PHB2

【导读】肿瘤细胞具有高度异质性，在同一或不同基因座上，常常存在异常长非编码RNA（long noncoding RNAs, lncRNAs）和异常编码基因协同调控肿瘤发生的现象【1-2】。然而，许多关键的lncRNA和编码基因源自不同的基因座，通过独特的协同作用和机制，导致肿瘤发生发展【3】。因此，探索这些来自同一或不同基因座的lncRNA和编码基因如何协同调控恶性肿瘤发生发展，具有重要科学意义和潜在临床价值。 最新研究表明，这些异常lncRNA和编码基因受到从一维至三维层面上遗传和表观遗传因素的复杂转录调控。真核基因组在进化上高度保守，但其空间构象展现出细胞特异性和高度可塑性【4】。在这一背景下，染色质通过缠绕与折叠，形成了独特的三维基因组，其中基因座位点的开放或闭合状态直接关联着转录的活跃或沉默，从而为调控因子的精准结合创造了理想条件。然而，这种多层次调控的精确协同机制仍不完全清楚。 2024年9月27日，同济大学生命科学与技术学院张赫团队在 Nature Communications 上发表了题为“Prohibitin 2 orchestrates transcription of long noncoding RNA and coding gene to accelerate tumorigenesis”的最新研究论文，首次发现Prohibitin-2（PHB2）作为穿梭因子，调控了CANT2 lncRNA和编码基因CCBE1的异常协同转录，加速恶性黑色素瘤的发生发展，阐明了肿瘤表观遗传调控新模式。 首先，该研究对黑色素瘤细胞进行ATAC-seq和RNA-seq分析，发现chr6p22.3位点处于开放染色质状态，并由此转录出一个新转录本，进一步分析转录本的编码能力和亚细胞定位后，明确其为核内lncRNA，并将其命名为CANT2。该研究发现黑色素瘤细胞中CANT2 lncRNA的启动子染色质可及性程度高，这为PHB2创造了理想结合环境，PHB2随后招募组蛋白甲基转移酶MLL2到CANT2启动子，增加H3K4三甲基化水平，激活致癌lncRNA CANT2的转录激活，显著促进肿瘤生长和转移。 该研究接下来对CANT2 lncRNA敲除后的差异表达基因进行筛选，并结合分析ChIRP-MS数据，发现PHB2进一步与激活的CANT2转录本结合，定位到抑癌基因CCBE1的启动子区域。在此过程中，PHB2招募组蛋白去乙酰化酶HDAC1，降低CCBE1启动子区域的H3K27乙酰化水平，抑制CCBE1转录，显著促进黑色素瘤发生发展。 当敲降PHB2后，PHB2与CANT2 lncRNA和编码基因CCBE1启动子的结合水平分别下降，两种组蛋白修饰因子MLL2和HDAC1结合也同步下降，显著改变CANT2和CCBE1启动子区组蛋白修饰水平，使CANT2和CCBE1的转录水平同时变化。此外，通过构建靶向CCBE1启动子的enChIP体系，该研究发现PHB2与CANT2均通过与CCBE1启动子直接结合来发挥作用。这些数据表明PHB2是新发现的具有协同调控lncRNA-基因转录的关键穿梭因子，为肿瘤潜在治疗提供了新的靶点选择。 综上所述，该研究揭示了穿梭因子PHB2协同调控lncRNA和编码基因的新机制，为肿瘤发病机理提供了有趣的“一石二鸟”模型，同时PHB2这一特性也为未来发现更多类似疾病调控穿梭因子，并针对这类穿梭因子设计靶向药物提供了新路径。 作为同济大学对口支援井冈山大学的联合学术成果，这是井冈山大学历史上首次以共同通讯单位在Nature系列子刊发表研究论文。同济大学 丁天宜 博士、博士研究生 徐浩文 和 张晓宇 博士是该文的共同第一作者，同济大学 张赫 教授为该文唯一通讯作者。同时，该工作还获得了同济大学生命科学与技术学院、同济大学附属东方医院、器官发育与表观遗传江西省重点实验室、井冈山大学附属医院临床医学研究中心、井冈山大学医学部和生命科学学院的大力支持，受到了国家重点研发计划、国家自然科学基金委和上海市科委等项目的资助。 论文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-52425-z 参考文献： 1. White NM, Maher CA. The potential use of lncRNAs found in the 8q24 region as biomarkers for colon cancer. Ann Oncol 28, 1688-1689 (2017). 2. Ahmadiyeh N, et al. 8q24 prostate, breast, and colon cancer risk loci show tissue-specific long-range interaction with MYC. