IFNβ

摘要：登革热病毒（DENV）通过感染的伊蚊传播给人类，引起的疾病从轻微的登革热到致命的登革休克综合征不等。不同DENV血清型或不同黄病毒之间相似保守的结构和序列导致了交叉反应的发生，随后是抗体依赖性增强（ADE）。迄今为止，能够提供针对不同DENV血清型感染的有效保护的疫苗仍然是最大的挑战。因此，深入研究对于开发有效和有效的治疗药物至关重要。此外，黄病毒的交叉反应性导致临床环境中的误诊，可能会导致适当干预管理的延迟。因此，迫切需要具有高特异性和敏感性的准确诊断，以便及时诊断并为DENV感染的个体提供早期治疗。在这篇综述中，将讨论DENV感染治疗平台中中和抗体、抗病毒药物和疫苗候选物的最新发展。此外，还将介绍抗原隐蔽表位的发现、分子模拟原理以及单链或单域抗体在DENV应用方面的进展。 1.引言 登革热病毒感染是热带和亚热带地区最常见的蚊媒传播疾病之一，全球每年约有1亿至4亿感染病例。目前，DENV感染在非洲、东地中海、美洲、东南亚和西太平洋等国家流行。全球登革热流行的分布表明，登革热感染的爆发正在全球范围内发生（图1）。根据最近的WHO报告，2020年感染病例的增加使得DENV成为COVID-19之后最严重的病毒性疾病。在这些国家中，菲律宾、越南、印度、哥伦比亚和巴西报告了最多的DENV感染病例。导致蚊子传播疾病在全球传播的主要因素之一是快速的城市化和不适当的基础设施规划，这可能导致无效的病媒控制管理。此外，商务团队或个人旅行也促进了这些蚊子传播疾病在他们从一个地方到另一个地方旅行时传播到新环境中。2013年，在马来西亚沙捞越发现了一种新发现的DENV血清型。最初，这起DENV病例被认为是DENV4的森林登革热感染，涉及蚊子Aedes nivalis和非人类灵长类动物之间的传播。经过一系列遗传验证过程，它被确定为新的DENV5血清型，主要发生在东南亚的森林中。尽管DENV5的实际传播途径仍不清楚，但可能导致其出现的因素可能是由于森林株到人类株的遗传变化、DENV的高变异频率和大规模的森林砍伐。这种新的DENV5血清型与另外4种现有血清型在系统发育上有明显的不同，表明DENV的新出现正在进行中，预示着可能会有更多的病毒出现，这可能是由于气候和生态系统的变化导致的动物源性传播。到目前为止，针对DENV感染的特定治疗药物或疫苗仍然不可用。原因之一是DENV和其他黄病毒之间通常发生的交叉反应，因为黄病毒在包膜蛋白（E）上呈现的相似保守结构。如前所述，DENV E蛋白与ZIKV E蛋白的同源性高达50%，因此，在第二次感染任何黄病毒科成员时，由于免疫系统产生的交叉反应性抗体的特异性和数量，会发生交叉反应随后是ADE。此外，不同黄病毒如寨卡病毒（ZIKV）和基孔肯雅病毒（CHIKV）或不同DENV血清型的共感染总是呈现类似的起始症状，因此可能导致临床诊断管理的复杂化。为了解决这个问题，准确且快速的诊断工具对于早期药物治疗至关重要。在这篇综述中，将重点讨论DENV感染问题，如由于不同血清型DENV感染和不同黄病毒感染导致的交叉反应、ADE、免疫逃避和商业诊断试剂盒的限制。此外，将回顾和介绍不同的诊断和治疗方法的最新进展，以建议可能解决交叉反应问题的方法。事实上，潜在的治疗剂和诊断标记的发现永远不会结束，直到产生特定的、敏感的诊断标记和疫苗或治疗剂，它们在治疗DENV感染方面既敏感又有效。 图1. 2020年和2021年全球登革热疫情。受影响的国家包括孟加拉国、菲律宾、越南、印度、马尔代夫、印度尼西亚、新加坡、哥伦比亚、巴拉圭、秘鲁、肯尼亚、斐济、库克群岛、留尼汪岛、斯里兰卡、泰国、苏丹、毛里塔尼亚、东帝汶、也门、尼泊尔、马约特岛、厄瓜多尔和巴西。 1.1.登革热病毒基因组和结构 DENV是来自黄病毒科的黄病毒属。通常，如登革热休克综合征（DSS）和登革热出血热（DHF）等严重症状可能由四种抗原性不同的DENV血清型（DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4）中的任何一种连续感染引起。DENV是一种小的二十面体包膜病毒，由11 kb的正单链RNA组成，其成熟的包膜结构称为病毒粒子，包含三种结构蛋白，包括衣壳（C）、包膜（E）和膜（M），以及七种非结构（NS）蛋白，如NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5（图2）。结构蛋白主要参与病毒组装。例如，C蛋白与RNA相互作用以组装核衣壳。成熟病毒粒子的形成需要M蛋白的帮助，M蛋白在识别不同黄病毒感染的不同类型免疫反应中很重要。它也是DENV的主要组成部分，作为表面蛋白，协助病毒附着和融合在宿主细胞膜上。除此之外，M蛋白可以通过寡聚化形成结构病毒粒子。另一方面，非结构蛋白和细胞蛋白对于病毒基因组的复制、翻译、封装和病毒蛋白的正确折叠至关重要，所有这些都发生在与粗面内质网相关的细胞质中。 图2. DENV基因组和NS1蛋白结构域图。病毒基因组经过翻译产生单一多聚蛋白。多聚蛋白处理后，通过蛋白水解裂解产生病毒蛋白。对于NS1，涉及DENV病理学的三个结构域包括β-卷、翼状结构域和β-梯。 1.2.登革热病毒的生命周期 人类通常通过感染的蚊子如埃及伊蚊或白纹伊蚊感染登革热病毒（DENV）。DENV在感染的第一天就会针对树突状细胞（DCs）和巨噬细胞。从其他综述中总结，DENV生命周期包括病毒进入和附着、病毒和内体膜融合、核衣壳释放、蛋白合成和处理、RNA复制、核衣壳形成、病毒组装、病毒成熟，最后是成熟DENV粒子的释放。对于宿主细胞附着，DENV E蛋白将与目标细胞的细胞因子如树突状细胞特异性细胞间粘附分子-3抓取非整合素（DC-SIGN）、甘露糖受体、硫酸肝素等相互作用。接下来，DENV通过网格蛋白介导的内吞作用进入目标细胞，内体隔室内的低pH值允许DENV与内体膜融合。在酸性内体环境的帮助下，RNA基因组从解包的核衣壳释放到细胞质中进行蛋白处理和复制。最初，RNA基因组作为mRNA并进行翻译以产生病毒蛋白。RNA基因组的复制发生在病毒诱导的细胞内膜上，称为复制复合体，由病毒RNA、病毒蛋白和宿主细胞因子组成。这个复合体在内质网（ER）膜上形成，也有助于保护复制产物免受宿主先天免疫系统的识别。核衣壳形成后，DENV粒子开始组装，当它进入ER腔时形成未成熟的DENV粒子。在跨高尔基体网络（TGN）的分泌途径中，DENV的成熟需要通过类胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的作用将前膜/膜（prM/M）切割成M蛋白，以释放成熟和传染性的DENV。为了避免过早的DENV膜在病毒粒子从感染细胞释放之前与宿主细胞融合，pr将继续与E二聚体结合，包裹疏水融合环。最后，成熟的DENV一旦释放到细胞外空间，pr最终会从病毒粒子表面脱离。 1.3.临床表现 登革热感染包括发热期、危重期和恢复期。发热期通常持续一周，症状包括高热、流感样症状、头痛、呕吐和关节痛。危重期也称为生命威胁期，会出现血浆渗漏和内出血等更严重的症状。在恢复期，随着血管通透性的恢复，症状会减轻。DENV感染可以引起一系列广泛的症状。在第4天至第10天的潜伏期内，疾病可能是无症状的或表现为称为登革热（DF）的轻微急性发热疾病，而危重期通常从第3天至第7天开始。登革出血热（DHF）伴随着异常的血管通透性，可能会导致突发性低血容量休克，称为登革休克综合征（DSS），这是感染严重登革热患者的危重阶段。DENV感染可能导致不同程度的严重性，这取决于血清型、遗传变异和病毒毒力。不同的登革热血清型可能因其结构差异和病毒复制率而对病理产生不同的影响。此外，核苷酸的变化，如氨基酸突变或替换，会影响病毒毒力，因为核苷酸的变化最终会导致不同的病毒-宿主相互作用和传播能力。 2.关于DENV未解决问题的综述  在这一部分，简要回顾了涉及先天和适应性免疫反应的免疫反应。我们还回顾了一些未解决的问题，如DENV的免疫逃避、DENV血清型内的交叉反应、不同黄病毒间的交叉反应、不同的抗体依赖性增强（ADE）机制及其影响。第4.2节将讨论当前诊断试剂盒的限制。 2.1.对DENV感染的免疫反应 树突状细胞（DCs）是病毒颗粒入侵期间先天和适应性免疫反应之间的连接。它负责上调促炎细胞因子和共刺激分子的表达，这有助于激活人体免疫反应。因此，当NS1通过调节相关基因表达干扰其成熟和迁移时，DCs将无法刺激Th1细胞分泌IFN-γ。为了确保灭活流感病毒NS1，抗病毒药物必须能够恢复宿主的抗病毒反应，如与IFN产生相关的先天免疫，并限制病毒复制。DCs将目标抗原扩展到T细胞，如CD8+和CD4+，作为引流淋巴结（LNs）中先天免疫反应的起点。激活的皮肤肥大细胞在激活招募细胞毒性细胞如CD8+ T细胞、自然杀伤（NK）细胞和自然杀伤T（NKT）细胞到感染部位中起着至关重要的作用，以刺激病毒终止，同时控制引流LNs中的感染。CD8+ T细胞可以直接通过靶向登革蛋白（如NS3）的各种变异，借助激活的CD4+ T细胞来终止感染细胞（Mathew等人，1996）。CD8+ T细胞通常关注非结构蛋白，而CD4+ T细胞更多地关注衣壳、包膜和NS1表位。CD4+ T细胞的作用包括帮助B细胞反应，协助从CD8 T细胞中提取记忆反应，并提供细胞毒性效应，以及Mapalagamage团队回顾的专门CD4+ T细胞的许多其他功能。补体系统的激活对于在先天免疫反应的早期阶段阻断病毒感染很重要。然而，DENV的免疫逃避可以通过NS1实现，当它与不同补体激活途径（如经典途径和凝集素途径）中的相应补体组分相互作用时。这将导致补体组分的功能改变，并抑制补体介导的反应。通过这些策略，DENV增加了其生存和病毒复制的机会。此外，NS1和NS4B之间的相互作用将通过与双链RNA共定位来调节RNA复制。 DENV的病毒复制在早期通常由干扰素（IFNs）的产生控制，这是第一道防线。一旦病毒进入人体皮肤，TLRs和C型凝集素受体（CLRs）作为模式识别受体（PRRs），由免疫哨兵产生，会识别DENV的存在。PRRs的激活通过产生IFNs和肿瘤坏死因子（TNF）激活人体的抗病毒先天反应。TLR-3和TLR-7的激活将导致产生IFN-α和IFN-β，这对于抑制DENV感染很重要。IFNs与IFN受体之间的结合反应将触发Janus激酶-信号转导和激活转录因子（JAK-STAT）途径，进一步增强效应蛋白的产生高达100单位。除了IFNs，包括视黄酸诱导基因1（RIG-I）和螺旋酶黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）在内的细胞内传感器也是负责病毒RNA识别的第一线防御，它们也有助于产生IFN-β。激活的RIG-I在检测到病毒RNA后会被转移到线粒体，与线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）相互作用。RIG-I和MAVS之间的相互作用将进一步导致MAVS聚集，充当免疫信号体，启动核因子κB（NF-κB）和转录因子IRF3，诱导转录因子转移到细胞核后产生I型IFN。 2.2.DENV逃避免疫系统 DENV逃避免疫系统通常发生在抑制免疫反应激活途径的情况下。例如，DENV设法通过抑制MAVS途径来绕过人类的第一道防线。一种策略是通过干扰NS3蛋白阻断RIG-I进入线粒体。除了NS3，NS4A也能通过结合MAVS的半胱天冬酶激活和招募域（CARDs）来抑制RIG-I和MAVS之间的结合。病毒逃避宿主病原体识别受体的另一种方式是通过干扰TLR-3抗病毒信号的激活。另一方面，DENV也能够通过几种机制抑制干扰RNA（RNAi）途径，这是产生先天抗病毒反应的重要途径。亚基因组黄病毒RNA（sfRNA）将从病毒RNA的3′-非翻译区产生，以防止Dicer酶切割双链RNA。通过表达NS4B调节宿主RNAi/microRNAs途径，RNAi途径将受到干扰，从而促进DENV的复制。NS5可以通过阻断转录复合体PAF1C的招募来影响IFN的产生，以阻止IFN刺激基因（ISGs）的产生。此外，DENV还可以通过几种机制影响IFN机制的功能。例如，非结构蛋白NS2B/3能够通过中断IFNα/β诱导途径来下调抗病毒反应，而其他非结构蛋白如NS2A、NS4A和NS4B可以通过部分阻断STAT信号途径来影响细胞间的IFN信号传导。 2.3.不同DENV血清型间的交叉反应和不同黄病毒间的交叉反应 所有DENV血清型的NS1蛋白共享相似的序列高达70%，并且其序列与其他黄病毒也有40-50%的相似性。因此，不同血清型DENV之间以及DENV与其他黄病毒之间总会发生交叉反应。根据在巴西发生的DENV-1和DENV-2的共感染以及在索马里、台湾和中国检测到的DENV-2和DENV-3的共感染，Araújo, F. M.和他的团队表明埃及伊蚊可能被不同病毒的组合感染，或者它们可能有能力同时传播多种病毒。正如Wenming等人（2005）所假设的，如果一个地方存在多种血清型，那么通过感染蚊子传播DENV-2和DENV-3的共感染可能会发生。此外，也有报道DENV和寨卡病毒（ZIKV）以及DENV和基孔肯雅病毒（CHIKV）之间的共感染。 与DENV类似，寨卡病毒（ZIKV）也是一种正单链RNA病毒，源自黄病毒科。寨卡病毒感染通常显示非特异性的临床症状，如结膜炎、轻度发热、头痛和皮疹，这很容易与其他黄病毒感染如登革热和基孔肯雅病混淆。此外，ZIKV感染还可能影响孕妇，导致胎儿畸形和婴儿出生缺陷，如小头畸形。一个最初被检测为登革热病毒感染的旅行相关病例，由于NS1抗原测试的假阳性结果，后来被怀疑为急性寨卡病毒感染。当ZIKV对先前感染过另一种黄病毒感染（如DENV）的患者造成二次感染时，这个人可能体内有DENV背景免疫，并在DENV检测中呈阳性结果，导致IgM测试的交叉反应。然而，如果ZIKV是初次感染，IgM测试中的交叉反应会很低。正如George等人所报告的，先前感染过ZIKV的患者会有更高水平的DENV-2原发病毒血症，随后与严重DENV感染相关的变化。这是因为ZIKV感染触发的高浓度DENV交叉反应性抗体对DENV-2的中和效果很低，导致DENV-2交叉反应性抗体反应的非中和浓度。这些反应还增加了从DENV-1、3或4获得异型血清型感染的机会，这意味着对ZIKV的预先存在的免疫反应可能会诱导所有DENV血清型的ADE。 2.4.ADE的机制和影响 ADE的第一种机制被称为内在ADE，其中DENV免疫复合物的内化将通过抑制细胞内抗病毒反应增加感染细胞的“爆发大小”。DENV可以通过与亚中和抗体形成DENV-抗体复合物并通过抗体介导的吞噬作用进入宿主细胞。当2个巨噬细胞Fcγ受体配对并诱导白介素-10（IL-10）产生时，它将导致偏向T辅助细胞-2（Th2）反应，由于RIG-I/MDA5和JAK-STAT途径的抑制，导致释放的1型干扰素、白介素12、干扰素γ和TNF变得下调。简而言之，内在ADE通过改变先天免疫系统和细胞内机制来增强病毒复制。 另一种ADE机制是外在ADE。两种常见的ADE机制是Fc受体（FcR）依赖性ADE和C1q依赖性ADE（图3）。FcR依赖性ADE是广泛病毒感染（如HIV、流感A、登革热和埃博拉）的最常见机制。具有FcR的细胞，如单核细胞、B细胞、中性粒细胞和巨噬细胞，很容易被病毒-抗体复合物附着，因为抗体的Fc区域将与细胞表面的FcR结合，导致病毒附着到细胞表面的增加。一旦DENV-免疫复合物抑制负责产生白介素-12（IL-12）、干扰素γ（IFN-γ）、TNF-α和一氧化氮自由基（NO）的抗病毒免疫反应，IL-6和IL-10的表达将被激活，并刺激病毒颗粒的传播，导致感染细胞和病毒颗粒的增加，随后发生ADE。 图3. 抗体依赖性增强（ADE）的不同机制。病毒进入可以通过不同的途径，在(A) Fc受体或(B) C1q受体的帮助下被吞噬进入细胞膜，并进一步引起ADE。 C1q依赖性ADE机制是补体经典途径的启动，这在埃博拉病毒（EBOV）感染中很常见。在这种机制中，ADE是通过补体蛋白C1q和C1q受体（C1qR）来促进的，它在大多数哺乳动物细胞中被区分出来，尽管FcRs在免疫系统中完全表达，包括B细胞、中性粒细胞和单核细胞或巨噬细胞。 当病毒与非中和抗体或亚中和水平的抗体结合时，这将有助于病毒进入并进一步增强病毒感染，这可能是二次感染。这种情况指的是抗体依赖性增强（ADE）。最初，预先存在的抗体可以通过阻止DENV与细胞表面的天然受体之间的结合来中和同源DENV感染，但它将允许异型登革病毒进入并穿过初次感染途径，导致由于高病毒负荷而发生ADE。 通过多年感染后刺激免疫记忆产生的交叉反应性抗体可以中和多种DENV血清型。这些抗体通常具有较差的中和活性，并倾向于附着在可用性低的免疫显性表位上，导致ADE和交叉反应的更高比率。正如Mongkolsapaya等人所报告的，异型记忆和交叉反应性CD4+T细胞的存在将在二次感染的免疫回忆反应期间加剧感染。 在异型血清型二次感染期间由抗体反应诱导的非中和抗体可能导致内在ADE，这可能导致更严重的登革热感染。这种类型的ADE与外在ADE相比，可以在感染的早期阶段大大增强病毒复制。这是因为它能够逃避先天免疫反应，并通过抗体介导的内化自由迁移，不容易被内源性干扰素途径检测到。 3.针对DENV感染的治疗剂  3.1.中和抗体及其机制  中和抗体在抑制DENV包膜（E）蛋白的功能位点与宿主细胞相互作用中发挥重要作用。高度中和的抗体通常结合在E蛋白上容易接近且暴露在病毒粒子表面的表位上。