PHD2

慢病毒是以HIV-1为基础改造而来的一种病毒载体。在数十年的应用中，慢病毒载体的生物安全性和有效性不断被提升，目前已经成为体内外生物实验中一种功能非常强大的基因递送工具。 在基因递送方面，慢病毒载体拥有诸多独特的优势：稳定持久表达、可感染多种类型细胞、可携带大片段基因、免疫原性比较低等。无论是基础科研还是临床应用，慢病毒载体都具有非常广泛的应用前景。 慢病毒的应用场景 目前慢病毒载体主要应用在以下几个方面： 细胞基因治疗（截止目前，已上市的CAR-T产品有9款采用了慢病毒载体递送CAR基因） 基因表达调控（过表达、RNA干扰研究等） 基因编辑（CRlSPR/Cas9 gRNA文库筛选、基因敲除、敲入、点突变、基因激活/抑制） 稳转细胞株构建 活体细胞成像追踪 转基因动物 图1 慢病毒载体的主要应用方向 应用案例 案例1：用慢病毒载体进行基因过表达，构建稳转细胞株，研究葡萄糖激酶在前列腺癌（PCa）中的作用1 细胞代谢在肿瘤进展中起着关键作用，靶向癌症代谢可能有效地杀死癌细胞。本文旨在研究葡萄糖激酶在前列腺癌中的作用，并确定PCa治疗的关键靶点。 实验设计和主要研究结果： 癌症基因组图谱（TCGA）数据库和在线工具评估结果显示ADP依赖型葡萄糖激酶（ADPGK）是唯一一种在前列腺腺癌（PRAD）中上调并预测较差总生存（OS）的葡萄糖激酶。临床样本分析显示，与非PCa组织相比，ADPGK在PCa组织中显著上调。 ADPGK过表达促进了PCa细胞的增殖和迁移，而敲低ADPGK则抑制了恶性表型。 代谢组学、蛋白质组学以及ECAR和OCR测试揭示了ADPGK显著加速了PCa的糖酵解。 ADPGK与丙酮酸激酶C（ALDOC）结合，通过AMP激活蛋白激酶（AMPK）磷酸化促进糖酵解。 图2 用于ADPGK过表达的慢病毒结构示意图及ADPGK过表达结果。 案例2：用慢病毒载体递送RNA干扰工具，研究脯氨酸羟化酶结构域蛋白在调节心肌细胞钙水平中的功能2 由于高氧消耗，心肌细胞对环境中的氧气极为敏感。脯氨酸羟化酶结构域蛋白2（PHD2）是一种氧气传感器，对细胞缺氧适应性至关重要。近年来的研究发现，PHD抑制剂（PHIs）和针对PHD2的小干扰RNA（PHD2shRNA）可以在不影响细胞能量水平的情况下激活AMPK，将细胞缺氧信号转化为能量代谢信号，使细胞产生能量保护反应，并显著提高细胞对缺氧的抵抗力。研究还发现，信号分子钙（Ca2+）在响应缺氧的AMPK信号通路激活中发挥着重要作用。然而，PHD活性如何增加细胞内Ca2+水平并激活AMPK信号通路的分子机制仍然不清楚。 实验设计和主要研究结果： 确认PHIs 诱导心肌细胞中的钙释放。 PHD2 在心肌细胞中激活肌浆网通道辅助蛋白 CaMKⅡ。用shRNA干扰技术敲低心肌细胞中PHD2，Western blot证实了PHD2的沉默。与对照细胞相比，沉默PHD2显著增加了CaMKⅡ的磷酸化。 Ca2+ 在心肌细胞中介导 PHI 刺激引起的 AMPK 激活。肌浆网通道抑制剂瑞安诺丁显著降低了PHI处理诱导的与Ca2+相关的荧光强度。慢病毒介导的RyR2特异性shRNA显著降低了RyR2在mRNA水平上的表达。此外， IP3R阻断剂2-APB预处理或慢病毒介导的IP3R特异性shRNA均未显著影响PHI处理诱导的P-AMPK水平。2-APB预处理对PHI诱导的Ca2+荧光也无显著影响。这些结果表明，PHI诱导的钙释放和AMPK激活主要由肌浆网通道而非IP3R通道调节。 CaMKⅡ介导PHI诱导的钙释放和AMPK激活。PKA不参与PHI/Ca2+/AMPK信号通路，而CaMKⅡ在PHI/Ca2+/AMPK信号通路中发挥着重要作用。 TRPA1介导PHI/Ca2+/AMPK信号通路的激活。TRPA1抑制剂HC030031预处理显著抑制了PHI诱导的P-AMPK和P-CaMKⅡ增加，并显著减少了PHI诱导的Ca2+荧光。PHD2 shRNA组中TRPA1蛋白水平显著高于对照组。这些结果强烈表明TRPA1在PHD诱导的Ca2+释放途径中发挥着至关重要的作用。 图3 慢病毒介导的特异性shRNA对 PHD2、RyR2和IP3R的敲低效果。 案例3：用慢病毒介导的基因编辑技术研究穿透内耳血迷路屏障（BLB）的靶点3 内耳疾病是一种导致全球超过 15 亿人听力丧失的疾病。