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 9742-9746 (2010). 3. Du M, et al. Remote modulation of lncRNA GCLET by risk variant at 16p13 underlying genetic susceptibility to gastric cancer. Sci Adv 6, eaay5525 (2020). 4. Finn EH, Misteli T. Molecular basis and biological function of variability in spatial genome organization. Science 365, (2019). 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门推荐活动 点击免费报名 🕓 上海｜11月15日-16日 ▶ 2024第一届中国类器官转化医学大会 点击对应文字 查看详情

血管平滑肌细胞(VSMCs)表现出高度的可塑性，在各种病理刺激下发生表型转变，如促炎细胞因子和机械拉伸等。 血管平滑肌细胞(VSMCs)表现出高度的可塑性，在各种病理刺激下发生表型转变，如促炎细胞因子和机械拉伸等。有证据表明，VSMC表型转换是动脉粥样硬化、损伤后再狭窄和动脉瘤等多种心血管疾病发病机制中的早期和关键步骤。 相反，目前我们对维持VSMC收缩表型的关键因素知之甚少。了解其潜在的机制对于维持血管内环境的稳定和预防心血管疾病至关重要。 图片来源：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36200440/ 近日，来自北京大学基础医学院的研究者们在Circulation Research杂志上发表了题为“PHB2 Maintains the Contractile Phenotype of VSMCs by Counteracting PKM2 Splicing”的文章，该研究揭示了Prohibitin 2通过与hnRNPA1相互作用，阻断hnRNPA1介导的PKM选择性剪接和葡萄糖代谢重编程，维持VSMC的收缩表型。 血管平滑肌细胞(VSMCs)的表型转化是多种血管疾病早期发病的重要原因。最近的研究表明，代谢重编程可能参与了VSMC的表型转变。然而，将能量代谢与不同的VSMC表型联系起来的确切分子仍然难以捉摸。 本研究采用颈动脉损伤模型，研究损伤后新生内膜的形成以及VSMC的表型转化。通过RNA-seq分析、细胞迁移实验、胶原凝胶收缩实验、丝状肌图分析、免疫印迹分析、蛋白质相互作用组分析、免疫共沉淀和哺乳动物双杂交实验来阐明其表型和分子机制。 通过基因本体论注释收集细胞能量调节基因，并对转化生长因子-β或血小板衍化生长因子BB刺激的VSMC进行RNASeq分析。6个候选基因与能量代谢相关基因和转化生长因子-β相互上调、血小板衍生生长因子BB下调的基因相互重叠。其中，Prohibitin 2已被报道对线粒体氧化磷酸化起调控作用。事实上，抑制素2缺失的血管平滑肌细胞失去了收缩表型，这是收缩蛋白减少的证据。 与Phb2Flox/FLOX小鼠相比，Phb2SMCKO小鼠更容易受到损伤后VSMC的增殖和新生内膜的影响。进一步的蛋白质相互作用组分析、免疫共沉淀和哺乳动物2-杂交实验表明，禁止素2通过其C末端直接与hnRNPA1相互作用，hnRNPA1是丙酮酸激酶M1/2(PKM)mRNA剪接的关键调节器，促进PKM2的表达和糖酵解。Prohibitin 2缺乏促进了PKM1/2mRNA的剪接和从PKM1向PKM2的逆转，并促进了VSMC的糖酵解。阻断Prohibitin 2-hnRNPA1的相互作用可增加PKM2的表达，促进糖酵解，抑制VSMCs收缩标志基因的表达，并加重损伤后新生内膜的形成。 血管平滑肌细胞(VSMC)表型测定中的禁止蛋白2示意图 图片来源：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36200440/ 综上所述，本研究揭示了禁止素2是糖酵解的内源性调节剂，维持VSMC的动态平衡。以抑制素2-hnRNPA1-PKM2轴为靶点来调节VSMC的能量代谢可能有助于心血管疾病的治疗。（生物谷 Bioon.com） 参考文献 Yiting Jia et al. PHB2 Maintains the Contractile Phenotype of VSMCs by Counteracting PKM2 Splicing. Circ Res. 2022 Oct 28;131(10):807-824. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.122.321005.