然而，非中和抗体，包括亚中和水平的中和抗体，当它们结合到DENV粒子时，可能会导致ADE。 以西尼罗河病毒的中和机制为例，该机制被称为“多重打击”模型，与使用抗体“包被”病毒粒子模型的其他病毒的中和也类似。中和效果取决于中和抗体的浓度。对于潜在的中和抗体达到中和的最小化学计量学，大约需要30个抗体占据一个病毒粒子。可能影响中和抗体与病毒表位之间相互作用的因素包括病毒表位的可接近性、抗体浓度和结合亲和力。 被中和抗体包被的病毒粒子的传染性可以通过不同方式被阻断，其中之一是通过抗体的Fab臂交叉链接病毒粒子，以形成大的交叉链接病毒/抗体聚集体，这可以通过降低可以感染细胞的病毒粒子浓度来阻止病毒粒子的传播。除了交叉链接，抑制E蛋白构象变化和受体结合可以避免病毒粒子与内体膜之间的膜融合，从而允许病毒基因组释放到细胞质中。一些中和抗体可能具有双重活性，可以阻断膜融合，同时中断受体结合机制，从而阻断病毒通过内体进入。当预连接测定格式中中和抗体的中和滴度超过后连接中的中和滴度时，总体中和可能会发生，并允许对DENV粒子进行双重保护。 关于中和逃逸的问题，可以通过利用针对不同表位的潜在中和单克隆抗体（mAbs）混合物来解决，以阻断突变逃逸。Wang等人的研究表明，通过LALA突变工程化的重组四价对称抗体在小鼠模型中通过中和从每个亲本抗体单独发展出来的逃逸突变体，非常有效地抑制了ZIKV感染，逃逸突变体的生长被抑制。 3.2.针对DENV感染的潜在中和抗体 DENV的E蛋白始终是开发中和抗体的主要关注点。每个DENV E蛋白的外域由三个独特的域组成，如域I（EDI）、II（EDII）和III（EDIII），它们连接在一起作为二聚体存在。通常，中和表位位于EDI内的铰链区、EDII末端和EDIII侧面。在与E蛋白三种域匹配的中和小鼠单克隆抗体（mAbs）中，大多数强烈中和的mAbs识别EDIII的表位和A链。潜在的中和抗体通过与病毒粒子表面的E二聚体交叉链接，靶向成熟病毒粒子上的暴露四聚体结合位点，从而抑制构象变化，阻止融合膜的形成。 1A1D-2是一种中和抗体，可以通过阻断EDIII位置来防止E蛋白的构象变化和膜融合的形成。Gandham和他的团队开发了硫代适体（DENTA-1），利用中和抗体1A1D-2的中和机制针对EDIII，因为其出色的结合特性。由于过滤结合测定表明硫代适体能够紧密地结合在DENV-2 EDIII上，DENTA-1有很大可能表现出与1A1D-2相同的中和效果。对于静态下的成熟病毒粒子，中和抗体与EDIII的结合区域位于非表面暴露的β−1链，这表明未暴露区域可以很容易地与溶剂接触，并通过靶向结合区域来增强抗体的中和活性。Deng等人的另一项研究也证明，特异性结合EDIII的抗体2B8能够抑制DENV血清型2在BHK细胞上的附着。 Dejnirattisai及其团队报道了发现广泛中和抗体的潜力，这种抗体有可能中和所有DENV血清型。他们发现，针对包膜二聚体表位（EDE）的mAbs能够与针对融合环表位（FLE）的抗体相比，更有效地中和感染人类细胞和昆虫细胞的DENV。原因之一可能是由于抗EDE抗体的能力，它们可以在不同的成熟阶段识别具有不同prM浓度的DENV，与依赖于prM存在进行融合环结合的抗FLE抗体不同。 除此之外，工程化抗体如双特异性抗体的发现也是开发针对DENV的治疗性抗体的一种流行方法。将两个具有特定功能的mAbs结合起来产生双特异性抗体（DVD-1A1D-2A10），已被发现保留并表现出亲本活性。这种双特异性抗体能够在DENV早期感染期间阻断病毒附着和融合过程，因为它由能够与EDIII相互作用以抑制DENV在宿主细胞上的附着的1A1D亲本抗体组成，以及另一个能够与EDII域结合以干扰病毒粒子和内体膜之间融合过程的2A10亲本抗体。具有双重阻断功能的优势，病毒附着和融合的阻断可能同时发生，或者可以抑制其中任一过程，作者预测，这可能更有效地抑制DENV感染。DENV E蛋白在病毒附着和融合过程中分别具有转变为二聚体和三聚体结构的能力，然而双特异性抗体由于其亲本活性的优势，能够同时结合EDII和EDIII域，从而避免E蛋白结构的变化。此外，这种双特异性抗体在1.33 µM的浓度下还显示出完全的中和活性，与其各自的亲本抗体相比，在相同浓度下仅显示出70%的中和效果。双特异性抗体的产生非常有希望被开发成针对DENV的治疗性抗体。 3.3.抗病毒肽 作为抗病毒剂之一，肽类抑制剂旨在通过影响病毒蛋白的功能来中断DENV生命周期。抗病毒肽可以通过几种途径抑制DENV感染，如（i）识别宿主细胞受体以阻止病毒进入，避免宿主细胞与病毒蛋白结合，（ii）靶向结构蛋白，通过阻止宿主细胞与病毒之间的结合来防止病毒进入，（iii）靶向非结构蛋白，主要处理抑制病毒复制。然而，抗病毒肽作为有效治疗药物使用存在一些缺点，如稳定性弱和生物利用度有限。解决这些问题的方法之一是应用化学修饰来改变肽的物理化学性质，另一种方法是通过突变分析改进抗病毒肽的性质。 一些抗病毒肽靶向登革热蛋白酶，如NS2B-NS3，它参与病毒多聚蛋白的切割，以在成熟时释放结构和非结构蛋白。Ltc 1在高温（40°C）下表现出更好的抑制能力，降低了感染细胞中的病毒载量。因此，Ltc 1可能通过抑制NS2B-NS3蛋白酶的活性来干扰DENV的生命周期。还有其他针对NS2B-NS3蛋白酶的抑制剂，有潜力被开发为抗病毒剂。 Hrobowski及其团队建议，可以使用模拟II类融合蛋白高度保守区域的肽来阻断病毒进入和融合。他们鉴定了一种肽抑制剂DN59，模拟DENV E蛋白的茎域，能够以低浓度抑制DENV-2感染。它在20 µM时显示出最高的抑制活性100 ± 0.5%，其IC50记录在大约10 µM。它还对DENV-2感染显示出极好的特异性，以低浓度超过99%的抑制活性抑制斑块形成。除了对DENV-2具有抑制活性外，这种肽抑制剂还对西尼罗河病毒（WNV）显示出抑制效果，由于它们具有相似的保守区域，因此它可能作为黄病毒的广谱肽抑制剂。进一步的研究表明，这种肽抑制剂对所有DENV血清型都有抑制效果，IC50在2到5 µM之间。有趣的是，他们还发现DN59能够破坏病毒膜并释放病毒基因组。基因组在用DN59处理后完全从E蛋白中分离出来，因为它在病毒膜上形成孔洞，由于其与脂质体囊泡的强烈相互作用并破坏脂质双层，导致病毒失去感染性。 此外，MLH40肽的模拟能力使其能够通过模拟M蛋白外域的螺旋疏水茎区和保守的疏水环来中断DENV M-E相互作用，当它结合到DENV时会引起同源二聚体E蛋白结构的改变，从而抑制所有类型的DENV的病毒感染。 DENV C蛋白与脂滴（LDs）之间的相互作用对于登革病毒颗粒的形成很重要。利用分子模拟的原理，肽可以通过模拟C蛋白无序的N端区域，包括NML + R基序（被认为是LD-C蛋白的相互作用位点）来抑制DENV颗粒的形成。还有另一种发现涉及DENV C蛋白的抗病毒机制。一种名为ST148的复合抑制剂显示出抑制DENV复制的潜力，它与两个衣壳二聚体“接吻”相互作用，形成一个抑制剂结合的衣壳四聚体，这可能在病毒感染新细胞之前或期间发生。含有这种复合抑制剂的病毒在感染新细胞时的核衣壳解包过程中会有故障效果。这将进一步导致C蛋白和RNA基因组的降解。因此，这种机制可能是未来抗病毒方法的有用见解。 另一方面，Kaptein和合作研究者鉴定了一种有前途且有效的泛血清型DENV抑制剂，称为JNJ-A07。它是一种靶向NS3和NS4B相互作用的抑制剂。NS3-NS4B复合物的形成是病毒复制的重要部分，因此该抑制剂通过在细胞质环上引起构象变化来阻断复合物的形成。他们的研究表明，抑制NS3和NS4B之间的相互作用显示出有前途的抗病毒机制和很好的抑制效果。这种抑制剂具有良好的药代动力学，并且对不同的21种基因型和血清型组合显示出有前途的抑制活性。 3.4.疫苗开发和针对DENV感染的潜在疫苗候选物 由于其四种抗原性不同的血清型可能引起的复杂感染，疫苗的开发一直是登革热治疗的巨大挑战。一种DENV血清型的初次感染将导致长期同型保护，但对其他血清型的短期异型保护，因此一个人在第二次异型感染期间可能会面临疾病加重。通过在二级淋巴组织中形成生发中心（GC），在滤泡辅助T细胞（Tfh）的帮助下，产生长期抗体分泌浆细胞对于开发有效的登革热疫苗很重要。 到目前为止，全球唯一授权的疫苗是Dengvaxia（CYD-TDV），它是一种活体嵌合、减毒和四价疫苗，由非结构黄热病17D株病毒骨架组成，结合了四种DENV血清型的结构前膜（prM）和包膜（E）基因。然而，Dengvaxia仅适用于9至16岁之间的感染人群。 其他疫苗候选物仍在通过不同阶段的临床试验，从第一阶段到第三阶段。正在进行第三阶段临床试验的疫苗候选物包括TV003/TV005（NCT01506570）和TDV/DENVax/TAK003（NCT02302066）。疫苗候选物TDEN-LAV（NCT01702857）仍在进行第二阶段临床试验，TDEN-PIV（NCT01666652）和D1ME100/TVDV（NCT00290147）目前处于第一阶段临床试验阶段，而V180（DEN-80E）（NCT01477580）已完成第一阶段临床试验。 Graham及其团队最近开发了一种新的活体减毒四价疫苗（DLAV），在接种疫苗后的8到14天内迅速产生DENV特异性多功能T细胞，并至少保留6个月。此外，DLAV还诱导效应记忆T细胞重新表达CD45RA（TEMRA），在接种疫苗后1年内保持其高频率。这表明这种疫苗诱导的免疫保护非常有希望。 在先前的研究中，Pinto团队展示了基于E蛋白的DNA疫苗（pE1D2）和基于NS1的DNA疫苗（pcTPANS1）都能在免疫小鼠模型中诱导免疫保护。在他们最近的研究中，他们更感兴趣的是找出两种DNA疫苗候选物组合所能诱导的保护性免疫。他们的研究表明，用pE1D2+pcTPANS1 DNA疫苗接种的小鼠由于结合的免疫反应而获得了出色的免疫保护。即使在DENV-2的致命挑战之后，pE1D2+pcTPANS1免疫的小鼠也没有发现病态，由于免疫反应的加强，它们也没有表现出感染的临床迹象。 所有上述讨论的潜在治疗剂总结在表1. 4.DENV诊断 在登革热诊断中，提供高特异性定量评估的传感器对于更好的监测和早期检测很重要。用于DENV诊断的常见检测方法之一包括酶联免疫吸附测定（ELISA）。这种测定有一些限制，如昂贵的测试套件和需要几个小时才能检测到目标兴趣。除此之外，在急性阶段使用病毒分离来诊断DENV感染既耗时又需要非常熟练地处理细胞培养或动物模型。对于逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法，它能够在发热阶段检测早期DENV感染，但也耗时且程序复杂。免疫层析测定法也常用于DENV检测，特别是应用了金纳米颗粒偶联抗体作为捕获蛋白的测定法。金纳米颗粒（AuNPs）是由于其稳定性、无毒性、生物相容性和易于与许多生物分子功能化等优点而在侧流测定中应用的有前途的纳米材料。 由于感染患者血清中NS1抗原水平高，使其成为许多商业免疫测定类型（如侧流快速测定和ELISA试剂盒）中一个有前途的生物标志物，因此NS1的检测已被应用于许多类型的单克隆或多克隆抗体基础免疫测定。与病毒RNA相比，病毒抗原在登革热感染患者的血液中循环时间更长，因此在RT-PCR中病毒RNA不可检测时，检测NS1抗原更受青睐。 图4说明了初次和二次感染期间NS1抗原、IgM和IgG的水平。在初次感染期间，从第0天起就可以检测到NS1抗原，并且在第4天会获得一个小高峰。即使NS1和IgM从感染的第3天到第9天同时存在，抗原检测也不会受到IgM存在的影响。另一方面，IgM的检测只能在发病后3到4天进行，并且从第5天起在血清中会保持持续量。从症状发作后第10到15天起，才能有效检测IgG。通常，IgG检测测定会用于根据IgG水平区分初次和二次感染。这是因为IgG只有在初次感染后几周或几个月才会显著提高。在二次感染期间，由于其快速的记忆反应，从第3天起就可以检测到IgG，这导致早期IgG水平高。 图4. 原发性和继发性登革热感染的NS1、IgM和IgG水平。(A) 在原发性感染期间，从第0天起可以检测到NS1，从第3天起可以检测到IgM，而IgG只能在第10天起检测到。(B) 对于继发性感染，IgG水平用于区分原发性和继发性感染，因为在急性期由于快速的免疫记忆IgG反应，IgG水平非常显著。 4.1.当前商用诊断试剂盒 NS1的检测是早期诊断DENV感染的有效方法，一旦发热开始，由于其在早期阶段出现，即在第0天至第9天内，第6至10天可以检测到最大水平。在Alcon等人的研究中，从症状发作的第一天开始，NS1抗原在血清中循环，长达9天，NS1的浓度从第0天的0.04lb/mL增加到第7天的2.00 lb/mL，而恢复期血清样本从第8天开始的浓度为0.04 lg/mL。对于二次感染，NS1在血淋巴中的浓度约为0.01至2 lb/mL，且在恢复期血清样本中未检测到。因此，大多数商用试剂盒侧重于检测NS1作为DENV诊断的生物标志物，因为它在早期阶段有可检测的显著量。 根据S. D. Blacksell及其团队的评估，商用NS1抗原现场诊断测试的敏感性和特异性分别在48.5%至58.6%和92.5%至99.4%之间。根据Osorio L.团队对不同商用NS1诊断测试的敏感性和特异性进行的比较，SD BIOLINE™ NS1/IgM/IgG检测提供最高的检测敏感性，高达80.7%，其次是SD BIOLINE™ NS1/IgM（78.4%）和第二代Pan E™（71.1%）。还有其他研究对不同类型的商用诊断试剂盒进行了审查。 商用SD Bioline Dengue Duo检测是常见的诊断测定，包括2种评估测试，用于检测患者血清中的DENV NS1和抗-DENV IgG或IgM。它的益处在于对DENV IgM和IgG的额外评估，增加了检测敏感性，这对NS1检测测定是补充的。SD Duo测试的改进敏感性再次通过比较NS1/IgG/IgM的联合检测和每个单独生物标志物的检测得到证明。NS1/IgG/IgM测试显示最高的敏感性（90.65%），其次是IgG测试（90.06%），NS1测试（87.50%）和最后是IgM（60.515）。将两个或更多登革热生物标志物（如NS1与IgM或NS1与IgM和IgG）的组合似乎对诊断试剂盒的整体性能有改善作用，从53.5%提高到88.7%和从60.61%提高到90.65%。 然而，无论是IgG还是IgM检测的单独阳性结果也可以表明过去几个月的感染，这只能被视为推定诊断。此外，当IgM测试作为单一生物标志物使用时，其敏感性被报道为低，从IgM测试获得的阴性结果不能完全排除登革热感染的嫌疑，因此IgM测试更适合用于检测近期感染，而不是作为急性感染诊断的标志。 4.2.当前诊断测试的限制 在Jayathilaka及其团队的研究中，大多数特异性检测NS1的抗体是针对高度保守的NS1区域，这导致与JEV和WNV的交叉反应超过65%。NS1抗体的产生可能是由于其他黄病毒的感染，并在DENV的二次感染期间增加到更高的抗体滴度。此外，RDTs中的假阳性通常是由于先前由任何类型的黄病毒或不同登革热血清型感染的残留抗体引起的，这在流行区经常发生。 Chung提到，商用诊断试剂盒似乎存在高变异性，范围从37%到98.9%，这可能是由于在二次感染期间，特别是在病毒血清型2、血清型4的发热开始后，随着时间的推移，敏感性降低，血清中发现大量DENV反应性IgG时，这一点在Osorio等人（2010）的研究中得到证明，即在二次感染的发热开始4天后和严重感染的情况下，检测敏感性降低。与诊断试剂盒的时间依赖性敏感性相关的是，疾病的持续时间据说会影响诊断试剂盒的敏感性，因为Guzman团队的研究报告称，与后期收集的血清样本相比，试剂盒在测试亚洲患者的急性血清样本时更为敏感，这些样本是在疾病初期的前3至4天内收集的。 此外，诊断试剂盒的敏感性也因不同类型的DENV血清型而异。在Guzman等人（2010）的研究中，Platelia试剂盒对DENV-2的敏感性最低，与其他血清型相比，诊断试剂盒对不同血清型的敏感性差异可能与不同血清型和同一血清型不同来源的特定NS1表位有关。 尽管有各种商用DENV诊断试剂盒的可用性，但仍存在一些现有的限制，如表2所列。 4.3.改善DENV诊断和发现有前景的诊断标记 Nascimento等人的研究发现，抗登革热NS1 IgG和IgG3有潜力被开发为长期DENV感染的生物标志物，而不是通常用于检测急性感染的生物标志物，如IgA和IgM抗体。这可能是因为它们在感染症状出现后的第一周内持续存在，有助于早期检测，并且检测窗口期更长，即在症状出现后4至6个月内。相比之下，NS1抗原检测的检测时间限于发病后的前几天，以最大化检测灵敏度。 生物功能化的锥形光学纤维可作为DENV诊断中的无标签定量诊断工具，因为它具有快速检测时间、简单过程、便携式可用性和易于制造的优点。在二次感染的早期，IgG抗体的存在量会比初次感染时更高，因此为抗体通过抗原生物受体的捕获提供了更高的可能性。Mustapa及其团队专注于通过在锥形多模光纤（TMMF）上固定DENV NS1抗原来检测抗NS1 IgG抗体。他们确定生物功能化的TMMF能在5分钟内检测到100 pg/mL的抗体，其灵敏度可达7 × 10-6a.u/pg/mL。这种生物功能化的TMMF可被用于DENV诊断，以获得更好的灵敏度和快速诊断结果。 