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摘要：在有利的人造环境中培养细胞已成为细胞和分子生物学中的一种多功能工具。培养的原代细胞和连续细胞系在基础、生物医学和转化研究的调查中不可或缺。然而，尽管它们扮演着重要的角色，但细胞系经常被其他细胞、细菌、真菌、酵母、病毒或化学物质污染或误认。此外，处理和操作细胞与特定的生物学和化学危害相关，需要特殊的防护措施，如生物安全柜、封闭容器和其他专门的防护设备，以最小化暴露于有害物质的风险，并保证无菌工作条件。这篇综述简要介绍了细胞培养实验室中最常见的问题以及一些预防或解决相关问题的指导方针。 1.引言 细胞培养实验在生物医学研究、再生医学和生物技术生产中被广泛使用。由于动物保护法律对实验室动物使用的限制，以及威廉·拉塞尔和雷克斯·伯奇提出的3R原则（替代、减少和细化）的严格执行，以改善动物福利，可以预期在未来几年中，细胞系的普遍使用将进一步增加，以替代基于动物的研究。然而，值得注意的是，如果操作不当，细胞培养实验容易出错。因此，至关重要的是，细胞培养研究应采用良好的细胞培养实践（GCCP）来确保体外实验的可重复性。 特别是，种间和种内交叉污染和细胞误认、遗传漂变、细菌、真菌、酵母、病毒或化学物质的污染，以及缺乏质量控制测试，是普遍存在的致命细胞培养问题，这些问题使得文献充斥着虚假和不可重复的结果。粗略估计表明，使用问题细胞系发表的论文数量约为16.1%。此外，国际细胞系鉴定委员会（ICLAC）在其2021年6月发布的最新登记册中列出了576种被误认或交叉污染的细胞系。 尽管很难估计有多少误导性文章实际上受到影响，但仍迫切需要更好地提高科学家对这个问题的敏感性。此外，当使用细胞系时，生物安全和伦理方面并不在公众意识中，甚至被忽视。例如，一些连续生长的细胞系是通过使用猴病毒40（SV40）大T抗原（SV40T）或其他具有致癌潜力的因子转化建立的，通过引入端粒酶逆转录酶（TERT）活性来实现永生化，来自基因修饰动物，或通过CRISPR/Cas9基因编辑等新技术。因此，许多细胞系需要被归类为需要充分安全关注的转基因细胞系（GMCLs）。 在过去的几十年中，科学家们制定了许多关于良好细胞和组织培养实践（GCCP）的指导方针，这些指导方针不断更新，提供了在进行细胞培养时应考虑的主要原则的指导。GCCP指导方针强调了质量管理问题、培养系统背景、文件记录和报告、一般安全指示、教育和培训信息，以及与细胞培养实验相关的伦理问题。此外，这些专家文件试图促进实验室实践的协调、合理化和标准化，包括制造和测试，以促进研究人员的工作符合法律、法规和伦理原则。此外，这些指导方针提供了关于建立和配备细胞培养实验室环境的基本、有益和有用的附加设备的信息，重点是国家和国际公认的标准。这些指导方针相当复杂和全面，因此它们将主要对有多年细胞培养实验经验的受过训练的研究人员感兴趣。 在本文中，将在更简化的层面上讨论使用细胞系的一些一般方面。特别是，总结了细胞系鉴定的测试、潜在的细胞培养污染物，以及生物医学研究中使用细胞系的伦理问题和生物安全指南的简要信息。因此，所提供的信息对于即将开始进行细胞培养实验的人来说应该是有用的。 2.细胞培养类型的分类  细胞系大致可以分为三组，即（i）有限细胞系，（ii）连续细胞系，也称为永生化或无限细胞系，以及（iii）干细胞系。有限细胞系通常来源于原代培养，生长缓慢。因此，它们可以在体外培养有限数量的细胞代数，然后最终经历衰老和衰老，这一过程表现为失去典型的细胞形状和细胞质脂质的富集。重要的是，有限细胞系是接触抑制的，在形成单层后在G0、G1或G2阶段停止。 相比之下，连续生长的细胞系通常来自转化或癌细胞，并且快速分裂，在体外培养中达到比有限细胞系更高的细胞密度。在某些情况下，这些细胞系表现出非整倍性（即，一个或多个染色体的数量多于或少于其他染色体）或异倍性（即，染色体数量不是单倍体数量的简单倍数）。它们通常可以在降低的血清浓度下生长，不接触抑制，并且可能形成多层。干细胞是一种未分化或部分分化的多能细胞类型，起源于多细胞生物。这些细胞可以扩展为相同类型的无限多的细胞，或者在适当的条件下被触发产生具有特殊功能的细胞。因此，它们可以作为许多不同细胞类型的多能前体。 在所有情况下，来自不同来源的细胞的生长需要一个人工但受控的环境，在这种环境中，有时需要高度专业化的培养基、补充剂和生长因子以确保适当的细胞生长。一种细胞类型可以生长附着（附着在表面），需要一个分离剂进行传代，或者可以自由悬浮。附着细胞可以进一步分为具有长形状的成纤维细胞样细胞和具有多边形形状的上皮样细胞。同样，每种细胞培养在形态、活性、倍增时间和遗传稳定性方面都有独特的属性，它们的处理和维护可能需要不同的培养基、培养条件和添加剂或处理剂，包括抗生素、分离溶液或细胞附着的表面涂层。非附着或悬浮细胞要么作为单个细胞生长，要么作为自由悬浮的团块在液体培养基中生长，这些细胞在传代过程中不需要酶促或机械分离。然而，在某些情况下，这些细胞需要摇晃或搅拌以进行适当的气体交换和适当的生长。非附着细胞的典型例子是来自血液、脾脏或骨髓的造血细胞系，它们在不附着在基质上的情况下增殖。尽管如此，一些附着细胞系也可以适应悬浮生长，这允许在特殊应用中以更大的规模和更高的产量进行更易于管理的细胞培养。此外，与附着细胞相比，悬浮培养的细胞通常更容易处理。例如，当需要通过分析流式细胞术或荧光激活细胞分选（FACS）分析附着细胞时，细胞必须首先从其基质上分离。然而，酶促消化或使用非酶细胞解离缓冲液可能导致表面蛋白的降解，这可能阻止它们在相应的协议中的后续识别和细胞分离。这使得使用流式细胞术对附着细胞进行表型和特征分析极为困难。例如，胰蛋白酶通常用于分离附着细胞。它依赖时间地降解大多数细胞表面蛋白，通过在不跟随脯氨酸的赖氨酸或精氨酸残基后切割肽键。这导致细胞解离过程中大多数表面蛋白的降解。类似地，其他酶如特异性胶原蛋白酶、丝氨酸蛋白酶弹性蛋白酶切割C末端中性、非芳香族氨基酸残基的肽键、肽酶Dispase水解非极性氨基酸残基的N末端肽键，以及许多其他分离剂引发蛋白质的显著降解。 因此，已经引入了几种较温和的酶混合物，如Accutase和Accumax，或非酶细胞解离试剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）和氨三乙酸（NTA）混合螯合二价金属阳离子，用于常规细胞传代和敏感细胞的操作。这些配方毒性较小，保留了大多数表位，以便后续流式细胞术分析。 最近，细胞在三维微环境中的培养已成为研究人员关注的焦点。这些3D细胞培养要么是通过在定义的支架内培养细胞产生的，如来自细胞外基质蛋白或琼脂糖或聚合物材料的水凝胶，要么是作为自组装系统，在这些系统中细胞以团簇或球状体生长。人们普遍认为，这些体外细胞模型提供了在封闭系统中研究细胞反应的可能性，这种系统比依赖于二维的细胞培养技术更接近生理情况。因此，这些模型对于那些研究细胞间相互作用、肿瘤形成、药物发现、干细胞研究和代谢相互作用的人来说特别有趣。与2D系统相比，3D模型有潜力彻底改变药物效力测试、疾病建模、干细胞研究和组织工程研究的方式。最后，这些系统将大幅减少某些研究领域对实验动物的使用，这是3R原则的一个关键方面。 3.培养基  适当的细胞培养基对维持和促进细胞培养的生长以及确保实验结果的可重复性至关重要。一些细胞还需要非必需氨基酸（丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸）以有效生长并减轻细胞的代谢负担。用于保存和维持广泛哺乳动物细胞类型的最常见标准培养基，例如，Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）和Roswell Park纪念研究所（RPMI）培养基。通常，这些培养基包含碳水化合物、氨基酸、维生素、盐和pH缓冲系统（表1）。常见的培养基如DMEM可提供现成的液体形式，或者以粉末形式出售，以便于储存和延长保质期。此外，许多培养基可以提供不同葡萄糖浓度（低或高葡萄糖）以及有无L-谷氨酰胺或稳定的谷氨酰胺的配方。最后，它们可以带或不带pH指示剂如酚红出售。重要的是，基础培养基通常不含蛋白质、脂质、激素或生长因子。因此，这些培养基需要添加胎牛血清（FBS），通常称为小牛血清（FCS），通常浓度为5-20%（体积/体积）。FBS是从健康的产前牛的胎儿血液中获得的。最终的血清通过离心凝固的血液去除细胞、纤维蛋白和凝血因子。值得注意的是，不同来源的FBS在生长因子和激素谱、病毒含量、内毒素负荷、渗透压、总蛋白和金属含量、糖类以及最终处理（例如，过滤、检测潜在污染）方面可能有所不同。因此，大多数科学家更喜欢购买可追溯的FBS批次，以获得可靠的批次间一致性，以在实验期间获得可重复的结果。此外，新生儿小牛血清（NBCS）来自20天以内的小牛，小牛血清（CBS）来自3至12个月大的小牛，以及从12个月以上的成年牛中分离的成年牛血清（ABS）经常用于补充细胞培养基。一些研究人员常规地在56℃下加热灭活血清15-30分钟，以灭活补体并破坏潜在的细菌污染物。然而，在大多数情况下，这不是必要的，应该省略，因为热灭活也会降低生长因子的浓度或生物活性，而这些生长因子是细胞正常生长所必需的。 然而，值得注意的是，含血清的培养基有许多缺点。血清是复杂的，具有不确定的成分，导致批次间变化，增加了污染的风险，并且使用血清通常与避免胎儿和动物痛苦的伦理问题有关。因此，血清免费培养基（SFM）的开发已成为过去几十年的研究热点。原则上，SFM可分为五种类型，即（i）普通SFM，（ii）含有人类来源但无动物成分的异种免费培养基，（iii）无动物培养基，（iv）无蛋白质培养基，以及（v）化学定义培养基。所有这些培养基都含有关键成分（例如，能源、维生素、氨基酸、脂质、微量元素和无机盐离子），并经常添加特殊补充剂，如抗剪切保护剂、核酸和其他需要改善某些细胞类型或应用的培养性能的成分。不幸的是，某些SFM的公司和供应商经常提供不完整或根本没有关于其培养基成分的信息。因此，研究人员十年前就开始建立一个在线无血清数据库，用于交流有关SFM的信息和经验。 通过向细胞培养基中添加抗生素和抗真菌剂，可以更好地预防由细菌、酵母、真菌和支原体引起的生物污染。它们中的大多数通过抑制细胞壁合成（例如，青霉素）、干扰膜通透性（例如，两性霉素B）或通过阻止细菌起始复合体在mRNA和细菌核糖体之间的组装来抑制蛋白质合成（例如，链霉素）。然而，常规使用抗生素可能会发展缓慢生长的持久/耐药细菌污染物，这可能导致细胞分化和行为的微妙变化。 此外，青霉素、链霉素和庆大霉素等抗生素可以显著改变基因表达和调控，可能会修改聚焦于药物反应、细胞调控和分化研究的结果。例如，最近的一项简洁回顾强调了众多出版物显示的抗生素和抗真菌剂如青霉素/链霉素、庆大霉素和两性霉素B对体外细胞特性（包括增殖、分化、存活和遗传稳定性）的影响。同样，一项全面的文献搜索发现了由不同抗生素引起的许多报告的副作用，再次支持在可能的情况下推荐使用无抗生素培养基，以确保细胞培养发现的可靠性和可重复性。因此，研究人员应避免在细胞培养中永久使用抗生素，并应更好地尝试实施严格的无菌工作条件，以防止细胞培养中的细菌污染。4.酚红 酚红，也称为苯磺酞，是细胞培养中最常用的pH指示剂。这种水溶性染料在低pH值时呈黄色两性离子，而在更碱性的条件下则变为红色阴离子或紫红色双阴离子（图1）。因此，这种染料被用作许多组织培养基中的惰性pH指示剂，用于检测pH变化、死亡细胞的废物产物，或通常会导致培养基酸化的污染物的过度生长。然而，由于其结构与某些非甾体雌激素相似，它具有与雌激素受体结合的能力，亲和力为雌二醇的0.001%，从而刺激雌激素受体阳性细胞的增殖。因此，在与雌激素反应性细胞系统工作时，建议在实验过程中避免使用酚红。 图1. 通过酚红监测细胞培养中的pH变化。酚红（Phenolsulfonphthalein）是一种三苯甲烷染料，用于细胞培养中监测pH变化。随着pH值的升高，其颜色逐渐从黄色过渡到红色和紫红色。 5.细胞污染  生物和化学因素都可能导致细胞培养中的污染（表2）。在大多数情况下，细胞生长缓慢、形态变化、培养基pH值快速变化以及培养中死亡或漂浮细胞数量增加是污染的后果。因此，应常规筛查细胞培养中可能的污染物，以防止结果不一致和其他严重后果。下表讨论了最重要的污染物。 5.1.支原体污染 支原体是细菌类摩洛哥菌纲中最小的自复制生物。它们由脂蛋白质膜、核糖体和一个由大小从580到2200 kb的环状双链DNA分子组成的基因组组成（图2A）。支原体的生物合成能力有限，需要进入适当的宿主，在其中繁殖并长时间存活。它们的微小尺寸（约0.1-0.2微米）使得在标准明场显微镜下无法识别，这也是它们在许多实验室中经常未被检测到的原因。它们缺乏细胞壁，对许多在细胞培养中使用的常见抗生素（如青霉素或链霉素）具有抗性。