普）是一款靶向CD47的SIRPα- F c融合蛋白，能通过双重作用机制充分激活巨噬细胞，同时通过干扰CD47/SIRPα相互作用阻断“别吃我”信号，并通过激活巨噬细胞的Fcγ受体传递“吃我”信号。 由于CD47具备与PD-1相似的广谱治疗特性，在多种实体瘤及血液瘤中高表达，且能够与PD-1联合用药和双抗研发，具有巨大的肿瘤免疫治疗潜力，因而被称为PD-1的“继承者”。 IMM01具有独特的差异化优势，凭借特别改造的CD47结合结构域避免红细胞结合，以及增强的IgG1 Fc受体结合能力，显著提升了安全性和抗肿瘤效果，成为CD47抗体药物中少数能在单药治疗临床试验中观察到完全缓解并显示良好安全性的药物。 联合用药方面，IMM01正在开展3项III期临床，包括联合阿扎胞苷一线治疗慢性粒-单核细胞白血病（CMML）、联合阿扎胞苷一线治疗较高危骨髓增生异常综合征（MDS）、联合替雷利珠单抗治疗PD-1抑制剂治疗后复发或病情有所进展的复发性或难治性（R/R）经典霍奇金淋巴瘤（cHL）。 IMM01的进展及临床试验数据 图片来源：宜明昂科2024年中期报告 值得一提的是，替雷利珠单抗是“创新药一哥”百济神州的拳头产品，销售额保持快速增长态势。IMM01能搭上这辆正处于放量状态的快车，无疑极具商业价值。 从研发进度看，IMM01位于第一梯队，是全球首款进入III期阶段的SIRPα靶向药物。根据太平洋证券研报，经测算IMM01远期销售峰值有望达到10.5亿元。 02 大额BD合作背后 不只有CD47，是市场对宜明昂科的新的认识。 今年8月，宜明昂科将IMM2510（VEGFxPD-L1双抗）和IMM27M（CTLA-4抗体）大中华区以外的权益授权给instil bio，双方达成了总交易额超20亿美元的合作。正是这项合作，让宜明昂科撕掉了“只有CD47”这个标签，赋予了市场新的视角。 特别是9月8日，康方生物在2024年世界肺癌大会上，公布了PD-1/VEGF双抗依沃西（AK112）头对头击败K药的优异临床数据后，不仅康方生物及其合作伙伴Summit股价暴涨，就连拥有VEGFxPD-L1双抗IMM2510的宜明昂科，也在短短几个交易日暴涨近100%。 股价暴涨的背后，实则是PD-(L)1/VEGF双抗商业价值的体现。 目前，已有3款国产PD-(L)1/VEGF双抗达成超10亿美元的出海合作，除了宜明昂科IMM2510，还有康方生物以总额超50亿美元将AK112授予Summit，以及普米斯以总额超10亿美元将PM8002授予BioNTech。 如今，依沃西单抗已经验证了PD-(L)1/VEGF双抗的成药性，在今年5月获批联合培美曲塞和卡铂用于经EGFR-TKI治疗后进展的EGFR基因突变阳性的局部晚期或转移性非鳞状非小细胞肺癌患者的二线治疗。而且，新适应症也获NMPA纳入优先审评，单药用于PD-L1阳性（TPS≥1%）的EGFR基因突变阴性和ALK阴性的局部晚期或转移性NSCLC的一线治疗。 尽管依沃西单抗已率先拿下NSCLC的市场蛋糕，但IMM2510除了开展一线治疗NSCLC，还有软组织肉瘤（STS）、三阴性乳腺癌（TNBC）、肝细胞癌（HCC）等适应症，覆盖单药、联合用药、一线、二线等多种策略。 另外，相比于仅能结合VEGF-A的竞品，IMM2510的VEGF能结合更广泛的受体（包括VEGF-A、VEGF-B和PLGF），而且差异化的分子设计可带来较强的ADCC效应，对肿瘤细胞具有更强的杀伤力。根据太平洋证券研报，经测算IMM2510远期销售峰值有望达到20.9亿元。 IMM2510和IMM27M的研发进度 图片来源：宜明昂科官网 除IMM2510外，宜明昂科的新一代抗CTLA-4抗体IMM27M也颇具看点。 IMM27M透过基因工程改造具有增强的ADCC活性。临床前研究表明，IMM27M可诱导相比同类药物Yervoy（伊匹木单抗）明显更强的抗肿瘤活性，且即使在低至0.3 mg/kg的剂量下也能达到肿瘤完全缓解。 值得一提的是，Yervoy为百时美施贵宝（BMS）研发的全球首个CTLA-4抑制剂，2023年销售额超过20亿美元。 目前，IMM27M已完成I期剂量递增研究的患者招募，且初步数据显示，安全并具有良好的耐受性，于经过重度治疗晚期实体瘤患者中，2例患者确认达到PR。此外，今年7月还启动了IMM27M联合IMM2510治疗R/R实体瘤的Ib/II期研究。 03 下一个康方生物？ 2024年，可谓是双抗的爆发之年。 一边是国产双抗出海持续升温，今年已发生近10起相关交易，另一边是康方生物PD-1/VEGF双抗依沃西头对头击败K药，将双抗研发的热情推到了高潮，同时也带动了资本市场对双抗药企的关注。 而站在风口浪尖上的宜明昂科，目前共布局了7款双抗管线，除了上文提到的VEGFxPD-L1双抗IMM2510，还有针对血液瘤和实体瘤的IMM0306（CD47xCD20）、IMM2902（CD47xHER2）、IMM2520（CD47xPD-L1）、IMM4701（CD24xCD47），以及针对自免和代谢性疾病的IMC-002（IMM0306，CD47xCD20）、IMC-004（IMM7211c，ActRIIAx未披露）。 已达成大额BD交易，加上丰富的双抗管线，隐约能从宜明昂科身上看到一点康方生物的影子。 宜明昂科的产品管线 图片来源：2024年中期报告 当前，这些双抗管线处于临床不同阶段。其中，进度较快的IMM0306，正在开展单药治疗R/R滤泡性淋巴瘤（FL）及边缘区淋巴瘤（MZL）的Ib/IIa期临床，以及与来那度胺联用治疗R/R CD20阳性B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）的Ib/IIa期临床。 IMM0306是全球首个进入临床阶段的CD47xCD20双抗，对CD20的亲和力高于CD47。据临床前研究表明，IMM0306即使在低得多的剂量水平下亦比CD20单抗Rituxan（利妥昔单抗）单药治疗效果更佳，且其在相近剂量水平下比IMM01与利妥昔单抗联合疗法效果更佳。