然而，内耳毛细血管表面存在血迷路屏障（BLB），由于渗透性低，限制了大多数药物化合物从血流进入内耳组织，极大地阻碍了全身药物预防和干预的有效性。本研究报告了一种在 BLB 上表达的新型受体低密度脂蛋白受体相关蛋白 1 (LRP1)，它可以作为穿梭治疗药物跨越这一屏障的潜在靶标。 实验设计和主要研究结果： LRP1在小鼠和猪的耳蜗细胞中广泛表达，尤其在BLB区域和目标细胞中。 通过靶向LRP1的配体肽IETP2，可以将不同的小分子如荧光染料、抗氧化药物和MRI造影剂等传递到内耳。这表明LRP1可能是一个有效的靶点，用于开发非侵入性和针对性的药物递送策略，以提高内耳疾病的治疗效果。 LRP1在细胞内吞作用中也起着关键作用。研究表明，IETP2肽与LRP1结合后可以被LRP1阳性细胞内化，并且这种内吞作用依赖于LRP1的表达。通过使用CRISPR/Cas9技术敲低LRP1基因，进一步证实了LRP1在IETP2内吞中的关键作用。 这些发现为开发新的治疗策略提供了重要的基础，可能有助于未来内耳疾病的诊断和治疗。通过利用LRP1的介导作用，研究人员可以探索将治疗药物更有效地传递到内耳，从而提高治疗效果并减少副作用。 图4 用于敲低LRP1的慢病毒载体结构和sgRNA。 图5 LRP1的敲低效果。 派真生物有幸为以上三项研究提供慢病毒。 案例4：慢病毒递送高灵敏度的报告基因Akaluc用于追踪胶质瘤的体内生长、侵袭和转移过程4 使用非侵入性生物发光成像（BLI）对肿瘤生长进行纵向追踪是研究体内癌症模型的关键方法。Akaluciferase（Akaluc）是一种新的BLI系统，其信号强度高于标准的萤火虫荧光素酶（Fluc）。本文设计了一种慢病毒载体，用于在胶质瘤细胞系中表达Akaluc，追踪胶质瘤的体内扩张过程。 实验设计和主要研究结果： Akaluc和Fluc报告基因的设计和灵敏度比较。用表达Venus-Akaluc或Venus-Fluc融合蛋白的慢病毒载体转导人GBM细胞系U87MG和小鼠高级别胶质瘤细胞系GL261，结果显示病毒载体转导对胶质瘤细胞的增殖率没有显著影响，表达Akaluc的细胞比表达Fluc的细胞的BLI信号强大约10倍。  颅内移植表达Akaluc的胶质瘤细胞产生超过Fluc 100倍的BLI信号。将GL261-Venus-Akaluc和GL261-MSCV-Fluc胶质瘤细胞颅内植入到同系的C57BL/6小鼠中，在所有时间点，Venus-Akaluc组的BLI信号显著高于GL261-Fluc组。 Akaluc BLI系统可以追踪更少数量的移植胶质瘤细胞，从而有助于更准确地模拟肿瘤发生和早期肿瘤生长。 Akaluc BLI系统可用于在体内对胶质瘤治疗反应进行纵向追踪。 总之，Akaluc BLI提供了一种敏感的方法用于体内追踪胶质瘤生长、侵袭和转移，特别适用于对较小的肿瘤进行成像以及监测治疗后的肿瘤复发。 图6 用于递送Akaluc BLI系统的慢病毒载体结构示意图以及Akaluc BLI系统体内示踪效果。 派真生物可提供表达Akaluc的慢病毒。 参考资料： https://doi.org/10.1186/s40779-023-00500-9 https://doi.org/10.1016/j.yexcr.2021.112777 https://www.nature.com/articles/s41392-022-00995-z https://doi.org/10.1007/s00259-021-05439-4 关于派真生物

引言Von Hippel-Lindau（VHL）蛋白在明确细胞肾细胞癌（ccRCC）中经常发生突变，是氧化应激中涉及的缺氧诱导因子（HIF）的主要调节因子。然而，VHL是否具有HIF-独立的抑制肿瘤活性仍然不太清楚。2024年2月15日，浙江大学许大千、吕志民及哈尔滨医科大学雷博共同通讯在EMBO Journal 在线发表题为“VHL suppresses autophagy and tumor growth through PHD1-dependent Beclin1 hydroxylation”的研究论文，该研究证明VHL抑制营养应激诱导的自噬，其在散发性ccRCC标本中的缺失与自噬水平显著升高，并与患者预后较差相关。在机制上，VHL直接结合自噬调节因子Beclin1，其在Pro54上的PHD1介导的羟基化之后。这种结合抑制Beclin1-VPS34复合物与ATG14L的结合，从而抑制了营养缺乏时的自噬起始。