最重要的是，支原体污染不会产生其他细菌或真菌污染所特有的浑浊度。 图 2. 在细胞培养上清中检测支原体。(A) 支原体是最小的自复制细菌，没有细胞壁。它们由脂蛋白质膜、核糖体和一个由圆形双链DNA分子组成的基因组组成。(B) 一个被支原体污染的大鼠细胞系单层用DAPI染色，并在荧光显微镜下用适当的紫外线滤光片包(340/380 nm 激发)在400倍放大下进行分析。请注意那些非常小的明亮的细胞外核点，这是支原体的典型特征（由箭头标记）。比例尺代表50μm。(C) 在描述的分析中，2μL正常对照培养基（Medium(-)）和2μL从支原体感染的细胞系中取出的培养基（Medium(+)）使用Venor®GeM OneStep试剂盒（#11-8050, Minerva biolabs GmbH, Berlin, Germany）根据制造商的说明进行支原体感染测试。作为阳性对照，试剂盒系统内包含的2μL阳性对照也被共同扩增。每个样本中的内部控制在PCR反应中产生191 bp大小的扩增子，证明了PCR反应的功能，而265-278 bp大小的扩增子表明有支原体污染。PCR产物在含有乙二胺四乙酸的2%标准琼脂糖凝胶上分离，并通过标准凝胶成像仪可视化扩增子。 系统性研究已经确定了支原体进入细胞培养的典型方式。这些方式包括从其他研究实验室或商业供应商那里获得的受感染培养物、培养基、血清或试剂的交叉污染。此外，使用非无菌用品、实验室人员作为支原体携带者的感染、孵化器或生物安全柜中支原体的扩散、液氮罐中细胞培养的污染、通过空气传播的颗粒和气溶胶、过度使用抗生素以及培养皿密封不当也是有利于支原体污染的来源。 尽管支原体与宿主细胞竞争生物合成前体和营养物质，但受影响的细胞培养中观察到的生长速率变化通常很小，这就是为什么相应的污染不容易被检测到的原因。然而，支原体可以广泛影响宿主的DNA、RNA和蛋白质代谢，影响细胞内氨基酸和可用ATP水平，改变细胞表面抗原，并可能引起DNA断裂和其他重大染色体变化。因此，定期检测和快速识别这些污染物对于防止研究结果失真、误导性出版物和研究资金浪费至关重要。为了实现这一点，开发了许多敏感和特定的测试方法，这些方法允许检测相应的感染，通常不考虑来源或物种。在检测支原体污染的金标准中，首先将培养上清样本添加到支原体培养的液体培养基中，并在肉汤、琼脂或指示细胞上孵育几天。然而，这种方法耗时且其他更快的检测方法已经被引入。它们包括，除其他外，使用40,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）或Hoechst 33342（图2B）等荧光染料进行特异性DNA染色、酶联免疫吸附试验（ELISA）、用支原体特异性核糖体探针标记RNA、酶法程序、流式细胞术方法、比色法或基于条带的支原体检测试验、检测细菌16S rRNA的敏感PCR基础检测和复杂的傅里叶变换红外（FITR）显微光谱法。荧光染料染色相当非特异性，而大多数其他检测具有高分析灵敏度（即测试识别污染物的能力）和特异性（即测量支原体而不是密切相关的非支原体物种的能力）。特别是，依赖于常规（或终点）PCR的商业化试剂盒通常具有同时检测70-90种支原体的能力，因为这些试剂盒中包含的引物集通常设计为专门针对并扩增支原体基因组中高度保守的16S rRNA编码区域（图2C）。 支原体可以在受感染的培养物中产生几乎无限多的效果。因此，开发了广泛的消除相应污染物的代理和方法。有不同物理、化学、免疫和化疗治疗方法可用于消除支原体污染物。然而，许多这些方法不切实际，因为它们要么耗时，需要特殊设备，只捕获有限数量的支原体物种，或者总体效率低。最初，引入了几种抑制支原体生长的抗生素，但它们大多数效果一般，对真核细胞有害，或者由于对相应药物产生抗性而效果有限。尽管如此，现在有几种更具选择性和有效的抗支原体药物可用，这些药物通常允许在一轮治疗中就消除支原体感染（表3）。在大多数情况下，这些去除剂含有大环内酯类、四环素类、喹诺酮类或这些药物的组合。 常见的化合物Baytril®、Ciprobay®和Zagam®中包含的不同喹诺酮具有相似的化学结构（图3）。它们通过阻断细菌核酸合成来发挥抑制活性，通过破坏细菌拓扑异构酶II，抑制拓扑异构酶IV和DNA旋转酶的催化活性，并导致细菌染色体断裂。BM-Cyclin中包含的大环内酯类Tiamulin通过靶向细菌核糖体的50S亚基来抑制蛋白质合成，并进一步是肽酰转移酶的强抑制剂。它对支原体的活性通过四环素显著增强。其他现成的去除剂包含抗生素和抗菌作用肽的组合或属于不同抗生素家族的三种不同杀菌成分的组合。 图 3. 用于去除或预防支原体污染的选定化合物。(A) 贝尼尔（CAS号：93106-60-6），(B) 环丙沙星（CAS号：85721-33-1），(C) 扎加姆（CAS号：110871-86-8），以及 (D) 含有盐酸米诺环素（CAS号：13614-98-7）和富马酸替米考星（CAS号：55297-96-6）的BM-Cyclin是强大的抗支原体剂，用于消除或预防支原体污染。有关所描绘化合物的生物活性，请参考表3。 不同的杀菌成分在消除支原体感染方面具有高效性。通常，这些物质在施用两到三周后对所有常见的支原体菌株都有效。例如，图4展示了通过电子显微镜评估的大鼠细胞系中支原体的完全根除。 图 4. 通过电子显微镜评估大鼠细胞培养中支原体污染的清除情况。一个受污染的细胞培养物用Plasmocin处理了2周。展示的是处理前（A-C）和处理后（D）细胞的代表性电子显微镜图像，这些图像显示了广谱抗支原体试剂成功地从培养物中清除了支原体。图像的原始放大倍数为4646倍至27800倍。请注意（A）中支原体膜与宿主细胞质膜的特征性融合。 然而，使用这些产品治疗或预防支原体感染可能会引起显著的细胞毒性和遗传毒性效应。例如，米诺环素被证明能诱导Bcl-2的表达，Bcl-2在线粒体中积累，并与包括Bax、Bak和Bid在内的促死亡分子相互作用，从而保护细胞免于死亡。同样，替米考星通过阻断催化嘌呤5'单核苷酸转化为核苷的5'-核苷酸酶（CD73）的活性，抑制了人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和小鼠乳腺癌细胞系4T1的生长和转移。因此，用于去除支原体感染的化合物的应用是实验研究结果的一部分。 5.2.病毒污染 与支原体感染相比，细胞培养中的病毒污染物构成了更严重的威胁，因为检测它们的困难和缺乏治疗受影响细胞培养的方法。此外，一些病毒有能力将其基因组整合到宿主细胞中，这在某些情况下会导致新病毒颗粒的永久性产生。这对操作员来说是一个潜在的健康风险，并且可能是水平病毒传播到其他细胞系的源头。因此，这对受感染细胞系的生物安全分类有直接影响。不幸的是，用于系统评估病毒污染物的通用测试相当复杂且无针对性。没有对病毒真实性的确切了解，这些检测方法仅限于电子显微镜和逆转录病毒逆转录酶的测定。特别是，当怀疑有传染性病毒因子时，电子显微镜的多功能性是一种有效、通用且无偏见的手段。这种技术适用于获取高分辨率图像，从而提供细胞感染状态和病毒形状的即时概览。观察到的形态和大小进一步允许对病毒类型进行即时初步分类。例如，成熟的逆转录病毒通常是球形包膜颗粒，平均直径在100到200纳米之间，显示出与六个逆转录病毒属不同的独特形态。特别是，透射电子显微镜（TEM）适用于在不需要事先对传染性因子进行假设的情况下直接观察生物样本中的病毒。例如，广泛用于肝病研究的连续生长的小鼠肝星状细胞系GRX的逆转录病毒负荷首次通过TEM得到证实。经过这么多年，这个细胞系仍然能够大量产生逆转录病毒颗粒（图5）。 图 5. 小鼠细胞系GRX中的逆转录病毒污染。(A) 逆转录病毒的一般结构。逆转录病毒是直径约100纳米的包膜颗粒。由env基因编码的包膜由糖蛋白组成，这些糖蛋白在出芽过程中从宿主细胞的质膜中获得脂质的包裹。逆转录病毒基因组进一步由两个长度为7-9 kb的相同单链RNA分子组成。病毒衣壳的主要组成部分是群特异性抗原（gag），而逆转录酶（pol）对合成病毒DNA是必需的。(B) 通过电子显微镜分析评估的小鼠肝星状细胞系GRX中未指定逆转录病毒的发生。逆转录病毒颗粒可以在培养基和细胞质中找到。(C,D) 逆转录病毒的高倍图像显示了典型的球形结构。(E) 这幅电子显微镜图像显示了一个出芽过程，其中一个逆转录病毒颗粒通过扩散穿过宿主的质膜获得其包膜。放大倍数分别为10,000倍（B），100,000倍（C），27,800倍（D）和21,560倍（E）。 5.3.化学污染 任何在细胞培养中引起不良影响的非活性化合物都需要引起密切关注。即使是必需的营养物质，在浓度足够高时也可能产生毒性。杂质可能通过培养基、血清和水引入细胞培养。然而，塑料管道、细胞培养皿和储存瓶中的增塑剂，以及荧光或紫外线照射下在培养基中形成的自由基，或玻璃器皿和移液管上的沉积物，都可能导致污染。此外，CO2气流中的杂质以及用于消毒孵化器或生物安全柜的杀菌剂或杀虫剂残留物可能至关重要。最关键的是内毒素，它们来源于大多数革兰氏阴性细菌的外细胞膜。这些由相当稳定的脂多糖（LPS）组成，它们从细菌中脱落，并在细菌溶解过程中大量释放。因此，从玻璃器皿中去除热原需要在高温下进行广泛的加热，而这些物质对高压灭菌相当有抵抗力。因此，大多数市售的现成细胞培养基和补充剂都是以这种方式准备的，它们不含或含有非常低水平的内毒素。此外，可靠的细胞培养基和补充剂生产商会提供分析证书，表明相应溶液或化合物中的内毒素水平。 一些培养条件（例如，低血清浓度、高光照暴露）会促使形成高活性的自由基，可能导致DNA损伤、蛋白质交联、脂质过氧化物和诱导细胞凋亡。因此，通常向细胞培养基中添加具有自由基清除活性的抗氧化剂，如抗坏血酸、N-乙酰-L-半胱氨酸或维生素（维生素E、维生素A、维生素C），以防止氧化应激及其后果。或者，可以将微量元素硒作为抗氧化剂酶的辅因子，如谷胱甘肽过氧化物酶，添加到培养基中以消灭活性过氧化物。 此外，铅、镉和汞等重金属的高浓度对许多细胞类型是有毒的。因此，重要的是在准备培养基或补充剂之前，要对用于水和溶剂进行重金属测试。或者，如果实验室水不适合细胞培养，应使用提供分析证书的商业供应商的纯水。 5.4.种内和种间交叉污染 同一物种（种内污染）或另一物种（种间污染）的无关细胞污染细胞系是一个常见且反复出现的问题。特别是，当污染物是一种快速分裂的细胞系时，它会过度生长并取代原始培养物。如果污染未被检测到，这可能导致不可靠和不可复制的结果，从而歪曲生物医学文献。细胞系交叉污染的问题已经众所周知数十年，始于1960年代围绕HeLa细胞的争议。2010年发表的第一份综合分析引用了68个参考文献，列出了360个交叉污染的细胞系。随后，在2021年，旨在引起研究人员对这一问题关注的国际细胞系认证委员会（ICLAC）列出了来自不同物种的576个因交叉污染或其他方式而误认的细胞系（表4）。交叉污染的来源多种多样，包括通过气溶胶或未堵塞的移液管的不想要的传播，不同细胞系之间共享培养基和试剂，以及不注意使用条件培养基。 如今，有不同方法可用于确定细胞系交叉污染。种间交叉污染可以通过同工酶分析检测，该分析利用电泳结合模式检查物种间在一组细胞内酶的个别同工型结构和迁移性方面的微小差异。人类细胞的种内交叉污染可以通过人类淋巴细胞抗原（HLA）位点分型识别，这是一组位于第6染色体上的基因，编码参与免疫系统调节的高度多态性的细胞表面蛋白。此外，分子血清学方法、使用合成探针或引物的遗传测试以及基于直接DNA测序的序列分型可以区分不同的HLA基因型。 5.5.细胞误识别 类似于细胞交叉污染，细胞系的误识别导致数千篇误导性和错误的论文。在常规操作过程中由于注意力不集中、操作员工作量大或实验工作分心而引起的难以辨认的标签和细胞培养容器的误标记是误识别的最直接原因。可以理解的是，与更快速分裂的污染物细胞的污染可以迅速在几次传代中过度生长原始培养物，并在后续步骤中引起细胞系误识别。当使用同一移液管或同时进行多次培养的重新饲养操作和操作，作为不同细胞类型有意共同培养的结果，或在与饲养细胞工作时缺乏意识时，可能会导致这种过度生长。 6.短串联重复序列分析  如今，识别交叉污染和细胞误识别的最常用方法是短串联重复序列（STR）分析。该方法可以比较不同样本在DNA中特定位点的等位基因重复次数。尽管这些重复的相应等位基因变异相当多态性，但等位基因的数量非常小。因此，为了使不同的STR配置文件对识别或区分目的具有高区分统计能力，通常在多重PCR检测中同时分析多个STR位点。 在STR分析中，从模板DNA获得的扩增的可变微卫星区域在遗传分析仪上分离，然后使用软件进行分析，该软件计算每个变体位点的重复次数。如今，为许多物种建立了有效和标准化的STR小组。在这方面，建立包含19个鼠STR标记的多重PCR检测的鼠细胞系认证联盟是开创性的。这种多重PCR为不同的小鼠细胞系，包括密切相关的细胞系，提供了独特的STR配置文件。