Mustapa及其团队最近的研究是改进TOF的生物传感性能，通过整合纳米材料如聚酰胺胺（PAMAM）树状分子。这是一种超支化大分子，当集成到TOF中时，可以作为活性层。这种策略可能会增加TOF传感器的活性位点，以便于目标抗原的附着，主要是由于PAMAM树状分子的极性功能，它能够在其边缘锚定蛋白质并改善蛋白质装载。他们的研究将PAMAM树状分子集成到TOF传感器中作为活性层，以增强抗体吸收，从而在固定过程中为DENV-2 E蛋白的结合提供更多的活性位点。这种改进的PAMAM集成TOF传感器显示出与Kd值为1.02 ×10-10M的传感亲和力，比他们之前的研究更好。这可能是因为使用了PAMAM，它提供了更多的结合位点，并为E蛋白附着提供了更大的表面积。他们的研究证明，将PAMAM树状分子作为活性层在生物功能化的TOF传感器中大大增强了其在识别DENV E蛋白方面的性能。 之前，许多工作已经进行了利用血清型特异性抗体在DENV诊断测定中的应用，但这些方法在区分所有DENV血清型方面效果不佳。与其使用杂交瘤技术产生的抗体，不如使用来自人类天然噬菌体展示库的血清型特异性抗体，据报道它们可以通过与单一泛反应性捕获抗体结合来进行多重诊断，因为它们具有特定的表位。这些表位与NS1中最易接近的表位之一的翼状结构域表位不同。因此，使用来自人类天然噬菌体展示库的血清型特异性抗体的应用可能为解决DENV血清型鉴别的挑战提供了思路。 研究人员成功地产生了能够检测所有DENV血清型和ZIKV的杂交瘤抗体，且不会与小鼠免疫接种的重组DENV1、DENV2、DENV3、DENV4和重组ZIKV蛋白发生交叉反应。有效的检测仅适用于在急性期收集的血清样本，因为这是NS1和RNA都可检测的阶段。杂交瘤抗体对血清型特异性测试和泛DENV测试的检测限从1到20 ng/mL不等，而20 ng/mL是ZIKV NS1检测的检测限。 含有高浓度IgG的血清样本可能会导致NS1抗原与IgG形成免疫复合物而无法被检测，这进一步影响了诊断试剂盒的灵敏度。IgG的高水平通常存在于二次登革热感染患者的血清样本中。对于一些血液传播病毒如乙型和丙型肝炎，解离的抗体-抗原免疫复合物在早期诊断中起着重要作用。根据Koraka及其团队的说法，NS1抗原和IgG形成的免疫复合物需要被分解，以检测二次感染患者血清中NS1的存在。 针对病毒的sdAb研究越来越受欢迎，他们发现sdAb可以作为治疗和诊断领域的有前途的工具。纳米抗体是指具有最小分子大小的抗原结合片段，大约为15 kDa。它可以从鲨鱼和骆驼科动物（如羊驼和驼）中获得，这些动物没有轻链。纳米抗体的一个例子是单域抗体（sdAb），它由互补决定区（CDRs）组成，如CDR1、CDR2和CDR3。CDR3是一个不寻常的环，它长且延伸，能够穿透并结合到抗原的裂缝中，使其在目标结合上具有高亲和力。sdAb具有极高的热稳定性，高达95°C，并能在热变性过程中重新折叠，保持其结合亲和力。sdAb的热稳定性可以是解决使用传统mAb进行快速诊断测试时遇到的问题的方案之一。 具有特定结合亲和力的人类单链可变抗体片段（HuScFv）针对NS1的R和E域，被证明在暴露于HuScFv时，通过干扰细胞内NS1的产生和恢复宿主先天免疫活性，有效减少流感病毒感染的宿主细胞中的病毒复制。众所周知，具有Fc区域的抗NS1抗体会以某种方式诱导补体介导的细胞溶解，这可能加剧DENV感染。因此，首个专注于完全针对NS1的HuScFv的抗体开发被报道。这种HuScFv不包含Fc区域，并且比传统的IgG小得多。HuScFv与NS1的结合能力，无论是在天然形式还是分泌形式，表明它可能能够中断NS1的作用。这项研究表明，通过HuScFv和NS1之间的相互作用，可以中断病毒复制过程，因为病毒释放减少了。 与商用试剂盒SD Bioline Dengue Duo、固定mAb试剂盒和固定VHH抗体试剂盒相比，固定VHH抗体试剂盒在3种诊断试剂盒中实现了最高的特异性（99.50%），其对重组NS1的检测限为4.5 ng/mL，远低于固定mAb试剂盒（9 ng/mL）。从固定VHH抗体试剂盒获得的检测限不仅在急性期循环NS1的检测限范围内（10 ng/mL至50 µg/mL），而且远低于该范围，表明该试剂盒对检测低水平的DENV2 NS1具有显著的灵敏度。Fatima及其团队还使用表位绘图来识别VHH抗体和mAb的潜在表位。他们发现，两种类型的所有结合肽都有与NS1抗原的氨基酸序列从位置224到232相对应的同源区域。His和Trp几乎出现在每个克隆中，表明这两种氨基酸对抗体结合至关重要，特别是His残基。这种固定VHH抗体试剂盒是一个非常有前景的诊断工具，与其在效率、灵敏度、特异性和结合亲和力方面相比固定mAb试剂盒的优势。 基因工程改造可以应用于单域抗体（sdAb）以提高免疫分析的检测限。将sdAb作为捕获蛋白在与复杂基质的大总面积发生共价相互作用时存在局限性。它的小分子大小在与广泛的结合界面结合时会遇到困难，这将进一步影响目标蛋白的检测和分析的灵敏度。一种有趣的方法是通过蛋白质工程改造sdAb，获得二聚体形式的SpyTag融合sdAb，通过固定在SpyCatcher涂层微球上形成SpyCatcher/SpyTag对。应用SpyCatcher/SpyTag对有助于显著增加与非定向sdAb相比，所有DENV血清型污染的人血清中NS1的检测信号。检测限提高至5倍的增加是SpyTag融合sdAb在DENV诊断和其他蛋白质捕获应用中的有希望的结果。 上述讨论的主题的启示性部分总结在表3中。 5.结论  DENV的广泛传播早已是一个长期的公共卫生问题，随着COVID-19大流行的爆发，一些亚洲国家将需要面对双重负担，特别是对经济和卫生部门的影响。更令人担忧的是，大多数COVID-19病例从轻到中度疾病，与登革热感染常见的症状（如发热和皮疹）相似，因此存在很高的可能性，COVID-19病例和登革热病例可能会被误诊，或者一个人可能会同时感染两种病毒，就像DENV和其他黄病毒一样。此外，也有报道称在印度尼西亚、泰国和新加坡等国家存在交叉反应的案例。到目前为止，由于不同DENV血清型和不同黄病毒的感染导致的交叉反应问题仍未解决。此外，也存在更高的可能性发生ADE状况，并恶化病情。除了这些问题，DENV逃避免疫反应的习惯也是有效控制DENV感染时需要考虑的因素之一。为了解决交叉反应问题，已经持续进行了许多方法来发现有用和潜在的抗病毒药物、中和抗体和疫苗候选物，它们可以有效地发挥作用。这些方法包括基因工程的应用、纳米抗体的衍生、分子模拟、抗原隐蔽表位的发现、结构研究和抑制机制。此外，开发更敏感和特定的诊断替代品也非常需要，以解决当前商用诊断试剂盒的限制，以便能够快速和早期诊断黄病毒或其他新出现的烈性病毒，以便对感染患者进行立即的临床管理。纳米抗体衍生物和抗体工程等方法在开发敏感和特定的生物标志物检测器方面是一个有趣的想法。有趣的是，NS1可能作为DENV检测的潜在生物标志物，因为许多生物标志物检测器可以如上所述特别针对NS1抗原。总之，治疗和诊断方面的开发为未来的发展提供了有用和有趣的想法。

摘要：近几十年来，疫苗一直是预防病原体传播和癌症的非凡资源。即使它们可以由单一抗原形成，但添加一个或多个佐剂是增强免疫信号对抗原反应的关键，从而加速并增加保护效果的持续时间和效力。它们的使用对于脆弱人群，如老年人或免疫功能低下的人尤其重要。尽管佐剂非常重要，但只是在过去的四十年里，对新型佐剂的寻找才有所增加，发现了新的免疫增强剂和免疫调节剂类别。由于涉及免疫信号激活的级联反应的复杂性，它们的作用机制仍然不甚了解，即使得益于重组技术和代谢组学，最近已经取得了显著的发现。本综述着重于研究中的佐剂类别、近期作用机制研究，以及纳米输送系统和可以化学操纵以创造新型小分子佐剂的新型佐剂类别。 1.引言 佐剂——根据该词的拉丁语词源（adjuvare，意为“帮助”）——被定义为添加到疫苗中以增强免疫系统对抗原的反应并延长其持续时间的物质。在疫苗开发中使用佐剂利用了这些物质可以提供的许多好处，例如减少每次接种剂量所需的抗原量和加强接种的频率，或通过延长其半衰期改善抗原成分的稳定性，从而增强其免疫原性。佐剂可以根据其作用机制、化学性质或来源（合成、天然、内源性）进行分类。佐剂超级家族包括许多不同的物质，特别是能够激活或增强免疫信号或传递系统的小分子或大分子。免疫增强剂是能够在成人或脆弱人群中激活免疫信号的化合物；其中包括模式识别受体（PRRs）的激动剂，如RIG-I样受体（RLR）、干扰素基因（STING）、Toll样受体（TLR）和NOD样受体（NLRs）。传递系统是能够改善和延长疫苗保护的佐剂，如乳液和纳米制剂，类似于脂质体、病毒样颗粒和病毒体。根据所需的免疫反应类型，抗原应与适当的佐剂或佐剂组合正确配制，以获得尽可能少的副作用的最佳反应。到目前为止，已经开发出适当的配方，特别是通过结合不同的佐剂家族，尤其是铝盐与脂质体或乳液。确定适当的佐剂组合可能极为重要，目前许多临床研究正在进行中，以研究它们在不同病理情况下的疗效，特别是在癌症方面。由于佐剂的应用范围从病原体到过敏、自身免疫性疾病和癌症，需要正确理解关键机制，以便只针对特定途径，避免潜在的毒性。即使疫苗试验遵循严格的指导方针，多年来也出现了许多关于其安全性的担忧，特别是在COVID-19疫苗接种活动期间。疫苗的潜在毒性有时归因于所含佐剂。最近还对最成熟和最安全的佐剂，如铝衍生物的潜在毒性表示担忧。即使铝含量在许可的佐剂中每剂从0.8到0.125毫克不等，但近年来出现了关于神经毒性和自闭症的担忧。相比之下，其他研究表明铝的神经毒性是在长期服用后发生的，监管机构将铝在食品中的可容忍周摄入量（TWI）限制在每公斤体重1毫克。有趣的是，有时佐剂由脂质构成，如纳米制剂的脂质体，或其他内源性无风险大分子。EMA和FDA已经批准了47种疫苗，但这些制剂中包含的大多数佐剂是最早的铝佐剂类成员，或脂质体制剂。这种选择可能是由于这些佐剂类的已知耐受性，以及寻找新化合物的相关成本。事实上，近年来发现了不同类别的小分子免疫增强剂；然而，与药物一样，这些化合物需要适当的、耗时的临床前和临床试验来评估它们的疗效和安全性。在最近和最有趣的类别中，报告了几种PRR激动剂，对成人群体具有有希望的结果。最近的研究表明，能够通过线粒体应激途径激活免疫反应的小分子具有通过PRR途径激活免疫反应的效力。本综述着重于作用机制，开发的佐剂类别，特别强调可以针对的新的途径，以创建新的佐剂。 2.佐剂作用机制 尽管佐剂通常用于数十亿剂疫苗的配方中，但其作用机制仍然不甚了解。因此，深入理解作用方式和参与免疫系统对病原体反应的免疫机制是开发新佐剂的关键步骤。最近，人们非常关注更深入地理解疫苗佐剂如何刺激免疫反应。由于最近在免疫学研究方面的进展，已经有可能阐明佐剂作用的一些机制，如储存效应和细胞因子和趋化因子的释放，免疫细胞在注射部位的动员，适应性免疫反应的诱导，增加抗原免疫原性，以及抗原呈递细胞（APCs）的激活。阐明佐剂发挥作用的所有机制将提供关于自适应免疫如何由先天免疫促进的关键信息，并有助于开发新的强效疫苗。可以使用广泛因素对佐剂进行分类，包括它们的物理化学特性、起源和作用模式；最受欢迎的分类方案将疫苗佐剂分为两组，传递系统和免疫刺激剂。另一类佐剂由粘膜佐剂组成，可以作为传递载体或免疫刺激化合物，如壳聚糖及其衍生物（N-三甲基和单-N-羧甲基壳聚糖）、霍乱毒素（CT）和热敏肠毒素（LTK3和LTR72）。表1中报告了新的传递系统佐剂。传统上，传递载体仅作为免疫刺激佐剂的储存库，以激活先天免疫系统的细胞。由于现在有证据表明一些传递机制可以激活先天免疫，这种分类不再准确。事实上，传递载体佐剂既作为抗原载体，又通过激活先天免疫系统引起局部促炎反应，导致免疫细胞被招募到注射部位。抗原-佐剂复合物通过作为病原体相关分子模式（PAMPs）激活模式识别受体（PRR）途径。这些现象导致先天免疫细胞的激活，导致细胞因子和趋化因子的释放，这是免疫增强剂佐剂利用的相同作用模式。免疫佐剂（表1）是通过直接刺激先天免疫系统来增强抗体产生的免疫增强剂化合物。此外，作为免疫调节剂的佐剂可以刺激特定类型的细胞因子的产生，从而增强免疫系统的反应。例如，铝盐、弗氏佐剂和CpG寡脱氧核苷酸已被报道能够诱导产生和释放一些参与调节先天和适应性免疫的细胞因子，如干扰素（IFNs）、干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素（IL2和IL12）。已有几种细胞因子被报道作为免疫增强剂佐剂，刺激抗原特异性血清/粘膜抗体和细胞介导的免疫。在这类物质中，最知名的细胞因子佐剂是粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、IFN、趋化因子和一些白细胞介素（IL-1, IL-2, IL-12-IL-15, IL-18）[15]。此外，免疫刺激剂对于招募免疫细胞（如巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞（DCs））、激活APCs以及疫苗在注射部位的长期积累非常有用。最近的研究将Toll样受体（TLR）与自身免疫系统联系起来，发现了TLR激活先天免疫系统导致适应性免疫和炎症反应诱导的机制，确保了持久保护。 佐剂可以作为传递系统，捕获、吸附或聚集抗原，并随时间缓慢释放它们。这种被称为"贮存效应"（图1a）的机制发生在注射部位，佐剂通过防止由于肝脏清除导致的抗原移除，增强了疫苗的半衰期，并确保了免疫系统的持续刺激，从而产生高抗体滴度。多年来，许多通过贮存效应发挥作用的佐剂被描述出来，如脂质体、乳液（油包水和水包油）、病毒体，以及脂质或聚合物纳米颗粒（NPs）。其中一些已被开发来模拟病原体膜，以运输、保存和释放抗原，并同时增强其免疫原性功能。几种类型的脂质体，如传统的脂质体、多层囊泡（MLVs）或固体核心脂质体，也通过促进贮存效应发挥作用。油包水乳液，如完全弗氏佐剂（CFA），以及一些NPs也通过确保持久免疫反应的贮存效应发挥作用。 图1. (a) 贮存效应及细胞因子和趋化因子的募集。(b) 免疫细胞的募集和炎症体的激活。 颗粒佐剂可以通过利用几种机制诱导免疫反应，例如上调细胞因子和趋化因子的释放，诱导注射部位的炎症状态，激活炎症级联反应，并招募先天免疫细胞。例如，油包水（o/w）乳液MF59和AS03刺激免疫细胞（中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞）的募集，这些细胞将抗原和佐剂运输到更接近的淋巴结。免疫细胞在注射部位的募集诱导半胱氨酸蛋白酶的激活，导致进一步释放趋化因子（IL-18、IL-33、IL-1β），吸引其他树突细胞并延长这一现象（图1b）。此外，MF59和AS03在注射部位增加了CCR2、白细胞募集趋化因子（例如CCL2、CCL3和CCL5）以及集落刺激因子3（CSF3）的表达。同样，明矾在注射后诱导局部促炎微环境，引发补体级联反应，导致从血液流中招募免疫细胞。炎症体是先天免疫系统的重要组成部分。它们是针对病原体的有效免疫反应所必需的。当炎症体被激活时，细胞分泌促炎细胞因子，如IL-18、IL-33和IL-1β，这些细胞因子增强适应性免疫反应（图1b）。炎症体是由工作成分组成的细胞质蛋白信号通路，如富含亮氨酸的重复（LRR）C末端或DNA结合域（HIN200）、caspase-1效应物和适配蛋白ASC，这些蛋白激活炎症caspases。粒细胞、T细胞和B细胞、单核细胞、肝细胞、神经元、小胶质细胞和朗格汉斯细胞都表达炎症体，负责识别病原体并启动先天免疫反应。当炎症体被激活时，它蛋白水解裂解前caspase 1，释放活性形式，将前IL-1β和前IL-18转化为活性物种。ILs从细胞释放后，启动炎症并诱导保护免受病原体侵害的免疫反应。此外，IL-18激活淋巴细胞并刺激T细胞和B细胞的增殖，自然杀伤细胞（NKs）的活性，以及IFN-γ、TNF、IL-1和IL-2的分泌。因此，作为炎症体激活剂的佐剂是增强和维持免疫反应强度的成功策略。这些佐剂通过类似的机制激活炎症体，包括溶酶体降解、cathepsin释放和活性氧（ROS）的形成。在炎症体激活剂中，可以找到如铝盐、壳聚糖、皂素、鞭毛蛋白和合成阳离子聚合物等佐剂。铝盐诱导溶酶体损伤，诱导参与炎症体形成的cathepsin B的产生，特别是NOD样受体蛋白3（NLRP3）；活性炎症体触发caspase-1并刺激细胞因子的释放。壳聚糖和由合成阳离子聚合物制成的纳米颗粒激活NLRP3炎症体，并增强多种白细胞介素（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A和TNF）、IFN和IgG滴度的分泌，增强细胞和体液免疫反应。 佐剂可以通过一系列机制增强疫苗的免疫反应，如贮存效应和刺激先天免疫。先天免疫代表了针对病原体的第一道防线。事实上，早期识别病原体是发展适应性免疫反应的关键步骤。佐剂可以通过激活细胞模式识别受体（PRRs），识别PAMPs和损伤相关分子模式（DAMPs），刺激抗原呈递细胞（APCs）。由于在先天免疫系统中的中心作用，PRRs代表了新佐剂的战略目标。在PRRs超家族中，区分为表面和内体受体的Toll样受体（TLRs）是很有前途的佐剂目标，因为它们可以诱导信号通路，从而诱导关键转录因子的产生，如核因子-B（NF-B）。佐剂也可以用于靶向内体PRRs，如寡聚化结构域样受体（NLRs）和视黄酸诱导基因I样受体（RLRs）（图2a）。