非羟基化的Beclin1 P54A的表达使VHL介导的自噬抑制失效，并显著减少了VHL的肿瘤抑制效应。此外，Beclin1 P54-OH水平与野生型VHL表达的人ccRCC标本中的自噬水平呈负相关，并与患者预后不良相关。此外，将VHL缺失的小鼠肿瘤与自噬抑制剂和HIF2α抑制剂联合治疗能够抑制肿瘤生长。这些发现揭示了VHL抑制肿瘤生长的一个意想不到的机制，并暗示了通过联合抑制自噬和HIF2α治疗ccRCC的潜在方法。Von Hippel-Lindau（VHL）肿瘤抑制基因的体细胞突变在散发性肾细胞癌（RCC）中普遍存在，其中明确细胞肾细胞癌（ccRCC）是最常见的亚型。VHL蛋白（VHL）作为一个伏林支架蛋白（CUL2）-环泛素连接酶复合物的底物识别模块，结合到缺氧诱导因子（HIF）1/2α上。这种结合依赖于HIF1/2α中两个保守脯氨酸残基的水化，由脯氨酸羟化酶酶（PHD1，又称EGLN2）、PHD2（EGLN1）和PHD3（EGLN3）催化，这些酶需要氧气作为辅基质。因此，PHD介导的HIF1/2α水化导致VHL介导的HIF1/2α泛素化和在正常氧化条件下降解，但在低氧条件下，PHD的活性被低氧水平抑制，导致增强的HIF1/2α表达诱导下游基因表达。VHL患者肾脏中出现的VHL缺陷病变显示出HIF和HIF靶基因的增加，小鼠VHL–/– ccRCC异种移植实验显示HIF2α促进肿瘤的作用，而HIF1α限制肿瘤的作用。然而，一些VHL–/–ccRCC细胞系不受HIF2α活性操纵的影响，一些VHL突变的ccRCC对HIF2α抑制剂治疗具有抵抗性，这表明VHL缺陷通过尚未确定的和与HIF2α无关的机制促进肿瘤发展。模式图（Credit: EMBO Journal）自噬在癌细胞中经常失调，并在肿瘤发生中起着关键作用。癌细胞可以具有高水平的基础自噬，通过利用自噬分解产物，如氨基酸、核苷酸、碳水化合物和脂肪酸，进行生物合成和能量生成，来增加自噬，从而生存于微环境应激，并增加生长和侵袭性。在自噬启动期间，自噬体核形成需要一个复合物，在这个复合物中，哺乳动物Beclin1（酵母中的APG6）招募III型磷脂酰肌醇3激酶VPS34来生成磷脂酰肌醇3磷酸（PI（3）P），以便结合具有PI（3）P结合结构域的蛋白质，从而调节细胞内的内部运输和自噬体形成。与VPS34形成复合物的ATG14L与Beclin1相互作用，并将VPS34以及其膜锚VPS15靶向到前自噬体结构，并促进自噬体-内吞体融合。除了通过含有ATG14L的Beclin1/VPS34调节自噬外，Beclin1/VPS34还形成与UV辐射抵抗相关基因（UVRAG）的不同复合物，以调节内吞运输。AMP激活的蛋白激酶（AMPK）、雷帕霉素抑制的机械靶向拉帕霉素样激酶-1（ULK1）、磷酸甘油酸激酶-1（PGK1）和Bcl-2依赖的调节Beclin1/VPS34/ATG14复合物在自噬活动中发挥重要作用。然而，肿瘤抑制因子是否以肿瘤类型特异的方式直接和差异地调节Beclin1/VPS34/ATG14L复合物活性和自噬仍然未知。该研究证明VHL通过直接与由PHD1水化的Beclin1结合并抑制ATG14与Beclin1/VPS34的结合来抑制ccRCC细胞中营养应激诱导的自噬。Beclin1 P54A敲入表达使VHL介导的自噬抑制失效，并促进肿瘤生长。原文链接https://doi.org/10.1038/s44318-024-00051-2责编|探索君排版|探索君文章来源|“iNature”End往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文Nature | 破除传统：为何我们需要重新思考肿瘤的命名方式热文Nature | 2024年值得关注的七项技术热文Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文Nature | 癌症与神经系统的致命舞蹈