图6展示了广泛使用的永生化小鼠细胞系AML12获得的四个STR标记的代表性色谱图。 图 6. 小鼠细胞系的典型短串联重复（STR）标记色谱图。使用CellCheckTM Mouse系统（IDEXX, Kornwestheim, Germany）对小鼠AML12细胞的基因组DNA进行STR分析，该系统扩增分布在17条染色体上的19个物种特异性STR标记。在这张图中，展示了来自第17、18、19号染色体和X染色体的四个代表性STR配置文件。有关该细胞系的完整STR配置文件，请参考表5。 重要的是，当比较三种不同的小鼠细胞系之间的19个鼠STR标记时，每个细胞系都有独特的组合，允许明确区分每个细胞系（表5）。 如今，已有数据库可供存取用于小鼠、猫、狗、牛、马、人类等STR测试设置的引物信息。此外，Cellosaurus资源提供了大量信息，并提供了诸如STR相似性搜索工具（使用STR进行细胞系认证，CLASTR）等程序，用于比较STR配置文件。 7.细胞系变化和过度传代  通常，实验室中培养的永生化细胞系会经过许多代。然而，高传代次数或长时间培养的细胞系可能会出现染色体复制或重排、突变和表观遗传变化。这种现象通常被称为遗传漂变。因此，细胞的形态、增殖率、代谢能力或总体健康状况可能会发生显著变化，影响实验结果。因此，在进行实验时，记录细胞系传代次数（反映细胞被亚培养到新容器的次数）是一个重要考虑因素。 也有报道指出，传代次数的增加可能会增加病毒污染的风险。此外，过度传代的细胞会选择生长速度更快的细胞，这些细胞在某些情况下表现出降低的分泌率、介导转运和细胞旁通透性，而细胞通透性则增加。因此，当传代次数相差数百代时，不同实验室进行的类似或相同研究可能会得出完全不同的实验结果。尽管没有关于最佳传代范围的具体指南，但通常的做法是在使用20至30代后不再使用细胞。不幸的是，尤其是当细胞来自细胞库以外的来源时，通常无法准确知道传代次数，因为细胞库通常会提供细胞传代次数的数据。 在某些情况下，研究人员认为即使传代次数也不准确，因为不同实验室在传代过程中可能使用不同的初始细胞种植密度或分裂率，这会影响细胞在培养中的分裂次数。因此，引入了一个用于计算精确的人口倍增水平（PDL）的公式，该公式与细胞代时间同义，特别用于原代细胞。在相应的公式中，PDL是自体外初次分离以来细胞群中细胞翻倍的总次数，计算如下：PDL = 3.32 (log Xe − log Xb) + S，其中Xb是孵化时间开始时种植的细胞数，Xe是孵化时间结束时的细胞数，S是分裂前的起始PDL。 8.使用细胞工作的生物安全方面 细胞培养可能对人类健康和环境造成伤害，需要被指定到一个考虑多种因素的生物安全级别。在使用细胞系之前，必须准确了解这些风险，考虑到其内在属性、（遗传）操作类型，以及由于污染病原体而可能显著增加的相应细胞系的生物危害。尽管这些估计必须逐个案例进行，但有一些一般指南需要遵循。首先，被研究细胞与人类的遗传关系越近，对人类的风险就越高，因为污染病原体通常具有特定的物种屏障。然而，应该注意，因为一些污染生物体有潜力跨越通常的物种屏障。其次，细胞系的肿瘤诱导潜力强烈依赖于其来源。例如，上皮细胞和成纤维细胞的肿瘤诱导潜力较低，而造血细胞则显著更高。第三，已经在许多实验室中使用多年的、得到良好表征的细胞系，比未表征的持续生长细胞系或原代细胞的风险总体较低。在识别和评估潜在风险后，通过遏制、限制人员和设备进出细胞培养实验室、按照标准操作程序（SOPs）工作、避免在工作期间形成气溶胶或飞溅、定期进行细胞培养培训、以及实施和遵循良好实验室规范（GLP）的一般指南来定义避免或最小化这些风险的方法是至关重要的。此外，建议在与原代人类细胞培养工作时接种乙型肝炎病毒疫苗。然而，不同国家之间的生物安全和生物安全全球规范和国际标准往往差异很大，开始工作前应注意。 9.来自患者的细胞系、类器官、异种移植模型和条件重编程 如前所述，已建立的细胞系在长期传代后可能会发生遗传漂变或表型变化。因此，它们可能不再忠实地代表它们最初来源的细胞类型所特有的所有分子特征。因此，科学家们已经开发了允许从健康供体或患有特定疾病的受试者的组织或血液中建立原代细胞的技术。对人类而言，这些来自患者的细胞系具有高度的临床转化相关性。 然而，自发永生化通常是一个罕见的事件，过去通常通过用病毒癌蛋白转化部分解除细胞周期调控或通过过表达TERT替换在细胞复制过程中丢失的短DNA片段（这些片段参与控制细胞衰老）来建立相应细胞。同样，CRISPR-Cas9介导的靶向癌基因，可以用于体外永生化细胞，已被确定为建立永生化细胞系的有效工具。 然而，应批判性地指出，这些操作可能会产生转录和细胞周期效应，此外，相应代理通过抑制DNA损伤信号通路导致突变的积累。最近，条件重编程（CR）已成为建立原代细胞长期培养的强大工具。CR技术最初于2012年建立，允许许多组织的正常和肿瘤上皮细胞无限期地在体外增殖。在这项技术中，可以通过与辐照成纤维细胞饲养层细胞和Rho激酶抑制剂Y-27632共同培养，使细胞条件性重编程。这项技术现在被广泛用于建立来自正常和病变细胞的患者源性细胞培养。在这个过程中，上皮细胞被重编程以获得成人干细胞特性，通过将细胞从标准培养基转移到CR培养基，逆转它们的分化状态，并允许大量产生用于患者衍生模型的细胞。因此，CR在精准医疗、再生医疗、药物测试、基因表达分析、异种移植研究以及确定从正常细胞表型向肿瘤细胞表型转变过程中发生的遗传、表观遗传和代谢变化方面提供了激动人心的可能性。重要的是，现在有复杂的协议进一步允许使用CR快速高效地扩展非上皮细胞，包括来自神经、神经内分泌、内分泌和间充质起源的细胞，这些细胞可以在条件下长期生长。 在个性化医疗中，类器官——通常源自多能性胎儿或成人干细胞的自组织3D组织——已引起了极大的兴趣。它们是器官的微型化和简化版本，形成于包含一组生长因子的选择性3D培养基中。特别是，来自患者的类器官(PDOs)已在癌症研究中被广泛引入。它们重现了原发肿瘤的基本特征，包括组织学的复杂性和遗传特征，因此理想地用于预测对抗癌药物的敏感性或肿瘤进展的方面。 同样，来自患者的异种移植(PDX)模型是动态实体，在其中可以实验性地监测癌症的演变。PDXs是通过在合适的动物宿主中植入并培养患者的肿瘤细胞而建立的癌症模型。在大多数情况下，接受者是植入了人类免疫系统的免疫缺陷小鼠。这些模型已成为研究人类免疫与癌细胞之间分子相互作用的有用实验工具。特别是，这些模型在基础研究中变得非常吸引人，以了解癌症进展和转移的方面。此外，PDXs经常用于临床前癌症研究，以识别新的预测性癌症生物标志物，测试癌症药物的效力，调查肿瘤内异质性和克隆动态，评估个性化治疗选择，并测试一般的转化假设。 所有这些更紧密地模拟细胞微环境的先进细胞培养技术如今已成为基础和临床研究的一个组成部分。然而，使用这些来自患者的模型(PDMs)需要广泛的专业知识、培训和质量控制。为了促进相应模型的发展，已建立了几个国际财团，旨在生成具有相关基因组和临床数据的新型人类肿瘤衍生的培养模型。国家癌症研究所(NCI)和人类癌症模型倡议(HCMI)已启动代表性倡议。 10.清洁和消毒  生物安全取决于实验室的清洁度。一般指南是严格遵循所有可能的安全规则。忽视或未能遵守任何安全规定可能导致与实验室相关的感染和环境污染。因此，需要通过对在实验室操作中使用的生物制剂进行消毒来降低生物风险。 在适当的废物管理中，应尽可能适当验证灭活方法。原则上，消毒有四个主要类别，即(i)通过热量进行消毒，(ii)用液体消毒，(iii)通过蒸汽和气体消毒，以及(iv)暴露于紫外线辐射。 高压蒸汽灭菌是消毒实验室材料和灭活或消毒生物制剂的最有效和可靠方法。这是一种使用高压水蒸汽进行消毒的方法，是培养基、玻璃器皿和移液管尖端消毒的首选方法。然而，必须保持足够的高温和压力一段时间，这也保证了孢子的灭活。通常，在121°C下高压蒸汽灭菌60-90分钟足以实现废物温度至少115°C持续20分钟。此外，只有受过培训的个人才能操作和维护高压蒸汽灭菌器，并且应定期通过生物指示剂检查高压蒸汽灭菌的成功。重要的是，接受高压蒸汽灭菌的废物或材料应放置在容器或密封的高压蒸汽灭菌袋中，以允许良好的热量穿透[98]。不应将危险化学品或放射性废物进行高压蒸汽灭菌。在防穿刺容器中收集受污染的解剖刀片、皮下注射针头、刀具和碎玻璃，并盖上盖子。在卫生水处理前，应先对大量液体废物和受污染的培养基进行消毒。 化学消毒通常是表面和家具消毒的首选方法。为了获得消毒剂的最佳效果，必须考虑几个因素。首先，消毒剂应对要去除的生物制剂具有特异性。第二，消毒剂应适合应用领域，因为当应用于表面或液体时可能会有显著的活动差异。最后，消毒剂在一般应用条件（例如，所需的接触时间、工作浓度）以及在其他影响因素（例如，酸、有机负荷）存在时的有效性可能会有所不同。 在封闭系统中应用的类似蒸汽和气体可以提供出色的消毒效果。一些实验室使用过氧化氢、二氧化氯、戊二醛、对甲醛、环氧乙烷和过氧乙酸的气溶胶来消毒生物安全柜或孵化器。然而，所有这些化学品都是危险的，使用这些物质进行消毒应只有经验丰富的受过培训的人员进行。 最后，暴露于紫外线(UV)辐射可以有效地破坏大多数微生物。特别是，UV-C光（光谱范围：100-280纳米），被大气吸收，对广泛范围的微生物具有最大的破坏力。因此，这个UV区域通常用于生物安全柜中，以减少表面污染。然而，暴露于UV可能导致操作员的眼睛和皮肤灼伤，因此应谨慎使用。因此，对于细胞培养初学者来说，在开始使用UV-C辐射设备进行清洁和消毒之前，建议接受专家的理论和实践培训。 11.结论  细胞培养在生物医学研究中扮演着重要角色。然而，细胞误识别、种内和种间交叉污染以及细菌感染、真菌、酵母或病毒的污染可能导致致命后果和科学文献的污染。因此，在每个使用细胞培养的实验室中，应强制进行定期污染检测和细胞鉴定测试。通过多种具有杀菌或杀菌作用的组分，可以有效地去除细菌、霉菌和酵母的生物污染。ICLAC错误识别细胞系的登记册和相关的Cellosaurus知识资源是极其重要的知识资源，并提供了诸如CLASTR等有用的搜索工具，用于比较STR配置文件。此外，实施良好的细胞培养实践和无菌技术对于提高细胞培养安全性、促进可复制的科学数据的产生以及促进不同实验室建立的结果的可比性至关重要。此外，适当的员工培训和标准化文档记录和报告细胞培养程序是进一步提高细胞培养实验室工作质量和安全的有效手段。最近，在生成更具生理相关性的PDMs，如PDOs和PDXs方面的进展已经彻底改变了常见的细胞培养方法，并帮助更好地理解人类生物学和病理生理学。在这方面，CR是一种有吸引力的技术，可以用于快速高效地建立来自患者的细胞培养，用于基础和临床研究，并进一步显著替代基于动物的研究。然而，应该记住，设计得最好、工程最精良的细胞培养实验室也只和其中最不胜任的工作者一样好。 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 时间：2024年10月16-17日 地点：上海张江（酒店定向通知） 规模：600-800人 主办单位：生物制品圈、抗体圈 演讲支持：Entegris、瑞孚迪、AS ONE CORPORATION 会议费用：免费FREE!（仅收取100元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），先到先得，报完即止！ 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！ 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 日程安排 更多嘉宾正在邀请中 第一届精彩回顾 第二届精彩回顾 第三届精彩回顾 第四届精彩回顾 第五届精彩回顾 第六届精彩回顾 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要:一系列重组单克隆抗体（rMAbs）已被用于治疗多种疾病，包括各种癌症和免疫系统疾病。中国仓鼠卵巢（CHO）细胞已成为生产这些rMAbs的首选，因为它们具有强大的稳定性、易于转染，以及与人类细胞相似的翻译后修饰能力。可以通过瞬时转染和/或稳定表达在CHO细胞中表达rMAbs。为了提高CHO细胞中rMAbs的产量，已经开发了多种方法，包括载体优化、培养基配方、培养参数和细胞工程。本文简要概述了这些方法，并同时讨论了生产过程中遇到的挑战，如聚集和岩藻糖基化问题。 1.引言 作为免疫球蛋白（Ig）超家族的成员，抗体（Abs）是由浆细胞分泌的糖蛋白。在结构上，Abs由两条重链（HCs）和两条轻链（LC）通过共价和非共价相互作用交织而成，形成通过柔性铰链区域连接的三个片段。这些片段包括两个抗原特异性结合（Fab）域，用于附着于抗原，以及一个可结晶片段（Fc）域，负责启动效应功能。在人类中，根据HC的不同恒定区域结构和性质，Abs被分为五个类别：IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。