TRPA1 x TRPV1

文章解读+创新点拓展，为您带来科研新体验～ 导读 随着单细胞测序技术和类器官培养技术的发展，科学家们对复杂生物系统的理解达到了前所未有的深度。近期，由张旭、吴倩和王小群领导的研究团队在《Cell》上发表了一篇重磅论文《Decoding transcriptional identity in developing human sensory neurons and organoid modeling》，通过构建人类胚胎期背根神经节（DRG）的时空发育图谱，开发了模拟人类DRG发育的类器官系统，揭示了感觉神经元分化的路径和调控机制。这项研究不仅加深了我们对神经系统发育的认识，也为未来临床治疗开辟了新的途径。 研究背景 感觉神经元是传递触觉、温度、疼痛等感觉信号的重要媒介。了解这些神经元如何从干细胞中分化而来，对于探索神经系统疾病的发生机制及开发相应的治疗方法至关重要。然而，由于伦理和技术限制，直接研究人体内感觉神经元的发育过程一直是一个巨大的挑战。本研究利用单核RNA测序（snRNA-seq）和转录因子序列荧光原位杂交（TF-seqFISH）技术，成功绘制了覆盖妊娠早期至中期的人类DRG发育的高分辨率时空图谱，填补了这一领域的空白。 研究设计与结果 研究人员首先收集了来自不同发育阶段的人类胚胎样本，并使用先进的snRNA-seq技术对其进行了全面分析。通过对数万个单个细胞的数据进行处理，他们识别出了多种特定的感觉神经元亚型及其随时间变化的空间分布模式。此外，还建立了一个人工模拟环境下的DRG类器官系统，能够再现体内DRG的发育特征。通过这种方式，研究人员可以在实验室条件下详细观察和操控感觉神经元的分化过程。 为了验证所建立的DRG类器官系统的可靠性，研究者们实施了一系列实验，包括钙成像、基因敲减以及药物抑制实验等。结果显示，这种体外培养系统可以有效地模拟真实组织中的神经元发育情况，并且发现了关键转录因子MEIS2对于某些类型感觉神经元分化的重要性。这些发现进一步证明了DRG类器官作为一种强大的工具，在研究人类神经系统发育方面具有巨大潜力。 图1：人类胚胎DRG的细胞异质性和空间分布 研究人员对妊娠周数（GW）为7-21的DRG样品进行了snRNA测序，观察到相应妊娠阶段样品之间明显的发育连续性和高转录相似性 （图1A）。并注释出19个主要细胞簇，这些细胞簇包括来自神经和胶质谱系的前体细胞及其衍生细胞。通过整合TF-seqFISH转录因子与snRNA-seq数据，研究人员分别绘制了GW8、GW10和GW18的全面DRG时空图谱，揭示了在人类DRG发育过程中细胞分化动态变化及空间特征的变化（图1B）。 通过定量分析人类胚胎DRG中主要细胞类型在妊娠阶段的变化，观察到两个明显的神经发生波。第一个波从GW7之前开始，在GW8结束，主要产生本体感受器和机械感受器；第二个波从GW7到GW12，主要产生伤害性感受器和C类低阈值机械敏感受体 (C-LTMR) 。同时，胶质细胞分化也分为两期进行，施旺细胞（SC） 和卫星胶质细胞（SGC）分别在GW12-GW15、GW17-GW21 进行分化 （图1C、1D）。值得注意的是，GW12 是一个关键的转折点，标志着神经嵴细胞（NCC）的命运从神经元向胶质细胞转变。 TF-seqFISH分析进一步揭示了不同细胞类型独特的时空分布：其中一簇未分化感觉神经元（uSN1）仅在GW8观察到，而另一簇未分化感觉神经元（uSN2）则在GW8和GW10均可见。与神经发生阶段（GW10）存在的少量胶质细胞相比，在GW18时，胶质细胞形成一个结构环包围着神经元，表明胶质增殖和分化进入后期阶段（图1E）。免疫荧光染色也验证了单细胞转录谱推断的发育轨迹，显示在GW7时，来源于uSN1的神经元（NTRK3+/RUNX3+/ISL1+，大直径神经元系）和来源于uSN2的神经元（NTRK1+/RUNX1+/ISL1+，小直径神经元系）的比例相当。 然而，到GW12时，uSN2衍生的神经元比例显著增加至76%，而uSN1衍生的神经元比例下降至8％。值得注意的是，在早期DRG发育过程中，NTRK2+机械感受器（一种uSN1衍生细胞类型）的比例始终保持较低水平（图1F-1I）。 为了准确量化SGC，研究人员对SGC-神经元单元进行了计数，反映了卫星胶质生成的动力学过程。在GW12时，有15.4% 的神经元被SGCs包围，这一比例在GW15时上升至40.9%。SC首次出现在GW17，并随后逐渐增多（图1J、1K ）。 综上所述，这些发现揭示了人类胚胎期早期和中期DRG中细胞特化严格的时间顺序以及不同类型细胞复杂的结构特征。 图2：信号通路和基因调控网络确保了ncc的多种命运分化潜能 对NCC衍生细胞分化轨迹分析发现，NCC衍生细胞可以分为感觉神经元前体细胞（SNP）和SC前体细胞（SCP）子类群。SNP进一步分化为uSN1和uSN2亚型，而SCP则进展到分化成SGC和SC（图2A）。 研究者将轨迹变量基因分为九个模块，进一步根据不同的表达趋势进行分组：持续下调、上调后下调、下调后上调和持续上调 （图2B）。这些基因模块在不同发育阶段的细胞中富集，调控人类DRG发育过程。 进一步发现了在细胞类型特异性中的各种转录因子的作用（图2C、2D）。通过进行信号通路富集分析发现 WNT 、MAPK 信号通路在 NCC 中高度富集，RA 信号通路在 NCC、SNP 和 uSN1 中富集。此外，BDNF 和 NT-3 信号通路在 uSN1 中富集，NGF 信号通路在 uSN2 中富集（图2E）。除了神经发生分支中 RUNX1/3 的特异表达外，还发现 MEIS2 和 SKOR2 是第一波神经发生的必要条件，该波主要产生大量感觉神经元，而 FOXO1 在第二波中起主导作用，主要是产生小的感觉神经元（图2F、2G）。 这一发现得到了GW7 DRG组织免疫荧光染色结果的支持，结果显示 NTRK2/3 与 MEIS2 具有显著共表达（94.6%），以及 NTRK2/RUNX3与SKOR2 之间具有显著共表达（84.8％）（图2H，2I）。同样地，NTRK1 / RUNX1与FOXO1的共表达（33.2％）强调了FOXO1作为第二波神经发生的关键调节因子的可能性（图2J）。 