▎药明康德内容团队编辑根据中国国家药监局药品审评中心（CDE）官网，在刚刚结束的1月，有60余款1类新药首次在中国获得临床试验默示许可。按照新注册分类，“1类新药”是指尚未在全球任何国家和地区获批上市的药物，这类新药往往代表了药物研发领域的前沿方向。本文中就让我们来看看1月份获批临床的1类新药都有哪些？又有望惠及哪些患者？（扫描下方二维码，即可获得“2024年1月首次在中国获得临床试验默示许可的1类新药”PDF文件）从药物类别来看，在获批临床的64款1类新药中，有58 %（37款）为化药，42%（27款）为生物药。它们拟开发的适应症涵盖了肿瘤、炎症性疾病、心血管疾病、代谢性疾病、疼痛等多种疾病。其中，抗肿瘤新药数量占比最多，有近50%，主要针对实体瘤（多为晚期），涉及肝癌、非小细胞肺癌、转移性去势抵抗性前列腺癌、晚期不可切除或转移性微卫星高度不稳定型或错配修复缺陷型实体瘤等；少数针对血液瘤（5%），涉及多发性骨髓瘤、髓系白血病等。数据来源：CDE网站，医药观澜制图从药物类型来看，这些1类新药涵盖了新药开发的多种形式，包括小分子靶向疗法、抗体药物、各种偶联药物（XDC）、细胞和基因疗法（CGT）等等。其中，小分子靶向疗法、抗体药物、CGT相关新药数量较多。在小分子靶向疗法中，除了少数激动剂外，绝大多数新药为抑制剂。这些抑制剂针对的靶点包括TYK2、PHD2、KRAS G12C、Nav1.8、CYP11A1等等。其中，有多款新药靶向“合成致死”新靶点，例如先声药业的USP1小分子抑制剂SIM0501、勤浩医药的KIF18A抑制剂GH2616、阿斯利康（AstraZeneca）的靶向MTA和PRMT5复合物的新一代PRMT5抑制剂AZD3470、诺华（Novartis）的潜在“first-in-class”WRN抑制剂HRO761等等。在CGT领域：来自康霖生物、本导基因、中吉智药的几款自体干细胞药物获批临床，拟用于输血依赖型β-地中海贫血；百吉生物的TCR-T疗法BRL03、普众发现的UCAR-T疗法AMT-116、 华夏英泰的STAR-T疗法YTS104和美杰赛尔的PD-1基因编辑T细胞注射液等多款T细胞疗法新药也获批临床，拟用于治疗实体瘤和血液瘤；此外，还有几款AAV基因治疗药物获批临床拟治疗罕见病，如凌意生物的LY-M001注射液拟用于治疗I型或III型戈谢病、至善唯新的ZS805注射液拟用于治疗法布雷病。图片来源：123RF1月也有多款抗体类药物获批临床，拟用于治疗不同类型的适应症。例如，博锐生物与恩沐生物联合开发的创新三特异性抗体BR115、神州细胞CD38单抗SCTC21C、百时美施贵宝的BCMA和CD3双特异性抗体alnuctamab等获批临床，拟用于治疗各种血液瘤和实体瘤；舒泰神的抗 NGF全人源 IgG1 单抗STSA-1001获批临床，拟用于治疗癌痛；赛诺菲的潜在“first-in-class”单抗amlitelimab获批临床，拟用于治疗成年中重度特应性皮炎；神州细胞重组抗 IL-17 单抗SCT650C获批临床，拟用于治疗中至重度斑块状银屑病。此外，还有多款XDC获批临床，包括第一三共/默沙东合作开发的CDH6靶向ADC药物DS-6000a、爱科瑞思的5T4靶向ADC药物ACR246、惠永制药的GRP78靶向PDC药物LN005、星联肽的Nectin-4靶向PDC药物SC-101等。除了上述提到的产品类型，还有许多其它1类新药也于1月获批进入临床，或者获批开展针对新适应症的临床试验。限于篇幅，本文不再一一介绍。希望这些新药后续临床研究顺利进行，早日造福患者！如果您想了解更多内容，请扫描下方二维码，获取2024年1月首次在中国获得临床试验默示许可的1类新药的PDF文件。参考资料：[1]中国国家药监局药品审评中心（CDE）官网.Retrieved Jan 31，2024, from https://www.cde.org.cn/main/xxgk/listpage/4b5255eb0a84820cef4ca3e8b6bbe20c[2]各公司官网及新闻稿本文来自药明康德内容团队，欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。转载授权请在「医药观澜」微信公众号留言联系我们。其他合作需求，请联系wuxi_media@wuxiapptec.com。免责声明：药明康德内容团队专注介绍全球生物医药健康研究进展。本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表药明康德立场，亦不代表药明康德支持或反对文中观点。本文也不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。