其中，IgG是血清中最普遍的类别，具有较长的半衰期，占循环抗体的75%。 由于市场需求强劲，制药工业蓬勃发展，全球处方药销售额在2017年超过了1万亿美元。美国食品药品监督管理局批准的生物制药中，相当一部分由重组单克隆抗体（rMAbs）或其偶联物组成。2017年全球单克隆抗体（mAb）市场超过了1000亿美元。自2016年以来，大约70%的所有重组抗体由仓鼠卵巢（CHO）细胞系生产。这些rMAbs被用于治疗各种疾病，包括癌症、自身免疫病和炎症性疾病。预计到2025年市场价值将超过3000亿美元，rMAbs站在生物制药的前沿，在治疗批准方面处于领先地位。此外，单克隆抗体的截短版本，如Fab片段，也用于治疗和研究领域。rMAbs和（Fab）s的产生采用了多种表达系统。大肠杆菌（E. coli）因其流程简洁，能在较短时间内产出克/升级别的量而受到青睐，用于生产Fab分子。除了细菌如大肠杆菌外，还采用了各种表达系统来生产重组抗体。这些表达系统的比较详见表1。为了治疗目的，rMAbs需要精确的糖基化和其他翻译后修饰才能发挥其预期的生物功能。因此，获准用于人类治疗的rMAbs仅限于在哺乳动物细胞中生产，如CHO、小鼠骨髓瘤细胞系（NS0）和Sp2/0细胞，这归因于它们进行复杂翻译后修饰的能力。CHO细胞特别受到青睐，用于生产rMAbs，因为CHO细胞产生的rMAbs在结构和功能上与天然mAbs相似，对人类病毒有抵抗力，外源基因稳定整合，内源性蛋白分泌少，便于分离，且适合大规模悬浮培养。2020年之前在CHO细胞中生产的治疗性rMAbs已在一篇综述文章中记录。因此，表2列出了美国或欧盟最近批准的治疗性重组抗体，它们在CHO细胞中生产。值得注意的是，2021年和2022年美国或欧盟批准的治疗性重组抗体中，只有一种在NS0细胞中生产，其余均在CHO细胞中制造。因此，经过多年的专注研究和开发，CHO细胞已成为抗体生产最普遍的宿主细胞系，主要是因为它们能够执行对治疗效果至关重要的单克隆抗体所需的翻译后修饰。 鉴于这些优势，治疗性rMAbs主要在CHO细胞中制造，随后进行色谱纯化。1986年第一个获准上市的重组治疗蛋白（组织型纤溶酶原激活剂）的表达滴度为<50 mg/L。30年后，基于CHO的rMAb生产过程已达到高度完善，通常在批处理过程中实现约1 g/L的峰值产品滴度，在连续批操作中实现1-10 g/L。为了增加CHO细胞中rMAb的产量，采用了多种策略，包括定制载体设计、优化生长培养基配方、控制培养条件和潜在的细胞工程增强。 2.构建策略 表达载体在CHO细胞内异源rMAbs的表达中起着关键作用。这个载体基本上控制着rMAb在瞬时和稳定表达中的表达程度和质量。图1所示的表达质粒所涉及的步骤包括从启动子转录、RNA剪接生成mRNA、mRNA翻译、翻译调控等。为了提高这些外源基因的表达效率，在载体构建中采用了各种方法。 1.启动子：目前CHO细胞表达载体中使用的突出启动子来源于猴空泡病毒40（SV40）、人类巨细胞病毒（CMV）即刻早期（IE）启动子和延伸因子-1α（EF-1α）。其中，EF-1α启动子的效力最高。对启动子的修改已经证明能够增强CHO细胞中的抗体生产。 2.5'-非翻译区（5'-UTR）：在Hsp70 mRNA的UTR中发现了一个增强翻译的元素，增加了依赖帽子结构的翻译效率。5'-UTR内的RNA结构被公认为影响翻译效率的角色。这一见解提供了一种系统的方法来微调哺乳动物细胞中的蛋白质表达水平，最终有助于提高重组蛋白的表达。 3.内含子：内含子在调节外源基因表达中具有增强能力。之前已经进行了比较分析，研究了五种不同内含子对CHO细胞中外源基因表达的影响。在这些内含子中，SV40内含子在瞬时和稳定转染条件下均显示出最高的外源基因表达水平。值得注意的是，该内含子还在CHO细胞内显著提高了重组蛋白的生产。 4.信号肽：新合成的蛋白质通过其信号肽从细胞质转移到内质网（ER），这是蛋白质分泌的关键阶段，特别是在抗体的情况下。通过使用小鼠IgGκ信号肽，已成功在CHO细胞表达系统中高效生产CYTL1蛋白。此外，已经展示了对HC和LC的信号肽进行优化，展示了它们在实现CHO细胞中治疗性抗体高效表达中的作用。 5.密码子优化：将抗体可变区中的密码子替换为天然人类抗体基因中的首选密码子，可显著提高哺乳动物细胞中抗体表达水平，增加幅度从两到三倍。在密码子和/或5'-UTR内精炼序列应进一步增强HC和/或LC蛋白的翻译，就像优化mRNA UTR以改善治疗性mRNA和mRNA疫苗的表达。实际上，已经证明HC基因的基因优化可以增强其mRNA稳定性，进而增加抗体生产。 图1：在哺乳动物细胞（例如中国仓鼠卵巢细胞）中表达重组抗体。已经采用了几种方法来增强重组抗体的表达，例如选择启动子、结合含有5'-UTR的内含子、优化表达基因的密码子、控制LC/HC的比例等。HC：重链，LC：轻链，UTR：未翻译区域。 除了上述构建表达质粒的方法外，出现了多种策略以促进CHO细胞中rMAbs的表达。这些策略包括单顺反子载体、双启动子表达载体和由内部核糖体进入位点（IRES）或Furin-2A介导的双顺反子载体[图2]。单顺反子载体从质粒表达单一蛋白。在CHO细胞内生成rMAbs时，使用两个单独的单顺反子载体分别表达HC和LC[图2(I)]。在双启动子表达载体中，两个不同的启动子分别调控HC和LC mRNA的转录[图2(II)]。然而，双启动子载体的能力本质上是有限的，这在容纳超过两个转录单元时带来挑战。这种限制限制了这种方法的应用。另一方面，双顺反子载体使LC和HC能够在单个mRNA中共同表达，由单个启动子驱动。这些载体为LC和HC蛋白提供平衡的生产水平，从而在最小化聚集和一致的糖基化的情况下提高rMAb表达。可以使用IRES或Furin-2A肽制定两种变体的双顺反子载体[图2(III)]。 图2：重组单克隆抗体表达载体的示意图 (I) 单顺反子载体， (II) 双启动子表达载体， (III) 双顺反子载体： (a) IRES介导的载体，(b) Furin-2A介导的载体。HC：重链，LC：轻链，PolyA：聚腺苷酸信号，IRES：内部核糖体进入，F2A：Furin-2A。通常使用的启动子来源于猴空泡病毒40、人类巨细胞病毒即刻早期启动子和延伸因子-1α。普鲁霉素和硫酸blasticidin被广泛用作筛选抗生素，以建立稳定的细胞克隆。 IRES是发现于某些病毒基因组中的非编码序列片段，通常位于RNA病毒（例如脑心肌炎病毒和丙型肝炎病毒）的5'-UTR。IRES促进帽子独立翻译启动，能够从单一mRNA转录本表达多种蛋白。另一方面，Furin-2A介导的载体由于其高效的“自切割”机制而成为一个可行的选择，确保从单一开放阅读框中比较均衡地表达轻链和HC。2A肽是由大约20个氨基酸组成的“自切割”肽，存在于小核糖体病毒中。已知有四种2A肽，分别来自口蹄疫病毒（F2A）、马鼻炎病毒（E2A）、猪睾丸病毒-1（P2A）和Thosea asigna病毒（T2A）。在LC和HC多肽之间整合2A肽，通过2A多肽C-末端的共翻译切割，触发不同的LC和HC段的生产，从而实现HC和LC蛋白的平衡共表达。 除了像普鲁霉素（PURO）这样的抗生素筛选系统外，另一种方法涉及创建二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞，这些细胞可以使用含有甲氨蝶呤的培养基进行培养和筛选。这种技术允许在有限的时间内生成稳定的细胞系。 此外，整合普遍染色质开放元件（UCOES）序列已被证明能够增强CHO细胞中的抗体生产。UCOEs的特征在于它们能够可靠地提供稳定的转基因表达，这种表达与整合位点无关，并且与拷贝数直接成比例。在结构上，UCOEs由无甲基化CpG岛组成，这些岛包含单向或双向转录的管家基因启动子。 3.在CHO细胞中表达rMAbs过程中遇到的各种困难 在CHO细胞中表达rMAbs时出现了许多挑战。某些障碍可能会影响这些rMAbs的有效性，需要解决。 3.1. 聚集 鉴于在动物和人类中引发免疫原性反应的潜力，控制治疗产品中抗体聚集至关重要。使用CHO细胞生产rMAbs时，由于诸如氨基酸序列、细胞系特性、克隆多样性和细胞培养条件等因素，产生的抗体聚集可能会有所不同。抗体聚集的性质可以根据溶解度、共价或非共价相互作用、可逆性和单体变性而不同。值得注意的是，较低的培养温度可以在稳定表达rMAbs的CHO细胞中增加抗体聚集形成，这是由于LC和HC的转录增加，加上内质网机械的限制。可以使用尺寸排除色谱法检测这些聚集体。 为了减少聚集趋势，已设计了许多策略。例如，将海藻糖（一种由两个α-葡萄糖单元组成的二糖）纳入培养基中，已显示出避免聚集的前景。此外，与抗体共表达分子伴侣，例如二硫异构酶蛋白二硫异构酶（PDIa4），可以通过避免抗体的错误折叠有效减少聚集体的形成。 3.2. 翻译后修饰 3.2.1. 糖基化 rMAbs最常见的翻译后修饰涉及CH2域（HC的恒定区域）中保守的天冬酰胺残基的糖基化。在rMAb生产过程中的过程变化经常导致寡糖谱的变化。先前已经广泛研究并回顾了在rMAbs中常见的寡糖，详细说明了它们对结构、稳定性和生物功能的影响。值得注意的是，rMAbs上的特定糖型可以对其生物活性和治疗特性产生重大影响。例如，高甘露糖可以加速抗体清除率，而无岩藻糖基化、双分支GlcNAc残基和高甘露糖可以增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。相反，去糖基化的IgG抗体缺乏引发体内炎症反应的能力。因此，为了治疗目的，在CHO细胞中生产去糖基化的rMAbs是首选的。 3.2.2. 羟基化 在rMAbs中观察到赖氨酸残基的羟基化，位于共识序列（XKG）中，这被认为是其他蛋白质（如胶原蛋白）中的修饰位点。这种羟基化被推测是由CHO细胞中与赖氨酸羟化酶复合体相当的活性产生的。这种与胶原蛋白的类比和共识序列的存在导致了CHO细胞在rMAbs中对赖氨酸进行羟基化的类似酶促过程的假设。 3.3. 遗传不稳定性 在通过工程哺乳动物细胞进行rMAbs的工业生物加工中遇到的一个主要挑战是细胞系不稳定性的发生。这种现象涉及生产细胞系的特定生产力下降。生产的不稳定性可以归因于两个关键机制：（1）表观遗传不稳定性，特征是甲基化诱导的启动子（如CMV IE）的转录沉默，该启动子负责驱动rMAb基因的转录；（2）遗传不稳定性，表现为在增殖的CHO细胞群体中rMAb基因拷贝数的逐渐减少。 3.4. 片段化 rMAbs的片段化是一个普遍的挑战，影响蛋白稳定性，需要在生产过程开发过程中进行严格的质量控制监督。残留宿主细胞蛋白酶的存在是导致rMAbs片段化的一个重要因素。 3.5. 二硫键还原 在CHO细胞培养中生产的rMAbs在收获程序和/或蛋白A色谱阶段可能会发生链间二硫键的显著还原。这种现象可能导致检测到包含LC、HC以及两者的多种组合的抗体片段。 3.6. 蛋氨酸氧化 蛋氨酸（Met）残基的氧化是蛋白质降解的常见途径之一。在rMAbs的背景下，特定Met256和Met432残基的氧化被识别为导致其与蛋白A和蛋白G的相互作用发生变化。这种改变导致rMAb与这些蛋白质之间的结合亲和力降低。 3.7. 移码突变 移码突变可能导致预期氨基酸序列的完全改变，可能影响蛋白治疗剂的生物功能，并引入免疫原性风险。值得注意的一个例子是在细胞系筛选研究过程中，使用CHO细胞生产的治疗性IgG1 rMAb中发现并分析了一种新-1移码变体。 4.培养条件 在过去几十年中，细胞培养技术经历了显著的进步，已转变为一种相对可靠和有韧性的方法。这一进展中的一个关键成就是增强型化学定义培养基的创造和商业可用性。媒体发展的另一个显著突破是向无血清配方的转变。 培养基组成的优化导致了提出加入各种化学物质以增强细胞培养条件的建议。其中，特定代谢物如苏氨酸和花生四烯酸被提出作为细胞培养基的潜在添加物。值得注意的是，丁酸钠（NaBu）因其能够提高CHO细胞中rMAbs的特定生产力而受到关注。这种效应归因于NaBu对rMAbs的半乳糖基化的影响，从而改善了这些抗体的正确组装。 单克隆抗体是复杂的异质糖蛋白，经历多重翻译后修饰，导致各种变体，例如特定mAb的电荷变体。通过阳离子交换色谱法可以检测到电荷变体，其中酸性mAb峰先于主峰，碱性mAb峰后于主峰。传统上，离子排除色谱（IEC）已用于mAb纯化。先前的研究调查了细胞培养过程控制和离子补充对CHO细胞产生的mAb电荷变体的影响。研究发现，在3L生物反应器中的最优条件下，特别是Zn2+和温度变化，观察到显著的增强，进一步提高了抗体质量。主峰增加了12%，酸性峰减少了16%，滴度没有明显损失。这些结果为增强mAb生产中遇到的电荷变体提供了宝贵的见解。 此外，连续灌注已证明能够维持比间歇灌注培养更高水平的细胞密度、产品滴度和质量。