此外，TF-seqFISH数据证实了这些发现，并揭示了一致的RNA共表达模式，强调了uSN1中的MEIS2、SKOR2 和RUNX3以及uSN2 中的FOXO1和RUNX1 的共同表达（图2K，2L）。 图3：第一波感觉神经发生波的发育过程 第一波神经发育过程中uSN1分化为本体感受器和机械感受器（图3A、3B）。分析发现，从uSN1到本体感受器过渡期间上调的基因与神经肌肉接头有关，参与的转录因子有MEF2A 和SMAD9；机械感受器细胞中上调的基因与分化相关，参与的转录因子有DRGX 和SHOX2（图3C、3D）。差异性表达分析发现功能基因PIEZO2 主要在机械感受器中表达，ASIC1 和ASIC2 在本体感受器中表达（图3E），表明 ASIC 阳离子通道在增强本体感受器的机械敏感性方面发挥着重要作用。 研究者进一步探索了潜在的分子调节因子，将三种本体感受器亚型划分为：未特化的本体感受器P-1（NTRK3 和RUNX3）、腹侧远端本体感受器P-2 （CRTAC1、TCERG1L 和PCDH17）以及背侧远端本体感受器P-3 (CDH13、ETV1、TACR3 和ITGA2）（图3F、3G），表明本体感受器神经元的早期身份确定过程受肢体间充质信号的影响。 对于机械感受器，研究人员识别出几种不同的亚型：未特化的机械感受器（NTRK3、NTRK2 和SHOX2），Aβ纤维快适应低阈值机械感受器（Aβ RA LTMR；RET，GFRA2，MAFA和NTRK2-low），Aβ纤维慢适应低阈值机械感受器（Aβ SA LTMRs；NTRK3 和NTRK2-high） ，以及Aδ LTMR（NTRK2 和RET）（图3H、3I）。asmFISH证实了这些特殊本体感觉受和机械感受器亚型在GW18的存在及其定位（图3J）。 研究者进一步使用URD和SCENIC分析来确定分化轨迹的调节基因，发现ETV1+、NPAS2+和MEF2C+在背侧远端本体感受器中占主导地位，并且NFIA和PKNOX2在腹侧远端本体感受器表达显著（图3K）。这些发现表明，在不同的外源信号和转录因子组合在非常早的阶段就开始影响本体感受器的细胞身份和功能发育。此外，研究人员还还识别出不同机械感受器亚型富集的调控子（图3L）。 这些结果突出了TF在塑造机械感受器功能多样性的关键作用，以及皮肤类型依赖性机械感受器发育特征的作用。 图4：第二感觉神经发生波的触觉感受器多样性和分子逻辑 第二波神经发生启动了C-LTMR和伤害感受器的发育（图4A）。将uSN2衍生的神经元分为13个亚型，包括12种伤害感受器亚型和C-LTMR，每个亚型都由独特的离子通道、受体和已知的伤害感受器特异性标记物定义（图4B、4C左）。某些伤害感受器亚型表达多种感觉受体（图4C右），比如N11和N12都是NTRK3+伤害感受器，它们表达CHRNA7、GRM8、SCN1A、HRH1和TRPV1受体，表明其在多模式疼痛过程中的作用（图4B、4C）。asmFISH证实了这种表达模式，证明了这些不同类型的伤害感受器在发育过程中存在（图4D）。 在确定了伤害感受器细胞类型后，分化轨迹分析（图4E、4F）显示uSN2s中的一个分支被分为不同的亚群，这些亚群与伤害感受器亚型相关联。每个分支具有独特的调节子谱系特征。利用TF-seqFISH数据确认了相应伤害感受器亚型中RUNX1与这些特异性转录因子的表达类型，共同调节亚型多样性（图4G）。 由于在URD树中观察到uSN2的早期分离后，研究人员对uSN2进行了无监督聚类，产生了8个异质性亚组（uSN2-1到uSN2-8），每个亚组都显示出与特定的神经元亚型的强关联（图4H）。这些发现表明，从uSN2亚型衍生出的感觉神经元的命运限制可能发生在早期、未特化的阶段。 图5：非神经元细胞发育中的转录程序 在NCC分化为胶质细胞的过程中，出现了一种中间状态的SCP，能够同时向SC和SGC分化（图2A）。研究者使用树状图来追踪从SCP（CDH19+/CDH6+）到成熟SGC（APOE+）和SC（PMP22+）的胶质细胞谱系轨迹（图5A）。分析关键转录因子和基因的时空表达模式揭示了与SGC相关的基因比与SC相关的基因更早被上调，也表明SGC分化先于SC形成（图1C、1D及5B）。GO富集分析显示，在主要表达于SGC和SC中的基因参与了细胞迁移和神经功能成熟等过程（图5B）。 为了进一步阐明感觉神经元和胶质细胞之间的细胞相互作用，使用了CellChat分析，并将配体受体（LR）对分为14种不同的模块（LR1-LR14），以揭示不同细胞类型之间通信的特定LR信号通路（图5C）。神经-胶质单元的形成由外源性基质分子和特异性细胞表面受体介导，如纤连蛋白、胶原蛋白以及 Semaphorin家族超家族成员（图5D）。 值得注意的是，在各种感觉神经元亚型中识别出独特的LR对。例如，LR9 特征是LRRC4C与NTNG1的相互作用，分别富集在SGC和机械感受器中。此外，SGC表达SLIT2/3，它们专一地结合到痛觉感受器中的ROBO2（LR10），而SGC中表达的SEMA4B可以特异地结合到本体感受器中的DCBLD2（LR11）（图5E）。这些细胞类型的特殊胶质-神经元相互作用通过单细胞空间转录组数据进一步得到证实，表明周围 SGC在促进神经元特异功能方面可能发挥专门的作用（图5F）。 巨噬细胞对于免疫相关病理条件下疼痛感受器的激活起着关键作用，这些巨噬细胞表达ITGAM、CSF1R、PTPRC、MRC1和MERTK的细胞（图5G）。免疫染色显示，在DRG中巨噬细胞招募始于GW10，与第二波神经发生结束的时间一致，表明巨噬细胞可能参与并影响神经发育过（图5H）。巨噬细胞（P2RY12+）和神经元（ISL1+）的比例随着时间推移而增加（图5H、5I）。 为了阐明巨噬细胞和感觉神经元之间建立功能单元的分子相互作用，使用CellChat分析LR相互作用。GO富集分析帮助显示semaphorin-plexin和整合素信号通路在巨噬细胞招募中十分重要。此外，APOE-SCARB1、PTPRC-MRC1和SYK-FCGR2A之间的相互作用可能是巨噬细胞-神经元单位的关键调节因子，提示它们在调控DRG发育中巨噬细胞功能方面的潜在作用（图5J、5K）。 