2003年阿达木单抗(Adalimumab，Humira，修乐美)上市后，改写了类风湿关节炎(RA)药物市场，连续十几年销量登顶，创造了一个传奇。而这个传奇药物的诞生离不开“噬菌体展示”技术（phage display technology），这项技术也在2018年获得了诺贝尔化学奖。 1. 噬菌体展示技术的首个杰作阿达木单抗 1.1 什么是噬菌体展示技术？ 噬菌体展示技术要追溯到1985年。Smith首次将编码多肽序列的外源DNA片段插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ中，产生融合蛋白，从而在噬菌体表面展示外源多肽（见图1）。        图1 外源基因在噬菌体表面的展示 1988 年Smith又将合成的随机序列的寡核苷酸片段克隆到丝状噬菌体上，表达后的每个噬菌体粒子表面展示一种肽段，所有这些展示不同肽段的噬菌体构成了噬菌体展示肽库。由于噬菌体表达肽与编码基因直接相关，扩增和克隆后很容易得到DNA序列，由此建立了噬菌体表面展示的随机肽库。 利用与靶标分子的特异性亲和力筛选噬菌体结合物，随着病毒感染宿主细菌的繁殖扩增，模拟自然进化的淘筛过程，就可以快速发现与靶标特异性结合富集的多肽序列，从而正式开创了噬菌体展示技术。本质上，噬菌体展示技术是一种组合生物学技术。 1.2 噬菌体展示技术催生阿达木单抗 1993年英国Cambridge Antibody Technology与美国BAS FBioresearch Corpor -ation的联合研究中心通过噬菌体展示技术，发现了全人源抗肿瘤坏死因子(TNF)单克隆抗体的潜在临床价值。1990年Winter教授通过构建噬菌体展示抗体库，在试管内实现了抗体药物的研究。他们通过不断进行“突变引入”及“自然淘筛”的过程，最终开发了第一个全人源的抗TNF单克隆抗体药物，即阿达木单抗。阿达木单抗的研发成功标志着噬菌体展示技术落实到了医药研发领域，这一艰辛曲折的过程可以用图2来表示。 类风湿关节炎（RA）的当前治疗策略包括非甾体抗炎药(NSAIDs)、皮质类固醇、改善疾病的抗风湿药( DMARDs) 和生物反应修饰剂(生物制剂)。阿达木单抗属于生物制剂类别。在阿达木单抗上市前的相当长一段时间，面对疾病对关节的侵蚀，人类都应对乏力，而阿达木单抗2003年在美国上市后，成为类风湿关节炎的有效阻击手。 目前，噬菌体展示技术利用基因编码手段构建组合文库（library），被广泛应用于抗体、骨架蛋白、多肽等分子的展示，为批量药物构建和筛选以及生产提供了有力的工具平台。 图2 噬菌体展示抗体库的构建及筛选流程（阿达木单抗的target 即是TNF） 2.噬菌体展示技术的流程 2.1 噬菌体展示系统的分类 噬菌体展示系统分为丝状噬菌体展示系统、T7噬菌体展示系统、T4噬菌体与lamda噬菌体展示系统。噬菌体展示内容包括随机肽段、天然肽段、cDNA、抗体、抗体片段等，噬菌体展示技术的筛选方式包括体外筛选和体内筛选。 2.2 噬菌体展示技术筛选scFv抗体的流程 下面以single chainfragment variable (scFv)抗体为例介绍噬菌体展示技术是如何构建噬菌体scFv抗体库，并进行活性筛选获得产量级高亲和性抗体药物的。 在基因工程抗体的研究中，研究者常将抗体片断与 M13 噬菌体尾部的结构蛋白—pⅢ融合表达而展示于噬菌体表面，通常抗体在噬菌体上呈 3~5个拷贝展示，如3所示。 图3 抗体片断与M13噬菌体融合表达 目前研究得最成熟的是scFv抗体。这是因为受到噬菌体基因组大小的限制，插入的外源抗体基因的大小最多1500 bp。scFv抗体是由抗体重链可变区（Viarable Heavy chain，VH）和轻链可变区（Viarablelight chain，VL）通过15～20个氨基酸的短肽（linker）连接而成的抗体（见图4）。scFv抗体的相对分子质量约为25 kDa，与完整体(分子量约为 150 kDa)相比，具有体积小、穿透性好等特点，能够到达深层靶组织，在疾病治疗应用方面有独特的优势。