通过结合高灌注率和在第6天延迟降低培养温度，产品滴度达到了16.19 g/L的峰值水平，单体的相对丰度为97.6%。为了验证优化的灌注培养在更大规模上的有效性，使用了200L生物反应器，到第16天产品滴度最高达到了16.79 g/L。这项研究为通过优化的灌注培养策略实现CHO细胞高效生产mAb提供了宝贵的见解。 5.宿主细胞工程 宿主细胞工程已成为通过操纵CHO细胞中特定基因表达来增强rMAbs生产的一种策略。许多研究的焦点是凋亡，这是一种重要的细胞死亡形式，这促使开发了通过各种策略产生抗凋亡细胞系。这些策略包括引入抗凋亡Bcl-2样蛋白、抑制促凋亡因子或抑制p53肿瘤抑制蛋白等方法。同样，在重组CHO细胞中过度表达人类端粒酶逆转录酶也被追求以促进增殖并增强对凋亡的抵抗力。此外，过度表达分子伴侣已被用来促进重组且通常复杂的蛋白质的有效成熟，或减轻未折叠蛋白反应，以对抗来自细胞压力的凋亡。 在CHO细胞内提高细胞分裂周期25同源物A的表达，有可能通过在细胞系开发的初始阶段操纵细胞周期来增强传统基因放大系统。因此，这种操纵导致转基因拷贝数迅速增加，转基因表达显著放大。 在异源蛋白表达中的另一个挑战涉及分泌途径，从新生多肽链的易位到ER开始。不正确的信号肽切割可能导致LC聚集。为了减轻这个问题，已进行了SRP14（信号识别粒子的一个组成部分）的过度表达，从而显著提高了难以生产的抗体的特定生产力。 此外，已经证明PDI的短暂过度表达可以提高rMAb分泌率。此外，已经确定了两种miRNA（miR‑557和miR‑1287）对表达rMAb的CHO细胞中的活细胞密度和特定生产力的积极影响。 为了通过增加突变来增强rMAbs的亲和力，探索了几种策略。激活诱导的胞嘧啶脱氨酶（AID）通过将脱氧胞嘧啶转化为脱氧尿嘧啶来启动体细胞超突变，从而诱导额外的突变。AID在B细胞中多样化抗体库中发挥关键作用。将表达AID的质粒引入CHO细胞已被用来提高所产生抗体的亲和力、特异性和稳定性。 6. 影响重组单克隆抗体产量的因素 除了CHO细胞外，还采用了多种系统来生成重组蛋白，包括瞬时和稳定表达方法。探索在其他细胞类型中使用的条件下在CHO细胞中应用的可能性可能是有价值的。 6.1. 2-氨基嘌呤对重组单克隆抗体在仓鼠卵巢细胞中生产的影响 2-氨基嘌呤（2-AP）对CHO细胞中rMAb生产的特定影响尚不清楚。然而，在人类细胞系中，2-AP已被证明可以增强外源基因的瞬时表达。在CHO细胞中可能观察到类似的效应，可能导致rMAbs的瞬时表达增加。需要进一步的研究来确定2-AP对CHO细胞中rMAb生产确切影响。 6.2. 蛋白激酶R和核糖核酸酶L对仓鼠卵巢细胞中重组单克隆抗体瞬时表达的影响 蛋白激酶R (PKR) 和 2'-5'联腺苷酸依赖性核糖核酸酶L (RNase L) 是已知的限制干扰素处理细胞中病毒复制的细胞内酶，并且可以抑制异源基因的瞬时表达。PKR和RNase L对CHO细胞中rMAb瞬时表达的影响可能涉及类似的瞬时基因表达抑制。它们的存在可能会降低瞬时表达期间rMAb生产的效率。那么，在PKR敲除和/或RNase L敲除CHO细胞中，rMAb的瞬时表达可能会得到增强。 6.3. 腺苷脱氨酶对RNA 1在仓鼠卵巢细胞中重组单克隆抗体瞬时表达的影响 信息表明，腺苷脱氨酶对RNA 1 (ADAR1) 的共表达可以在多种细胞系中增强基于质粒的基因表达。这种增强似乎与启动子类型、蛋白报告基因和细胞系无关。因此，合理推测CHO细胞中ADAR1的共表达也可能通过提高基因表达效率来增强rMAb的瞬时表达。然而，与任何实验操作一样，实际效果需要在CHO细胞中rMAb生产的特定环境中验证。 6.4. Bcl‑xL表达对重组单克隆抗体瞬时和稳定表达的影响 信息表明，Bcl-xL抗凋亡蛋白的瞬时表达可以延长细胞存活并保护细胞免受凋亡。虽然这种效应可能通过提高细胞活力来潜在增强rMAb的瞬时表达，但它不一定直接促进稳定表达。稳定表达涉及不同的机制，包括转基因整合到宿主细胞基因组中，这可能不会直接受到像Bcl-xL这样的抗凋亡因素的影响。需要进一步研究以评估Bcl-xL表达对rMAb瞬时和稳定表达的影响。 6.5. 蛋白二硫异构酶表达对重组单克隆抗体瞬时和稳定表达的影响 信息表明，PDI的瞬时过表达可以增加rMAb的分泌速率。与Bcl‑xL类似，PDI对稳定表达的影响可能因涉及的不同机制而不同。虽然PDI可能在瞬时表达期间潜在增强rMAb的分泌效率，但稳定表达依赖于各种因素，包括染色体整合和转基因表达的长期维持。需要额外的研究来确定PDI表达对CHO细胞中rMAb瞬时和稳定表达的影响。 6.6. 温度对仓鼠卵巢细胞中重组单克隆抗体生产的影响 通过在CHO细胞中实施较低的温度，已经注意到rMAb瞬时生产的改善。相反，降低培养温度可能会增加稳定表达rMAb的CHO细胞中抗体聚集物的形成。调查瞬时和稳定表达之间差异的分子机制将是一项迷人的工作。 6.7. 合成5'-非翻译区对仓鼠卵巢细胞中重组单克隆抗体生产的影响 通过涉及设计、筛选和优化5' UTRs的高通量策略，发现了三种增强CMV启动子蛋白表达的合成5'-UTR。这些合成5'-UTR对CHO细胞中rMAb生产的影响值得进一步研究。 6.8. 3'-非翻译区对仓鼠卵巢细胞中重组单克隆抗体生产的影响 除了5'帽子、5'-UTRs、编码区和聚腺苷酸尾巴之外，3'-UTR在减轻mRNA疫苗的免疫原性、确保mRNA疫苗的细胞内稳定性和翻译效率的一致改进中起着至关重要的作用。5'-UTR和下游的3'-UTR对mRNA疫苗的稳定性都有很大的贡献。因此，探索3'-UTR对CHO细胞中rMAb生产的影响是一个值得进一步研究的主题。 7.结论 事实上，自从CHO细胞问世以来，它们一直是科学研究和工业生产rMAb的首选，大约75%的相关科学出版物持续使用这些细胞。过去十年中这一稳定的百分比表明，CHO细胞可能会在可预见的未来继续在哺乳动物细胞培养中的蛋白表达中发挥关键作用。尽管它们有着悠久的历史，但持续的努力正致力于改进CHO细胞中rMAb的生产。 多个领域的进步正在促进CHO细胞中rMAb生产的持续改进。这些包括改进培养基配方以优化培养条件，开发更高效的表达载体以增强基因表达，以及探索旨在增加CHO细胞中rMAb表达水平的多种细胞工程技术。随着对rMAb的需求增长和应用多样化，研究和开发工作有望进一步推进基于CHO细胞的蛋白表达平台的能力和潜力。 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 时间：2024年10月16-17日 地点：上海张江（酒店定向通知） 规模：600-800人 主办单位：生物制品圈、抗体圈 演讲支持：Entegris、瑞孚迪、AS ONE CORPORATION 会议费用：免费FREE!（仅收取100元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），先到先得，报完即止！ 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！ 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 日程安排 更多嘉宾正在邀请中 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：mRNA疫苗作为有前景的癌症疗法已经发展起来。这些疫苗可以编码与肿瘤相关的抗原，从而实现个性化的治疗方法。它们还可以针对癌症特有的突变，并克服免疫逃逸机制。它们通过操纵身体的细胞功能来产生抗原，引发免疫反应，并通过克服与特定组织相容性白细胞抗原分子相关的限制来抑制肿瘤。然而，成功地将mRNA传递到目标细胞是一个关键挑战。病毒和非病毒载体（脂质纳米颗粒和阳离子脂质体）在保护mRNA免受破坏和协助细胞摄取方面显示出了巨大的能力。细胞穿透肽、水凝胶、基于聚合物的纳米颗粒和树状分子已被研究以增加mRNA的传递效率和免疫原性。这篇全面的综述探讨了mRNA疫苗及其用于癌症的传递平台，涉及设计考虑、多种传递策略和最新进展。总体而言，这篇综述为mRNA疫苗作为有效癌症治疗的创新策略的进展做出了贡献。 1.引言 mRNA疫苗领域在mRNA疫苗成功对抗传染病之后经历了突破性的进步。mRNA疫苗在提供针对病毒病原体的特异性和引人注目的免疫反应方面的空前成功，激发了对mRNA治疗癌症疗法的强烈研究努力。癌症疫苗历来包括与癌症相关的抗原（CAAs）、免疫刺激剂和癌症特异性抗原（Ags）。与传统疫苗相比，它们提供了多种优势，如编码多种蛋白质、引发强大的免疫反应以及促进快速开发和生产。mRNA疫苗可以表达包含众多表位的完整Ags，同时绕过主要组织相容性复合体（MHC）的限制。然而，将mRNA疫苗传递到目标细胞面临着重大挑战。 mRNA疫苗的成功在很大程度上取决于推进有效的传递平台，这些平台确保mRNA的稳定性、保护和有效的细胞内传递。各种传递平台被开发出来，以提高mRNA疫苗的效力，同时最小化潜在的不良反应。基于脂质的纳米颗粒（LNPs）在mRNA疫苗开发中至关重要，它们可以成功地封装和保护mRNA分子，促进细胞摄取，实现内质网逃逸，并帮助有效地转化为Ags。脂质化学和配方技术的最新进展显著提高了LNPs的效力，导致在临床前和临床环境中成功传递mRNA。 病毒载体长期以来被用于基因传递，并作为mRNA疫苗载体获得了相当大的关注。这些载体可以有效地转导目标细胞，实现mRNA的细胞内传递以进行后续翻译。病毒载体提供高转导效率，并可以触发强大的免疫反应。然而，安全问题、预先存在的免疫力和有限的货物容量提出了挑战，这些挑战必须得到解决，以便它们在mRNA疫苗传递中的成功应用。 基于聚合物的载体作为mRNA传递平台被探索，并由于其多功能性、生物相容性和可调节属性提供了多种优势。它们与细胞膜的有害电荷组分进行静电连接，帮助细胞摄入并促进从内质网转移。此外，将靶向配体整合到聚合物载体上允许特定部位的传递和提高效力。基于肽的传递平台作为mRNA传递平台得到了发展，它们利用其低毒性、合成简便和潜在的靶向传递能力。肽可以被设计成具有固有的细胞穿透属性或针对特定细胞表面受体，促进有效的mRNA摄取和细胞内传递。细胞穿透的、pH响应的和自组装肽在增强mRNA疫苗传递和随后Ags表达方面显示出了有希望的结果。这篇综述讨论了不同mRNA疫苗在临床前和临床开发中的现状。它通过关注关键考虑因素，如mRNA修饰、Ags选择和佐剂整合，来优化它们的设计。此外，它探讨了用于将mRNA传递到目标细胞的多种策略，包括病毒载体和基于脂质的纳米结构、基于聚合物的载体、基于肽的支架系统和纳米材料。此外，这篇综述强调了最近的进展和创新方法，如树状分子和离子电渗技术，旨在克服与mRNA疫苗传递相关的挑战。这些进步旨在提高mRNA疫苗传递平台的安全性、效力和转化潜力。我们的综述最后通过追踪mRNA疫苗及其传递策略的演变，从它们在传染病和癌症治疗中的成功应用开始。这篇综述为mRNA疫苗和先进的传递平台提供了深入的分析，为这一有前景的领域的当前状态和前景提供了宝贵的见解。 2.mRNA疫苗 RNA分子作为一类治疗药物获得了显著的认可，尤其是在成功开发2019冠状病毒病（COVID-19）疫苗之后。这一突破为针对传统上具有挑战性和“不可成药”的目标以及在基因层面治疗疾病开辟了新的可能性。mRNA疫苗代表了一种有前景的癌症治疗方法，提供了特定且耐受性良好的治疗选择，已在临床前研究中显示出对实体肿瘤的有效性。例如，采用生物信息学驱动的策略开发了一种专门针对卵巢癌和乳腺癌中的癌症抗原125（CA-125）的mRNA疫苗。疫苗设计包括自佐剂特性和计划增加树突状细胞（DCs）抗原呈递能力的元素。检测到干扰素-γ（IFN-g）和分化簇8阳性（CD8+）T细胞激活，验证了疫苗的潜力。为了获得强大的抗肿瘤效果，必须有效地传递和翻译编码肿瘤抗原的mRNA，并同时触发先天免疫反应以促进抗原呈递。因此，针对DCs是提高疫苗效率的有利方法。目前，已经探索了多种策略来特别针对DCs。一种方法涉及使用抗原传递载体，包括纳米颗粒或脂质体，这些载体装饰有与DC受体、DC-SIGN或CD40特异性相互作用的配体。这些配体促进DCs选择性地摄取抗原，促进抗原呈递给T细胞。此外，在疫苗配方中加入佐剂可以激活DCs，进一步增强其刺激免疫反应的能力。这种针对性疫苗在提高包括癌症和传染病病原体在内的各种疾病的疫苗精确度和效力方面具有巨大潜力。这一进展是治疗性癌症疫苗研究的一个重要里程碑。表1总结了不同的mRNA疫苗、目标抗原和临床前及临床试验的关键发现（表1）。 2.1.mRNA疫苗在临床前试验中 众多的临床前研究已经调查了针对多种类型癌症的各种mRNA疫苗。最近的研究调查了肿瘤衍生RNA作为设计基于树突细胞（DC）疫苗的抗原来源及其在肿瘤疫苗策略中的有效性。Kyte等人进行了自体肿瘤mRNA树突细胞（tDCs）作为针对黑色素瘤的疫苗的临床前评估。