定位与它们的性质密切相关；事实上，血浆TLR识别病原体蛋白和脂质，而内体受体则由核酸激活。TLR通过MyD88途径诱导NF-kB，导致促炎细胞因子的释放。基于TLR的佐剂复制了感染期间产生的PAMPs，因此可以非常有效地对抗通常诱导PRRs的病原体或疾病。尽管PRR激动剂具有出色的免疫刺激性效果，但它们作为疫苗佐剂的使用受到高制造成本的限制，这代表了未来临床应用的限制。APCs，如树突细胞（DCs），表达各种PRRs，使它们能够识别多种病原体成分。当PRRs被PAMPs激活时，它们启动复杂的信号级联反应，导致细胞因子和趋化因子的产生，包括干扰素（IFNs），增强抗原呈递能力，以及DCs向淋巴组织的迁移，在那里它们与T细胞和B淋巴细胞相互作用，启动和塑造适应性免疫反应。成熟的DCs也可以刺激naive CD4+ T细胞分化为不同的T辅助（Th）亚群（例如，Th1和Th2细胞），帮助B细胞产生抗体。几种细胞因子调节Th细胞分化；例如，如IL-12、IL-15和IL-27等细胞因子调节naive CD4+ T淋巴细胞向Th1细胞的发展。总之，Th1细胞主要响应于细胞内病原体，如病毒和一些细菌，而Th2细胞主要响应于大型细胞外寄生虫。DCs还能够刺激naive细胞毒性CD8+ T细胞成为活化的CD8+ T细胞。这种现象称为“交叉呈递”，对于诱导针对外源性抗原的强大和持久的细胞免疫，以及有效预防病毒疾病和癌症是必要的。目前尚不清楚外源性抗原是如何在DCs中处理并呈现给MHCI上的CD8+ T淋巴细胞的；然而，已经提出了两种不同的机制。在细胞质途径中，抗原通过内体囊泡进入细胞质，并被蛋白酶体降解。在囊泡途径中，抗原在溶酶体隔室中被降解，独立于蛋白酶体活性。铝、皂素和TLR佐剂可以利用这种机制。 图2. (a) 表面和内体 TLR 激活。(b) 增强抗原呈递。由主要组织相容性复合物（MHC）在抗原呈递细胞（APCs）上呈递的抗原，是激活适应性免疫的关键步骤。许多佐剂，如明矾、乳液和纳米颗粒（NPs），被认为通过"靶向"抗原到APCs，增强MHC的抗原呈递功能。迄今为止，尚不清楚佐剂增加抗原呈递的机制是否有助于适应性免疫系统的发展。例如，明矾已被证明可以增强树突细胞对抗原的摄取，以及延长抗原呈递的持续时间。抗原大小似乎在调节抗原呈递效率方面很重要。在早期内体/吞噬体中发现了大的脂质囊泡，它们增加了抗原呈递，而在晚期溶酶体中发现了较小的囊泡，它们减少了抗原呈递。 3.佐剂类型  3.1.铝盐  基于铝的佐剂（ABA）最早发现于1926年，目前是全球疫苗中最常用的佐剂。最初使用的铝佐剂是硫酸铝钾，通常称为"明矾"，通过将抗原溶液和佐剂与碱直接沉淀制备而成（明矾沉淀疫苗）。今天，抗原被吸附到预先形成的铝盐凝胶上（直接吸附），在商业制剂的标准化和可重复性方面提供了更多的优势。目前，传统使用的明矾几乎完全被类氢氧化铝（Alhydrogel?，Croda，丹麦Frederikssund）和非晶磷酸铝（AdjuPhos?，Croda，丹麦Frederikssund）所取代。两种新型佐剂是硫酸铝羟磷酸盐（AAHS），目前用于某些人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗的配方和Imject? Alum（Pierce，Rockford，美国），由非晶碳酸铝和结晶氧化镁组成。在人类疫苗接种中，ABA主要用于针对破伤风、白喉、百日咳、脊髓灰质炎、甲型和乙型肝炎以及人类乳头瘤病毒（HPV）的疫苗。FDA批准的含有ABA的人类疫苗列表见表2。ABA也在兽医疫苗中广泛应用，用于预防细菌、病毒和寄生虫感染。 尽管使用历史悠久，但关于ABA（铝盐佐剂）免疫刺激特性背后的机制仍需进一步阐明。最初，ABA的佐剂特性首先归因于"贮存效应"。根据这一假设，抗原颗粒从不溶性盐颗粒中缓慢释放到体内，随着时间的推移，允许抗原对免疫系统的长期暴露和强化的免疫刺激，从而产生更高的抗体滴度。然而，最近的发现挑战了这一理论，证明抗原在接种部位的保留并不是免疫反应所必需的，而是接种部位炎症的程度才是佐剂效应的解释。因此，除了作为缓释系统外，ABA对免疫刺激还有其他主要影响，如先天免疫细胞的募集和激活、炎症介质的释放以及通过诱导Th2细胞激活适应性免疫。 给药后，先天炎症细胞，如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞（DC）和单核细胞，被招募到注射部位。尽管许多免疫佐剂的活性基于Toll样受体（TLR）信号，但铝盐显然不引起基于TLR的反应。与在细胞损伤后释放到细胞质中的不溶性单体尿酸钠（MSU）晶体的尿酸类似，已经显示ABA的颗粒性质促进了巨噬细胞的吞噬作用和APCs中抗原的摄取。此外，ABA的细胞毒性诱导了热休克蛋白（如hsp70）和其他DAMPs（如MSU形式的尿酸）的分泌。NLR家族含吡啉结构域3（NLRP3）是核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体家族（NLR）的成员，是一种细胞质模式识别受体（PRR），在调节先天免疫信号中起着至关重要的作用。NLRP3通过钾离子外流激活，作为膜完整性的感应器。当被ATP、石棉、硅石、铝佐剂或MSU等刺激触发时，NLRP3与适配蛋白凋亡相关斑点蛋白含有CARD（ASC）和非活性前caspase-1结合形成NLRP3炎症体多聚体复合物。前caspase-1的自蛋白解剪切为活性caspase-1，将促炎细胞因子前体pro-IL-1β、pro-IL-18和pro-IL-33裂解为它们的活性和分泌形式。有假设认为，铝盐可能通过直接方式激活NLRP3炎症体，通过吞噬溶酶体损伤和随后的cathepsin B释放，或者通过MSU的间接释放。除了NLRP3介导的炎症外，哨兵细胞极化为活跃的巨噬细胞和APCs，增加了吞噬体活性氧物种（ROS）的产生，吞噬体酸化干扰和通过低氧诱导转录因子-1α（HIF-1α）的细胞代谢重编程，是最近揭示的对ABA免疫刺激特性有贡献的其他机制（图3）。 图 3. 基于铝的佐剂（ABA）的效果。 哨兵细胞激活为抗原呈递细胞（APCs）对适应性反应至关重要，从而将先天免疫与适应性免疫联系起来。ABA通过主要组织相容性复合体II类（MHCII）分子增加活化树突细胞上的抗原呈递。MHCII抗原呈递位点激活CD4+ T细胞，这些细胞分化并激活B细胞，进而主要产生IgG，推动体液免疫。铝盐优先增强抗体介导的免疫反应，通过TFH细胞和IL-4信号，结果产生IgG1并诱导Th2细胞分化，这些细胞通过IgE推动嗜酸性粒细胞炎症反应。与强烈的Th2反应相比，明矾对需要Th1细胞介导保护的感染效果较差。在小鼠研究中，已证明明矾间接抑制Th1反应，原因是IL-4激活。通过Th1反应产生的淋巴因子是补体固定IgG2a抗体的基本诱导因子，因此是巨噬细胞的刺激因子。此外，先天免疫系统的细胞可以发展适应性特性（“训练免疫”），并且铝佐剂可能涉及训练免疫的诱导。然而，NLRP3炎症体和caspase-1在抗体反应诱导中的作用仍然存在争议。经过近一个世纪的使用，铝盐仍然是疫苗佐剂的里程碑，因为它们具有确立的安全性和有效性记录。ABA非常耐受，并且仅报告了一些轻微的局部反应，如注射部位疼痛、肿胀、红斑，以及罕见的肉芽肿和过敏反应，这些反映了它们通过炎症体激活、促炎介质、吞噬细胞积累和抗体产生的作用模式。在一些免疫接种对象中还描述了接触性皮炎的罕见病例，注射后头痛、关节痛和肌痛以及持续性肿胀。有关铝佐剂长期毒性的辩论引起了广泛关注，包括如阿尔茨海默病（AD）、慢性自身免疫和多发性硬化症等影响。由佐剂引起的自身免疫综合征（ASIA）指的是一组不良效应，包括海湾战争综合征、巨噬细胞性肌筋膜炎、硅肺症和与佐剂暴露相关的接种后现象。此外，由于铝离子在AD的发病机制中被牵连，人们对ABA的生物持久性和潜在神经毒性提出了担忧，但这种相关性从未被证明。尽管需要进一步的知识来更新和确认ABA的安全概况，但作为佐剂的铝盐的风险-效益概况仍然极其积极，并确认它们作为疫苗佐剂的黄金标准。 3.2.STING激动剂佐剂 环状GMP-AMP合酶/干扰素基因刺激因子（cGAS/STING）途径是先天免疫系统胞质模式识别受体（PRRs）网络的一部分，监测细胞质以感知危险刺激。途径的刺激激活下游的核因子-κB（NF-κB）和干扰素调节因子3（IRF3），增加I型干扰素（IFN-1）和其他促炎细胞因子的转录，从而增强抗原呈递和免疫反应。cGAS/STING在免疫调节中的关键作用使其成为免疫疗法的重要靶点，特别是与癌症相关的，并且是使用STING激动剂作为有前途的疫苗佐剂的理由。STING激动剂（图4）主要在肿瘤学和病毒学中应用，包括环状二核苷酸（CDNs）、非核苷小分子（NCDNs）、胞质双链DNA（dsDNA）、锰离子、可电离脂质和聚合物。如20,3-环状鸟苷酸-腺苷酸（cGAMP）、环状二聚鸟苷酸（c-di-GMP）或环状二聚腺苷酸（c-di-AMP）等环状二核苷酸是途径的天然激动剂，但它们由于高极性和由于外切核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶（ENPP1）酶降解导致的短半衰期，其药代动力学（PK）特性较差，大大限制了它们的使用。为了改善环状二核苷酸的PK特性，已经测试了如ADU-S100的磷酸衍生物，ENPP1抑制剂也是一个有前途的新策略。为了选择活性更好的候选物，寻找模仿CDNs和STING结合构象的刚性类似物的研究导致了一类新的激动剂，即大环桥接刺激剂（MBS），如E7766。为了克服环状二核苷酸的PK限制，研究还集中在NCDNs上，如黄酮类5,6-二甲基黄酮-4-乙酸（DMXAA）和α-芒果苷，以及二聚酰胺苯并咪唑（diABZI）衍生物，这些在肿瘤免疫疗法和针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）方面取得了有希望的结果。 图 4. 小分子STING激动剂的二维结构 作为触发STING途径的一种方式，诱导细胞质双链DNA (dsDNA) 释放的策略也被采用，例如使用放疗、基于明矾的佐剂，以及化疗药物，如顺铂或多柔比星。无机锰被发现能激活cGAS，并通过增强第二信使cGAMP的产生，充当STING的间接激动剂。在其他激动剂类别中，我们列举了聚合物，如壳聚糖或PC7A，以及基于纳米粒子的可电离脂质。目前在临床试验中的STING激动剂总结在表3中。 cGAS/STING信号的触发因素是细胞质dsDNA，这是细胞损伤的重要标志。因此，cGAS作为直接的DNA受体，催化dsDNA转化为第二信使cGAMP，这诱导了STING的激活和寡聚化。STING寡聚体激活TANK结合激酶1 (TBK1)，它招募IRF3并通过NF-κB诱导I型干扰素刺激基因的转录。下游自噬的诱导和NLRP3炎症体的激活增加了病原体清除，并在自身免疫和炎症性疾病、衰老以及与肿瘤相关的炎症中具有重要意义。STING激动剂通常与环状二核苷酸有关，如cGAMP、c-di-GMP和c-di-AMP，它们作为各种微生物的代谢产物被发现。 STING途径的激动剂能直接诱导树突细胞的成熟和MHCII分子的上调，增加抗原呈递、T细胞的启动，并通过炎症细胞因子间接促进前述效应。STING激动剂还增强适应性免疫反应，通过IgG1和IgG2的产生、脾脏生发中心的诱导以及记忆B细胞的刺激来增强体液免疫。此外，I型干扰素诱导CD4 T细胞分化为Th1和TFH细胞，显著帮助B细胞的启动，也促进CD8 T细胞的激活和增殖，这对抗击耐药肿瘤细胞很重要。通过STING刺激协调的多种免疫反应使得这一途径成为免疫疗法的一个有吸引力的靶点。尽管cGAS/STING的急性激活无疑对病原体和癌细胞有益处，但慢性激活可能导致由IFN驱动的系统性炎症，引发细胞因子风暴（细胞因子释放综合征），类似于败血症。除了可能诱发系统性炎症反应外，STING过度刺激引起的其他主要问题包括缺乏细胞和组织特异性以及淋巴细胞毒性。这些前提，加上具有挑战性的药代动力学特性，使得STING激动剂的全身给药情况复杂化，它们通常在肿瘤内给药。使用药物载体技术，如纳米粒子、基于脂质的载体和抗体至关重要，以实现更选择性的靶向，结合改善的传递和功效。尽管它们的药代动力学具有挑战性，且全身使用的疗效指数较窄，STING激动剂代表了一个非常有前途的佐剂类别，需要优化它们的制剂以进一步提高其佐剂性。 3.3.TLR配体 3.3.1.Toll样受体 市场上的大多数疫苗主要由单一佐剂组成，但通常保护性免疫反应并未达到有效使用疫苗的标准。因此，显著的Toll样受体（TLR）是先天免疫的关键组成部分，提供防御性炎症反应以抵御入侵的病原体。人类TLR包括10个成员（TLR1-10），可以跨越细胞表面（TLR1、2、4、5、6、10）或定位在内质网膜（TLR3、7、8、9）上，并参与不同PAMPs（表4）的识别。PAMPs的结合诱导TLR同二聚体（TLR3、4、5、7、8、9）或异二聚体（TLR1/2或TLR2/6）的形成，将两个toll/IL-1受体（TIR）结构域聚集在一起，允许适配蛋白MyD88（髓样分化初级反应-88）与复合物结合。TLR3是唯一结合不同适配蛋白的受体，即含有TIR结构域的适配蛋白-诱导干扰素-β（TRIF）蛋白。与其他TLR不同，TLR4信号可以通过涉及MyD88信号适配蛋白或TRIF的两条独立途径进行。一旦激活，TLR将增加免疫细胞的迁移并引发适应性免疫反应。 由于TLRs作为免疫增强剂，它们的激动剂可以用作疫苗佐剂。疫苗产生的免疫反应类型取决于由特定TLR及其适配蛋白激活的信号通路。虽然大多数TLR途径导致Th1免疫反应，TLR2诱导Th0、Th1或Th2反应，TLR3激活NF-κB途径。表1总结了疫苗配方中使用的几种TLR激动剂，TLR激动剂的结构报告在图5中，临床试验中的TLR激动剂在表5中。 3.3.2.TLR2激动剂 TLR2可以识别许多PAMPs，因为它们可以与TLR1和TLR6形成异二聚体。L-pampo是由PAM3CSK4（PAM3）、TLR1/2、聚(I:C)和TLR3构成的复杂系统，是一种有效的佐剂。它在乙型肝炎病毒（HBV）疫苗中使用，诱导细胞介导的免疫反应，增加CD4+ T细胞水平。目前，它正在作为使用RBD（受体结合域）、S1抗原和RBD-Fc作为病毒抗原的SARS-CoV-2疫苗的佐剂进行研究，已被证明能引发强烈的体液和细胞免疫反应。 TLR2识别细菌脂蛋白，因此，由细菌LPS衍生的合成脂肽作为疫苗佐剂被开发出来。MALP2（巨噬细胞激活脂肽2，图5）来源于支原体发酵，利用TLR2-MyD88信号通路激活免疫细胞。PAM2CSK4和PAM3CSK4是两种作为疫苗佐剂评估的TLR2激动剂，用于对抗利什曼病、疟疾和流感。由于它们的尺寸、化学复杂性和疏水性，TLR2激动剂通常不用于疫苗开发，即使在固相自动肽合成研究可以帮助发现新的更简单的衍生物。 图5.小分子Toll样受体激动剂的2D结构。TLR2激动剂（紫罗兰色上部） 面板）、TLR4 激动剂（青色，中间面板）、TLR 7/8 激动剂（绿色，下面板）。 3.3.3.TLR3激动剂 TLR3是内体受体，能够检测病毒dsRNA。聚(I:C)是一种结构类似于病毒RNA的佐剂。它能够诱导IFN-I和IFN-III的产生，并刺激Th1细胞因子反应。MVS途径（RIG-1和/或MDA5）的激活会导致人类毒性，因此开发了新的聚(I:C)衍生物，聚(ICLC)和聚(IC12U)。 聚(ICLC)是一种聚-L-赖氨酸羧甲基纤维素，能刺激干扰素的产生。它诱导炎症体和补体系统的表达，并在针对恶性疟原虫、HIV和癌症的疫苗候选中使用，显示出引发Th1反应的强能力。由于这种佐剂的高度免疫刺激性和对血清核酸酶的高抗性，设计了聚(IC12U)。这种新物质显示了尿嘧啶和鸟嘌呤残基的错配，导致毒性较低（不与MDA5结合），以及IFN-I的产生减少。 3.3.4. TLR4激动剂 TLR4通过MD-2（髓样分化因子-2）和CD14识别细菌脂多糖。LPS的免疫刺激性活性是由于脂质A区域，并且脂肪酸链的变化反映了不同的生物活性。Eritoran是一种TLR4-MD2激动剂。它是一种由脂质A衍生的合成物，其特点是含有四个脂质链，其中一个含有顺式双键。3-O-去酰基-40'-单磷酸脂质A（MPLA，图5）和葡萄糖基脂质A（GLA）表现出低致热性和强免疫增强特性。LeIF（利什曼原虫真核起始因子）和neoseptins（合成肽模拟化合物，图5）是两种非糖脂配体，它们不像LPS，但能够像天然配体一样激活TLR4。在THP-1细胞中筛选激活NF-κB途径的小分子化合物，发现了一种属于吡啶并吲哚类的特定TLR4激动剂（1Z105，图5）。1Z105被确定为安全的TLR4激动剂，其他研究目前正在进行中。TLR4可以激活一个强大的TRIF介导的细胞反应，其特征是多能CD8+/CD4+ T细胞的存在和对癌症和传染病的CTL活性增强。 3.3.5.TLR5激动剂 TLR5由多种免疫细胞表达，参与细菌鞭毛蛋白的识别。配体与TLR5的结合诱导炎症途径的激活，释放包括TNFα、IL-1β、IL-6和一氧化氮在内的炎症介质，引发Th1和Th2反应。当与抗原一起给予时，鞭毛蛋白诱导粘膜免疫反应，这对于保护免受呼吸和胃肠道感染至关重要。鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白已与PR8流感病毒（IPR8）、HA（H5N1）或禽流感病毒（AIV）H5N1抗原配方，证明它能引发强烈的免疫反应，包括IgA的产生。