图6：感觉神经元的进化保护和分化 基于先前的数据和研究者的研究分析发现，从妊娠7周到21周的人类胚胎DRG发育过程与小鼠胚胎期第12天（E12）到出生后第4天（P4）的DRG发育进程高度相似（图6 A、6B），但存在时间上的差异，进一步分析发现在人类DRG中，细胞分化从妊娠7周至12周明显减少；而小鼠细胞分化在E12.5达峰值并持续下降直至出生（图6 C）。TRPA1、TRPV1、SCN10A、SCN11A 和ANO5 等与疼痛相关的基因的表达水平上在人类中更高；相反，P2RX2 在小鼠中的表达水平高于人类。瘙痒感知相关的基因，HRH1，在人类神经元中相对高表达；此外，参与多模态伤害感受过程的MRGPR家族成员MRGPRD未在人类胚胎DRG中表达。阿片类药物受OPRM1 和OPRD1 的表达水平在人类中较高且范围较广。 此外，TH在小鼠部分感觉神经元中表达，但在发育期的人类DRG中低表达。人与小鼠DRG发育过程中关键基因表达启动时间也有显著差，特别是与瘙痒感知相关的IL31RA、CYSLTR2 和HRH1 基因，这些基因在人类DRG中早于小鼠DRG表达（图6F）。这些观察结果强调了人类和小鼠DRG中独特的基因表达谱，揭示了感觉系统进化适应的重要见解。 此外，人类N6痛觉神经元类似于小鼠TRPM8+ 冷热感受器，N10痛觉神经元类似于小鼠SST+ 神经元，而N11痛觉神经元类似于小鼠CGRP-θ神经元（图6G）。有趣的是，免疫染色结果显示，由RET+特征标记并伴有DCC、SCN1A、NTRK3 和GRM8 的N12，在基因表达模式上没有明显的差异（图6H、6I）。N12神经元表现出钙信号通路、吗啡和尼古丁上瘾、阿片肽信号通路以及apelin信号通路相关基因的高表达。这些途径中的几个靶点被用于治疗精神疾病和偏头痛（图6J、6K）。 总体而言，这些发现揭示了物种间显著差异的基因表达和感受器细胞类型，在感觉和疼痛过程中起着关键作用。 图7：hDRGO模拟了人类感觉神经元的发育特征 基于先前的研究和对人类脊神经节发育的外源信号和内在转录因子调节的理解，研究者建立了一个稳健的方法来生成准确再现人类感觉神经元发育过程和多样性的人类背根神经节类器官（hDRGO）模型（图7A）。免疫荧光染色显示了各种感觉神经元亚型的存在（PRPH+），包括本体感受器（NTRK3+）、机械感受器（NTRK2+）和痛觉受体（NTRK1+）（图7B）。 结合钙成像和免疫荧光染，证实了hDRGO中存在丰富的DCC+/NTRK3+/NTRK1+人伤害感受器神经元，这些伤害感受器通过响应辣椒素显示伤害特征，表明hDRGO有效地反映了人类伤害感受子亚型的多样性和特异性（图7J）。研究人员在第30天和第60天分别进行了hDRGO的snRNA-seq分析，其中包括NCC、SNP、uSN1、uSN2、本体感受器、机械感受器、伤害感受器、SCP、SGC、纤维母细胞和内皮细胞（图7C，7E-7G）。 在整个hDRGO培养过程中，祖细胞（NCC、SNP和SCP）连续分化并形成复杂的细胞类型（图7D）。hDRGO的细胞组成和转录组与胚胎早期至中期发育阶段（GW7-GW15）表现出相似性（图7H）。 使用慢病毒载体递送靶向MEIS2、SKOR2以及FOXO1的shRNA，以分别抑制hDRGO第一波和第二波神经发生（图2F、2G），结果表明，在FOXO1敲除的类器官中NTRK1+神经元减少，而在MEIS2和SKOR2敲除的类器官中NTRK2+和NTRK3+神经元减少（图7K-M）。这些发现进一步证明MEIS2、SKOR2 和FOXO1 在uSN1和uSN2 的细胞命运决定中起关键作用，也验证了hDRGO对人胚胎DRG发育过程的模拟。 拓展延伸 ● 疾病建模 1.癌症研究：通过从肿瘤患者的样本中生成类器官，研究人员能够模拟肿瘤微环境，探索癌细胞的行为和反应机制。例如，结直肠癌类器官被广泛用于研究癌变过程、转移机制以及寻找新的治疗靶点。 2.神经系统疾病：脑类器官（如“迷你大脑”）是研究神经发育障碍（如自闭症谱系障碍）、神经退行性疾病（如亨廷顿舞蹈症）的有力工具。这些模型可以帮助科学家理解疾病的分子基础，并测试潜在的治疗方法。 3.遗传病：对于一些罕见或复杂的遗传病，可以从患者来源的诱导多能干细胞（iPSC）培养出相应的类器官，以研究基因突变如何影响器官功能。 ● 药物筛选与毒性测试 1.药物发现：制药公司利用类器官进行高通量药物筛选，快速评估大量化合物对特定器官的影响。这种方法有助于早期识别有潜力的候选药物，从而加速新药研发进程。 2.个性化医疗：针对个体患者的类器官可以用来测试不同药物的效果，预测患者对特定治疗方案的响应，实现精准用药。 3.安全性评估：相比传统的二维细胞培养和动物实验，类器官提供了更为真实的体内条件模拟，因此更适合于评估药物的安全性和可能产生的不良反应。 ● 再生医学 1.组织修复：类器官技术有望推动再生医学领域的发展，特别是对于那些难以自我修复的组织，如肝脏、肾脏等。科学家们正在探索将类器官移植到患者体内以促进组织再生的可能性。 2.器官移植：长远来看，如果能够解决免疫排斥等问题，类器官甚至有可能成为人工制造完整器官的基础，解决器官短缺问题。 ● 基础生物学研究 1.器官发育：类器官为研究器官形成过程中涉及的关键步骤提供了前所未有的视角，包括细胞分化、形态发生及器官特异性结构的建立。 2.细胞间通讯：由于类器官保留了原始组织的复杂性，它们非常适合用于研究细胞间的信号传导网络及其在健康和疾病状态下的变化。 ● 毒理学研究 化学物质暴露：类器官可用于评估各种化学物质对人体各器官系统的潜在危害，帮助制定更科学的环境保护政策和产品安全标准。 临床应用与展望 本研究所取得的技术成果将有助于推动神经科学领域向前迈进一大步。首先，通过创建高度仿真的DRG类器官模型，科学家们可以在不依赖于动物实验的情况下，更准确地模拟人类神经系统疾病的状态，从而加速新药研发进程。其次，基于此平台开展的基因编辑或CRISPR筛选实验，可以帮助识别出与特定神经退行性疾病相关的致病基因，为个性化医疗提供理论支持。最后，考虑到DRG在慢性疼痛管理中的重要作用，这项研究有望带来全新的治疗策略，比如针对特定类型的痛觉感受器设计特异性药物靶点，实现更加精准有效的镇痛效果。 注：本文旨在介绍医学研究进展，不做治疗方案推荐。如有需要，请咨询专业临床医生。 参考文献 Lu T, Wang M, Zhou W, Ni Q, Yue Y, Wang W, Shi Y, Liu Z, Li C, Hong B, Zhou X, Zhong S, Wang K, Zeng B, Zhang J, Wang W, Zhang X, Wu Q, Wang X. Decoding transcriptional identity in developing human sensory neurons and organoid modeling. Cell. 2024 Nov 4:S0092-8674(24)01205-4.  点击下方「阅读原文」，前往梅斯官网查询更多相关课程和实验技术服务支持~