同时由于其分子量小，可以在人体内较快被降解代谢，故毒副作用较小。 图4 Singlechain fragment variable ( scFv )抗体 将通过聚合酶链式反应技术（Polymerase ChainReaction，PCR）克隆出的全套人抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因在噬菌体表面进行展示，这就构成了噬菌体scFv抗体库。scFv抗体库的搭建流程具体如下（见图5）：首先需要从人B淋巴细胞中提取DNA，并以此逆转录获得 cDNA，接着用特异性引物分别扩增重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因，通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)将两段基因以一段连接序列相连，获得scFv基因。将scFv与噬菌体载体经过酶切、酶连后，获得重组噬菌体载体，侵染宿主菌扩增后即获得噬菌scFv抗体库。 抗体库建立后就可以采用以下步骤来筛选和获得高亲和力的scFv抗体：①将106 ~1011scFv-M13噬菌体克隆与固相化的抗原结合;②洗涤去除低亲和力的scFv-M13 噬菌体克隆;③洗脱与抗原特异性结合的高亲和 scFv-M13噬菌体克隆;④高亲和噬菌体克隆侵染宿主菌;⑤扩增高亲和scFv-M13噬菌体克隆。 图5 基于噬菌体展示技术的scFv抗体库建立的流程 3.噬菌体展示技术的发展 1985年，Smith首先应用丝状噬菌体展示技术（Fila-mentousphage display;Ff phage display)，并提出了分子库的概念。1990年，McCafferty等用此方法构建了106大小的库，并成功地从中筛选到目的抗体。以后相继有报道用此方法筛选到多种抗体，其库容大多数在108左右，最大的达到1010～1011。 噬菌体展示技术已经发展成为可以操作多基因(基因簇、基因组)的体外克隆及体内克隆和重组表达的噬菌体展示技术系统(Phage display system，PDS)，且由经过分子遗传改造后的噬菌体、辅助噬菌体、宿主细菌等组份集成构成。各种应用环境的新要求和新挑战也不断促进其改良和更新，先后出现了基于噬菌体M13、λ、T4和T7的展示技术系统。 Smith以及发明阿达木单抗的Winter因为在噬菌体展示技术领域的杰出成就获得了2018年诺贝尔化学奖（见图6）。 图6  2018年诺贝尔化学奖得主（从左到右：Frances H. Arnold、George P. Smith及Sir Gregory P. Winter) 4. 噬菌体展示技术的应用 目前，噬菌体展示技术广泛应用于生命科学领域。 4.1 应用于研制新型疫苗 传统疫苗操作繁琐，还具有一定的危险性，并且由于传统疫苗采用死疫苗或减毒活疫苗，所以含有的保护力有限，人工合成疫苗则可以弥补这些缺陷。噬菌体展示技术给人工合成新型疫苗提供了一种有效手段。利用噬菌体展示技术，将白色念珠菌特异表位基因插入到被M13 PVIII基因修饰的pKK233.3质粒载体，即可获得杂合噬菌体。将其外源多肽展示，其纯化的该表位抗原PA免疫小鼠，面对有无佐体，都产生抗体，无明显毒副作用。此法可知，噬菌体做表位载有很好的免疫原性，用噬菌体展示特定的特异性抗原，可获得低价高效的人工合成疫苗。 4.2 应用于筛选酶抑制剂 用噬菌体肽库来寻找抑制酶活性的肽段十分高效，目前已经使用这一技术获得了很多高活性的酶抑制剂。例如找寻可抑制丝氨酸蛋白E因子VIIa的肽段，Dennis等从肽库中筛选了非竞争FVIIa活性的肽段。此肽段具有很强的亲和力和很强的特异性和敏感性。 4.3 应用于细胞信号的传导 细胞信号转导的物质基础是蛋白质分子与蛋白质分子之间、蛋白质与其他分子之间的相互作用。利用噬菌体展示技术能够探测细胞信号结合位点，绘制细胞信号传导路线，以发现新的蛋白信号结合分子。 