对鞭毛蛋白的修改导致了嵌合鞭毛蛋白或活细菌中的鞭毛蛋白抗原复合物，如结核分枝杆菌、霍乱弧菌、化脓性链球菌、单核细胞增生李斯特菌、肠毒素大肠杆菌（ETEC）等，并在动物模型中使用。三种使用鞭毛蛋白作为佐剂的疫苗正在进行临床试验阶段，其中两种针对流感病毒，一种针对鼠疫耶尔森菌。 3.3.6.TLR7/8激动剂 TLR7/8能够诱导Th1免疫反应，并产生高水平的I型干扰素、IL-12、TNF-α和IL-1β。TLR7/8和TLR9激动剂能够激活并促进cDCs（常规树突细胞）和浆细胞样树突细胞（pDCs）的克隆扩展，动员CD14+ CD16+炎症单核细胞和CD14dimCD16+巡逻单核细胞。Imiquimod（R837，图5）目前已获批准并用于治疗生殖器疣、表浅基底细胞癌和日光角化病。另一种异喹啉衍生物resiquimod（R848）具有抗病毒和抗癌治疗用途，正在评估用于黑色素瘤治疗。已经开发了不同的结构相关的oxoadenine化合物，尽管需要其他临床前研究来证明它们的疗效。CL075是一种结构相关的杂环化合物，具有融合的喹啉-噻唑环。 3.3.7.TLR9激动剂 TLR9识别细菌DNA基序胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）二核苷酸，通过MyD88途径激活免疫系统。CpG是已被修改以防止蛋白酶降解并用作佐剂的分子基序。CpG-CDNs能在自然杀伤细胞、B细胞和pCCS中引起强烈的趋化因子、细胞因子和抗体产生，并引发强烈的Th1型免疫反应。CpG1018是一种能够引发Th1型免疫反应的寡核苷酸。CpG1018是过去20年中批准的四种新型佐剂之一。即使它的使用最初在Hepliisav-B疫苗中受到限制，但目前正在评估用于对抗黑色素瘤和SARS-CoV-2的疫苗。MGN1703属于TLR9激动剂，是一种包含CG基序并呈现线性结构的小DNA分子。它由中间的双链DNA部分构成，两侧是单链结构。它作为疫苗的佐剂在癌症疫苗中进行了测试，在那里它激活了先天和适应性免疫反应，仅有轻微或暂时的副作用。它目前正在作为免疫调节剂单独或联合用于治疗恶性肿瘤，如黑色素瘤、小细胞肺癌和结直肠癌的I/II期研究中进行评估。 3.4.CLR配体 C型凝集素受体（CLRs）是病原体和受损组织来源脂质的免疫传感器，参与激活先天和获得性免疫。免疫反应可以通过CLRs细胞信号通路和其他PRRs（如TLR）的串扰来引发，导致不同信号通路的激活和特定细胞因子的表达。CLR触发的佐剂包括Curdlan、PGA-45、海藻糖二硬脂酸酯（TDB）和海藻糖二肉豆蔻酸酯（TDM），它们诱导强烈的Th17和Th1反应。 Curdlan在铜绿假单胞菌疫苗中使用，并诱导高水平的IL-17A和CD44+ CD62L-CD69+ CD4+ TRM细胞产生。Curdlan还能够激活树突细胞（DCs）并增强基于DC的抗肿瘤免疫，因此正在评估用于抗肿瘤免疫疗法。由于Curdlan的高度疏水性，开发了部分氧化的Curdlan衍生物β-1,3-聚葡萄糖醛酸，PGA-45聚合物，它能够刺激IKK-β的磷酸化并降低磷酸化Akt的表达，表明PGA-45可以激活多种细胞表面受体，包括TLR4和dectin-1。 海藻糖-6,60-二肉豆蔻酸酯（TDM）及其合成类似物海藻糖-6,60-二硬脂酸酯（TDB），能够通过与C型凝集素受体Mincle结合来激活巨噬细胞和树突细胞。TDB在结核病亚单位疫苗的临床研究中。TDB还可以独立于Mincle发挥作用，通过PLC-γ1/钙/CaMKKβ/AMPK途径诱导小胶质细胞极化为M2表型，使这种佐剂成为治疗神经炎症性疾病的治疗剂。 3.5.RLR配体 视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLRs）是病毒感染的传感器，诱导产生I型和III型干扰素和炎症细胞因子，激活参与先天和获得性免疫反应的信号通路。RLRs可以检测病毒和宿主RNA，导致抗病毒反应，但如果RLR途径被无控制地激活，也会导致免疫病理。聚(I:C)激活RLRs途径，因为它模仿细胞中的病毒入侵，导致MAVS-IRF3/7级联的激活和IFN-β和ISGs的产生。IFN-β的表达取决于聚(I:C)的长度；短序列在髓样细胞中诱导IFN-β表达，而长序列在成纤维细胞中诱导IFN-β表达。这意味着使用特定激动剂刺激RLR途径将导致细胞特异性IFN-β表达的诱导，特别是在成纤维细胞中，与单核细胞和巨噬细胞相比，可以赋予更强的抗病毒状态。 4.辅助佐剂和佐剂配方  市场上的大多数疫苗只包含一种佐剂，然而，保护性免疫反应通常不足以实现疫苗的有效性。为了增强疫苗的效果，开发了许多佐剂配方。佐剂和抗原可以一起传递，使用两种流行的方法之一，共价偶联或将抗原和佐剂包装在传递机制中。适当的佐剂组合选择可以导致对疫苗免疫反应的补充或协同改善。例如，AS04中的明矾和MPL的联合使用在乙型肝炎病毒（HBV）和人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗中显示出比仅使用明矾盐的相同疫苗更好的免疫反应。 4.1.脂质体 脂质体是球形颗粒，可以包裹抗原和免疫刺激性分子，保护它们免受降解并将其传递给APCs。脂质体由可生物降解、生物相容、无毒的磷脂组成，允许灵活的结构修改，以实现可调节的特性，如大小、表面电荷、膜柔韧性和药物装载模式。作为疫苗佐剂传递系统（VADS）的脂质体使用带来了许多优点，如高安全性和强烈的免疫反应。市场上的脂质体配方包括Epaxal和inflixal，分别用于对抗甲型肝炎和季节性流感病毒。另一种基于脂质体的疫苗是GSK（GlaxoSmithKline）开发的Shingrix，已获得FDA批准，用于带状疱疹病毒的老年人预防。 4.2.乳液 作为疫苗佐剂开发的乳液可以分为两种主要形式，完全弗氏佐剂（CFA）和不完全弗氏佐剂（IFA）。这两种佐剂都是油包水乳液，具有运输抗原和激活先天免疫系统的能力。CFA由矿物油、乳化剂和热杀死的结核分枝杆菌组成，促进免疫反应的刺激。然而，CFA可能会引起强烈、持久的局部炎症，并有在注射部位形成溃疡的潜力。IFA与CFA的成分相同，但不含有杀死的细菌M. tuberculosis。这种佐剂可以产生比没有它的相同疫苗更强大和持久的抗体反应。然而，IFA在疫苗配方中的使用受到其强烈副作用和毒性的限制，这是由高水平的非生物降解油和质量差引起的。 4.2.1.Montanide Montanide 是一个包括油包水和水包油乳液在内的大型家族，它已被用于兽医和人类疫苗中。MontanideTM 的生物可降解性质减少了与 IFA 类似物理结构的许多细胞毒性特征。在注射部位形成储存库，有助于抗原的逐渐释放，这是这种基于油的佐剂的作用机制的一部分。产生集中并防止恶化的抗原，并促进吞噬作用 。Montanide ISA 51 和 ISA 720 已在涉及癌症、艾滋病、疟疾或自身免疫疾病的疫苗的多项临床试验中使用。Montanide ISA 201 和 ISA 206 则被用于口蹄疫疫苗。 4.2.2.MF59 MF59 是一种水-油乳液佐剂，由角鲨烯组成，角鲨烯是一种生物可降解且与人体兼容的油，是人体的正常成分，在 pH 6.5 的 10 mM 柠檬酸钠缓冲液中通过表面活性剂 Tween 80 和 Span 85 稳定，平均粒径小于 200 纳米。它首次在 1997 年在欧洲被批准用于人类疫苗（Fluad），现在已在超过 30 个国家的超过 1 亿人中使用。其作用机制类似于明矾盐，具有在注射部位的储存活性，刺激局部先天免疫反应。肌肉中 MF59 的给药激活了强大的细胞和体液免疫反应，释放 ATP 并上调细胞因子和趋化因子，这反过来促进了白细胞的募集、抗原摄取和迁移到淋巴结以激活 B 细胞和 T 细胞，结果比明矾盐更有效。MF59 具有可接受的安全性和良好的耐受性，自 1997 年以来已施用了数百万剂。 4.3.AS0佐剂系统 AS0 佐剂系统基于经典佐剂分子的组合，如明矾、乳液和脂质体。它们由葛兰素史克公司开发，以实现最大的佐剂效果和可接受的耐受性，结合免疫刺激分子，如 TLR 配体等。这些经典佐剂和免疫刺激剂的各种组合旨在针对目标人群（包括儿童、老年人和免疫功能低下的个体）的病原体个性化适应性免疫反应。 4.3.1.AS04 AS04 由 3-O-去酰基-40'-单磷酸脂 A（MPL）组成，这是从革兰氏阴性细菌 Salmonella minnesota 分离出的脂多糖（LPS）的去毒形式，吸附在明矾盐上 。MPL 在保持较低毒性的同时，通过 TLR4 激活保留了 LPS 的免疫刺激性，当吸附在明矾上时。TLR4 在先天细胞上的信号传导介导了 AS04 的佐剂作用，与明矾的内在免疫调节特性相结合。我们可以在乙型肝炎病毒（HBV）Fendrix  和人乳头瘤病毒（HPV）Cervarix  疫苗中找到 AS04，与仅用明矾盐佐剂的相同疫苗相比，显示出更好的免疫反应。 4.3.2.AS03 AS03 是一种角鲨烯油包水乳液佐剂，与 MF59 类似，结合了表面活性剂聚山梨醇酯 80 和 α-生育酚（维生素 E），结果具有较低的反应原性并具有更好的安全性。2009 年，欧洲委员会批准了 AS03 佐剂疫苗 Pandemrix 的商业化，2013 年食品药品监督管理局授权了 AS03 佐剂流感 A（H5N1）单价疫苗 。它也用于 SARS-CoV-2 重组蛋白疫苗（CoV2 preS dTM）。α-生育酚的抗氧化和免疫刺激性特性与 MF59 相比，促进了免疫增强反应，调节了某些细胞因子和趋化因子的表达，如 CCL2、CCL3、IL-6 和 GM-CSF。此外，AS03 通过刺激 NF-κB 激活免疫系统，这导致肌肉和引流淋巴结中细胞因子和趋化因子的释放，并促进先天免疫细胞的迁移。此外，AS03 可以促进 CD4+ T 细胞特异性免疫反应，这可能导致持久的中和抗体产生和更高水平的记忆 B 细胞 。为了增加其免疫原性，使用两种强效免疫刺激剂，QS-21（来自 Quillaja saponaria 的皂苷）和 3-O-去酰基-40'-单磷酸脂 A（MPL），产生了 AS02。 4.3.3.AS01 AS01 佐剂是两种强效免疫刺激组分的组合，TLR4 配体也在 AS04 中使用（MPL）和分离纯化的皂苷部分（QS-21），在脂质体中配制。它用于带状疱疹疫苗 Shingrix 和疟疾疫苗 Masquirix 。临床前研究表明，QS-21 作为佐剂增强了抗体以及细胞介导的免疫反应 ，但作为疫苗中的单一组分佐剂，它的耐受性较差。在 AS01 中，脂质体中的胆固醇允许它结合 QS-21 并抑制其反应原性。MPL 通过 TLR4 激活先天免疫系统，而 QS-21 激活引流淋巴结中副皮质窦巨噬细胞（SSMs）中的 caspase 1。两种已建立的佐剂分子的结合引发了先天免疫的协同激活，结果大于独立组分的总和，激活了不是由任一组分单独触发的新途径，增加了表达 IL-2、IFNγ 和 TNF 的多能 CD4+ T 细胞。AS01 作为佐剂在带状疱疹疫苗中的使用已获批准，该疫苗用于老年人，具有高疗效，并在非洲有限的运动中实施的疟疾疫苗。 4.4.免疫刺激复合物 免疫刺激复合物是另一种具有强大佐剂活性的疫苗传递载体。它们是球形的，笼子状的自组装颗粒，大小约为 40 毫米。ISCOMs 由 Quillaja 皂苷、胆固醇、磷脂和抗原组成。没有抗原的颗粒被称为 ISCOM 基质。ISCOM 抗原可以是原生病毒的包膜蛋白、细胞膜蛋白或通过极性相互作用含有疏水域的肽 。ISCOMATRIX® 是使用与 ISCOMs 相同的材料开发出来的，但没有抗原，可以在疫苗配方中添加，使得使用更加多样化，并消除了疏水抗原的限制。树突状细胞（DCs）和 ISCOM 相互作用可以改善结合抗原的交叉呈递 。因此，有效地诱导了 CD4+ 和 CD8+ 抗原特异性 T 细胞反应。诱导细胞毒性 T 细胞、平衡的 Th1/Th2 反应和持久的抗体反应都是 ISCOM 疫苗的记录效果 。其他 ISCOM/ISCOMATRIX 疫苗已针对 HIV、HPV 和癌症利用抗原 NY-ESO-1 进行了临床试验。在所有情况下，研究都显示出良好的安全性和耐受性，以及诱导体液和细胞免疫反应。尽管具有这些特点，但由于一些皂苷在高浓度下具有毒性，因此对人类疫苗中使用 ISCOMs 的安全性问题已经阻止了其使用 。 4.5.类病毒颗粒 类病毒颗粒（VLPs）是与病毒大小相似的二十面体纳米颗粒（范围在20至800纳米之间），它们具有自我组装衣壳蛋白的能力。它们是非感染性颗粒，因为它们没有遗传物质。VLPs由具有重复表位的外部病毒壳组成，这些表位被免疫系统识别为非自身，并产生快速且持久的免疫反应，即使没有佐剂。它们可以通过使用不同的技术和细胞系统，如大肠杆菌、酵母（酿酒酵母和毕赤酵母）、杆状病毒、哺乳动物细胞、植物细胞或无细胞系统，由各种病毒类型生产。 历史上的VLPs制造方法包括一个称为“先组装后纯化”的多步骤方法。第一步包括衣壳蛋白在表达细胞载体内的自发组装。第二步则提供新形成颗粒的纯化。有时需要将VLPs拆解后再重新组装，以获得纯化的颗粒并提高质量。另一种VLPs的制造方法提供了使用无细胞体外组装，颠覆了传统的自我组装方法。特别是，体外系统被用作一个平台，在衣壳蛋白表达和纯化后诱导其自发组装，无需拆解新形成的VLPs。在市场上，两种重要的佐剂疫苗使用这种类型的纳米颗粒，即乙型肝炎（HBV）和人乳头瘤病毒（HPV）疫苗。当前的乙型肝炎疫苗是一种利用酿酒酵母作为表达载体的重组DNA疫苗，包括用于预防乙型肝炎感染的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）。这种疫苗已被证明至少可以提供10年的免疫力。 在HPV疫苗中，非包膜HPV病毒颗粒包含双链DNA（dsDNA）。L1和L2蛋白组成衣壳的主要和次要结构蛋白，具有二十面体对称性。酿酒酵母是目前用于表达L1蛋白的载体。VLPs和佐剂（AlP）的结合导致强烈的免疫反应和90%的宫颈癌保护。 4.6.病毒体 病毒体是一种药物传递系统，由病毒包膜和病毒或其他病原体的成分组成。它们由重组流感病毒包膜形成，包含血凝素（HA）、神经酰胺酶（NA）和磷脂，并且像VLPs一样缺乏病毒遗传物质。第一个基于病毒体的疫苗是在1975年开发的，这允许研究这种类型疫苗的有效性。自那以后，有两种疫苗已经上市，用于预防甲型肝炎（Epaxal）和流感（Inflexal）。 病毒体结构中HA的存在允许保持受体结合能力，增加免疫原性和膜融合活性，但由于缺乏病毒RNA，病毒体在结合后不能在细胞中诱导感染。病毒体可以将抗原输送到抗原呈递细胞（APCs）的细胞质中，并诱导细胞毒性T淋巴细胞反应，使它们成为完美的传递系统。然而，由于佐剂质量较差，病毒体在激活APCs和鼓励交叉呈递方面效果不佳。使用更强的佐剂可以克服这种固有限制。最近开发了一种基于病毒体的创新流感疫苗，结合了TLR4配体单磷酸脂A（MPLA）和金属离子螯合脂质DOGS-NTA。病毒体可以诱导强烈的体液和细胞免疫，与自然感染和其他强效佐剂相当。由于其极高的耐受性和安全性，这种传递系统已获得FDA批准用于人类。除了针对流感和甲型肝炎的两种基于病毒体的疫苗外，还有几种疫苗正在进行临床试验，包括针对HIV、HPV、RSV和疟疾的疫苗。 5.佐剂设计和开发的新见解 如前所述，在过去20年中，发现了新的免疫激活佐剂类别，能够增强免疫功能低下和老年人等脆弱人群的免疫反应。有几种佐剂类别可用，每种都有其自身的优势和劣势。油包水乳液等传递系统是有效且安全的系统，尽管有可能产生局部或系统性不良效应。最近的研究表明，PRR信号在几个人群中可以改变，降低了疫苗配方的保护效果。例如，防止胎儿排斥的免疫机制以及老年人中TLR途径的失调或遗传多态性的存在。出于所有这些原因，选择适当的佐剂配方对于提高效果而不降低风险-效益比至关重要。从化学角度来看，蛋白质数据银行存储库上有几种与特定配体共晶的蛋白质晶体结构，有助于通过计算机辅助药物设计寻找新化合物。报道的STING和TLR小分子激动剂的大多数结构是杂环化合物，模仿核苷酸。即使在这种情况下，也已经开发了许多具有不同应用的结构相关化合物，包括在癌症疾病中广泛应用的激酶抑制剂和作用机制不太明确的配体或人类辅因子的配体。另一个需要考虑的方面是存在用于合成肽的高通量全自动仪器。最近已经做出了努力来合成复杂的高分子量肽和糖蛋白。此外，已经开发了使用天然成分的新型复杂纳米配方，如来自昆虫的功能化聚合物。所有这些方面都非常有前景，并为佐剂发现的发展开辟了新的场景。 6.结论 佐剂是疫苗配方的关键组成部分的大家族。它们的使用在历史上最重要的疫苗接种活动中至关重要，包括脊髓灰质炎、猪流感和最近的COVID-19大流行。即使已经取得了良好的结果，但还需要更多的努力来增加疫苗对耐药病毒的保护，并减少额外加强针的需要。重组技术、DNA筛选和生物信息学研究已经阐明了新的机制和免疫信号通路的关键参与者。还需要更多的努力来识别更有效的佐剂，以对抗未来的大流行并增加对抗癌症的成功率。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