关注并星标CPHI制药在线 11月11日，翰森制药宣布其P2X3受体拮抗剂HS-10383治疗慢性咳嗽的1期临床试验取得积极成果，且亮相在中国香港举行的亚太呼吸学会会议（APSR 2024）。 HS-10383是翰森制药自主研发的一种高选择性P2X3受体拮抗剂，被开发用于治疗难治性或不明原因慢性咳嗽（RUCC）。目前，该药正在进行一项随机、双盲、安慰剂对照、平行设计的2期研究，以评估其在不同剂量下每日一次，口服给药的疗效、安全性和耐受性。 此次公布的1期临床试验结果显示：HS-10383整体耐受性良好，所有不良事件均为轻度至中度。而且，HS-10383半衰期长（终末半衰期达35-48小时），支持每日一次的口服给药。而且，研究中没有观察到味觉障碍相关的不良事件（AEs），且没有TEAEs导致终止治疗的情况。 01 关于难治性或不明原因慢性咳嗽 难治性或不明原因慢性咳嗽（RUCC）是指经过常规治疗后咳嗽仍无明显缓解，或无法明确病因的咳嗽，其特征是持续超过八周的顽固性咳嗽。发病机制上，咳嗽敏感性增高被认为是难治性慢性咳嗽主要的病理生理学特征，而神经源性炎症、神经重塑是咳嗽敏感性增高相关的重要机制。 RUCC严重影响患者的生活质量，据统计全球约10%的成年人受困于慢性咳嗽（咳嗽时间>8周），全球RUCC病人超2800万，中国超700万，且受环境、人口老龄化、后疫情时代等因素影响逐年递增。目前，RUCC治疗主要集中在症状管理方面，有效治疗选择有限，且缺乏长期治疗方案。 02 P2X3受体拮抗剂进展 P2X3受体拮抗剂被认为是治疗RUCC的潜力药物。P2X3受体是一种ATP门控的非选择性阳离子通道，被ATP激活后可以诱导非选择的阳离子内流（主要是Ca2+），使细胞发生去极化，激活胞内相关受体，进而传导相关的信号。P2X3受体在神经系统和呼吸系统中广泛表达，研究发现其过度活化与慢性咳嗽、神经炎症、子宫内膜异位、膀胱过活、COPD、瘙痒等感觉神经元超敏化直接相关。而P2X3受体介导的迷走神经C和A纤维活化是诱发咳嗽和致敏的核心因素之一，调节抑制P2X3活性将可降低传入神经兴奋性以抑制咳嗽。 据公开资料，目前全球监管机构仅批准一款P2X3受体拮抗剂，即默沙东的Lyfnua（Gefapixant）。该药是一种口服、选择性P2X3受体拮抗剂,通过与气道C纤维上的P2X3受体结合，阻断细胞外ATP的激活，从而减少感觉神经元的兴奋，降低咳嗽反射。2022年1月，Gefapixant在日本获批治疗RUCC，2023年9月获欧盟批准。 2023年《美国医学会杂志》（JAMA）发表的一项重磅分析研究显示：与安慰剂相比，每日两次45 mg剂量的Gefapixant治疗可降低RUCC患者的咳嗽频率、咳嗽严重程度，并改善这部分患者的咳嗽特异性生活质量。 Gefapixant是默沙东于2016年收购Afferent Pharma时获得，目前其还未在美国获批，且曾于2022年、2023年两次收到FDA的完整回复函（CRL）。而Gefapixant未在美国获批，业界推测是其临床试验设计问题，且已公布的临床试验结果并不理想。 此外，目前全球还有多款在研P2X3受体拮抗剂，如Eliapixant、Camlipixant、Sivopixant (S-600918)、QR052107B、TCR1672、WT-1108。 Eliapixant是拜耳公司开发的一种口服选择性P2X3受体拮抗剂。使用速释片剂配方开展的Eliapixant在健康受试者中的单剂量、首次人体试验（FiH）研究表明，Eliapixant药代动力学呈食物依赖性和非剂量线性关系，药物浓度达到最大值的时间为1.5～3 h，半衰期（t）为24～59 h。与空腹状态相比，进食状态下Eliapixant的暴露量更大。在进食状态（10800 mg剂量范围内）和禁食状态下，暴露量低于剂量比例，Eliapixant对味觉的影响很小。 《Clin Pharmacokinet》上发表的1期临床研究结果显示：较高剂量（200和750 mg）的Eliapixant产生的血浆浓度预计可达到至少80%的P2X3 受体占位（RO），且具有良好的耐受性，味觉相关AEs发生率较低。 2021年9月，拜耳宣布每日两次口服 Eliapixant 达到了针对难治性慢性咳嗽的2b期 PAGANINI 研究的主要终点：与安慰剂相比，Eliapixant 组患者的 24小时咳嗽计数减少27%。不过，研究中8%接受Eliapixant治疗的患者因AE退出试验，24%接受最高剂量Eliapixant治疗的患者出现了与味觉相关的副作用。 但在Gefapixant于2022年遭FDA拒批后，拜耳放弃了Eliapixant，将其权益退还给了Evotec SE。 Camlipixant是BELLUS Health开发的一种口服、高选择性P2X3受体拮抗剂，对P2X3受体的亲和力是Gefapixant的200倍。临床数据显示：Camlipixant通过选择性抑制P2X3受体，可以降低难治性慢性咳嗽患者的咳嗽频率，且产生味觉紊乱的药物相关不良事件的发生率相对较低。已公布的2b期临床试验结果显示：接受治疗第28天时，Camlipixant两种剂量水平（50mg和200mg，每日两次给药）使难治性慢性咳嗽患者经安慰剂调整的24小时咳嗽频率降低了34%，且具有临床意义和统计学显著性。而且，该药具有良好的耐受性。2023年4月，GSK斥资20亿美元收购BELLUS Health将Camlipixant纳入囊中。 