tDCs诱导了对肿瘤特异性抗原的T细胞反应。该研究表明tDC特异性反应，包括所有六名患者中的T细胞增殖，在两名患者中分泌干扰素-γ（IFN-g），以及一名患者中HLA的阻断。此外，Kyte等人证明tDC疫苗无毒性，并成功在黑色素瘤患者中诱发T细胞反应。Key等人的另一项研究旨在评估有趣的T细胞反应并调查它们作为加强剂量的持续长期效力。他们展示了针对抗原的显著细胞介导的免疫反应。此外，研究确认即使在来自单一细胞的T细胞克隆中，辅助性T细胞1/2（Th1/Th2）细胞因子谱也是混合的。这表明疫苗本身可能不足以作为单一疗法，并为其与免疫检查点抑制剂（ICIs）的结合提供了强有力的理由。这项评估突出了这种组合作为恶性黑色素瘤疫苗策略的潜在用途。 佐剂用于选择性激活不同的免疫组分，从而增强疫苗的免疫刺激性活性。mRNA疫苗中使用的佐剂可分为三组：（1）具有自我佐剂特性的RNA，（2）传递系统的组成部分，以及（3）外部免疫刺激剂。临床前调查提供了证据，证实了将ICIs和癌症疫苗结合用于非免疫原性肿瘤治疗的使用。这种方法在免疫治疗领域呈现了一个有希望的途径。Liu等人合成了带有血凝素（HA）标签的黏蛋白1（MUC1）mRNA，以制定mRNA疫苗。使用脂质/钙/磷酸盐（LCP）系统作为佐剂开发mRNA疫苗。在这项研究中，评估了编码MUC1新抗原的mRNA疫苗的有效性，旨在激活位于淋巴结内的DCs。研究展示了成功的T细胞刺激和扩增，特别是针对三阴性乳腺癌（TNBC）肿瘤。为了进一步提高mRNA疫苗的抗肿瘤效力，它与明确针对细胞毒性T淋巴细胞蛋白4（CTLA-4）的抗体结合使用。疫苗诱发了强大且针对性的CTL反应，疫苗和特定CTLA-4抗体的同时给药显著增强了对肿瘤的免疫反应。Gu等人调查了通过将Toll样受体（TLR）2/6 mRNA，特别是Pam2Cys（一种佐剂），纳入脂质纳米颗粒（LNPs）来增强mRNA疫苗效力。用这种疫苗进行免疫调节了引流淋巴结（dLNs）中的免疫微环境，导致包括白介素-12（IL-12）和IL-17在内的关键细胞因子的释放。抗原呈递主要由迁移性和dLN驻留的传统2型DCs促进，导致CD4+和CD8+ T细胞介导的强大抗肿瘤反应。 在另一项研究中，Tse等人证明编码构成型激活的干扰素基因刺激物V155M（STINGV155M）蛋白的mRNA作为增强CD8+ T细胞反应的有效遗传佐剂。疫苗诱导的干扰素刺激反应元件和核因子kB途径激活了I型干扰素反应，并增强了抗原特异性T细胞。用编码E6和E7肿瘤蛋白和STINGV155M的mRNA进行疫苗接种，导致人乳头瘤病毒阳性（HPV+）TC-1肿瘤小鼠模型中肿瘤生长减少。这项研究为mRNA编码佐剂在增强疫苗效力方面的有效性提供了令人信服的证据。 另一种方法涉及将mRNA疫苗NP与佐剂C16-R848结合使用，这增强了合成mRNA疫苗在癌症治疗中的效力。这种由编码卵清蛋白（OVA）的mRNA和带有C16-R848涂层的脂质-聚乙二醇（PEG）壳组成的配方，保留了佐剂的活性。它显著提高了mRNA转染效率，并通过MHC类I促进了抗原的呈递。这种方法通过增强OVA特异性CD8+ T细胞的增殖及其在肿瘤床中的积累，刺激了有效的T细胞介导的免疫反应。张和夏开发了一种自佐剂mRNA纳米疫苗用于癌症治疗。这种纳米疫苗由编码肿瘤抗原的mRNA和类似脂质的材料（C1）组成。它有效地将mRNA传递给DCs，并同时刺激TLR4，从而激活T细胞。重要的是，这种纳米疫苗在几个小鼠模型中显示出显著的抗肿瘤效果。 TriMix由CD40L和CD70 mRNA以及TLR4组成，在晚期黑色素瘤中展示了佐剂活性。TriMix和TriMixDC-MEL的配方，由自体单核细胞衍生的mRNA共电穿孔DCs组成，在晚期黑色素瘤中展现了安全性和抗癌效果。Van Lint等人调查了CAA mRNA（酪氨酸酶相关蛋白-2 [Trp2]、Wilms肿瘤基因1 [WT1]或酪氨酸酶）与佐剂TriMix的淋巴结内递送。这种方法诱导了DCs的成熟，促进了LNs内CAA特异性T细胞的激活。研究表明选择性地摄取mRNA疫苗，导致CD11c+细胞在LNs中编码Trp2、WT1或酪氨酸酶。TriMix mRNA的存在创造了一个吸引和刺激CD4+和CD8+ T细胞的环境，特别是针对抗原。此外，这种疫苗在诱导CTLs和在小鼠模型中产生治疗反应方面显示出与mRNA电穿孔DCs相当的效力。这项研究强调了淋巴结内递送CAA mRNA，结合免疫调节mRNA作为一种有希望的疫苗策略的潜力。 Ramos da Silva等人进行了一项研究，涉及将自扩增mRNA以及未修饰和核苷修饰的非复制型mRNA封装进脂质纳米颗粒（LNPs）中，以开发疫苗。这些疫苗编码一种嵌合蛋白，包括HPV-16 E7肿瘤蛋白和1型单纯疱疹病毒糖蛋白D（gDE7）。该研究发现，即使是单次低剂量免疫接种这些gDE7 mRNA疫苗中的任何一种，都能激活特异性E7 CD8+ T细胞。此外，这些疫苗诱导的记忆T细胞反应能够预防肿瘤复发，并在不同生长阶段有效消除皮下肿瘤。此外，gDE7 mRNA-LNP疫苗在单剂量疫苗后，对同种异体小鼠肿瘤模型显示出显著的肿瘤保护效力。比较分析强调了这些mRNA-LNP疫苗比gDE7 DNA和gDE7重组蛋白疫苗的优越性。这项研究强调了基于mRNA的疫苗在癌症治疗免疫疗法中的潜力。 2.2.处于临床试验阶段的mRNA疫苗 最近的研究评估了使用mRNA疫苗针对癌症的可行性。在临床治疗的子宫癌患者中，给予含有WT1 mRNA的自体DC基础疫苗。HLA-A2阳性的患者观察到积极的肿瘤学和免疫学反应，而HLA-A2阴性的患者没有表现出这种反应。另一项临床试验涉及使用来自自体癌症干细胞的mRNA的单核细胞衍生的自体DC基础疫苗。接种疫苗的患者显示出强大的免疫反应和延长的无进展生存期。用剂量强度的替莫唑胺和编码pp65溶酶体相关膜糖蛋白的DC基础mRNA疫苗治疗胶质瘤患者，显示出延长的无进展生存期和增加的pp65细胞反应。Cafri等人开发了mRNA-4650，它编码自体癌症抗原。该疫苗包含来自患者肿瘤的肿瘤蛋白53（TP53）、KRAS或磷脂酰肌醇3激酶、催化亚单位α（PIK3CA）突变，以及多达15个预测的I类HLA新抗原。mRNA-4650在I/II临床阶段是安全的，并触发了针对预期新表位的突变特异性T细胞反应。由携带mRNA编码的肿瘤抗原癌症睾丸（CT）7、黑色素瘤抗原基因（MAGE）-A3和WT1的朗格汉斯型DC（LCs）组成的疫苗，通过抗原特异性CD4和CD8 T细胞诱导了干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）和肿瘤坏死因子（TNF）-α的释放，以及接种组内的克隆扩增。在临床研究中，基于DC的mRNA疫苗在多种癌症类型中显示出有希望的免疫反应和改善的生存期。 BNT162b2是一种核苷修饰的RNA和含有LNP的疫苗。Shroff等人比较了接受细胞毒性治疗的癌症患者和对照组对BNT162b2 mRNA疫苗的反应。首剂后，67%的癌症患者产生了中和抗体，第二剂后增加了3倍。尽管癌症患者显示出针对Spike蛋白的抗体和T细胞，但他们的反应比对照组弱。在癌症患者中识别出特定于Spike受体结合域的记忆B细胞亚群，可能预示着对额外剂量的更好反应。一项针对20名癌症患者的I期研究发现，给予第三剂疫苗使中和抗体增加了3倍，伴随轻微的不良反应，但没有T细胞改善。Harrington等人评估了16名慢性髓性白血病（CML）患者接受BNT162b2疫苗单剂量后的免疫效应，这些患者之前接受了酪氨酸激酶抑制剂治疗。在接种疫苗后21天内，87.5%的CML患者表现出抗Spike免疫球蛋白G（IgG），产生了中和抗体。在可评估的患者中，93.3%检测到T细胞反应，80%表现出多功能性反应，包括CD4+和CD8+ T细胞。慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤（CLL/SLL）患者在2剂BNT162b2 mRNA疫苗接种后没有显示出体液反应。然而，近四分之一的人对第三剂疫苗有积极反应。在接受积极治疗的个体和在接种前1年内接受抗CD20治疗的个体中，抗体反应率较低。Thakkar等人发现，第三剂BNT162b2疫苗在最初血清阴性的癌症患者中诱导了57%的血清转换。这种反应保持强劲，抗体水平、T细胞活性和中和能力持续6个月。在接受第三剂疫苗后没有产生足够反应的严重免疫受损的血液恶性肿瘤患者中，临床试验中的第四剂疫苗在67%的患者中增强了免疫力。然而，BNT162b2在不同队列中的免疫原性表现出差异。在骨髓增生性恶性肿瘤患者中反应强劲，达到88%，但多发性骨髓瘤患者表现出明显较低的反应，尤其是那些接受基于抗CD38的治疗的患者。总之，基于LNP的BNT162b2疫苗对接受积极化疗的癌症患者似乎是安全和有益的。 将编码抗原的mRNA和佐剂纳入阴离子脂质体配方可以增强mRNA疫苗的有效性。Tockary等人将RNA工程化，将佐剂与编码抗原的mRNA链结合起来。最终，双链RNA（dsRNA）-连接的mRNA被装载进脂质体配方中，有效地诱导了小鼠和人类DCs，导致大量促炎细胞因子的分泌。OVA mRNA配方已在临床上评估，并在小鼠淋巴瘤（E.G7-OVA）模型中取得了显著的治疗效力。精蛋白是一种小的阳离子肽，作为药物递送候选物质显示出前景。在自然界中，它通过静电键与DNA形成复合物，在精子发生过程中保护DNA的完整性。科学家采用了这种自然方法来开发药物递送平台，使用精蛋白作为RNA载体。在一项显著的应用中，为转移性黑色素瘤开发了一种受精蛋白保护的mRNA疫苗。这种疫苗编码多种肿瘤抗原，导致在I/II期疫苗接种试验中疫苗诱导的T细胞增加和免疫抑制细胞减少。RNActive由CureVac开发，使用编码OVA的修饰mRNA与精蛋白结合，赋予自我佐剂活性，触发针对癌症抗原的免疫反应。这一过程涉及TLR4的激活。RNActive疫苗可以引发强大的免疫反应，包括体液和细胞成分。它们还可以激活包括Th1和Th2细胞在内的耐药细胞亚群，这些细胞在协调免疫反应中至关重要。此外，这些疫苗可以触发短期效应反应和长期记忆反应。基于RNActive技术的mRNA疫苗CV9202显示出固有的自我佐剂特性。它可以针对非小细胞肺癌中常见的六种抗原，并刺激针对广泛CAAs的免疫反应。 CV9103和CV9104是基于RNActive技术开发的抗癌疫苗，专门设计用于针对被诊断为前列腺癌（PC）的个体的靶向治疗。在CV9103在I/II期试验成功后，目前正在对特定的去势抵抗和高风险PC患者进行CV9104作为术前新辅助治疗的临床评估。RNActive基础疫苗CV9201旨在治疗非小细胞肺癌（NSCLC）。它携带表达在NSCLC中的五种抗原的遗传信息。在一项I/IIa期剂量递增研究中，该疫苗显示出有希望的反应，在治疗后检测到免疫反应，支持进一步的临床研究。 最近，IIb期KEYNOTE-942/mRNA-4157-P201试验的积极结果代表了黑色素瘤治疗的重要进展。这项研究调查了Moderna的mRNA-4157个性化癌症疫苗，该疫苗包括一个合成的mRNA，编码34个新抗原，根据患者肿瘤的独特突变特征定制。它与Keytruda（pembrolizumab）联合作为辅助治疗，在完全切除后的III/IV期黑色素瘤患者中使用。 mRNA-4157/V940是一种开创性的基于mRNA的个性化癌症疫苗，专门针对每位患者量身定制，根据他们肿瘤的突变特征编码34个新抗原。当给药时，这种合成mRNA触发适应性免疫反应，为针对患者肿瘤突变的高度靶向的抗肿瘤反应做好准备。 将mRNA-4157/V940与Keytruda（一种增强免疫系统检测和对抗肿瘤细胞能力的免疫疗法）结合使用，预计将通过促进T细胞介导的肿瘤细胞破坏提供额外的好处。试验的突出成就是与单独使用Keytruda相比，复发或死亡的显著减少（44%）。这标志着首次证明由于程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）阻断，高风险黑色素瘤患者的无复发生存期得到改善，并表明个性化新抗原方法在革新癌症免疫疗法中的潜力。mRNA-4157/V940的不良事件与早期I期试验一致，Keytruda的安全性概况保持一致。总之，这些开创性的结果突出了像mRNA-4157/V940这样的个性化mRNA癌症疫苗与Keytruda等免疫疗法结合使用的前景，以推进黑色素瘤治疗。它们强调了定制化新抗原方法在癌症免疫疗法中的重要性，为改善患者结果和癌症斗争中的生存带来了希望。 3.mRNA疫苗传递平台 正在评估几种mRNA疫苗技术以引发靶向免疫反应。最近的文献综述探讨了将mRNA治疗剂纳入创新纳米级配方以增强癌症免疫疗法的潜力。此外，一项全面的综述检查了各种专注于提高基于mRNA的癌症疫苗效力的策略。这些综述强调了使用mRNA技术进行癌症治疗和免疫疗法的持续研究和兴趣。 