1.引言 治疗性蛋白的免疫原性与超敏反应相关。第1型超敏反应涉及产生IgE亚型的抗药物抗体（ADA）。然而，IgE ADA和高滴度IgG ADA的产生可能对包括输液反应和/或过敏性休克在内的重大不良反应有贡献，尽管这些类型的不良反应并不常见。IgE ADA复合物可以与嗜碱细胞和肥大细胞上的Fcε受体结合并交叉连接它们，导致IgE介导的过敏性休克。此外，IgG ADA可以与治疗性蛋白复合，IgG ADA免疫复合物可以交叉连接中性粒细胞上的Fcγ受体，从而释放类似组胺的血小板活化因子。此外，未能从血液中清除的大型治疗性蛋白-ADA复合物在组织如肾脏、滑膜和脉络丛中沉淀，导致组织损伤和器官衰竭。当ADA与内源性蛋白同源物发生交叉反应时，会发生最严重的不良事件。例如，多年给患者使用重组促红细胞生成素（EPO）后意外地发展为纯红细胞再生障碍（PRCA），这一特征被归因于ADA的发展，而没有发展出任何先前的重大免疫原性问题。ADA导致EPO的配方和给药途径的修改。诺华公司开发的通用EPO的临床试验显示了PRCA的发生；在这种情况下，PRCA的发生被归因于药物产品中大量存在的钨微粒引起的产品聚集。ADA与内源性蛋白发生交叉反应的其他临床情况包括人类生长激素配方中存在的聚集物引起的中和ADA，以及重组治疗产品如因子VII中残留宿主细胞蛋白（HCP）引起的ADA。鉴于这些严重结果是由交叉反应性ADA引起的，已经开发了广泛的体外方法来测量ADA的存在。此外，目前也有用于识别单克隆抗体和HCP免疫反应驱动因素的方法。考虑到这些历史结果，监管机构建议生物治疗药物开发商使用结构化方法来测量免疫原性风险。例如，欧洲药品管理局（EMA）已经发布了关于生物技术衍生治疗蛋白免疫原性评估的指南，其中将影响治疗蛋白免疫原性的因素分类为有益的患者、疾病或产品相关类别。除了EMA指南外，美国食品药品监督管理局（FDA）最近对新药产品和现有产品的通用版本的指南也建议了免疫原性风险评估方法，例如，2014年FDA指南—治疗蛋白产品的免疫原性评估指南。这些指南强调了T细胞表位对免疫原性的贡献，并提到了调节性T细胞的免疫调节作用。此外，“关键质量属性”记录在FDA赞助的质量设计倡议中，侧重于制造“工艺开发”，指的是可能使治疗性蛋白具有免疫原性的因子。最近发布的合成肽药物指南继续遵循监管指南趋势，坚持T细胞反应的重要性。值得注意的是，FDA不将小于40个氨基酸的肽视为蛋白质，但免疫原性测试仍然是这些肽的考虑因素，类似于蛋白质的免疫原性测试。FDA建议免疫原性评估应进一步扩展到合成相关的杂质，并建议肽药物开发商确定与活性药物成分共纯化的杂质中T细胞表位的存在。对于基于肽或蛋白质的药物，主要氨基酸序列本身可能是免疫原潜力的强决定因素。除了主要氨基酸序列之外，机构指南指出可能使特定个体倾向于免疫反应的患者和疾病相关类别。一些例子包括免疫缺陷和伴随的免疫抑制治疗，如甲氨蝶呤，可能会降低免疫原性和自身免疫性，而自身免疫可能会增加由于ADA的风险。相比之下，产品相关因素，即最终药物产品本身固有的有助于免疫原性的因素，可能包括糖基化概况的修改，生物物理和生化属性，肽制造杂质和/或降解产物，或在配方准备期间引入的因素。显然，监管指南和更新的临床前免疫原性风险评估方法正在趋于共识，为这篇综述提供了动力。 2.专注于T细胞依赖性免疫原性评估和缓解 虽然免疫原性测试涉及ADA检测，但根本原因是T细胞依赖（Td）免疫反应，无论是由于聚集物、HCP、杂质、由于目标参与导致的免疫调节，还是药物序列本身。因此，Td免疫原性风险评估侧重于可能来自产品序列（蛋白质或肽）的已知肽段，称为T细胞表位。某些药物衍生的肽/表位可能与人类白细胞抗原（HLA）/主要组织相容性复合体（MHC）II类分子结合，然后肽-MHC在抗原呈递细胞（APC）表面呈递给T细胞。更具体地说，从药物物质处理和衍生的T细胞表位（T辅助细胞表位）对ADA的发展至关重要。T辅助细胞表位由HLA II类分子的一个子集（主要是HLA DR，还有DP或DQ）呈递给CD4+ T细胞，然后释放出B细胞成熟和增加ADA结合亲和力成熟所需的必需细胞因子。这些相互作用发生在淋巴器官的生发中心，树突状细胞和B细胞向T滤泡辅助细胞和T滤泡调节细胞呈递T细胞表位，调节体液免疫反应的成熟。正如识别T辅助表位对免疫原性风险评估至关重要一样，通过去免疫化去除T细胞表位是Td免疫原性风险缓解的关键。去免疫化过程现在完全集成到专注于缓解Td免疫原性风险的临床前计划中。降低免疫原性（调节性T细胞表位）的T细胞表位对于引发含有“人类”成分的蛋白药物的免疫反应同样重要，如人类来源的单克隆抗体、酶替代疗法和其他人类来源的生物治疗药物。循环调节性T细胞（Tregs），也称为自然Tregs（nTregs），有助于调节人类免疫反应，已知是表位特异性的。在IgG中发现调节性T细胞表位（Tregitopes）可以改善单克隆抗体的风险评估。 2.1.定义：生物治疗药物的T细胞依赖性免疫反应 生物治疗药物的免疫反应可以分为两大类。在第一类生物治疗药物中，对“外来”蛋白（对患者来说是外来因子）的免疫反应是典型的，类似于对病原体、疫苗或同种型抗原的反应。血液因子如凝血因子VIII就属于这一类，因为它们在完全没有或部分缺乏内源性对应物的个体中发展。对于像庞贝病的酸性α-葡萄糖苷酶这样的替代酶也是如此。在第二类生物治疗药物中，对自体蛋白（“自身”蛋白）的免疫原性表明B细胞和/或T细胞耐受性的破坏，类似于某些自身免疫疾病中对自体蛋白的反应。自身耐受性由循环调节性T细胞主动调节。这些T细胞对自身蛋白（如免疫球蛋白）中的表位序列做出反应（在HLA结合特征方面可能与非自身蛋白相同），但它们对激活其T细胞受体（TCR）的反应不同。例如，Franco和Sette在川崎病免疫球蛋白治疗患者中发现了分泌IL-10以响应IgG中HLA DR限制性T细胞表位的调节性T细胞。在英夫利昔单抗治疗患者中也记录了对源自英夫利昔单抗的特定T细胞表位的IL-10反应（可能是由于Treg激活）。鉴于许多自身蛋白如单克隆抗体含有调节性T细胞表位，破坏免疫耐受的机制尚不明确，类似于对外来蛋白的免疫反应机制，但可能包括表位模仿、T细胞交叉反应、存在微量先天免疫激活剂如Toll样受体激动剂的存在，和/或聚集蛋白。Toll样受体的遗传变异、共刺激分子的多态性以及细胞因子受体的修饰等可能涉及耐受性的破坏。患有自身免疫疾病的患者可能有这些遗传异常之一，并且可能被认为有更高的发展ADA的风险。 2.2.T细胞独立与T细胞依赖反应 除了T细胞反应的调节外，像ADA产生这样的体液免疫反应可能是胸腺独立（T细胞独立[Ti]）而不是Td起源的。例如，当结构模式如聚合物重复或碳水化合物分子通过B细胞受体（BCR）直接激活B细胞时，B细胞可能以Ti方式激活。Ti激活的B细胞可以从Td激活中区分出来。Ti激活产生的抗体在同型和亲和力方面都是有限的，如果产生了记忆B细胞，那么抗体反应就不是长期的。相比之下，Td激活的B细胞以类别转换（IgM到IgG）为特征，如果产生了记忆B细胞，那么抗体反应具有更高的亲和力，更强大，更持久。生物治疗药物给药后IgG抗体的发展通常表明治疗药物正在推动Td免疫反应。根据定义，Td反应取决于T细胞通过抗原处理和呈现蛋白来识别治疗蛋白衍生的表位。由于人类群体表达不同类型的HLA II类等位基因，抗原表位与HLA之间的相互作用可能在人类群体表达的HLA等位基因谱中表现出不同的结合稳定性。这种HLA遗传多态性及其对特定肽结合（HLA限制）的影响是患者遗传学（HLA单倍型）成为对特定蛋白治疗药物免疫反应的主要决定因素的主要机制。 2.3.先天免疫反应 先天免疫系统控制Td免疫的启动。当被称为APC的先天免疫细胞在外围被激活时，它们会迁移到局部淋巴结，在那里它们可以在适当的共刺激信号存在下将药物衍生的肽抗原呈递给抗原特异性T辅助细胞。与TCR和BCR的特异性不同，先天免疫系统的细胞表达胚系编码的不变受体，称为模式识别受体（PRR），它们识别常见的微生物模式（病原体相关分子模式）。PRR包括几个家族的受体，如Toll样受体、RIG-1螺旋酶和C型凝集素受体。PRR不仅识别微生物模式，还识别一类称为警报素或与危险相关的分子模式（DAMPs）的警报信号，这些信号由受压和死亡的细胞大量释放，以促进局部炎症反应。DAMPs有助于对抗病原体、组织损伤和DAMP介导的炎症期间的压力，这发生在治疗蛋白给药期间，并促进适应性免疫反应。此外，宿主细胞和过程衍生的杂质，称为先天免疫反应修饰杂质（IIRMIs），可以通过与PRR相互作用促进适应性免疫，刺激先天免疫系统。体外和体内研究表明，即使在微量水平，IIRMIs也可以破坏对治疗蛋白的耐受性，并促进不需要的免疫反应。对Td免疫原性的新理解包括疾病状态，例如，针对心血管疾病患者的治疗通常不太可能与增加ADA的产生相关，而自身免疫疾病患者可能表现出一系列可以导致对治疗反应增加倾向的免疫功能障碍。或者，一些患者群体可能有不寻常的HLA分布，这些分布与更大程度地呈现来自药物序列的T效应表位有关，导致更高或更低水平的免疫原性。最后，药物本身的作用机制可能会干扰或促进免疫系统的激活，导致免疫原性风险更高或更低。在100人中看到一两个人（每100人）具有比其他人更高的基线免疫反应并不少见；这些高风险个体也可能对传递载体有夸张的免疫反应。受试者的基线免疫状态（包括B细胞和T细胞库以及HLA单倍型）可以影响他们对生物制剂产生免疫反应的能力。此外，如上所述，生物治疗药物在自身免疫疾病患者中可能更具免疫原性，因为受体患者的免疫系统存在潜在的炎症状态。在过去的几年里，针对自身免疫疾病患者的特定药物包括抗TNF药物，在选定的患者群体中具有显著不同的免疫概况。自身免疫疾病患者中ADA滴度增加的解释各不相同；然而，这些患者可能有缺陷的调节性T细胞或缺乏功能性调节性T细胞细胞因子受体（白细胞介素[IL]-2和IL-10）。调节性T细胞或调节性细胞因子的功能受到干扰，这些细胞因子对Treg功能至关重要，可能会显著降低Treg对含有Tregitopes的药物的反应，包括许多用于治疗自身免疫疾病的单克隆抗体。像甲氨蝶呤和TNF抑制剂这样的药物可以恢复Treg功能，当药物达到治疗水平时，可能会降低ADA滴度。这是RA活跃、加重的患者ADA滴度高的一个潜在解释，这也可能会解释为什么在有效抗炎药物治疗后ADA可能会消失。 2.4.药物功能作为免疫原性的决定因素 针对免疫系统的生物治疗药物的出现已经明确表明，药物本身的作用也可以促进或调节免疫原性，并在抗TNF药物的活性中发挥重要作用，因为TNF对调节性T细胞的作用，如上所述。抗TNF治疗后Treg功能的改善可能会导致在临床过程中对抗TNF药物的ADA滴度降低。同样，IL-2，一种调节性T细胞所需的细胞因子，不仅可以诱导亲调节环境，还可以降低药物产生ADA的可能性。这种机制可能有助于低剂量IL-2治疗在自身免疫疾病中的有效性。相反，IL-2也可以增强效应T细胞反应的功能，并已在治疗病毒和肿瘤疾病中以高剂量使用。 2.5.药物靶标和免疫原性：检查点抑制剂 一些药物如检查点抑制剂（CPIs）增强免疫反应；因此，CPIs在治疗侵袭性癌症方面已证明成功。然而，一些CPIs比预期更具免疫原性，可能导致随着继续治疗而失去疗效。一个假设是，它们的作用降低了可能存在于CPIs序列中的自然Tregitopes的耐受作用和/或增强了效应T细胞对药物序列中外来表位的反应。 2.6.药物靶标和免疫原性：抑制抗炎细胞因子 与CPIs相反，某些抗细胞因子药物比预期的免疫原性要小得多。其中一种药物是托珠单抗，一种抗IL-6生物制剂，目前广泛用于治疗RA和其他自身免疫疾病。值得注意的是，由于IL-6是T细胞激活所必需的，干扰IL-6可能会减少T细胞参与，从而降低ADA滴度。利妥昔单抗是另一种可能直接干扰免疫原性的药物；这种药物靶向发育中的B细胞上的CD20，并减少抗体分泌浆细胞的形成，这可能解释了为什么在利妥昔单抗治疗期间通常检测不到ADA。 2.7.肽类药物 在过去几十年中，肽合成的重要进展促成了治疗性肽药物制造的重大转变，并扩大了进入临床管线的新型肽的数量。对于单克隆抗体、血液因子和重组酶，肽药物中存在的HLA结合序列可能会激活调节性或效应T细胞，因此，这些肽在临床使用中可能表现出免疫原性。从完全重组到合成肽药物的转变引起了监管机构对合成相关杂质可能诱导不需要的免疫反应（包括产生ADA）的担忧。监管机构对选定的通用肽的经验导致了FDA仿制药办公室最近引入的通用肽产品指南草案。肽类药物的免疫原性主要与肽合成方法有关，因为可能会引入可能难以从最终药物制剂中去除的肽杂质。这些杂质可能含有可能有助于T细胞激活（随后，ADA）的新T细胞表位。在某些情况下，杂质的存在与过敏性休克有关。在肽合成过程的每一步可能会无意中产生几类肽杂质，如氨基酸插入和删除、非对映异构氨基酸的合并以及氨基酸R基团的氧化。杂质也可能在储存过程中产生。相对于Td免疫原性，当无意的氨基酸序列修改导致含有新HLA结合配体或改变现有表位的TCR面向轮廓的杂质时，可能会引入新的T细胞表位。 2.8.计算机辅助筛选 当前的免疫原性筛选实践通常从计算机辅助筛选评估开始，然后根据需要进行HLA结合测定、T细胞测定和MHC相关肽组学（MAPPs）。一些团队从MAPPs开始，不使用计算机辅助工具；然而，MAPPs消耗资源且成本高昂。对可用计算机辅助工具的更多经验和熟悉可能会促进这些工具作为未来免疫原性评估的第一步的更大适应。本节简要介绍用于计算机辅助筛选的工具，并强调这些工具的改进。 2.9.T细胞表位预测 ADA介导的反应是由于适应性免疫反应，由T细胞对HLA结合在APC表面展示的线性肽表位的反应支持。对于通过常规途径（外源性的，即静脉内、皮下和局部）输送的生物治疗药物，通过II类途径向CD4+辅助T细胞的呈递最为相关；然而，如上所述，涉及CD8+ T细胞反应的生物治疗药物由病毒载体和细胞治疗输送是一个日益关注的问题。幸运的是，现在可以高度自信地预测T细胞表位。T细胞表位序列的核心残基（由九个氨基酸组成）定义了与HLA DR、DP和DQ等位基因的口袋的结合亲和力和稳定性。在几个公共和学术平台上，有多种方法可以评估完整蛋白的免疫原潜力，有时这些方法与基于假设结合亲和力和T细胞前体频率的数学模型或与MAPPs确定的肽组搭配。用于表位扫描的公共网站可能会出现和消失，并且可能会修改，通常不通知，这导致随时间变化的免疫原性解释的变化。出于这个原因，许多中到大型制药公司导入在线算法并在其防火墙内运行它们，以减少知识产权披露的风险。其他公司或机构使用像安全访问的商业级ISPRI工具包这样的基于网络的工具，或将免疫原性解释外包给商业研究组织。一些工具，如商业ISPRI平台，使用独特的算法和代码来识别单克隆抗体序列中的Treg表位，并对表位内容相对于随机预期进行统计评估，并针对自身性（即耐受潜力）进行调整。使用标准化的“免疫原性量表”，可以直接将新的生物药物产品与其他已知的非免疫原性和免疫原性产品进行排名。该工具包不仅具有寻找“类人”（见下一节）的表位的新算法，因此不太可能参与激活的T细胞，而且还具有直接进行计算机辅助分析的去免疫化和耐受化方法。 2.10.筛选自身性（耐受潜力） T细胞不仅识别肽序列，还识别与HLA分子裂隙中结合的肽复合物。在任何HLA配体中，某些氨基酸与HLA分子本身接触，而其他氨基酸对TCR可接近。如果来自特定表位的TCR面向残基在来自人类蛋白质组的多个HLA结合序列中保守，则该表位可能会激活特定于这些人类蛋白的T细胞。这可能导致由自然Tregs产生的调节性反应，或者由于T细胞在胸腺选择期间的无力或删除而导致的有限或无反应。对于许多HLA等位基因，HLA结合裂隙中的锚定肽位置是已知的，其他残基与TCR相互作用。可以采用诸如JanusMatrix之类的算法，将来自候选治疗药物的预测表位与人类蛋白质组进行筛选，以区分更类似于自身、因此可能被耐受的肽与那些人类交叉保护有限、因此更可能被人类免疫系统识别为“外来”的肽。治疗衍生的“外来”表位很可能是针对治疗性T细胞反应的目标。 2.11.筛选相关肽库 如果确定了T细胞表位，那么也可以确定表位是否已经在体外或体内进行了测试。免疫表位数据库（www.iedb.org），是美国国家过敏和传染病研究所的一个合同项目，现已整理了20,860篇期刊文章和直接提交的内容，编目了近622,105个肽表位。通过将新序列与此数据库筛选，研究人员可以确定开发产品中的表位是否已报告为MHC配体，以及是否已知T细胞反应的表型，这允许将已知序列与具有更大免疫风险的未知序列进行分类。此外，当识别到风险信号时，包含来自APCs的序列的蛋白质组学数据库可以揭示组织和疾病状态之间的重要关系，以通知临床研究期间的仔细监测。7.2.12 按免疫原潜力对生物制剂候选物进行排名 在所有其他因素都相等的情况下，给定蛋白质中包含的T细胞表位的负担越大，该蛋白质诱导免疫反应的可能性就越大。可以通过在ISPRI工具包上执行的操作来实现一种生物制剂与另一种生物制剂的比较，通过对HLA等位基因的表位含量得分进行标准化并根据序列长度进行调整。区域表位密度也可以驱动免疫反应。 3.评估免疫原性风险的体外方法 广泛的验证体外测定可能成本过高；因此，在当前的临床实践中，正在执行使用先进的计算机辅助工具进行的分析。计算机辅助分析后，可以进行HLA结合和T细胞测定，或外包给商业研究组织。这些测定可以应用于（i）药物开发的非常早期阶段，以设计预测免疫原性低的新治疗药物，（ii）在后期阶段，对在人体首次研究中表现出高免疫原性的临床资产进行去免疫化，或者（iii）在项目终止后回顾性地进行，以解释观察到的高临床免疫原性背后的机制和风险因素。