Sivopixant是盐野义公司开发的一种口服高选择性P2X3受体拮抗剂，具有靶点选择性高，无味觉障碍副作用等优势。一项随机、双盲、安慰剂对照平行2b期临床试验结果显示：150mg和300mg，每日2次Sivopixant可显著降低患者24小时咳嗽频率、VAS评分，提高LCQ评分，6.5%的治疗组患者出现轻度味觉障碍。 QR052107B是朗来科技自主研发的新一代高选择性P2X3受体拮抗剂，拟开发用于治疗RUCC。实验室内的体外和动物模型试验显示：QR052107B具有良好的安全性和有效性，能够有效地抑制P2X3受体的活化，减缓病理状况进展。2022年11月，该药完成1期临床试验，并取得良好结果。值得一提的是，QR052107B是国内首家进入临床、每日口服一次的1类新药，其可完全避免味觉障碍相关不良反应，同时有望获得更好的疗效和依从性。 TCR1672是泰德制药自主研发的二代高选择性P2X3抑制剂，被用于治疗呼吸领域的RUCC和疼痛领域的子宫内膜异位症等复杂性内脏痛。2012年10月，该药在国内获批临床，用于治疗难治性慢性咳嗽。 WT-1108是维坦医药基于其特色创新药物开发平台WestanAI+研发的具有全新骨架结构、新作用机制、高亚型选择性的P2X3受体抑制剂，具有稳定性与生物利用度高、药效强、低味觉副作用等优势。2023年9月，该药在国内获批临床，用于治疗难治性或不明原因的慢性咳嗽。 03 总结 整体来看，P2X3受体拮抗剂主要开发用于治疗慢性咳嗽、子宫内膜异位症等，但由于安全性和疗效问题，近年来P2X3受体拮抗剂在慢性咳嗽领域的进展缓慢，甚至可以说有点消极。但随着高选择性、长效P2X3受体拮抗剂的出现，P2X3受体拮抗剂或将迎来新突破。而且，除了上述适应症，P2X3受体拮抗剂还有望用于治疗心衰。 2023年3月，Nature Communications发表的题为“P2X3 receptor antagonism attenuates the progression of heart failure”的论文表明：在心力衰竭的雄性大鼠模型中可以观察到颈动脉体产生与呼吸障碍相关的自发性间歇爆发放电。心力衰竭时外周化学感受传入神经纤维中的P2X3受体表达上调，拮抗这些受体可消除间歇性爆发放电，恢复正常呼吸模式，平衡自主神经系统，改善心脏功能，并减少炎症及心力衰竭生物标志物。 此外，随着难治性慢性咳嗽发病机制研究的深入，研究发现TRPV1/TRPA1、TRPV4、TRPM8、NAV 1.8 等靶点也有望成为难治性慢性咳嗽治疗的潜力靶点。期待在药企和研究人员的不懈努力下，难治性慢性咳嗽的治疗早日迎来重大突破。 END 【智药研习社线上研习会报名】 来源：CPHI制药在线 声明：本文仅代表作者观点，并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。 投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com ▼更多制药资讯，请关注CPHI制药在线▼ 点击阅读原文，进入智药研习社~

IND2025主会场授课已被预定，大会第一天下午茶歇前授课时间段预定开始，咨询热线：177 0186 0390。点击图片，查看IND2024会后报告 疼痛药物拥有巨大的市场潜力，对于疼痛的治疗需要根据其病因选择合适的治疗方法。根据疼痛的发病机制可以将其分为四类：伤害性、炎症性、神经性和功能失调性疼痛。   伤害性疼痛是由外周伤害感受器检测到有害的组织损伤刺激后被激活而引起的，刺激的持续存在可导致骨关节炎等病理状态。伤害性疼痛的治疗包括阻断伤害感受器感受外界刺激，如TRPV1和TRPA1；阻断感受器的动作电位传输，如Nav1.7和Nav1.8；用N型钙通道阻滞剂或神经递质受体拮抗剂阻断伤害感受器向大脑和脊髓的刺激传递；用阿片类药物阻断皮层区域激活。 炎症性疼痛是一种由组织损伤引起的疼痛，它引起免疫细胞和受损细胞的伤害感受器的激活。因此，通过非甾体抗炎药(NSAIDs)和环氧化酶2 (COX-2)抑制剂可以减少前列腺素E2的产生，免疫反应的降低可以减轻炎症性疼痛。 神经性疼痛不是病理的症状，而是神经系统损伤引起的周围和中枢神经系统病理改变的结果，并且疼痛通常在病理治疗后仍然存在。神经性疼痛可由糖尿病、化疗、脊髓损伤、神经创伤和中风等引起。治疗策略包括通过加巴喷丁类药物减少兴奋，增加双胺摄取抑制剂的抑制，或拮抗N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体。 功能失调性疼痛是由除以上三种因素引起的疼痛，主要是由于机体的功能失调而引起的，如纤维肌痛、肠易激综合征和颞下颌关节紊乱等。 止痛药发现的努力是针对每种类型的疼痛量身定制的。除了关注促进有效镇痛外，疼痛药物发现工作还应关注提高治疗率和避免耐受性和强化效应。疼痛也可以分为急性和慢性。急性疼痛是由损伤或疾病引起的，与骨骼肌痉挛和交感神经系统激活有关。急性疼痛具有有用的生物学目的，一旦疾病或损伤得到治疗，疼痛就会消失。另一方面，慢性疼痛比疾病或损伤持续的时间更长，被认为是一种独立的疾病状态。慢性疼痛可能源于心理状态，没有生物学目的，没有可识别的终点，治疗需要多学科的方法。 尽管努力开发新的更安全的镇痛药，但是阿片类药物和阿司匹林等非甾体抗炎药(NSAIDs)仍然是治疗疼痛的主要药物，其他用于治疗疼痛的药物包括三环抗抑郁药(TCA)、抗惊厥药(加巴喷丁类)、NMDA受体拮抗剂和曲坦类药物。在过去的一个世纪里，对疼痛机制的理解增加了，导致了一些靶点的确定，包括受体，如α2-肾上腺素能，大麻素，γ-氨基丁酸(GABA)，5-羟色胺(5-HT)1B/D,NMDA，阿片，TRPV1和降钙素基因相关肽(CGRP)受体等；酶，如COX-2和sepiapterin还原酶和离子通道，如电压门控钠通道。目前，阿片类药物仍然是治疗急性疼痛的主要药物，因此，应继续努力开发更安全的阿片类药物。 一、 开发更安全的阿片类止疼药 阿片样受体属于7次跨膜G蛋白偶联受体(GPCR)的超家族，分为mu、kappa和delta阿片样受体(分别为MOR、KOR和DOR) 。阿片类药物是唯一被证明对治疗大多数人群疼痛有效的药物类别。