其中，利妥昔单抗由罗氏研发，自1997年上市至今累计销售额超过1100亿美元。 值得一提的是，基于在IMM0306临床研究中观察到的B细胞耗竭是其治疗自免疾病的坚实基础，宜明昂科进一步布局了CD47xCD20双抗IMC-002，目前正在开展治疗系统性红斑狼疮（SLE）及视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）的I期临床。 另外，针对晚期HER2阳性及HER2低表达实体瘤的IMM2902（CD47xHER2双抗）也值得关注，毕竟Enhertu（DS-8201）能成为ADC全球“药王”，背后少不了攻克HER2低表达乳腺癌的助力。 目前，IMM2902正在中国和美国分别进行I期临床试验，以评估在晚期HER2阳性及HER2低表达实体瘤（包括乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌及胆管癌）的安全性及有效性，并于2022年7月获美国FDA授予针对乳腺癌的快速通道资格。 已进入临床阶段的还有IMM2520（CD47xPD-L1），正在开展用于多项晚期实体瘤的I期研究，预计2024年完成该试验。截至2024年6月30日，已招募及给药24例患者。初步数据显示，IMM2520安全并具有良好的耐受性，观察到1例PR及2例SD肿瘤收缩10%以上。 04 结语 不管是否能成为下一个康方生物，如今的宜明昂科正在加速冲刺，推出首款商业化产品。除已达成大额BD外，后续管线也在按部就班的研发当中，一些候选药物也展现出了良好的临床价值。 种种因素表明，下一代Biotech龙头似乎正在浮出水面。 参考资料 1.各家公司的财报、公告、官微 2.太平洋证券研报

Merger expands OncoC4’s wholly owned immunotherapy pipeline and establishes in-house clinical manufacturing capabilities Adds IND-ready AI-081, a PD-1/VEGF bispecific antibody with best-in-class potential and clinical-stage assets including next-generation siglec agonist AI-071 Both companies are co-founded by CEO, Yang Liu and CMO, Pan Zheng and have a similar shareholder base ROCKVILLE, Md., Sept. 25, 2024 (GLOBE NEWSWIRE) -- OncoC4, Inc., a late-stage biopharmaceutical company developing novel medicines for cancer, and AcroImmune, a biopharmaceutical company developing immunotherapy drugs for malignant tumor and inflammatory disease, today announced that the companies, which are under common control, have entered into a definitive merger agreement to combine in an all-stock transaction (the Merger). Under the terms of the agreements, OncoC4 will acquire 100% of the outstanding equity interests of AcroImmune. Upon completion of the Merger, the combined company is expected to operate under the name OncoC4, Inc., will be headquartered in Rockville, Maryland, and led by Yang Liu, PhD, Co-Founder, Chief Executive Officer (CEO). Both OncoC4 and AcroImmune were co-founded by Drs. Yang Liu and Pan Zheng and have a similar shareholder base. “This Merger seamlessly bolsters OncoC4’s wholly owned immunotherapy pipeline and adds investigational new drug (IND)-ready PD-1/VEGF bispecific antibody AI-081 with best-in-class potential and clinical stage assets with near-term catalysts including next-generation siglec agonist AI-071,” said Yang Liu, PhD, Co-Founder, CEO and Chief Scientific Officer (CSO) of OncoC4. “Additionally, the Merger will also expand OncoC4’s geographical footprint and establish in-house clinical manufacturing capabilities including