显然，对于新的（以及旧的生物药物的通用版本）生物药物要成功，如果在开发阶段的临床前进行免疫原性风险评估，则最具成本效益。 3.1.人类白细胞抗原结合测定 产生T细胞反应的第一步是APC将肽抗原呈递在HLA II类/MHC II类分子上供T细胞识别。一旦通过计算机辅助分析鉴定出潜在表位，可以通过HLA结合测定来首先验证预测，按照Steere等人描述的方法进行，以评估肽与一个或多个HLA超型等位基因结合的能力。超型等位基因指的是共享表位结合基序的HLA-DR等位基因家族。利用这些超型家族，可以在覆盖全球超过95%的人口的同时，对相对较少的等位基因进行结合测定。产生有意义的结合测定数据的一个关键因素是设计要测试的肽序列和测试肽的来源。II类肽的核心结合区域包含九个氨基酸，位于HLA分子的肽结合槽中。这种相互作用由核心结合区域两侧的邻近残基稳定，并延伸到结合槽外面。在设计结合测定的肽时，重要的是要正确地将结合基序置于HLA结合测定中，并具有最佳肽设计。简而言之，感兴趣的肽与特定等位基因的标记追踪肽和可溶性HLA超型单体一起孵育至平衡。第二天，停止结合反应，将混合物转移到预先用pan抗HLA-DR抗体包被的测定板中，并孵育过夜。在此孵育后，进行显色，肽结合通过时间分辨荧光光谱间接测量。使用固定浓度的标记追踪肽和一系列浓度的测试肽，可以生成一个多点剂量范围曲线，从而计算出IC50值，该值不仅提供肽与HLA结合能力的信息（是/否），还提供肽对给定HLA-DR超型的相对亲和力。IC50值可以用来根据它们对给定HLA等位基因的亲和力将肽分类，如高、中等、低和非结合。随着新技术的出现和可访问性，研究结合反应的动力学将提供更多细节。肽纯度也会影响结合测定的结果。某些制造商的肽纯度可能低至60%，这是由于制造过程和原料的纯度。肽内的杂质可能导致假阳性结果，因此导致错误的结论。结合测定的肽应具有最低85%的纯度，并应作为净肽订购。错误的结果也可以归因于错误的合成。例如，非结合肽可能是在同一台机器上合成的，该机器用于早期合成HLA结合肽。这种污染可能会破坏药物开发计划；参考中提供了一个示例。 3.2.外周血单个核细胞测定 从全血中分离的外周血单个核细胞（PBMC）是用于体外细胞基础测定的免疫原性预测中最广泛使用的效应细胞来源。实验中使用的PBMC可以来自健康志愿者或受影响患者的样本中新鲜分离，或从未冷冻保存的库中解冻，可能覆盖适当的疾病相关或常见且有充分文献记录的HLA等位基因的代表性。由于高通量和易于执行，使用全血PBMC或CD8+ T细胞耗尽的PBMC的PBMC测定仍然是最常用的体外细胞基础测定，用于测量免疫原性潜力。 3.3.树突状细胞-T细胞测定 体外单核细胞衍生的树突状细胞（moDCs）和自体CD4+ T细胞的共培养越来越多地用于评估药物候选物和产品关键质量属性（CQAs）的免疫原性潜力。DC-T细胞或DC-PBMC方法将系统简化为细胞介导免疫的基本组成部分：CD4+ T细胞与APCs在相关细胞比例下相互作用，这提高了灵敏度，因为实验系统中潜在反应细胞的总数远大于整个PBMC方法。然而，这种方法耗时且需要分离和分化单核细胞为DCs，然后进行抗原装载/脉冲步骤，这可能依赖于试剂、操作员和材料。单核细胞可以从PBMCs开始，通过塑料粘附或使用磁珠分离方法进行分离。然后使用细胞因子或其他因素进行moDCs的分化和成熟，同时添加所需的生物治疗药物、肽片段或聚集体。成熟的、脉冲化的moDCs通常与自体纯化的CD4+ T细胞共培养，以允许抗原呈递和T细胞激活，这取决于免疫原性潜力。反应的测量方法与PBMC测定相同，如上所述。moDC-T细胞系统的高级变体是模块化免疫体外构建（MIMIC R）模型，它能够可靠地产生针对生物制剂如蛋白质、肽、单克隆抗体和包括核酸在内的新型方式的抗原特异性先天和适应性免疫反应，也已用于这些目的。 3.4.流式细胞术分析T细胞表型 流式细胞术已成为免疫原性测试的宝贵工具，允许对免疫反应进行单细胞水平的特征描述。随着使用更多激光和滤光片组合的更复杂仪器以及染色和检测方法的进步，可以从患者的血液样本中获得大量信息。T细胞表位具有免疫原性或耐受性的能力。虽然在细胞培养中测量Tregs的扩增可能具有挑战性，但可以通过在存在免疫原性肽的情况下与效应T细胞共培养来确认Treg表位的存在。在这个旁观者测定中，激活的Tregs抑制抗原特异性T效应细胞对免疫原性肽的反应。标准旁观者测定利用对抗原的免疫记忆，如破伤风毒素，大多数细胞群体通过疫苗接种或自然暴露已经接触过。PBMCs在存在灭活的破伤风类毒素和Tregitope的不同浓度下培养10天。细胞经过染色分析，然后通过流式细胞术计数（Teff细胞定义为CD3+CD4+CD25+FoxP3low，Treg细胞定义为CD3+CD4+CD127lowCD25+FoxP3hi）。然后可以通过CFSE稀释测量细胞增殖。在存在Tregitope和破伤风类毒素的情况下，与单独存在破伤风类毒素相比，T效应细胞的增殖减少。 3.5.主要组织相容性复合体相关肽组学测定 在1990年代初，首先描述了一种称为MAPPs的额外方法。这种测定在识别APCs表面呈递的相关HLA上的处理肽方面证明是有价值的。此外，这种方法提供了健康受试者和疾病患者的抗原处理变异性的详细信息，并且与HLA相关的肽的测序可以确认/验证使用算法识别的序列。液相色谱-质谱灵敏度和蛋白质组学分析的最新进展使得HLA结合映射测定可以在临床前用于映射生物治疗药物中存在的潜在抗原序列。并非所有潜在的HLA结合肽都被APCs处理和呈递，因为HLA结合的部分展开和天冬氨酰蛋白酶修剪的结合。此外，HLA DM和HLA DO的编辑功能进一步提高了要呈递的肽的选择性。在这些测定中，APCs在体外产生并与感兴趣的治疗蛋白孵育24小时，之后它们经历细胞因子/有丝分裂原诱导的成熟步骤以上调HLA表达。细胞溶解后，HLA受体-肽复合物进行免疫沉淀，其中复合物被分离，然后进行酸洗脱步骤，肽从HLA复合物中解离，然后通过液相色谱-质谱测定肽序列。使用蛋白质组学蛋白质数据库算法可以进行内源性肽的减法和肽到治疗的映射。这些测定可能会识别出可以针对去免疫蛋白工程的抗原肽。此外，来自疾病患者的全血分析可以提供呈递改变以及对重组替代治疗的耐受性方面的见解。算法、先天和适应阶段输出以及MAPPs，所有这些都在案例研究中使用，已应用于抗IL-21受体ATR-107。对一级序列的计算机辅助分析预测了重链互补决定区（CDR）2中的两个重叠的CD4+ T细胞表位，以及轻链CDR2中的一个单独表位。MAPPs确认了LC CDR2中的表位作为DCs呈递的主要肽。ATR-107诱导DC激活，这可以通过细胞表面激活标记的上调表达、细胞因子产生增加以及在共培养条件下自体CD4 T细胞的特定增殖来证明。使用MAPPs验证计算机辅助预测结果可以为开发商提供保证。然而，MAPPs测定中肽的洗脱并不确认肽是否推动Td免疫反应。T细胞反应可能因响应序列的T细胞表型而异。当MAPPs在没有额外工具探索响应洗脱肽的T细胞表型的情况下使用时，可能会过高预测免疫原性。个体表位驱动免疫原性的重要性在Cassotta等人最近的一项演示中得到了加强，他们对针对α4整合素的人源化抗体纳他珠单抗的免疫原性进行了MAPPs分析。利用计算机辅助和体外细胞测定的组合，如与患者外周血液中分离的B细胞进行的MAPPs测定，作者确定两名接受纳他珠单抗治疗的多发性硬化症患者发展出中和ADA，对位于轻链V区的CD4+ T细胞表位有T细胞反应。 4.通过去免疫化和耐受化减轻免疫原性 4.1.去免疫化 减轻免疫原性的理想起点是通过工程设计分子，使其在患者中引发不需要的免疫反应的风险较低。这可以通过结合去免疫化和耐受化过程来实现。在单克隆抗体的情况下，去免疫化过程包括两种非互斥方法：超人类化，即将小鼠CDRs移植到人类来源的抗体框架中，以及移除T细胞表位序列，这些序列是使用表位预测对数和体外确认测定的组合来识别的。将小鼠CDRs移植到人类V区域通常会导致亲和力下降或丧失，这可以通过在人类框架中对药物-靶标相互作用至关重要的位置引入小鼠氨基酸（所谓的“回变”）来恢复。这些回变可能会引入额外的T细胞表位；因此，需要应用迭代和及时的去免疫化策略，以在分子序列被优化以实现预期的预测效果时，耗尽去除表位的可能性。在这种情况下，增强的二元替代技术可能是一个有效的组合方法，但需要进一步探索。 4.2.耐受化 与去除有害的CD4+ T细胞表位互补的是引入T调节序列，这个过程被称为耐受化。耐受化在替代疗法中特别有趣，在替代疗法中去除T细胞表位可能会影响药物功能，或者在基因疗法中用来平衡由衣壳抗原决定基引起的细胞毒性反应的激活。事实上，预防性给药腺相关病毒AAV衍生的衣壳蛋白融合到Treg表位可以减少病毒衣壳特异性CD8+ T细胞反应，并伴随着Treg细胞计数的同时增加。迄今为止，预期减少去免疫化和/或耐受化分子的免疫原性的证明依赖于体外和体外测定或临床前模型。高度免疫原性的单克隆抗体的去免疫化形式尚未在临床环境中完全适用，因为生物治疗药物开发商专注于开发具有更长专利寿命和更大操作自由度的新型、免疫原性较低的分子。 4.3.治疗诱导的耐受性 减轻ADA发展风险的努力通常集中在降低治疗蛋白的内在免疫原性上，对于患有血友病A和B的患者，他们对重组凝血因子产生抑制分子，已经建立了免疫耐受诱导协议。针对基于单克隆抗体的药物的ADA反应也可能导致反应丧失和药物更换，即使是完全人源化的分子也是如此。在这种情况下，已经构想并审查了各种诱导对生物治疗药物免疫耐受的方法。对其他救命治疗蛋白的ADA反应，如酶替代疗法，已经损害了治疗效果，有时甚至导致死亡。对于基因疗法，对转基因和病毒载体的ADA发展仍然是成功治疗的主要障碍：对病毒衣壳有预先存在的中和抗体反应的患者没有资格接受治疗，发展出治疗诱导的体液免疫的患者将没有资格重新剂量。“去免疫化”指的是去除推动T辅助介导的免疫反应的T辅助表位可能会减少T辅助免疫反应，而“免疫工程”或“耐受化”指的是通过保留或引入Treg表位（Tregitopes）到蛋白质序列中来识别和增强Treg反应。这种计算机辅助方法使得引入调节性T细胞表位以减少免疫原性的潜力成为可能。或者，可以使用现有的药物制定与免疫耐受诱导相关的方案，这些药物针对与ADA发展相关的免疫瀑布的主要参与者，通过抑制有害的效应T细胞反应或激活耐受途径。前者可以通过干预与T细胞和B细胞激活相关的机制或通过使用免疫抑制剂如环磷酰胺或甲氨蝶呤、抗CD3或抗CD20抗体、蛋白酶体抑制剂或多种耗尽剂的组合来实现。已经应用了几种这样的方法，包括同时使用甲氨蝶呤来减少T细胞介导的免疫原性。在庞贝病和对FVIII疗法抑制剂的耐受性诱导中，目前使用的方案涉及多种药物的组合，如利妥昔单抗（消除抗体分泌B细胞）和静脉注射免疫球蛋白（结合并去除抗体或诱导耐受性）。庞贝病的方案中加入了甲氨蝶呤，这种修改后的方案已经成功地在患有高风险庞贝病的婴儿中建立了对阿糖苷酶α的耐受性。其他正在考虑的方法包括同时给予纳米粒子形式的雷帕霉素方案或与Tregitopes共同给予。在体外条件下，注入扩增的Tregs和Bregs并表达抗原特异性受体可以控制血友病A临床前模型中抑制物的发展。大多数免疫耐受诱导方法仍处于开发初期，这些干预措施的长期效果仍然未知。然而，已经达到临床环境的耐受性方案的价值是激励继续评估免疫耐受诱导作为减轻生物治疗药物不需要的免疫原性的手段。 4.4.抗药物抗体测定标准化 由于缺乏ADA测定的标准化和协调，跨临床研究比较治疗蛋白的免疫原性一直具有挑战性。对于给定的治疗蛋白，关键测定参数（如灵敏度和药物耐受性）的变异性可能导致各个实验室对临床发病率的不同估计。在这种情况下，由Innovative Medicines Initiative（IMI）资助的ABIRISK财团（针对生物制药免疫：预测和分析临床相关性以最小化风险）产生了单克隆抗体，用作ADA测定中的标准。这些通用标准可用于基准测定灵敏度和药物耐受性，常规监测测定性能，并验证生物仿制药ADA测定中的抗原性等效性。此外，基于这些标准的免疫原性评估可以帮助临床医生了解如果观察到效果丧失的剂量策略。针对利妥昔单抗、纳他珠单抗、英夫利昔单抗、阿达木单抗或干扰素β的各种同型和亲和力的单克隆中和抗体是从用相应的治疗蛋白免疫的患者中分离的B细胞产生的，如前述方法所述。生产规模扩大和进一步的表征分析使用ABIRISK验证ADA测定正在进行中。最终，所有抗体将在国家生物标准和控制研究所公开提供。 5.新方式和免疫原性风险评估 如在“新方式”部分所讨论的，新的治疗方式，如细胞和基因疗法，在临床环境中已显示出免疫原性。这些方式可以刺激免疫反应的机制是复杂的，因为高水平的工程、细胞内表达、引入工程基因产品和复杂的输送系统。主要为蛋白质治疗药物开发的修改免疫原性风险评估工具和测定可用于最小化这些新型治疗的免疫原性风险。 5.1.特定细胞系/可溶性T细胞受体 依赖于APCs展示处理肽段在HLA类I/II背景下与T细胞库相互作用的新体外测定方法，被证明对于进一步定义抗原特异性和免疫反应传播非常有用。此外，使用表达类I和类II HLA的工程B细胞系有助于高通量预测细胞内处理和呈现潜在抗原表位。例如，在竞争性方法中，使用可溶性TCRs识别HLA参考肽复合物，用于检测单等位基因APC系呈现潜在免疫原性表位（默克，未发表数据）。 5.2.建模 如上所述，可以在开发的早期阶段部署各种计算机辅助和体外工具，以指导蛋白质工程和设计预测免疫原性低的药物候选物。然而，这些工具可以用来评估与产品相关的风险，特别是基于序列的风险，但它们可能不会揭示与免疫原性相关的因素，如患者和治疗相关因素。免疫原性的总体风险依赖于不同风险因素的加权和整合，其中一些是经验性的或理论性的。免疫原性定量系统药理学（QSP）模拟器可以帮助简化和统一这种整合。它们结合生物治疗药物、生理学基础的药代动力学（PK）和免疫反应的机制模型，以模拟大规模临床试验并预测免疫原性的发生率。可以模拟关键变量如HLA基因型、联合疗法、剂量方案和给药途径对ADA发生率的影响，以及ADA对药物PK的影响。QSP模拟器仍在开发中，它们需要更多的经验输入数据和完善与免疫系统相关的参数，如抗体发展的动力学。验证后，QSP模拟器可以促进个性化管理和减轻免疫原性。 5.3.免疫原性重点组织 由于在准确进行免疫原性风险评估以及测量和确定ADA的临床相关性方面存在挑战，制药公司、生物技术研究所和合同研究组织联合起来，通过解决现有差距在该领域取得进展。创建了科学非营利协会，如欧洲免疫原性平台（www.e-i-p.eu/）。该平台旨在促进免疫原性专家之间的交流，鼓励和领导与监管机构的互动，以及与更广泛的科学界分享知识和免疫原性领域的最新进展，并提供关于免疫原性的实践和监管方面的培训课程。 ABIRISK财团是另一种协作方法，旨在促进免疫原性科学的进步。临床和基础研究学术中心与工业伙伴合作进行了为期6年的研究项目，并解决了与不需要的免疫原性相关的一些主要问题和实际障碍，如现有预测工具的价值、ADA测定、协调和标准化、检测到的ADA的临床相关性、患者风险因素的识别和预测标记。 这种广泛的跨实验室合作在欧洲、美国和以色列产生了一个衍生倡议。BIOPIA（https://ki.se/en/cns/biopia）是一个非营利性努力，由欧洲实验室组成，这些实验室在生物制药PK和许多疾病的免疫原性方面拥有专业知识，这一倡议旨在提高对免疫原性的意识，并倡导整合药物水平和ADA测试以改善患者管理。该网站提供有关ADA和药物水平测试的信息，主要是帮助临床医生实施免疫原性和药物水平的常规临床测试。在美国，也在进行类似的努力，作为AAPS（美国制药科学家协会）的治疗蛋白免疫原性社区的一部分。免疫原性风险评估和缓解工作组进行了一项调查，以表征性能和协调风险评估方法，包括通过成员调查的算法和体外测定。未来的重点是适应当前工具并开发创新测定，以回答有关新方式和下一代疗法的问题。 5.4.监管机构对免疫原性的看法 最近的FDA指南提出了一种基于风险的方法来评估治疗蛋白诱导的免疫反应及其对安全性和效力的影响。还建议在生物仿制药开发早期制定基于风险的策略，最好在人源化之后，并与其他开发能力努力并行。早期评估将使由于结构和序列而产生的负债有更强大的理解。通过药物开发的不同阶段持续评估风险，可以指导临床应用的生物分析策略，这在以下部分描述。风险评估包括由于与蛋白质表达和纯化以及配方/辅料诱导的聚集或降解相关的工艺变化而引起的翻译后修饰的风险。 5.5.将风险评估整合到临床前管线中 简而言之，免疫原性风险评估应考虑潜在的治疗益处，并将其与考虑患者人群类型和适应症以及治疗靶标的以往经验的免疫原性潜在影响进行权衡。 对生物制剂候选物的早期评估允许基于识别风险的最低概率进行排名。还有去免疫化/序列优化的空间，其中去除几个氨基酸以去除表位或插入调节性序列以驱动抑制性T细胞反应。此外，基于风险的策略应包括由于与蛋白质表达和纯化相关的工艺变化引起的翻译后修饰的负债，以及由于配方/辅料引起的聚集或降解。 在开发基于风险的策略期间，还应考虑治疗蛋白的早期药理学知识，包括靶标参与和随后激活免疫途径。临床前毒理学研究为生物仿制药的安全性提供了见解。 可以在不同阶段用于候选物选择以最小化免疫原性风险的工具和测定。例如，在计算机辅助筛选中，可以使用基于计算机的算法评估不仅氨基酸序列对潜在HLA类I和II结合和可能发生化学修饰的残基，还可以评估聚集体的蛋白质结构。可以进行体外测定以评估生物治疗药物在不同供体组中激活T细胞的潜力。