然而，阿片类药物在治疗神经性疼痛方面效果较差，并且会产生诸如耐受性、成瘾性、呼吸抑制、便秘、恶心和嗜睡等不良反应。由于与阿片类药物相关的这些问题，药物的发现工作已被用于开发副作用较小的阿片类药物疗法。这些方法包括开发偏向性阿片受体激动剂，多功能阿片受体，阿片受体的变张调节剂，以及使内源性阿片肽药物化。 1.1 阿片受体变构调节剂 变构调节剂结合在受体的变构位点，可以调节正构配体与受体的亲和力以及生物学效应。变构调节剂根据其对正构位点活性的影响可以分为正变构调节剂，负变构调节剂和静默变构调节剂。正变构调节剂增强了正位位点配体的结合亲和力和/或功效，而负变构调节剂降低了正构位点配体的结合亲和力和/或功效。静默变构调节剂不对正构位点活性产生任何影响，但是它可以竞争性拮抗正负变构调节剂。 MOR的正变构调节剂可用于增强阿片激动剂如吗啡和内源性阿片的效力，并降低产生镇痛所需的剂量，因此MOR的正变构调节剂被开发用于提高疗效降低副作用。BMS-986121 ，BMS-986122和BMS-986187已报道的MOR正变构调节剂。  1.2 偏向激动剂       通常，GPCR与一个或多个异源三聚体G蛋白功能偶联，然而，现在已经证明GPCR可以介导多种信号通路，如β-抑制素信号通路。能够选择性地通过一个途径而不是另一个途径发出信号的化合物被称为“功能性选择性”或“偏倚性”激动剂。阿片样物质通过G蛋白级联和β-抑制素途径发出信号。偏向性激动剂可以优先通过G蛋白信号传导，增强镇痛，减少呼吸抑制、耐受和依赖等不良反应。MOR的偏向激动剂Oliceridine 已被批准上市，与吗啡相比，拥有更好的治疗指数。进一步增加G蛋白信号传导对β-arrestin2信号传导的偏好可能会导致新型阿片类药物治疗疼痛的发展并显著减少不良反应。 1.3 双位/二价阿片受体的配体 二价配体是含有两个药团的化合物，两个药团由大小/长度不同的连接体分开，连接体可以是刚性的或柔性的。这两种药效团可以是相同的(同二价)或不同的(异二价)。代表性分子有MDAN-21,CYM51010,NNTA和INTA等。 1.4 阿片肽类似物       阿片肽类似物主要是模拟内源性的阿片肽，其代表性结构有以下两个化合物： 二、NMDR受体拮抗剂 NMDA受体是一种配体和电压调节离子通道，位于突触后膜，几乎在所有脊椎动物突触中表达，调节Na+和Ca2+离子的通透性。NMDA受体属于嗜离子性谷氨酸受体家族(iGLuR)，在神经元发育、可塑性、和存活中起重要作用。NMDA受体的过度刺激引起高Ca2+内流，从而促进兴奋性毒性，发条现象和中枢致敏，这可能导致急性和慢性疼痛状况的发展。4因此，NMDA受体拮抗剂可用于减轻痛觉。       氯胺酮（Ketamine ）是已知的NMDA受体拮抗剂，用于治疗急性和慢性疼痛。美沙酮（Methadone），金刚烷胺（amantadine）和美金刚（memantine）也能拮抗NMDA受体，产生止痛作用。右美沙芬（Dextromethorphan）可拮抗NMDA受体并在几种慢性疼痛情况下产生镇痛作用。新型的NMDR受体拮抗剂NYX-2925 和RL-208 也被报道。 三、非甾体抗炎药       非甾体抗炎药是世界范围内使用最广泛的非处方药(OTC)和处方药。非甾体抗炎药是治疗许多炎症性疾病的首选药物，如关节炎、肌肉和关节损伤。这些药物也用于治疗一系列急性和慢性疼痛，包括轻微疼痛、月经痉挛、术后疼痛和偏头痛。非甾体抗炎药通过阻断参与前列腺素合成COX-1和COX-2的活性来产生抗疼痛作用。包括非选择性COX抑制剂，如阿司匹林，双氯芬酸，布洛芬和萘普生等。选择性COX-2抑制剂，如塞来昔布，罗非昔布和伐地昔布等。一些包含非甾体抗炎药和碳酸酐酶活性的化合物也被报道，如29和30。 四、去甲肾上腺素转运蛋白（NET）抑制剂      NET属于Na+/Cl -依赖转运蛋白家族，可以转运血清素、多巴胺、甘氨酸和GABA等。它是一种位于交感神经元上的突触前转运蛋白，参与去甲肾上腺素信号的失活，这对于防止去甲肾上腺素的不成比例的升高至关重要。因此，NET可以调节大脑中的肾上腺素能神经传递以及周围器官。NET抑制剂在多种精神疾病中发挥重要作用，包括焦虑、抑郁、精神分裂症、肥胖和慢性疼痛。    度洛西汀（Duloxetine）和米那普仑（milnacipran）是血清素（SET）转运体和NET转运体的双重抑制剂，被批准用于治疗重度抑郁症，有效缓解慢性疼痛，如纤维肌痛、骨关节炎和糖尿病性神经病变。最近，一种新的选择性NET抑制剂TAS-303和双重NET和SET抑制剂ZY-1408分别对疾病如抑郁症和压力性尿失禁有效。因此，应该继续努力筛选新型NET抑制剂治疗慢性疼痛。        除了上述四类经典的靶标外，还有一些较新的靶标处于开发状态，包括一些受体，离子通道和酶。 血管紧张素Ⅱ受体      血管紧张素II因其在肾素-血管紧张素系统(RAS)中的作用而闻名，RAS与脉管系统、心脏、肾脏和大脑有关。在多种细胞和组织类型中，血管紧张素Ⅱ以相似的亲和力结合GPCR亚型血管紧张素II 1型和2型受体(分别为AT1R和AT2R)。除了控制血压外，血管紧张素Ⅱ在神经性疼痛中起重要作用，AT1R拮抗剂和AT2R配体均产生镇痛作用，AT2R配体产生的不良效应比AT1R拮抗剂少。AT1R拮抗剂坎地沙坦(candesartan)和氯沙坦(losartan)减轻了神经性疼痛模型中的异位性疼痛和痛觉过敏。两项多中心、随机、双盲、2b期研究证实了AT2R拮抗剂EMA401对减轻疼痛性糖尿病神经病变患者疼痛强度的临床疗效。AT2R拮抗剂EMA 200和激动剂C21均可产生抗疼痛作用。目前正在研究血管紧张素 II受体的选择性激动剂和拮抗剂，以开发新型镇痛药。 降钙素基因相关肽(CGRP)受体     CGRP是一种中枢和外周作用的神经肽，具有强大的血管扩张作用的神经递质，涉及几种疼痛途径，特别是偏头痛。Erenumab(一种单克隆抗体)，由Amgen和Novartis开发，是FDA批准治疗偏头痛的首个CGRP拮抗剂(2018年)。虽然olcegepant是第一个开发的小分子高亲和CGRP受体拮抗剂，但的Ⅰ期临床试验已停止。其他小分子CGRP受体拮抗剂，如ubrogepant和rimegepant，分别于2019年和2020年获得FDA批准用于治疗偏头痛。