R&D, clinical, and manufacturing sites in China.” Dr. Liu continued, “Collectively, these synergies further strengthen the potential of OncoC4 to deliver differentiated and novel immunotherapies spanning multiple modalities for difficult to treat solid tumors and hematological malignancies. We look forward to continued advancement across our innovative pipeline with several upcoming early and late-stage clinical milestones over the next 12 months.” Dr. Pan Zheng, MD, PhD, OncoC4’s Chief Medical Officer (CMO) and cofounder of OncoC4 and AcroImmune added, “A bispecific targeting PD-1 and VEGF holds potential to broaden the horizon of checkpoint therapy across cancers. AI-081 consists of fully owned and high affinity binding motifs to PD-1 and VEGF that are designed to be best in-class among an emerging class of potentially transformative cancer therapies. We are very excited to file an IND application for AI-081 in the fourth quarter of the year.” OncoC4’s Pipeline Programs and Expected Upcoming Milestones Newly Added Wholly Owned Programs AI-081 – A potentially best-in-class bispecific antiboy against PD-1 and VEGF that has demonstrated high potency and in vivo anti-tumor activity in preclinical models IND filing expected in Q4 2024 AI-071 – A Phase 2 ready, next-generation siglec agonist that is designed for broad siglec coverage with potential application across immunotherapy treated indications. Siglec is a novel innate immune checkpoint discovered by OncoC4 founders with broad application for cancer and excessive inflammation. Initiation of Phase 2 trial for acute respiratory failure expected in Q4 2024Initiation of Phase 2 trial for immune related adverse events expected in Q1 2025 Legacy OncoC4 Wholly Owned Programs CD24 Siglec Program – Novel innate immune checkpoint discovered by OncoC4 founders with broad application for the treatment of cancer and excessive inflammation. ONC-841 – First-in-class anti-Siglec 10 mAb designed for broader impact across innate and adaptive immunity in tumor microenvironment Initiated Phase 1 trial in solid tumors in Q3 2024 Cancer Specific CD24 Platform Program – CD24 is a potent ‘don’t eat me’ signal used by tumors to evade innate immune destruction and an oncogene overexpressed in 70% of all human cancers. OncoC4’s cancer-specific mAb targets a neo-CD24 epitope with application across multiple therapeutic modalities. ONC-782 – CAR-T cell therapy for solid and hematological malignancies Initiation of Phase 1 Investigator Initiated Trial in China expected in 