基于现有科学数据，mRNA疫苗技术大致可分为两组：裸mRNA传递方法，包括电穿孔和离子电渗（IP）技术；以及靶向传递系统，包括基于脂质的传递系统，如脂质纳米颗粒（LNPs）和脂质体；聚合物纳米系统，如胶束、树状分子和聚合物水凝胶；基于肽的传递系统；基于碳纳米材料的传递系统；以及病毒载体介导的传递系统。选择这些标准是为了确保对mRNA疫苗传递格局进行全面准确的概述，从而在这个关键领域做出有力的结论和明智的决策。 3.1.裸mRNA传递方法 直接使用mRNA在DCs中产生T细胞反应（抗原特异性）并创造能够消除癌细胞的防御性抗体。通过使用电穿孔将mRNA传递给患者的DCs，这些疫苗技术有望增强免疫系统识别和靶向肿瘤细胞的能力。在结直肠癌的背景下，一项研究对疫苗接种方案进行了比较。具体来说，这项研究评估了两种不同方法的有效性：一种是使用与HLA-A2结合的源自癌胚抗原（CEA）的肽段脉冲的DCs，另一种是使用CEA mRNA电穿孔的DCs。分析表明，使用CEA肽段脉冲DCs有效地刺激了针对结直肠癌的特异性免疫反应。使用针对晚期黑色素瘤患者的单核细胞衍生DCs的mRNA疫苗，显示出显著的CD8+ T细胞反应。同样，将编码WT1抗原的自体成熟mRNA电穿孔DCs皮内注射给急性髓系白血病（AML）患者，也显示出积极的结果。含有自体DCs电穿孔自体癌症mRNA的黑色素瘤疫苗诱导了针对抗原的强烈免疫反应，表明其在体内引发免疫反应的潜力。从人类CD34+前体获得的LCs并用电穿孔WT1 mRNA，显示出持续呈现抗原肽段并诱导强烈的自体CTLs。这种方法消除了对外部细胞因子的需求，展示了mRNA电穿孔LCs作为癌症免疫疗法疫苗的潜力。然而，mRNA基治疗的更广泛应用面临着与它们对核酸酶的敏感性、进入抗原呈递细胞的细胞内传递以及免疫共刺激相关的挑战。克服这些挑战需要确保在传递过程中的稳定性和保护的靶向传递系统。为了推进这个领域，许多研究集中在开发针对癌症治疗背景下mRNA疫苗的靶向传递策略。 最近的一项综述提供了对合成RNA修饰的尖端方法的见解。这些创新方法主要关注核苷酸的改变，包括在50 UTR和30 UTR中纳入假尿苷以及RNA甲基化。这些修饰已被证明显著增强了基于RNA的疫苗的稳定性和效力。通过提高合成RNA的耐用性和性能，这些方法在推进疫苗开发和分子治疗领域具有巨大的潜力。这个研究方向强调了核苷酸工程在优化基于RNA的干预措施结果中的作用。 将IP技术与经皮传递系统相结合，成功地给药了最少的编码gp10025-33肽（KVPRNQDWL）的mRNA疫苗。IP刺激的mRNA疫苗传递引发了免疫反应并激活了皮肤驻留的免疫细胞。这种组合导致了免疫系统的强烈刺激，显著抑制了植入黑色素瘤细胞的小鼠中的肿瘤细胞。它还上调了IFN-γ并增加了肿瘤内CD8+ T细胞的浸润，从而有助于清除肿瘤。研究证明了IP用于传递mRNA疫苗的成功，对黑色素瘤治疗具有潜在的影响。 3.2.基于脂质的纳米系统用于mRNA疫苗传递 LNPs已被记录为mRNA疫苗的多功能传递平台。这些LNPs具有多个优点，包括易于组合和成分增强传递效率及最小化毒性。此外，通过包含佐剂或免疫细胞靶向配体，实现了对免疫反应的定制。LNPs目前在临床应用中最为先进。然而，这些系统涉及多个组分，并引起必须最小化以确保安全的炎症效应。近年来，有几项研究解决了提高LNP安全性的问题。这些努力包括开发可生物降解的LNPs，工程化具有不同脂质样分子的阳离子LNPs，设计增强内质网逃逸的LNPs，以及配制聚乙二醇化LNPs以减少不良免疫反应。此外，具有与环胺辅助的头基的环保阳离子脂质，已被证明可以提高LNPs的有效性和保护力。此外，基于交替共聚物的低炎症mRNA癌症疫苗载体PHTA展示了强大的抗肿瘤免疫反应及最小的炎症副作用，使其成为开发mRNA癌症疫苗的可能策略。 LNP颗粒的大小显著影响其免疫原性。包括稳定性和对目标蛋白的亲和力在内的多种因素，可以影响依赖LNP的RNA传递。例如，带有阳离子基团的脂质促进与内质网膜的静电相互作用，并使疫苗释放到细胞质中。此外，磷脂和聚乙二醇脂质共同促进了LNP介导的RNA传递的有效性。它们影响LNP在体内的清除和分布，进而影响基于LNP的RNA传递系统的性能。此外，包括像C12-200这样的立体纯衍生物在内的阳离子脂质可以影响LNPs的mRNA传递效率，这是由于它们的立体化学。此外，胆固醇和辅助脂质的结合显著促进了使用LNPs进行mRNA转染的有效性。因此，这些不同的脂质组分对于定制LNPs以有效传递RNA至关重要。 在四个LNP组分中，阳离子脂质起着基本作用。这些脂质在其常规pKa下带有正电荷，这使得在自组装过程中加载负电荷RNA到LNPs中成为可能。重要的是，它们在中性pH下保持不变，这有助于最小化毒性并保持LNPs在储存和传递过程中的稳定性。细胞摄取后，随着内质网pH的降低，这些LNPs重新获得正电荷，这有助于它们从内质网逃逸。磷脂中的乙醇胺基团由于其融合特性，可以增强内质网逃逸。此外，LNPs中磷脂的选择可以影响其传递特性。观察到中性磷脂主要促进肝脏传递，而带有负电荷的磷脂改变了LNPs从肝脏到脾脏的靶向。这种器官靶向的选择性可能是设计治疗应用RNA传递系统的有价值特性。 胆固醇通常被纳入作为调节LNP物理性质和纳米结构的调节剂，增强细胞内传递和体内LNP稳定性。结合聚乙二醇化脂质可能增强LNPs的胶体稳定性，延长它们的循环时间。同时，这可以减少它们被细胞摄取并阻碍它们从内质网释放。 通过使用微流体系统，可以制造精确大小的NPs，实现高效RNA封装，以高效率传递。在一项研究中，LNPs在保持一致的脂质组成的情况下系统地修改了大小。有趣的是，小鼠中较小的LNPs显示出显著较低的免疫原性，包括减少的免疫反应，包括抗体产生、免疫细胞激活和记忆细胞的产生。这些发现强调了优化LNP大小以最大化mRNA疫苗治疗效果的重要性。 LNP配方作为mRNA疫苗传递载体显示出显著潜力，证明了其引发强大CTL反应的能力。LNP介导的传递方法涉及分离患者的自体DCs及其随后与编码CAAs的mRNA转染。许多基于脂质的NPs正在作为mRNA疫苗载体进行调查，从而突出了一个积极的研究和开发领域。范等人调查了阳离子脂质辅助NPs（CLAN）作为mRNA疫苗载体。他们的发现揭示了CLAN有效地触发了DC成熟和抗原特异性T细胞增殖。此外，使用OVA mRNA封装的CLAN对携带淋巴瘤的小鼠进行静脉免疫接种，诱导了强大的OVA特异性T细胞反应，减少了肿瘤生长。这些发现突出了CLAN作为mRNA疫苗传递平台的有效性。 在一项相关研究中，一种名为C1脂质（C-12）的阳离子脂质类似化合物有效地将mRNA传递给抗原呈递细胞（APCs），同时激活TLR4并促进强大的T细胞激活。C1脂质可以通过吞噬作用促进mRNA疫苗摄取。此外，C1 LNP可以通过激活DC中的TLR4信号通路，刺激IL-12（一种炎症细胞因子）的表达。值得注意的是，依赖C1脂质的mRNA疫苗在癌症预防和治疗疫苗背景下展示了强大的抗肿瘤反应。此外，这些纳米复合物通过激活细胞质和内质网中的模式识别受体，诱导了先天DC免疫反应。它们还诱导了具有显著Th1特征的DC介导的适应性免疫。这项研究展示了阳离子脂质作为mRNA疫苗传递系统平台的潜力。 此外，一种针对淋巴结（LN）的LNP，称为113-O12B，增强了mRNA癌症疫苗的传递。它还增加了LN中的mRNA表达，并显著改善了对mRNA编码抗原的细胞介导的免疫反应。与PD-1抗体结合使用的LN靶向LNP系统在肿瘤模型中展示了改进的保护和治疗效果，展现了其作为mRNA疫苗多功能平台的潜力。 另外，一种包含棕榈酸-R848（TLR7/8的激动剂）的佐剂脉冲mRNA疫苗NPs的配方，展示了改善的mRNA转染效率和强大的获得性免疫反应。这种配方促进了特定抗原T细胞向肿瘤部位的渗透。它对淋巴瘤和前列腺癌模型有效，预防肿瘤生长和抑制已建立的肿瘤。因此，这种方法为开发有效的癌症免疫疗法提供了希望。 装载编码癌症相关抗原（CAAs）的mRNA的LNP显著减少了肿瘤，并在黑色素瘤模型中延长了总生存期。进一步包含脂多糖（LPS）增强了LNPs的免疫反应。包含修饰的N1-甲基假尿苷的mRNA的LNPs-mRNA疫苗配方在B16黑色素瘤模型中展示了显著的肿瘤减少、延长生存期和强大的免疫反应。这种配方增加了肿瘤内CD40+ DCs和多功能OVA特异性CD8+ T细胞，显示了有效传递mRNA疫苗的潜力。此外，携带OX40L mRNA的LNP显著减少了小鼠中H22肿瘤的大小。这表明LNPs可以是用于肝癌免疫疗法中系统传递mRNA疫苗的有价值工具。它们也可以作为传递mRNA疫苗的支架。Qiu等人对包裹在LNPs中的mRNA疫苗进行了系统评估。这种疫苗编码HPV的E7蛋白（HPV mRNA-LNP）。接种HPV mRNA-LNP疫苗激活了整体和HPV特异性CD8+ T细胞。此外，它通过肿瘤微环境中的不同IFN反应指导了CD8+ T细胞的功能承诺。与ICIs结合使用时，HPV mRNA-LNP疫苗进一步增强了HPV特异性CD8+ T细胞，同时保持了它们的抗肿瘤功能，导致肿瘤消退增强。这项研究突出了这种方法在癌症免疫疗法中的潜力。 包含甘露糖作为肿瘤特异性mRNA的靶向传递配体的改良LCP-NPs在正位模型中对三阴性乳腺癌（TNBC）展示了强大的CTL反应，通过与抗CTLA-4抗体共传递进一步增强。这突出了LCP系统用于靶向传递肿瘤特异性mRNA的潜力。此外，LCP-NPs被用作由RNAi基于的免疫治疗剂组成的纳米配方的载体。这种方法导致增强的T细胞反应，减少肿瘤生长，并降低转移。这些发现展示了使用LCP作为载体开发mRNA疫苗和其他基于RNA的免疫疗法的潜力。 脂质微粒（LMPs）最近作为传递mRNA疫苗的替代平台出现。像LNPs一样，LMPs可以有效地传递mRNA。它们在与免疫佐剂结合使用时显示出预防癌症的前景，确立了它们作为高效mRNA疫苗传递系统的价值。 这项研究强调了LNPs作为癌症免疫疗法框架中有前景的mRNA疫苗载体的潜力。 mRNA疫苗面临的一个重大障碍是它们易受降解。为了保护mRNA免受降解，设计了新的脂质体介导的传递方法。最近，一种通过将精蛋白和mRNA封装到1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷/胆固醇/1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇（DOTAP/chol/DSPE-PEG）阳离子脂质体中的mRNA疫苗被研究。这种配方展示了增强的摄取效率，并成功刺激了DC成熟，导致对特定肿瘤的显著抗肿瘤免疫反应。此外，由DOTAP、胆固醇缀合阳离子肽DP7、载体佐剂和mRNA组成的脂质体有效地抑制了肿瘤生长，同时增强了淋巴细胞反应。此外，合成了称为甘露糖-胆甾-缀合物（MPn-CHs）的靶向DC的脂质体，并用于配制靶向DC的脂质体（MPn-LPs），增强了mRNA表达并展示了靶向DC的mRNA疫苗的显著潜力。基于脂质体的mRNA疫苗LPX-mLMP2通过将mLMP2封装在DOTAP中合成。LPX-mLMP2展示了APCs对其的印象深刻的抗原摄取，导致有效的LMP2表达。疫苗在脾脏中积累，促进了DC成熟，并在体内引发了针对抗原的T细胞反应，最终在三次疫苗接种后显著减少了表达LMP2的肿瘤模型中的肿瘤生长。在另一种方法中，开发了修饰甘露糖的脂质体以传递总肿瘤mRNA，导致减少转移和黑色素瘤特异性CTL的产生。 最近的研究调查了阳离子脂质体用于mRNA疫苗传递，导致增强的DC成熟、肿瘤生长抑制和特异性免疫反应。 脂质体复合物（Lipoplexes）是阳离子脂质体非病毒合成脂质载体，广泛研究用于个性化癌症疫苗的临床应用。脂质体复合物用于第二代RNA疫苗。从实验室进展到临床使用的第一个产品是设计用于静脉给药的疫苗。它包括四种RNA脂质体药物产品，每个都编码黑色素瘤免疫治疗的常见肿瘤抗原。 I/II期临床试验正在评估针对非突变型癌症相关抗原（CAAs）的RNA-脂质体复合物疫苗，这些抗原包括MAGE-A3、酪氨酸酶、纽约食管鳞状细胞癌1和带有tensin同源性的跨膜磷酸酶，作为单一疗法或与抗PD1抗体联合治疗。这种疫苗能在经预处理、检查点抑制剂经验丰富的IIIB-C期和IV期黑色素瘤患者中引起持久的客观反应。值得注意的是，部分反应的患者表现出强烈的多表位CD4+/CD8+ T细胞免疫的诱导。 由聚乙二醇胆固醇（PEG-chol）和N-十六烷基-N,N-二甲基十六烷-1-溴化铵组成的mRNA脂质体复合物疫苗可以增强细胞内的蛋白表达。当作为免疫接种给小鼠时，这种疫苗增加了肺和脾脏中的蛋白表达，导致抗原特异性IgG1水平升高。尽管这些发现是有希望的，但需要进一步的研究和测试来评估这种疫苗用于人类潜在使用的安全性和有效性。 3.3.聚合物纳米系统用于mRNA疫苗传递 聚合物NPs在促进mRNA传递方面发挥着至关重要的作用，作为支架。