另一种小分子CGRP受体拮抗剂BI 44370 TA。目前正在美国和欧洲进行临床试验。 溶血磷脂酸（LPA）受体       LPA是一种小溶血磷脂，含有一个磷酸甘油头基团和一个单一的脂肪酸片段，在中枢神经系统的发育和生理中起重要的作用。LPA具有高亲和力结合并激活被称为LPA受体的GPCR。LPA受体分为六个亚型(LPA1 - 6)。LPA的产生和信号传导通过作用于神经元和免疫细胞，在诱导神经性疼痛中起重要作用。因此，针对LPA受体或产生LPA的酶，可能用于神经性疼痛的治疗。事实上，据报道，LPA1和LPA3受体介导小鼠糖尿病神经性痛觉过敏和痛觉减退的发生。已确定的LPA受体拮抗剂包括Ki-16425(非选择性)和ONO-9780307 (LPA1受体选择性)。Ki-16425能阻断LPA诱导和部分坐骨神经结扎神经性疼痛模型的异动行为。使用强效LPA1受体拮抗剂BMS-986020进行的2期临床试验表明，LPA1受体拮抗剂有效治疗特发性肺纤维化;然而，研究因肝毒性而终止。化合物如49和UCM-05194是LPA1激动剂也已被在小鼠免于神经损伤(SNI)神经性疼痛模型中，显示出显著的减轻神经性疼痛的疗效。因此，阻断LPA1受体的LPA1拮抗剂和导致受体脱敏的LPA1激动剂都可以用于神经性疼痛的新型治疗。 Nav1.7 and Nav1.8 编码Nav1.7的SCN9A 基因发生沉默突变时，病人感觉不到疼痛，但具有触觉和压力敏感性，嗅觉丧失，并且对组胺引起的瘙痒没有反应，而该基因发生功能获得性突变时，患者会发生极度疼痛障碍如阵发性极度疼痛障碍和外周性红斑性肢痛症。非选择性Nav抑制剂，包括利多卡因、美西汀、和卡马西平，对慢性疼痛有临床疗效。然而，由于部分不参与疼痛信号传导Nav亚型介导的不良效应，这些药物的临床应用受到限制。例如，抑制中枢神经系统表达的Nav1.1会导致中枢神经系统相关的不良反应;抑制心肌细胞中Nav1.5可诱导不良的心血管效应。目前为止，已报到了9个亚型，即Nav1.1~1.9。选择性Nav1.7抑制剂DS1971a在小鼠中对神经结扎引起的热和机械超敏反应具有镇痛作用，其他报道的选择性Nav1.7抑制剂有PF-05089771，PF- 05150122 ，PF-05186462 和XEN402 。但是在疼痛性糖尿病周围神经病变患者的临床试验中，PF-05089771 不能减轻疼痛，但能减轻灼烧感觉。XEN402能减轻遗传性红斑性肢痛症患者的疼痛。此外，选择性Nav1.7拮抗剂GX-201的研究显示，其体内停留时间较长，对炎症性和神经性疼痛的疗效有所改善，这表明Nav1.7抑制剂在临床研究中的失败可能是由于高血浆蛋白结合或高血浆清除率等药物特性差，导致靶点占用不足。对Nav1.7抑制剂的开发应该追求部分抑制剂，因为完全消除病人对疼痛的正常反应。 由SCN10A基因编码的Nav1.8似乎在疼痛的病理生理中发挥作用，且可能会消除中枢神经系统的不良反应，因为它位于中枢神经系统外的背根神经节。Nav1.8选择性阻断剂A-803467能够削弱大鼠的神经疼痛和炎症疼痛。因此，共同靶向参与伤害性传递的Nav通道，如Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9，或开发高选择性Nav抑制剂仍然是开发新型镇痛药的可行途径。 神经紧张素（Neurotensin ） 神经紧张素结合三种受体:神经紧张素1、2和3 (NTSR1、NTSR2和NTSR3)。神经紧张素通过NTSR1/2s介导伤害性反应，例如，非选择性NTSR1/NTSR2激动剂ABS212， JMV2007， JMV2009和NT69L在啮齿动物急性疼痛模型中产生抗伤害性反应，该作用NTSR1/2拮抗剂SR48692逆转。NTSR1激动剂PD149163和NTSR1 PAM PP-001均在大鼠急性和慢性疼痛模型中产生镇痛作用。如前所述，NTSR1和NTSR2激动剂均可产生镇痛作用，然而，神经紧张素的不良反应如低温和低血压是通过NTSR1激活介导的。最近有报道选择性NTSR2激动剂JMV431在大鼠的甩尾、福尔马林和CFA试验中产生抗痛感而不诱导低温。CGX-1160是一种神经紧张素a类似物，在脊髓损伤后中枢性神经性疼痛患者的Ⅰ期临床试验中产生抗痛觉作用。因此，高度选择性神经紧张素受体激动剂仍然是开发具有低滥用潜力的新型镇痛药的可行途径。 P2X3和P2X7嘌呤受体拮抗剂       除了作为细胞代谢的主要能量来源外，三磷酸腺苷(ATP)还通过激活P2X3和P2X7嘌呤能受体调节神经传递。ATP是一种伤害性调节剂，它作用于外周和中枢增强过程，导致超敏反应。选择性P2X3受体拮抗剂A-317491，其选择性比其他P2受体高100倍以上，在炎性疼痛的CFA模型和神经损伤的CCI模型中产生抗疼痛感觉。另一方面，A-317491在有害刺激的急性伤害感觉模型中不产生抗伤害感觉，这表明P2X3受体仅在组织受伤或致敏时有反应。P2X7受体拮抗剂A-438079在类似于P2X3受体拮抗剂的致敏条件下产生抗伤性。除了P2X3和P2X7拮抗剂外，P2Y14受体拮抗剂66和67在CCI诱导的神经损伤小鼠模型中逆转了慢性神经性疼痛。P2X3、P2X7和P2Y14受体可能是开发新型非阿片类镇痛药的理想靶点。 电压门控钾Kv7通道 电压抑制的K+通道在控制神经元兴奋性中起重要作用，打开神经元Kv7通道的化合物对动作电位启动有抑制作用，因此它们在神经性疼痛中具有应用潜力。氟吡汀(Flupirtine)是Kv7钾通道的开启剂，用于治疗对非甾体抗炎药或阿片类药物难治的患者的疼痛。Kv7.2负性突变的小鼠对疼痛的敏感性强于野生型。Kv7.2抑制剂XE991会增强小鼠痛感，这种增加作用可被Kv7离子通道开启剂retigabine所挽救。其他Kv7.2离子通道开启剂如71、ICA-27243和SCR2682在啮齿动物急性伤害性疼痛模型中产生抗痛觉性。此外，在使用福尔马林试验的等密度分析研究中，观察到Flupirtine和吗啡之间的协同作用。 GPR18,35,55      与GPR18相关的信号传导机制尚未完全建立，该受体介导的生理功能尚未完全了解。