2H 2024 ONC-783 – Bispecific mAb for hematological malignancies IND enabling studies initiated in Q2 2024 ONC-784 – ADC for solid tumors IND enabling studies to be initiated in Q1 2025 Partnered Programs Gotistobart (BNT316/ONC392) is a next-generation anti-CTLA-4 antibody candidate in joint late-stage clinical development with BioNTech as a monotherapy and in combination in multiple ongoing solid tumor indications. Designed for improved toxicity and ability to overcome immune suppression in the tumor microenvironment by depleting regulatory T cells to turn immunologically cold tumors hot. About OncoC4 Based in Rockville, Maryland, OncoC4 is a privately held, late-stage biopharmaceutical company that is actively engaged in the discovery and development of novel biologicals for cancer treatment. Its lead clinical candidate is gotistobart (BNT316/ONC-392), a next generation anti-CTLA-4 antibody that allows CTLA-4 to recycle and maintain its protective function against autoimmune diseases while enhancing anti-tumor activity at the same time. In March 2023, OncoC4 announced a strategic collaboration with BioNTech to co-develop and commercialize ONC-392 in multiple solid tumor indications. OncoC4 received $200M upfront and is eligible to receive development, regulatory, and commercial milestone payments in addition to double digit royalties. In addition, OncoC4 has a pipeline of first-in-class and best-in-class assetstargeting both novel and well validated oncology targets. For more information, please visit www.oncoc4.com. Investor Contact: Alexandra FoliasLifeSci Advisorsafolias@lifesciadvisors.com Media Contact: Kristin Politi, Ph.D. LifeSci Communicationskpoliti@lifescicomms.com

摘要：随着人类多能干细胞（hPSCs）特定谱系分化技术的进步，下游细胞分离已成为生产hPSC衍生产品的关键步骤。由于分化过程通常导致异质细胞群的形成，需要进行细胞分离，以富集所需的细胞群或去除不需要的细胞群。本文总结了hPSC衍生细胞分离过程的最新进展，包括标准的分离技术，如磁激活细胞分选，以及基于粘附强度和代谢通量等新型分离策略。特别讨论了下游生物加工流程和不同细胞谱系表面标记的识别。尽管大规模hPSC衍生细胞的下游生物加工仍面临挑战，但应实施合理的质量设计方法，以增强对过程与产品之间关系的理解，并确保所产生细胞的安全性。 1.引言 人类多能干细胞（hPSCs）因其独特的自我更新能力和分化成几乎所有类型细胞的能力，为多种体细胞组织提供了替代细胞来源。hPSC衍生物已在几个I期临床试验中进行了测试，以评估它们作为治疗产品的潜在用途，并且还用于药物发现和疾病建模。最初，hPSC衍生细胞的开发和制造集中在优化分化效率上，即上游生物加工，从而改进了分化协议，允许以高效率和纯度生产特定谱系的细胞。例如，使用基于胚胎体（EB）的协议或通过双重抑制SMAD（小母体抗背足蛋白）信号的单层协议，可以从hPSCs中以70-90%的纯度生成少突胶质细胞前体（OPCs）和神经前体细胞（NPCs），以及使用生长因子或小分子引导的协议可以生产30-90%纯度的心肌细胞。这些高效分化协议的开发显示了上游生物加工在生产hPSC衍生细胞方面的巨大进展。然而，下游生物加工（即细胞分离），作为完成hPSC衍生产品的关键步骤和瓶颈，需要进一步研究。 由于当前从hPSCs分化的过程通常会产生包括残留未分化细胞在内的混合细胞类型，因此需要进行下游生物加工，以选择性纯化所需的细胞群或去除不需要的细胞群（图1A）。例如，最终的干细胞产品不含未分化细胞或不需要的谱系的前体细胞对于减少移植后畸胎瘤形成的风险至关重要。在这里，我们回顾了hPSC衍生物的新兴下游生物加工，包括hPSC扩增和分化后的细胞分离的最新进展。