除此之外，噬菌体展示技术在医学诊断和治疗方面、多肽药物开发方面、模拟表位的筛选方面等，皆有杰出的贡献。 5. 噬菌体展示技术的前景 5.1 乳腺癌的早期诊断和靶向治疗新的靶点。 利用噬菌体随机七肽库通过4轮减性筛选获得能与人乳腺髓样癌Bcap-37细胞特异结合的小分子多肽。ELISA法表明，第1，3，5，6，8，12，14，16，17，18和20号单克隆噬菌体与人乳腺髓样癌Bcap-37细胞有很强的亲和力和特异性。测序结果显示，重复性最高的序列为LXRNTNX。经检索，该肽段与已知蛋白尚无同源性，因此它很有可能成为乳腺癌的早期诊断和靶向治疗新的靶点。 5.2 减低检测真菌毒素的成本。 真菌毒素是真菌在生长繁殖过程中产生的次级有毒代谢产物，具有致癌、致畸、致突变的毒性作用，严重危害人体健康，因此对其检测与控制非常重要。现有检测方法普遍存在样品预处理复杂、成本高、操作繁琐等缺点，且会对操作人员和环境造成潜在二次危害。噬菌体展示技术可以筛选真菌毒素的模拟表位和抗真菌毒素的重组抗体，降低检测成本，达到无毒检测真菌毒素的目的。因此可以将不同种类的纳米材料与噬菌体展示技术两者相互结合来检测真菌毒素。 6.结语 噬菌体展示技术的出现和应用离不开科学认知的进步与技术的革新。正如毛泽东诗：为有牺牲多壮志，敢叫日月换新天。无数研究者满怀理想，经历无数次失败与成功，在不到半个世纪的探索与不屑努力中，发现的成果不禁令人震撼。可以想象，伴随着更加先进的技术，噬菌体展示技术在新领域新方向研究的成功指日可待。 参考文献 [1] 马雪璟，李润涵，侯百东.单克隆抗体的出现与发展[J].科学通报，2020，65(Z2):3078-3084. [2]夏静.噬菌体展示技术在单克隆人源单链抗体领域的研究进展[J].生物学教学，2018，43(04):69-70. [3]宋文全.噬菌体抗体库技术的发展及应用[J].国外医学免疫学分册，2005，28(03):147-150. [4] 孟繁梅，张朝辉，艾云灿.噬菌体展示技术系统发展进展[J].遗传，2011，33(10):1113-1120. [5]NIXON AE，SEXTON DJ，ＬADNER RC．2014．Drugs derivedfrom phage display-From candidateidentification to clinicalpractice．MAbs，6(1): 73 [6]SHUKRA AM，SRIDEVI NV，CHANDRAN D，et al．201４．Production of recombinantantibodies using bacteriophages．European Journal of Microbiology and Immunology，４(2): 91 [7]FOREROTORRESA，SHAH J，WOOD T，et al．2010．Phase I trial of weeklytigatuzumab，an agonistic humanized monoclonalantibody targeting death receptor 5(DR 5)．Cancer BiotherRadiopharm，25(1): 13 [8] 王桂云.噬菌体展示外源多肽的免疫原性研究.东北师范大学学报，2001，33(3):101 ~ 104 [9]Dennis M s，Eigenbrot C，Skelton N J，et al. Peptideexositeinhibitors of factor VIIa as anticogulants. Nature ，2000，404(6777):465- 470 [10] 沈莉莉，王姣姣，陈吴越等，抗肿瘤多肽的高效筛选方法及研究现状，药学学报，2020， 55(10): 2298 −2305 [11]马仲才.噬菌体展示肽库在细胞信号转导研究中的应用.生命的化学，2001 ，21 (5):434 ~ 435 药事纵横投稿须知：稿费已上调，欢迎投稿 各位朋友好，觉得本文对您有帮助，请随手点一下下方的在看，以便让你的朋友也能看到哦。