在最近的一项综述中，概述了基于聚合物的系统的mRNA传递的关键组成部分，特别强调了分子设计标准、稳定性和生物分布等因素。 聚（β-氨基酯）（PBAE）聚合物可以与mRNA形成复合物。这些聚合物具有生物可降解性的优势，并且能够与水溶液中的带负电荷的mRNA自发自组装。它们具有独特的特性，包括高缓冲能力有助于内质网逃逸，正电荷有助于有效结合mRNA，以及能够水解降解为无毒副产品。最近，Kim等人开发了一种使用PBAE的冻干优化的mRNA疫苗传递载体。这项研究表明，通过胃肠道给药这种疫苗可以有效地传递并刺激免疫系统，导致诱导抗原特异性的细胞和体液免疫。 李等人开发了氟烷基化聚乙烯亚胺PEI（F-PEI）用于mRNA传递。F-PEI增强了细胞内mRNA传递并激活了TLR4介导的信号传导。此外，该团队使用了由F-PEI和编码肿瘤抗原的mRNA组成的自组装纳米疫苗。这些纳米疫苗诱导了DC成熟，实现了有效的抗原呈递，并随后触发了强大的抗肿瘤免疫反应。此外，基于F-PEI的mRNAOVA癌症疫苗在延迟已建立的B16-OVA黑色素瘤生长方面证明了其有效性。与ICIs结合使用时，基于F-PEI的MC38新抗原mRNA癌症疫苗成功抑制了已建立的MC38结肠癌并预防了肿瘤复发。因此，这些疫苗与ICIs的联合使用可能代表了一种增强对癌症的免疫反应并改善治疗结果的潜在策略。未来的临床试验需要验证这些方法在临床设置中的安全性和有效性。 为了mRNA传递，开发了一种新型自组装聚合物胶束，使用改性的PEI共聚物和维生素E琥珀酸酯（PVES）。这种胶束有效地将mRNA传递到各种细胞系，同时造成最小的细胞毒性。在小鼠研究中，使用PVES作为传递载体通过肌肉内给药mRNA疫苗。结果显示出强大的抗体反应，表明PVES是传递mRNA疫苗的安全有效载体。 树状分子是一类具有明确定义的树突状结构和协同多价性的聚合物，可以利用来传递mRNA疫苗。两亲性树状分子载体代表了先进的树状分子，是结合了脂质和聚合物载体特性的混合构建物。脂质组分赋予了与mRNA在其核心内部相互作用和包封的疏水性质。聚合物段提供了修改其表面性质和化学功能的灵活性，以增强靶向和细胞摄取。此外，脂质组分使树状分子能够像基于脂质的载体一样与膜融合，而聚合物段促进了类似聚合物载体的内吞作用，从而减少mRNA传递。这些载体具有精确且稳定的纳米尺寸结构，使它们适合传递mRNA疫苗。树状分子载体有效传递mRNA疫苗依赖于其两亲性质。亲水实体促进RNA结合和疏水性，从而稳定RNA复合物。这一独特的特性使得RNA作为稳定的复合物被包封，促进了其依赖内吞作用的摄取和释放到细胞质中。树状分子的两亲性质在成功的RNA传递中起着至关重要的作用。 基于聚合物水凝胶的疫苗传递系统因其在将疫苗有效地传递到特定生理部位方面的能力而受到研究关注。这些系统以其独特的属性为特征，增强了抗原传递并作为佐剂，增强了抗原诱导的免疫反应。例如，装载mRNA的聚(2-羟乙基甲基丙烯酸)水凝胶成功地传递到DC2.4细胞中。这种方法展示了延长释放和增强转基因表达的潜力，表明其作为提供免疫疗法中mRNA疫苗的替代方法的潜力。此外，聚乙烯亚胺和氧化石墨烯水凝胶被用来开发含有OVA mRNA和佐剂(R848)的纳米疫苗。这种水凝胶实现了mRNA至少30天的持续释放。释放的mRNA保护淋巴结免受降解，并促进了它们的目标传递。此外，实验数据表明，水凝胶显著增强了CD8+ T细胞特异性抗原产生，抑制了肿瘤生长。它还产生了抗原特异性抗体，有效地预防了转移。总的来说，这些发现强调了可注射水凝胶作为mRNA传递有前途方法的潜力。 3.4.基于肽的mRNA疫苗传递 细胞穿透肽(CPPs)因其能够穿越细胞膜并有效地传递核酸而迅速发展。CPPs作为肿瘤免疫疗法药物的潜力巨大。此外，通过结合适当的佐剂和应用如纳米技术等先进技术，可以显著提高mRNA疫苗传递的有效性。为mRNA疫苗传递设计了不同类型的肽(图2)。 图1. mRNA传递系统的示意图，用于高效编码抗原和激活树突状细胞（DCs） 包括封装在DOTAP/胆固醇/DSPE-PEG-精氨酸阳离子脂质体中的mRNA、阳离子DOTAP-胆固醇修饰肽（DP7）脂质体、MPn-CHs脂质体、甘露糖修饰脂质体、mRNA-脂质复合物和脂质复合物+ PEG-胆固醇在内的各种传递系统，有效地将mRNA传递到DCs中。mRNA编码的抗原刺激分泌如TNF-α等细胞因子，导致DC成熟。这些成熟的DCs随后释放IL-2和IL-12，激活CD4+和CD8+细胞，从而抑制肿瘤生长。 Lou等人开发了一种用GALA功能化的mRNA聚合物复合物的方法，展示了高转染效率和无细胞毒性的细胞摄取。用携带OVA mRNA的PPx-GALA配方处理，导致T细胞反应增加和DCs成熟，突出了其作为mRNA疫苗平台的潜力。作为mRNA疫苗传递平台，开发了一种富含精氨酸的CPP变体RALA。这种肽的独特序列和结构组织在作为mRNA疫苗载体的角色中至关重要。它与mRNA形成纳米复合物，能够在酸性pH依赖性方式中破坏膜，促进mRNA内质网逃逸并使其在DCs的细胞质中表达。RALA和修饰的mRNA含有假尿苷和5-甲基胞嘧啶，诱导了针对mRNA编码蛋白的强大CTL反应，突出了它们的优越效力。另一种方法涉及使用阳离子CPP(LAH4-L1)和聚乳酸NPs(PLA-NPs)。产生的纳米复合物通过吞噬作用和有衣小窝被DCs内化，导致大量蛋白表达。CPPs的不同肽序列，连同它们良好的生物相容性和它们所具有的特定目标内化能力，使它们成为一个有前途的替代mRNA传递平台。具体来说，使用大小<200 nm的双极CPP/mRNA复合物已证明能够有效地表达蛋白和细胞摄取。这些发现强调了CPPs作为癌症mRNA传递载体的有效性。 3.5.碳纳米材料用于mRNA疫苗传递 在癌症免疫疗法中，碳纳米材料因其独特的传递抗原和刺激免疫反应的能力而激增，以碳点(CDs)作为杰出的候选材料。Chen等人合成了能够结合mRNA并形成ACDs@mRNA纳米复合物的两亲CDs，显示出对脾脏的最佳目标传递。ACDs@OVA-mRNA配方有效地抑制了E47肿瘤生长，并增强了脾脏和癌症部位的癌症浸润T细胞，为推进肿瘤免疫疗法提供了有希望的结果。此外，荧光CDs被用作疫苗开发中的佐剂，与肿瘤蛋白抗原OVA结合。这种方法导致针对抗原的强大的细胞介导的免疫反应，成功地抑制了黑色素瘤癌症生长。这些研究强调了CDs作为疫苗接种中多功能工具的潜力。它们为改善包括癌症在内的各种医疗环境中的治疗结果提供了激动人心的机会。 图2. 肽介导的mRNA疫苗传递及免疫反应 携带OVA mRNA、RALA、含有假尿嘧啶和5-甲基胞嘧啶修饰的mRNA、阳离子CPP LAH4-L1、PLA-NPs、环肽纳米管（cPNTs）、两性CPP/mRNA复合物以及与海藻酸钠结合的SA@DOTAP-mRNA的聚阳离子肽GALA配方，有效地将mRNA传递到DCs中。信使RNA转录本被转化为蛋白质，然后被蛋白酶体（酶）切割成片段。由此产生的肽片段通过内质网运输，并通过MHC I类（MHCI）呈现给CD8细胞，增强T细胞反应。ER，内质网；TCR，T细胞受体。 碳纳米管（CNTs）因其固有特性，包括惰性、非免疫原性、无毒性和高稳定性，已成为疫苗开发的有希望的传递平台。CNTs的一个关键优势是它们能够有效地运输特定的抗原目标并促进它们向免疫系统的呈递。它们独特的结构允许同时有效附着多种抗原，在其表面产生多种抗原。然而，使用尺寸大于100纳米的碳纳米材料作为mRNA疫苗传递的支架存在几个挑战。这些挑战源于诸如不溶解性、形态不均匀、较大尺寸（小于100纳米）和潜在的肺部毒性等因素。这些考虑使得CNTs在mRNA疫苗传递中的实际应用更加复杂，尽管它们具有明显的优势。研究人员必须解决这些挑战，以充分发挥CNTs在基于mRNA的疫苗领域的全部潜力。 3.6.病毒载体介导的mRNA疫苗传递 病毒载体疫苗属于使用携带编码特定抗原的外来基因的遗传改变病毒颗粒的疫苗类别。在癌症疫苗开发领域，工程化的病毒载体、自复制RNA（小干扰RNA）病毒载体和重组病毒载体已成为有前景的溶瘤病毒（OVs）。这些OVs具有携带单链RNAs、特异性靶向肿瘤细胞并启动适应性免疫的能力。这种新方法在癌症疫苗和疗法的开发中具有巨大潜力。 TroVax()是一种改良的病毒载体疫苗，表达5T4癌症相关抗原。在I/II期人体试验中，它被耐受，没有不良反应，并在前列腺癌、肾细胞癌和结肠癌中诱发了特异性抗体反应。在随后的II期人体试验中，TroVax与化疗药物或ICIs结合使用，增强了抗原交叉呈递和免疫抑制细胞的清除。值得注意的是，与TroVax和同时低剂量IL-2的治疗在肾癌和结肠癌患者的存活率上表现出改善。 图3. 病毒载体介导的mRNA疫苗传递及其对免疫反应的影响的示意图 溶瘤病毒、重组病毒和自复制病毒被设计用于高效地将mRNA疫苗传递到肿瘤部位。这触发了包括先天/适应性免疫机制在内的强大抗肿瘤反应，导致激活凋亡途径、抑制血管生成，以及随后的肿瘤溶解和退行。 一项临床前研究展示了携带与前列腺癌相关的mRNA编码的六跨膜上皮抗原前列腺1的病毒载体平台的有效性。该研究观察到对抗原具有强大、持久的CD8+ T细胞反应，特别是在雄性BALB/c和C57BL/6小鼠株中。令人惊讶的是，尽管疫苗具有高度免疫原性，但其在小鼠PC模型中的保护效率相对较低，无论是可移植的还是自发的。然而，ChAdOx1-MVA疫苗和PD-1抗体组合在临床环境中显示出有希望的抗肿瘤反应。尽管如此，使用病毒载体也存在显著的限制，包括病毒基因组整合到宿主基因组以及宿主排斥的可能性，这可能导致细胞毒性和免疫原性。这些缺点促使人们探索癌症免疫疗法中传递mRNA疫苗的替代策略。 4.结论和未来方向 mRNA疫苗已被公认为一种强大的癌症治疗方法，提供了独特且耐受良好的治疗选择，已在临床前研究中证明有效。这些疫苗可以诱导多克隆免疫反应，并促进保护性抗体的产生，这是通过直接mRNA给药或将其引入DCs实现的。mRNA疫苗的优势在于它们能够编码多种蛋白质，从而克服与特定HLA分子相关的限制。COVID-19 mRNA疫苗的成功激发了人们对其在癌症治疗中潜力的强烈研究努力。 基于mRNA的癌症疫苗提供了编码多种蛋白质、引发强大免疫反应以及促进快速开发和生产的多种优势。然而，一个持续的挑战在于实现有效的mRNA疫苗传递，专门针对肿瘤细胞，这需要进一步的研究和开发。临床前试验已经证明了针对不同类型肿瘤的各种mRNA疫苗的有效性。临床研究集中在针对CAAs的有效mRNA疫苗上。在临床环境中，涉及分离患者自己的DCs并用编码CAAs的mRNA转染的技术正在被研究。基于mRNA的癌症治疗疫苗领域正在迅速发展，有几个领域需要进一步探索和发展。 通过各种传递平台实现mRNA疫苗的有效性，同时最小化不良反应。LNPs可以封装和保护mRNA，促进细胞摄取，并有效地转化为抗原。病毒载体也作为有效的mRNA疫苗载体，但需要解决与安全性、预先存在的免疫力和有限的货物容量相关的挑战。基于肽的传递平台有望增强mRNA疫苗传递和抗原表达。此外，纳米材料如CDs、CNTs和可注射水凝胶已被用于临床前和临床免疫疗法中的mRNA传递。其他技术，包括树状分子和离子电渗，正在被探索。总体而言，癌症免疫疗法中的mRNA疫苗显示出巨大的希望，正在进行的研究努力旨在优化它们的传递、改善免疫反应，并在临床环境中评估它们的有效性。 未来的研究应该集中在改进和优化传递系统，如LNPs、病毒载体和基于肽的平台。这些努力应该旨在提高它们的效率、稳定性、安全性和可扩展性。此外，识别和选择最佳的肿瘤特异性抗原对于提高mRNA疫苗的有效性至关重要。对CAAs和新抗原的额外研究可以导致针对个体肿瘤的有效靶向的个性化疫苗，提高它们的特异性和治疗潜力。探索将mRNA疫苗与ICIs或细胞免疫疗法相结合的协同方案，有望增强抗肿瘤免疫反应。这些联合策略可以克服免疫抑制的TMEs并改善总体治疗结果。进行稳健的人类试验以评估癌症治疗中mRNA疫苗的安全性、有效性和长期效益也是必要的。扩大临床研究的范围并探索不同类型的癌症将为mRNA疫苗的医疗效用提供宝贵的见解，并指导它们未来的发展。 为大规模疫苗接种建立成本效益的mRNA疫苗是具有挑战性的。应努力优化制造技术，降低生产成本，并确保一致的质量和批次间可重复性。对mRNA疫苗的免疫原性和潜在不良反应进行深入调查是必要的，以确保它们的安全性并最小化任何意外的免疫反应。了解mRNA疫苗引起的长期效应和免疫记忆对于它们在临床上的成功实施至关重要。开发稳健的生物标记和标准化的检测方法对于监测mRNA疫苗接种后的免疫反应至关重要，这对于评估疫苗效力、预测患者结果和指导治疗策略至关重要。将免疫监测方法整合到临床试验中可以为优化疫苗设计和剂量方案提供有价值的数据。通过解决这些问题，癌症免疫疗法中的基于mRNA的疫苗领域可以继续发展，为患者提供创新和有效的治疗选择，并有可能改变癌症治疗的格局。