我们提供了识别新型谱系特异性表面标记的例子，这些标记可以用于分离hPSC衍生细胞。此外，我们还讨论了hPSC下游生物加工的方法和实际流程，以及生产神经和心脏细胞面临的特定挑战。 图1 hPSC衍生产品的下游生物加工。(A) 富集和耗竭策略以分离hPSC衍生细胞。(i) 富集：收集所需细胞（适用于低分化效率）。(ii) 耗竭：去除不需要的细胞（适用于高分化效率）。(B) 下游处理的主要步骤。(1) 细胞收获；(2) 离心以去除收获酶；(3) 保持等待所有细胞被收获；(4) 耗竭以去除不需要的细胞；(5) 离心以去除耗竭缓冲液；以及 (6) 填充和完成将细胞转移到冷冻保护缓冲液中进行冷冻保存。如果每个步骤在理想情况下的产量为90%，则这些步骤后的总产量预计为59%。(C) 聚集对大规模细胞标记的影响。(i) 单细胞悬浮液允许用磁性珠进行细胞标记。(ii) 如果发生聚集，目标细胞无法均匀标记，聚集体中未标记的细胞被去除，从而降低了产量。(iii) 具有高聚集倾向的细胞保持在配制的缓冲液中作为单细胞悬浮液，以提高处理效率。本图包含了Servier Medical Art (smart.servier.com)的图像。 2.纯化hPSC衍生产品的技术 在分化过程中，hPSCs及其衍生物在细胞密度、表面标记的表达、代谢需求和粘附强度方面具有阶段特异性。基于这些和其他特征，已经评估了不同类型的干细胞衍生细胞的分离过程，包括基于密度的分离和荧光激活细胞分选（FACS）以及基于特定表面标记的磁激活细胞分选（MACS）等标准分离技术。随着对hPSC属性的更好理解，也开发了基于差异粘附到培养容器的细胞分离和基于不同代谢活性的选择性去除细胞等新型分离策略。 2.1.基于密度的分离 在分化培养中可能会产生具有不同细胞密度的混合细胞类型，可以根据它们的密度进行分离。一个例子是使用Percoll梯度离心来富集hPSC衍生的心肌细胞。从分化培养中收获的细胞被加载到Percoll的两层上，然后进行离心。大多数心肌细胞将出现在Percoll的下层，而非心肌细胞将在其他分数中。从含有大约50%心肌细胞的起始分化培养中可以获得高达95%纯度的心肌细胞。然而，这种方法分辨率低，不适合大规模分离。 2.2.基于细胞生物物理特性的分离 在未分化的hPSCs、部分重编程细胞、体细胞和hPSC衍生的分化细胞之间观察到显著的生物物理特性差异。例如，粘附特性、质膜刚度和光学特性在hPSCs的不同发育阶段表现出不同。这些特性的变化可以作为选择特定承诺群体的目标。 hPSC衍生的心肌细胞显示出来自肌球蛋白杆状体的特定二次谐波信号，这使得它们能够从异质的分化细胞群体中分离出来。或者，从重新培养的分化hESC聚集体中衍生的神经嵴细胞会自发地从主要细胞团中分离出来，这使得它们可以通过形状选择和手动挑选进行隔离。 另一方面，从小鼠诱导多能干细胞（miPSCs）衍生的扩增色素细胞被证明比非色素细胞更具粘附性。这种特性使得它们可以通过调节暴露时间和酶解离的类型来进行纯化：非色素菌落可以通过5分钟的Accutase处理和吹打来回收，而剩余的粘附色素细胞可以用胰蛋白酶二次回收。类似地，在细胞解离前用ROCK（Rho相关蛋白激酶）抑制剂（Y-27632）进行介质补充，可以去除粘附性较低的细胞，从而富集内皮祖细胞。此外，发现退出多能性会增加细胞膜刚度。这些膜流动性和脂质组成的改变可以与分化阶段联系起来。基于这一原理，可以根据膜流动性条件下它们的粘附特性进行细胞分离，以选择各种分化细胞。 人类诱导多能干细胞（hiPSC）菌落可以在4分钟内通过85-125 dynes/cm2的剪切应力在流体流动应用下脱落，而分化细胞由于粘附强度更高而保持附着。这种方法可以从异质重编程培养物和分化的后代中分离出完全重编程的iPSC菌落，纯度超过95%。然而，这种方法尚未评估用于特定谱系分化的细胞。 由于细胞/粘附表面相互作用在分化过程中受到调节，这导致了新型生物材料的开发，用于特定分化表型的细胞隔离。在未分化阶段，iPSC菌落可以从热敏聚合物（PNIPAAm（聚（N-异丙基丙烯酰胺）））在低温（即22°C）下选择性脱落，而承诺的细胞仍然附着在表面。这种方法可以实现未分化干细胞群体的非侵入性富集。类似地，hiPSCs承诺用于心脏谱系，种植在与层粘连蛋白-521涂层的聚（N-异丙基丙烯酰胺）上，其临界溶液温度在8°C，促进心肌细胞的特定脱落。 此外，研究发现，通过高速激光照射光响应聚合物的特定区域（即聚[（甲基丙烯酸甲酯）-共（分散黄7丙烯酸酯）]层）可以消除承诺的细胞。或者，不同亚型的层粘连蛋白促进各种分化细胞类型的不同粘附强度。例如，LN211/332/511E8促进非上皮细胞的粘附，而LN332/511E8则有利于上皮细胞的附着和增殖。细胞与不同层粘连蛋白亚型结合的特异性使角膜上皮细胞能够从异质分化的细胞中纯化。 2.3.基于代谢活性的选择性细胞去除 基于心肌细胞和非心肌细胞在葡萄糖和乳酸代谢上的显著生化差异，可以从hPSC分化培养中获得高纯度（高达99%）的心肌细胞。未分化的hPSCs和主要依赖糖酵解的非心脏细胞在葡萄糖耗尽和乳酸丰富的条件下无法生存，而心肌细胞可以通过使用乳酸作为替代能源而存活。因此，在补充乳酸的葡萄糖耗尽培养基中，心肌细胞更倾向于存活并因此被富集。同样，使用葡萄糖耗尽并补充脂肪酸和3,3′,5-三碘-L-甲状腺素（即促进脂肪酸氧化和线粒体生物发生的分子）的培养基，已报道了心肌细胞的选择和成熟。视网膜上皮细胞（RPE）被发现表达高水平的脂蛋白受体内化AcLDL（乙酰化低密度脂蛋白）。基于这一原理，使用Dil偶联的AcLDL对分化的RPE群体进行特异性标记和富集。另一个例子是靛青绿（ICG）被肝细胞特异性内化。通过修改ICG的荧光发射特性，设计了一种肝细胞纯化剂（HPA，λem = 562 nm），用于标记和体外分选来自hPSCs的纯化肝细胞。 2.4.负选择 与正细胞选择相反，其他方法已经开发出来，通过特异性诱导不需要的细胞类型的凋亡来去除它们，从而提高所需表型的回收率。