这些测定可以与整个蛋白质一起进行，以可能包括靶标参与，或者与重叠肽一起进行，以排除靶标参与。MAPPs和HLA结合测定旨在识别分子内的抗原。当在药物开发过程中出现特定问题时，可以使用包含免疫系统额外部分的体外和体内模型。评估非序列生物物理参数影响的先天免疫系统激活测定可以用来优化工艺开发和配方或工艺变化。临床免疫原性数据和患者特征是验证、评估和改进与靶标和非靶标负债相关的临床工具和测定关联问题的有效性的关键组成部分，特别是当临床前和临床靶标具有同源性时。如果有先前的临床经验，基于风险的策略也可以成为优势，例如，已经处于商业阶段的类似靶标的蛋白质的临床经验。此外，如果对一种疾病适应症的治疗蛋白有足够的临床经验，那么与安全性和效力相关的研究结果也可以总结为正在为新IND开发的新药（IND）的应用。 6.五年展望 由于免疫原性风险评估方法的进步，以及针对产品（主要序列和配方）的去风险工作，以及对可能导致ADA发展的患者因素的理解的提高，大多数生物治疗药物开发商正在将评估整合到药代动力学/药效学（PK/PD）、安全性和临床效力结果中，以更好地了解新产品或生物仿制药的风险。在药物开发过程中（设计新序列、选择领先化合物、去风险识别的负债或比较生物仿制药优先级），应持续考虑使用新兴技术（新的计算机辅助、体外和体内测定）。这些方法还提供了风险估计，包括对临床免疫原性的个体风险（HLA类型）的先验知识。目前不推荐在动物模型中进行体内研究以进行免疫原性测试，因为动物模型中的HLA与人类HLA之间的差异。相反，体外测定更适用于评估细胞介导的免疫反应的风险。在从一种模型物种过渡到另一种模型物种或人类时，可以预期MHC相关免疫反应的变化。在小鼠、非人灵长类和其他模型物种中与MHC结合的T细胞表位通常与与人类MHC结合的表位不同。大多数生物制剂的临床前研究通过在体外条件下测试免疫原性来规避这一问题，其中选择人类PBMC样本以广泛覆盖人类MHC。 在未来5年内，预计大部分风险评估将首先在计算机辅助下进行，然后再转移到（有限的）体外和体内模型。这是因为大多数进行全面临床前开发的制药公司实际上为单一目标生成了数千个潜在候选物。计算机辅助分析是免疫原性的一个很好的初步方法，它允许在需要的地方使用体外方法详细检查某些分子特征。随着更多结果可供公众审查，计算工具的准确性将提高。机器对机器界面，使得可以集成和高通量筛选同一目标的多个候选物，将同时改善临床开发候选物的临床前选择。药物开发商应该熟悉可用的工具，因为预计要筛选的候选物化合物数量将使其无法在没有自动化的计算机辅助分析流程的情况下进行管理。未来，计算机辅助分析（和体外验证）的范围也可能包括HLA类I免疫原性评估和体外测定。这是由于引入了新的治疗方式和病毒载体，它们与MHC类I途径相互作用。 免疫原性风险评估领域已经成熟，并将在新的治疗方式进入临床环境时继续发展。 免疫原性或不良免疫反应被定义为治疗性生物制剂产生针对自身和相关蛋白的免疫反应的倾向，或诱导免疫学相关的非临床效应或不良临床事件。在治疗性生物制剂开发过程中有两种类型的免疫原性： • 期望的免疫原性通常与疫苗接种有关。注射抗原（疫苗）刺激针对病原体（病毒、细菌、癌细胞等）的免疫反应，目的是保护宿主。 • 不期望的治疗性生物制剂的免疫反应也可能中和它们的生物活性并诱导不良事件，不仅通过抑制治疗性生物制剂的效力，还通过与内源性蛋白对应物发生交叉反应，导致其生理功能丧失（例如，中和抗体对治疗性EPO导致PRCA，通过中和内源性蛋白）。这种免疫原性概述是治疗性生物制剂发现和开发中后者的不良免疫反应。 抗原处理由专业的APCs如DCs、巨噬细胞和B细胞执行。这个过程包括两个步骤：首先，抗原捕获，其中抗原被送至细胞抗原处理机制；其次，抗原处理和呈递，其中与MHC分子结合的抗原肽被产生以呈递给适应性免疫细胞。细胞外抗原通过吞噬作用、巨噬细胞吞噬作用和受体介导的内吞作用被APCs捕获。在内质网或溶酶体的酸性环境中，抗原被降解成许多含有T细胞表位的免疫原性肽。摄取抗原后，MHC类II分子首先在内质网中合成，然后通过高尔基体运输，与抗原肽结合形成肽-MHC II复合物，然后这些复合物被呈递到APCs表面。TCRs可以识别肽-MHC-II复合物以激活T细胞以启动免疫反应。抗原呈递的质量取决于肽-MHC复合物的亲和力，肽-MHC复合物稳定性与免疫反应之间存在直接关系。APCs与CD4+ T细胞的结合能力通过DC-T细胞测定来确定。 治疗性生物制剂的免疫反应可以显著影响治疗性生物制剂的效力和患者安全性。第一代治疗性单克隆抗体是小鼠来源的，基于这些抗体的药物在患者中引起高度不良的免疫反应，因为抗体；这些免疫原性反应在人源化单克隆抗体中大部分被抑制，但仍有一定的关注。 不良免疫反应导致ADA的产生，导致许多临床相关效应（表7.1），导致过敏性休克、细胞因子释放综合征和交叉反应中和内源性蛋白，这些蛋白介导关键功能。当ADA的存在得到确认后，除了滴度和分析抗体的中和能力外，进一步的特征化可能是有用的，例如，急性超敏反应的免疫球蛋白类别。也可以对临床重要的ADA进行进一步分型，或确定ADA的“阈值”水平，超过这个水平对药物效力和安全性有显著影响。 从根本上说，鉴于目前许多治疗性生物制剂正在开发中，关于免疫原性的最重要因素是它是PK的协变量；当针对治疗性生物制剂发生免疫原性时，它会增加药物从体内的清除并减少对治疗性药物的暴露。患者相关和产品相关因素可能会影响治疗性生物制剂的免疫原性。这些因素是免疫原性风险评估（表7.2）的关键元素，并需要在免疫原性测试协议中考虑。 7.免疫原性调查 应在目标人群中调查免疫原性，因为动物测试和体外模型并不总能预测人类的免疫反应。在生产变更后证明产品可比性以及在产品获批后生产过程变更的情况下，免疫原性发挥着重要作用。然而，该协议不适用于开发过程中对拟议的生物仿制药产品进行测试。即使是微小的差异也可能影响生物活性、效力或安全性，包括拟议生物仿制药的免疫原性。 评估治疗性生物制剂中的物理化学或配方属性，如杂质、异质性、聚集体形成、氧化和脱酰胺作用，可以指导免疫原性的预测和开发免疫原性较低的治疗剂。此外，预测治疗性生物制剂中潜在的免疫原性表位是提高药物安全性和效力的重要且有效的策略。在治疗性生物制剂开发过程中，有多种临床前免疫原性评估策略可用，如表7.3所示。 7.1.测定 生物仿制药开发商应在临床免疫原性评估中评估以下与抗体相关的参数： 滴度、特异性、相关亚型分布、药物开发的时间进程、持续性、消失、对PK的影响以及与临床后遗症的关联。 产品活性中和：对所有相关功能（例如，摄取和催化活性、酶替代治疗的中和）的中和能力。 开发商应在启动任何临床免疫原性评估之前与监管机构协商测定的充分性。 开发商应开发能够灵敏检测免疫反应的测定方法，即使在循环药物产品（拟议的生物仿制药产品和参考产品）中也是如此。应尽可能使用相同的测定方法和相同的患者血清来评估拟议的生物仿制药产品和参考产品。建议在生物仿制药开发的早期阶段开发和验证免疫原性测定，并应对拟议的生物仿制药产品和参考产品进行验证。 建议采用多层次测试方法，包括开发和验证筛选测定、确认测定、滴定测定和中和测定。筛选测定，也称为结合抗体测定，用于检测与治疗蛋白产品结合的抗体。确认测定建立ADA对治疗蛋白的特异性。滴定测定描述ADA反应的强度。中和测定评估ADA的中和活性。在测定中设定适当的截止点对于最小化假阴性结果的风险至关重要。 应同时开发独立ADA结合测定，包括拟议的生物仿制药产品或参考产品作为捕获配体。每个测定都应经过验证，并已证明能够在药物存在的情况下灵敏检测ADA。应使用两种测定方法测试两种治疗组的样本，以证明ADA对拟议的生物仿制药产品和参考产品的交叉反应性。偏离这种方法应有科学依据。 7.2.灵敏度 建议筛选和确认IgG和IgM ADA测定至少达到100 ng/mL的灵敏度，根据生物仿制药的风险和先前知识，灵敏度限制超过100 ng/mL可能是可接受的。 7.3.特异性 测定特异性的缺乏可能导致假阳性结果；在证明单克隆抗体、Fc融合蛋白和Ig融合蛋白的抗体反应特异性方面存在挑战，并就如何管理这些挑战提供指导。 7.4.选择性 测定结果可能会受到基质或船上治疗蛋白产品的干扰。未能建立测定选择性可能导致非特异性信号，掩盖阳性结果。 7.5.精确度 结果应在测定运行内部和之间可重复；测定精确度对于ADA评估至关重要，因为测定变异性是确定截止点和确保弱阳性样本被检测为阳性的基础。 7.6.可重复性 如果多个实验室在研究中运行一个测定，开发商应建立数据可比性，包括测定灵敏度、药物耐受性和测定精确度。 7.7.稳健性和样本稳定性 生物测定的复杂性使它们容易受到测定条件变化的影响。因此，评估和优化参数（如细胞通道数、孵育时间和培养基成分）至关重要。此外，需要制定短长期稳定性管理计划，以保持抗体反应性。 7.8.格式 开发商应考虑每种类型的测定格式的优缺点，包括通量、灵敏度、选择性、动态范围、检测各种Ig亚型的能力、检测快速解离抗体的能力以及试剂的可用性。应考虑洗涤次数和强度，这可能会影响测定灵敏度和表位暴露。 7.9.试剂 如果阳性对照抗体、阴性对照和系统适用性对照是专门为测定生成的，那么开发商应确保关键试剂的一致性测定性能。 7.10.报告结果 应评估测定方法的适当性，最常见的是定性测定。表7.4展示了常见的筛选测定，表7.5展示了抗体测试的测定方法。 7.11.生命周期管理 在没有观察到临床后遗症的情况下，拟议的生物仿制药产品和参考产品之间的免疫反应差异可能会引起关注。这样的测定可能需要进一步评估（例如，延长随访评估期）。随访评估的持续时间应基于以下因素决定：(1)免疫反应生成的时间进程（如中和抗体、细胞介导的免疫反应的发展）和预期的临床后遗症（由参考产品的经验提供信息），(2)免疫反应消失的时间进程和治疗停止后预期的临床后遗症，以及(3)产品的管理时间。例如，对于长期给药的剂，建议随访期为1年，除非可以根据支持生物相似性的证据总体科学地证明更短的持续期。 然后开发商应获得生命周期管理报告，随着产品经历各个阶段，报告应包括以下部分： 免疫原性风险评估：该评估应针对治疗蛋白，并包括产品质量和主观因素的信息。 分层生物分析策略和测定验证摘要：开发商应总结每个临床开发阶段的评估策略。 临床研究设计和详细的免疫原性采样计划：开发商应包括所有进行评估的临床研究的采样计划。 临床免疫原性数据分析：开发商应包括所有具有免疫原性组成部分的临床研究的免疫原性分析摘要。 结论、风险评估和缓解策略：开发商应讨论免疫原性如何影响患者群体的蛋白质产品的安全性和效力，包括产品如何在上市后阶段进行监测。 7.12.免疫原性测试方法 在没有质量水平相关性以及对临床效力（效力降低或丧失）和安全性没有负面影响的情况下，免疫原性的微小差异可能是可以接受的。评估观察到的免疫原性差异的临床影响可能具有挑战性，因为样本量和随访时间有限。如果观察到的差异的临床影响不确定，例如，由于潜在严重不良反应的罕见性或免疫反应的缓慢发展，则可能需要通过上市后监测或特定风险管理策略更新风险管理计划。 免疫原性研究旨在检测和表征对产品的免疫反应，并调查ADA与PK和PD以及效力和安全性的相关性。因此，应将免疫原性评估包括在关键临床研究的计划中，包括同步采样ADA和相关生物标记物（如果有的话），评估生物仿制药的效力和安全性。 7.12.1.人群 选择适合比较免疫原性的人群很重要。在选择适当人群时，应考虑免疫能力、免疫抑制治疗的先前或同时使用以及参考产品免疫原性的历史数据等因素。由于免疫原性测试通常是作为关键的比较安全性和效力研究的一部分进行的，因此在设计程序的临床部分以证明生物相似性时，必须考虑上述因素。 如果需要，应根据观察到的差异、给药途径、剂量-反应曲线、治疗窗口和潜在的临床影响来证明免疫原性研究的类型。效力、安全性和免疫原性测试的目标人群需要对免疫原性及其后果敏感，并代表产品指示的人群。在高风险情况下，应在批准后的基础上分析样本。 在几种情况下，如果药物治疗（先前或同时）可以抑制免疫反应，则健康人群将是首选；一个很好的例子是，优先在健康人群中评估非格司亭产品。 7.12.2.并行评估 比较免疫原性研究旨在排除拟议的生物仿制药产品和参考产品之间在免疫原性方面的临床意义差异。能够影响生物仿制药安全性和效力的抗体存在是非常令人关注的；例如，通过改变PK、诱发过敏性休克或中和产品及其内源性蛋白对应物，可以克服这个问题。对于每个治疗组，比较研究应描述ADA反应的发生率和强度、ADA发展的进程、ADA持续性以及ADA对生物仿制药安全性、效力和PK的影响。 在拟议的生物仿制药产品开发过程中需要进行并行比较免疫原性研究。如果初始的物理化学和体外测试表明差异，则更有可能检测到免疫原性差异，特别是在分子已知具有高度免疫原性的情况下。 免疫原性测试应与PK、安全性和效力测试相结合。在确认性结合测定中测试阳性的结合ADA患者样本也应测试其中和药物的能力，除非有不这样做的强有力的理由。选择适当的中和抗体测试格式至关重要，应考虑药物的作用机制。根据作用机制，竞争性配体结合测定或基于细胞的测定可能是适当的。 7.12.3.终点 选择与治疗蛋白产品免疫反应相关的临床免疫原性终点或PD措施（例如，抗体形成和细胞因子水平）时，应考虑参考产品报告的免疫原性问题。开发商应预先定义临床免疫反应标准（例如，显着临床事件的定义，如过敏性休克），在可能的情况下使用既定标准，并在研究开始前就这些标准与监管机构达成一致。 7.12.4.采样计划 采样频率以及分析的时机和程度将取决于特定药物的风险评估。采样计划应设计得能够区分暂时阳性的患者和已发展为持续抗体反应的患者。治疗后的采样期应足够长，以便对治疗蛋白触发的免疫反应的持续性得出结论，并发现被治疗蛋白本身抑制的免疫反应。治疗后样本收集的时机由蛋白质的半衰期和ADA测定的药物耐受性决定。在治疗的早期阶段需要更频繁的采样，此时患者通常处于ADA发展的最高风险。长期免疫原性的跟踪采用较少频率的采样，可以提供有关免疫原性的发生率和后果的额外信息。在持续长期治疗的情况下，通常应在授权前期间提供1年治疗的免疫原性数据，但如有适当的科学理由，可以进行较短的跟踪。 应系统地按计划对患者进行免疫原性测试，包括重复采样、症状驱动的方式，并在怀疑发生不希望的免疫反应时收集额外的样本。几种与产品相关的因素将影响对治疗蛋白的免疫反应的发展。因此，检测免疫反应的采样计划应适应并分别适用于每个产品，考虑其PK（例如，消除半衰期）和ADA测定的药物耐受性。始终应收集基线样本。 开发商在描述ADA反应的动力学和潜在免疫介导的不良效应时应使用普遍接受的术语，考虑可比产品的经验以及相关的监管和科学出版物。在治疗期间，应在给药前收集样本，因为样本中活性物质的残留水平可能干扰测定。 如果产品可以通过不同途径给药，则开发商应在上市许可申请中证明其对每种给药途径的免疫原性评估方法的合理性。 7.12.5.依赖于药代动力学 ADA可以影响PK，特别是消除阶段。非中和性“结合”抗体有时可能会调节而不是仅仅减少产品的效力，例如，通过延长半衰期。PK的变化可能是抗体形成的早期迹象。因此，鼓励开发商在所有重复剂量研究中同时进行PK和免疫原性采样。 7.13.安全性和效力关系 应根据免疫原性风险评估考虑间歇治疗相关的免疫原性，例如，来自其他类似产品的经验，潜在免疫原性的风险，增强效应，以及接触生物仿制药后抗体的持续性或出现。 ADA的存在可能或可能没有临床后果。因此，临床开发应基于潜在风险的分析以及检测和减轻这些风险的可能性。免疫介导的不良效应分析计划应基于风险分析，包括产品（类别）的先前经验，蛋白质中可能的免疫原性结构和患者群体类型。预先存在的ADA患者可能表现出不同的效力和安全性概况，应在可行时作为亚组进行分析。分析计划应定义与急性或延迟超敏性、自身免疫和效力丧失相关的症候群。潜在的免疫不良效应应在风险管理计划中得到解决。 7.13.1.免疫原性测试的管理 尽管开发商努力选择免疫原性潜力低的化合物，但对治疗蛋白的有害免疫反应并不总是可以避免的。在这种情况下，开发商应尽可能探索减少临床开发中观察到的免疫原性不良影响的可能性。在某些情况下，免疫抑制或抗炎共用药可能显著预防或减少不良免疫效应。在某些情况下，如凝血因子所观察到的，可能可以通过耐受化方案重新建立免疫耐受，例如，通过给予较大剂量的治疗蛋白。临床研究应记录这样的治疗方案。 7.14.示例研究 附录3提供了一些从EMA和FDA获得生物仿制药批准的研究协议的详细信息。 7.14.1.英夫利昔单抗 虽然主要效力分析表明，在第30周时，拟议的生物仿制药（Flixabi）和参考产品的等效ACR20反应率相同，但在个别测定时间点，拟议的生物仿制药队列中通过高灵敏度测定测量的ADA率大约高出5%-12%（在试验的任何时间点，拟议的生物仿制药队列中近50%的患者ADA阳性）。然而，由于主要终点在预定的可比性范围内，因此未观察到对任何分析的效力参数有任何有意义的影响。 7.14.2.依那西普 虽然产品（Benepali）通过了所有生物相似性测试，但在第24周观察到整体ADA形成有显著差异。ADA差异的临床效应似乎可以忽略不计，并且在治疗8周后差异大部分消失。PK研究通常比临床试验更敏感，能够检测潜在的产品相关差异，这可能解释了为何类似的效力发现不能推翻PK的差异。这可能被视为过于严格。然而，效力试验的结果不仅取决于药物暴露，还取决于生物物质在体内的有效药理作用。因此，这两种类型的研究目标是不同的。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。