例如，将PSCs转染与合成微小RNA（miRNA）开关（即在没有目标miRNA的情况下减少相关蛋白的翻译水平），miR-Bim（Bcl-2相互作用的细胞死亡介质）开关，诱导未分化细胞的选择性凋亡，同时保持分化的心肌细胞。或者，凝集素rBC2LCN-PE23被发现能够特异性结合并内化到未分化的干细胞，并诱导它们的凋亡。这种化合物被发现可以有效地降低畸胎瘤形成的风险。 2.5.通过FACS分离 FACS设备可以检测用荧光素偶联抗体标记的细胞的荧光信号。基于标记特征和目标标记（通常是表面抗原），FACS允许将单个细胞根据多个表面标记进行高选择性地排序和分离成不同群体（例如SSEA（阶段特异性胚胎抗原）-4阳性或SSEA-4阴性）。FACS的一个优点是它允许基于多个表面标记进行连续和多参数分离，尽管细胞活性可能会受到排序程序的影响。然而，FACS的通量有限，每秒可排序5×103到7×104个细胞。因此，FACS更适合研究用途的小规模细胞分离。 2.6.通过MACS分离 MACS是一种类似于FACS的技术，但使用带有针对特定细胞表面抗原的抗体的磁性颗粒。在磁场中，磁性标记的细胞将在柱中保留，未标记的细胞将流出。例如，通过针对心肌细胞相关表面标记VCAM1（血管细胞粘附分子1）的MACS，从hPSC分化培养中富集心肌细胞至95%。然而，尽管MACS是一种吸引人的方法，可以从细胞混合物中选择性地去除不需要的细胞，但它也有其局限性。例如，一项建模研究表明，为了从分化和未分化细胞的池中清除SSEA-1阳性的未分化干细胞，需要不切实际数量的重复MACS。然而，磁性珠的亲和力也可以通过新型表面修饰来提高，以提高排序效率。MACS的一个优点是，由于成本较低和商业化的自动化、封闭系统的可用性，它比FACS更适合大规模处理。MACS珠的替代品，SpheriTECH，通过简单的亲和结合在大珠上排序细胞，无需纯化标签，就能纯化来自hiPSCs的光感受器前体细胞。 2.7.使用微流控技术分离 微流控技术最近被证明是hPSC培养、表征和筛选的高效工具。微流控技术也可用于异质分化细胞群体的分离。例如，已制造微流控滚动柱用于选择性分离SSEA-1阳性细胞。滚动柱芯片的边界涂有抗体，降低了SSEA-1阳性细胞的滚动速度，而承诺的细胞则流出通道。因此，SSEA-1阳性细胞在通道内停留的时间更长，从而可以从分化细胞中分离出来。通过在微流控芯片底部覆盖有抗Tra（肿瘤相关抗原）-1-60抗体的脊状图案，也进行了类似的操作，从hiPSCs衍生的心肌细胞中消除未分化细胞。 3.表面标记识别用于分离hPSC衍生细胞 由于FACS和MACS依赖于表面标记的检测，因此识别不同谱系在hPSC分化过程中不同阶段的特异性表面标记非常重要。我们讨论了关于未分化细胞和三个胚层衍生物（包括神经细胞、心肌细胞和胰腺前体）表面标记的研究示例（表1）。 3.1.未分化细胞的表面标记 表面标记如Tra-1-60、Tra-1-81和SSEA-4已被用于识别和去除未分化的hPSCs（小鼠胚胎干细胞，mESCs使用SSEA-1）。例如，FACS和MACS可以从其他细胞中分离出SSEA-4和Tra-1-81标记的hESCs（人类胚胎干细胞），针对SSEA-5、CD（分化群）9和CD90的FACS，这些是多能干细胞的标记，可以从未完全分化的hESC培养物中去除具有畸胎瘤形成潜力的细胞。波达卡林样蛋白-1也在未分化细胞中高度表达，识别波达卡林样蛋白-1的细胞毒性抗体已被用于选择性杀死未分化的hESCs。此外，表面蛋白的特定糖基化可以区分多能细胞和非多能细胞；因此，具有独特结合能力的凝集素已被用于去除hPSCs。 需要注意的是，畸胎瘤也可能起源于仍具有干细胞特征且未完全分化的前体细胞；因此，这些前体细胞也需要从干细胞衍生产品中去除。无论如何，对于安全的细胞治疗来说，确定去除标准和检测未分化干细胞或前体的检测方法的灵敏度至关重要。 3.2.神经分化的表面标记 当前的hPSCs神经分化方法在发育阶段和谱系规范方面导致细胞异质性。CD133、A2B5、CD29、CD146、NCAM（神经细胞黏附分子）（或CD56）和CD271被报道为神经前体细胞（NPCs）的表面标记，CD24和NCAM是神经元的表面标记。通过FACS靶向CD24或NCAM可以分离分化的神经元。NPCs、神经元和胶质细胞的分离也可以通过标记组合实现（例如CD184+/CD271−/CD44−/CD24+用于NPCs；CD271−/CD133+用于神经元），不同的组合可以用来描绘NPCs：CD184+/CD326−、CD133+/CD45−/CD34−，CD133、CD15和GCTM-2的表达，以及CD24、CD15和CD29的表达。最近，使用CORIN（一种地板板标记）来分离人类iPSC衍生的多巴胺能前体。使用LMX1AEGFP（LIM同源框转录因子1-A）报告细胞系，已鉴定出可以从hESCs衍生的多巴胺能神经元中选择性富集的新膜标记，如多唾液酸化的胚胎形式的神经细胞黏附分子（PSA-NCAM）和接触蛋白2（CNTN2）。其他研究已经鉴定出新的表面标记，用于正向富集中脑多巴胺能神经元，如LRTM1（富含亮氨酸重复和跨膜域1）、CORIN和CD166，或在LMX1+ FOXA2（叉头框A2）+细胞分选后去除不需要的细胞（CXCR4，C-X-C基序趋化因子受体4）的标记。 报道的少突胶质细胞前体的表面标记包括NG2（神经/胶质抗原2）、PDGFRα（血小板衍生生长因子受体α）和DLX2（远端缺乏同源框2）或PDGFRα/CD140。然而，由于细胞表型的异质性很大，因此很难仅基于单一标记分离少突胶质细胞。 3.3.心肌细胞分化的表面标记 已经鉴定了心脏前体细胞和成熟心肌细胞的标记。KDR（激酶插入域受体）low/C-KITneg心脏前体细胞表达高水平的心脏转录因子，并且在进一步分化后可以产生>50%的心肌细胞。同样，KDR+/PDGFRα+心脏前体细胞可以分化成>80%的心肌细胞。此外，也已经鉴定出心肌细胞特异性表面标记，包括信号调节蛋白α（SIRPA）、VCAM1和活化的白细胞细胞粘附分子（ALCAM）。从起始培养物中基于SIRPA的选择，这些培养物约有40-50%的心肌肌钙蛋白T阳性（cTnT+），90-98%的细胞对cTnT+呈阳性。通过MACS基于VCAM1的选择可以富集cTnT+细胞高达95%。与这些正向选择方法相比，对于心肌细胞分化效率高（80-90%）的培养物，可能考虑去除不需要的细胞群体。同样，可以使用VCAM1偶联的磁性Dyna珠子或整合素（α1、α5和α6）和N-钙粘蛋白纯化心肌细胞至90%以上纯度。 3.4.内胚层、肝脏、肾脏和胰腺细胞分化的表面标记 hPSC衍生的胰腺细胞是异质性的。CD142被鉴定为胰腺内胚层（PE）细胞的标记，这些细胞能够产生具有葡萄糖反应性的胰岛素分泌细胞，而CD200和CD318是内分泌细胞的标记。因此，靶向如CD142这样的标记可以富集PE细胞，这也被证明可以降低畸胎瘤形成的概率（从46%降低到0%）。GLUT2（葡萄糖转运蛋白2），与PDX-1（胰腺和十二指肠同源盒1）共表达，以及与PDX-1+细胞相关的CD24，也已被评估用于富集来自hPSCs的胰腺前体细胞。此外，在一项针对SOX17以分离hESC衍生内胚层细胞的研究中，已鉴定出表面标记CXCR4、CD49e、CD141和CD238。尽管CD133被报道为小鼠胰腺前体的标记，但它在人类中的表达可能比胰腺PDX-1阳性细胞更广泛。更成熟的内胚层细胞，如源自PSCs的肝细胞，也可以通过特定的膜标记（例如SLC10A1（溶质载体家族10成员1）、CLRN3（Clarin 3）或AADAC（芳基乙酰胺脱乙酰酶）），或ASGR1（即Asialoglycoprotein受体1）进行分离。通过一组膜标记，如CD9−/CD140a+/CD140b+/CD271+细胞，还可以分离出OSR（Odd-Skipped Related Transcription Factor）1+/SIX2（SIX同源框2）+肾脏前体细胞。类似地，通过选择性耗尽CD200+细胞可以选择性地分离角膜上皮细胞。 然而，仍然存在问题，即通过不同标记集识别的细胞群体是否是不同阶段的相同细胞，还是沿着相似发育轨迹的不同细胞。对于生产目的，需要对分离的群体进行全面表征，并证明其对目标应用具有一致的属性。 3.5.用于分离hPSC衍生细胞的非表面标记 除了表达在细胞膜上之外，特定于特定细胞的标记也可以用于分离这些细胞。例如，可以通过分子信标（MBs）检测活细胞中的mRNA，它们是带有荧光团的茎-环（发夹）寡核苷酸探针，另一端带有猝灭剂。针对Oct-4（八聚体结合转录因子4）或Sox2（性别决定区Y盒2）的MBs可以从分化细胞中分离未分化的PSCs；针对心肌细胞标记肌球蛋白重链β（MYH7）的MBs可以富集来自小鼠和人类胚胎干细胞的心肌细胞；针对NPPA（心钠素A型）mRNA的MB，已知与早期工作型心肌细胞相关，可以从心肌细胞分化培养中富集工作型心肌细胞。对于使用MBs进行细胞分离，精心设计并广泛验证针对所需基因的MB探针至关重要。 3.6.敲入报告细胞系 基因组编辑技术（例如CRISPR/Cas9（簇状规律间隔短回文重复/CRISPR相关蛋白9）、TALEN（转录激活因子样效应核酸酶）等）的应用使得构建新型细胞系成为可能，这些细胞系在特定标记表达时发出荧光或通过诱导抗生素抗性而具有特定表型，从而实现纯化。例如，CRISPR/Cas9编辑hiPSCs已实现双报告TBX5（T-Box转录因子5）Clover2和NKX2-5（NK2同源框5）TagRFP细胞的生成，用于纯化心脏细胞亚型，如来自第一心脏领域、心外膜、第二心脏领域和内皮细胞系的细胞。或者，NKX2-5eGFP/w和MLC（肌球蛋白调节轻链）2vmCherry/w报告细胞已被生成以分离心室样细胞。基因组编辑（TALEN）也被用来在肌球蛋白轻链2（MYL2）位点引入选择标记（新霉素）或GFP，用于识别和选择心室心肌细胞。同样，引入在心脏特异性α-肌球蛋白重链（即α-MHC，MYH6）启动子控制下的Zeocin抗性基因已被用于在心肌梗死小鼠模型中纯化iPSC衍生的心肌细胞（iPSC-CMs）。 类似的策略也被用于识别和选择肌源性衍生物。例如，CRISPR/Cas9介导的同源重组方法已被用于选择MYF5（肌源因子5）GFP肌肉前体。构建双报告PAX7（配对盒7）tdTomato和MYF5EGFP使得能够纯化肌肉干细胞（卫星细胞），而诱导PAX7表达系统促进了均匀的骨骼肌源性前体细胞群体的生成。报告细胞也已生成用于纯化神经衍生物。例如，引入驱动mCherry表达的人类囊泡GABA（γ-氨基丁酸）转运蛋白（hVGAT）启动子已实现GABA能神经元的分离，而中脑多巴胺能神经元可以使用酪氨酸羟化酶（TH）RFP构建进行选择。然而，鉴于hPSC衍生物的治疗应用，这些方法可能因基因组修改而增加肿瘤形成的风险。 4.hPSC衍生细胞下游生物加工的工作流程 hPSC衍生细胞生产的下游生物加工涉及多个步骤，这些步骤将累积减少每个步骤的产量（图1B显示了使用MACS耗竭的示例）。主要步骤包括：(1) 细胞收获：将细胞从大量培养容器的粘附表面分离；(2) 离心或浓缩和培养基交换：去除收获酶并洗涤细胞；(3) 保持：收集的细胞在缓冲液中保持，等待所有细胞被收获和离心；(4) 耗竭：去除不需要的杂质细胞；(5) 离心：去除耗竭缓冲液，并在冷冻保护缓冲液中重悬；(6) 细胞配方用于冷冻保存：将细胞转移到冷冻管中并准备冷冻保存。由于这些众多步骤，如果每个步骤的产量为90%（理想情况），最终产量将是50-60%，如果每个步骤的产量为80%（良好情况），最终产量将是30-35%。因此，由于下游加工，可能会损失超过一半的细胞，这通常发生在细胞扩增和分化数月后的一个工作日。 因此，了解每个步骤的操作参数绝对是必要的，以最小化细胞损失的同时保持功能活性细胞。 4.1.细胞收获 从大量容器中收获细胞的关键组成部分是收获酶和洗涤体积。酶的高浓度或不适当的解离溶液或持续时间可能会降低细胞活性和/或无法去除表面上的所有细胞。对于分化培养，胰蛋白酶一直是常用的酶，但其浓度和孵化时间需要针对特定细胞类型进行优化。使用作为高渗溶液配制的柠檬酸钠的新非酶传代方法已被用于分离hPSCs的多细胞聚集体。对于生物加工，希望减少收获体积，这需要在低体积和由于洗涤不足导致的细胞损失之间取得平衡。通过将温度从37°C改变到4°C，使用热响应水凝胶释放hPSCs的新进展已经实现。 4.2.离心 离心过程中的参数包括速度、时间、细胞悬浮液体积和细胞浓度。已经观察到不同细胞收集的沉降变化，这触发了多次离心。收获酶、淬灭缓冲液和等待时间都可能有助于沉降性能。对于大量容器，需要开发大规模离心过程（例如使用袋子）以减少离心步骤的时间。 4.3.保持缓冲液和保持温度 当容器数量高（>100 T- flasks）且处理时间长（长达6-8小时）时，保持过程变得重要。为了将所有细胞一起用于后续处理，首先收获的细胞必须在缓冲液中等待，直到收获步骤完成。因此，需要评估保持缓冲液和保持温度（37°C、25°C或4°C）以维持细胞活性。在制定保持缓冲液时，应考虑细胞聚集。尽管收获的细胞处于单细胞悬浮状态，但细胞可能在保持期间自组装成聚集体。聚集的程度取决于细胞类型、细胞浓度和保持时间。聚集体的形成将影响后续步骤中细胞标记和分离的效率，显著降低细胞产量。 4.4.耗竭缓冲液配方和体积 当细胞群体中有高比例的所需细胞时，耗竭被用来去除少量的杂质细胞。这个过程可以通过MACS针对不需要的细胞表面上的标记来完成。耗竭缓冲液的要求与保持缓冲液相似：维持细胞活性和防止细胞聚集。聚集的细胞不允许与抗体偶联珠均匀标记和容易的细胞-珠分离（图1C）。因此，需要仔细制定耗竭缓冲液。耗竭的细胞浓度和体积影响耗竭规模。首选高细胞浓度（>107细胞/mL）和低体积（<100 mL），同时需要最小化细胞损失。由于可以使用多个标记进行耗竭，因此可能需要重复此步骤以去除不同的细胞群体。 4.5.冷冻保存配方 冷冻保存缓冲液和体积是该步骤的重要参数。一般来说，冷冻保存缓冲液取决于感兴趣的分化细胞类型，冷冻保存的细胞浓度取决于预期的应用。对于移植研究，可能需要高浓度的细胞（每管107-108个细胞），以最小化解冻过程的时间和达到所需细胞剂量的管数。 5.hPSC衍生产品下游加工的挑战 5.1.hPSC衍生神经前体细胞下游加工的挑战 使用MACS已经实现了从PSCs衍生的神经元的大规模纯化，产量高达105-106个神经元（纯度超过90%）。然而，这些特定谱系的下游加工仍然存在特定挑战。在神经前体细胞的情况下，收获的细胞密度相对较低（约每平方厘米1×106个细胞），这可能需要从大量容器中收获细胞。如果能够达到更高的收获密度，那么为了获得所需数量的细胞（每次生产约109个细胞，下游加工体积为50-100 mL），所需的容器数量将显著减少。通过增加播种密度和/或增强细胞增殖来增加收获密度。然而，根据培养系统和细胞表型对密度变化的敏感性，播种密度可能会影响自分泌和旁分泌因子的分泌，这些因子已被证明影响hPSC的自我更新和分化。为了增强细胞增殖，可以考虑改变生长培养基（含有生长因子）和通常涂有层粘连蛋白、Matrigel和纤维连接蛋白等基质蛋白的基质。然而，对培养基和基质所做的任何改变都需要仔细比较。 5.2.hPSC衍生心肌细胞下游加工的挑战 对于心肌细胞来说，下游生物加工的负担比神经前体细胞更为严重。治疗应用所需的细胞数量对心肌细胞来说更高（每次生产约1010个细胞），比神经前体细胞（每次生产约109个）多。在心肌细胞的下游生物加工的所有步骤中，可能需要比神经前体细胞多10倍的浓缩细胞制备或多10倍的悬浮液体积。使用代谢选择方法已经实现了从人类PSCs衍生的心肌细胞的大规模纯化，纯度达到99%，产量高达2×109个功能细胞。心肌细胞也比神经前体细胞更容易形成聚集体，因此耗竭步骤的产量可能会降低。为了有效地用磁性珠标记细胞并分离不同的群体，心肌细胞需要在下游生物加工过程中保持为单细胞悬浮液。因此，需要制定保持缓冲液和耗竭缓冲液（例如抗聚集剂、生物聚合物）以防止细胞聚集（图1C）。鉴于治疗用途所需的数量，hPSC衍生心肌细胞的下游加工规模可能很大。因此，将需要扩大下游生物加工过程中不同步骤的规模（例如大规模离心）。或者，为收获hPSC衍生心肌细胞设计的自动化过程将是有益的。 6.结论和展望 在实现了hPSCs的高效分化后，下游生物加工已成为生产hPSC衍生细胞治疗产品的瓶颈。识别所需谱系的特定标记和去除未分化细胞的策略对于生产安全的细胞治疗至关重要。理想情况下，高细胞纯度，去除不需要的细胞类型将减少下游生物加工的负担。需要开发严格的质量控制系统和高灵敏度的检测方法，以确保细胞分离后产品的一致性。能够预测体内效应的体外检测是可取的，以减少临床前研究的数量。应用质量由设计（QbD）策略来理解过程和产品，更好地控制过程，以生产一致和安全细胞产品应该可能实现hPSCs的潜力。 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 时间：2024年10月16-17日 地点：上海张江（酒店定向通知） 规模：600-800人 主办单位：生物制品圈、抗体圈 演讲支持：Entegris、瑞孚迪、AS ONE CORPORATION 会议费用：免费FREE!（仅收取100元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），先到先得，报完即止！ 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！ 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 日程安排 更多嘉宾正在邀请中 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。