已经提出了许多GPR18的激动剂，包括Abn-CBD，Δ9-tetrahydrocannabinol，O-1918，N-arachidonoyl glycine , resolvin D1 和resolvinD2。这些化合物与大麻素相关，表明GPR18可能与CB1和CB2一起被归类为大麻素受体。。PSB-CB5是通过分子建模和计算研究发现的首个有效的GPR18拮抗剂。PSB-KK-1415被发现是一种有效的、选择性的GPR18激动剂，据报道在炎症性疼痛的动物模型中发挥抗炎和抗伤害性作用。选择性GPR18配体仍然是目前项目的重点，旨在发现安全有效的镇痛药。 GPR35参与了许多疾病，如疼痛、高血压和癌症。虽然GPR35的内源性配体尚不清楚，但色氨酸代谢物kynurenic acid、2-acyl lysophosphatidic acid和趋化因子CXCL17被认为是GPR35的内源性配体。GPR35激动剂，包括bufrolin、cromolyn、lodoxamide和zaprinast。在小鼠坐骨神经损伤实验中，化合物kynurenic acid和zaprinast降低热和触觉超敏反应，增强吗啡治疗神经性疼痛的疗效。已报道的GPR35拮抗剂包括ML-145和CID2745687。鉴定GPR35的激动剂和拮抗剂不仅有助于了解GPR35的生理学，而且有助于开发新型镇痛药。 GPR55与嘌呤受体和趋化因子受体家族有关，可能是一个非典型的大麻素受体，因为它的氨基酸与两种大麻素受体CB1和CB2序列同源性较低。GPR55的第一个假定的内源性配体是磷脂溶磷脂酰肌醇，激动剂包括Abn-CBD, Δ9-tetrahydrocannabinol，2-AG，N-arachidonoylethanolamine和O-1602，拮抗剂有CID16020046 和SR141716A 。GPR55刺激产生炎症性疼痛，因此暗示GPR55是疼痛的治疗靶点。 HMGB1 HMGB1是一种没有特异性配体的炎症生物标志物，其在抗疼痛感受中的作用仍有待阐明。然而，现有证据表明，HMGB1的抑制导致异位性疼痛的减少。HMGB1抑制剂glycyrrhizin在小鼠炎症性疼痛模型中产生减轻机械异常性痛和热痛觉过敏。另一种HMGB1释放抑制剂丙酮酸乙酯，减轻了小鼠急性胰腺炎伴随的胰腺痛感过敏。目前已经开发的针对HMBG1的化合物有限，因此，药物化学应继续努力追求高选择性HMBG1抑制剂，因为这些化合物可能导致新型镇痛药的开发。 神经营养生长因子(NGF)和原溶酶受体激酶A（TrkA） NGF通过诱导痛觉过敏在疼痛信号的传递中起作用，以高亲和力与TrkA的细胞外结构域结合，并以低亲和力与75 kDa的神经营养因子受体p75结合，导致一系列事件，这些事件负责NGF的生理效应，包括其促疼痛特性。人源化抗NGF抗体RN624的 3期临床试验目前正在进行中，用于治疗骨关节炎、慢性腰痛和癌症疼痛。NGF-TrkA途径的小分子药物发现工作主要集中在开发结合NGF、拮抗TrkA受体或抑制TrkA激酶活性的化合物。化合物ALE-0540、PD90780和Ro 08-2750与NGF结合，阻止NGF与TrkA和p75的结合。第一批开发的TrkA激酶抑制剂主要是泛Trk抑制剂，具有显著的脱靶激酶活性和不良反应。pan-Trk抑制剂的例子包括103和PF-06273340(104)。这些化合物在CFA诱导的疼痛模型中显示出剂量依赖性的抗痛觉性，其疗效高于非甾体抗炎药。三个Trk亚型的x射线晶体结构从2012年开始被解决，这导致使用基于结构的药物设计开发对TrkA选择性优于TrkB和C.的化合物。Array BioPharma使用诱导拟合方法和基于结构的药物发现开发了选择性TrkA抑制剂AR786。默克公司还报道了一种选择性TrkA激酶抑制剂106，其选择性分别比TrkB和TrkC高230倍和190倍。其他尚未披露结构的TrkA选择性抑制剂包括CT340、GZ389988、vm902a和Ono-4474。抗NGF疗法在临床试验中的成功，刺激了靶向NGF-TrkA通路的发展。虽然NGF/TrkA通路产生抗痛觉的机制尚未完全阐明，但已经提出TRPV1通道、AT2R和鞘氨醇-1-磷酸(S1P)受体可能参与其中因此，靶向NGF/TrkA通路和上述受体仍然是开发新型镇痛药的可行途径。 Sepiapterin还原酶（SPR）抑制剂 SPR是参与合成(6R)-L-erythro-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin (BH4)的末端酶，BH4是芳香族氨基酸羟化酶、烷基甘油单加氧酶和一氧化氮合酶等酶的重要辅因子。在啮齿动物模型中，BH4水平升高与更大的疼痛和过敏有关。因此，抑制SPR可能是开发新型镇痛药的可行途径。SPR的x射线晶体结构揭示了其抑制剂Nacetylserotonin（NAS）的结合袋，这有助于SPR抑制剂的药物设计。SPRi3在神经性疼痛SNI模型小鼠中产生剂量依赖性抗触觉异动效应，并在神经性疼痛慢性CCI模型小鼠中降低机械异动。化合物108显著减轻了由板内CFA引起的热痛感过敏，并降低了炎症足部的BH4水平。其他SPR抑制剂包括109、110、QM385和被批准用于支气管哮喘的曲尼拉斯特。磺胺吡啶(Sulfasalazine)，一种FDA批准的抗炎药物，被发现通过其代谢物磺胺吡啶(113)抑制SPR活性。通过抑制SPR活性降低BH4水平是缓解神经性和炎症性疼痛超敏反应的可行方法。有趣的是，完全抑制SPR不会导致BH的过度减少，因为BH4可以通过替代途径产生。缺乏BH4会导致严重的认知迟缓、肌张力障碍、震颤和高苯丙氨酸血症。因此，靶向SPR可能导致较少的不良反应，因为没有完全阻断BH4的合成。 可溶性环氧化物水解酶(sEH)抑制剂 sEH是一种主要存在于肝脏和其他组织(如肾、肠、脑和脉管系统)中的酶，其作用是代谢或水解环氧脂肪酸(EpFAs)。EpFA是由花生四烯酸通过COX、脂氧合酶(LOX)和细胞色素P450 (CYP450)酶生成的类二十烷类前列腺素和白三烯。CYP450酶作用于长链多不饱和脂肪酸，如二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸，通过双键的环氧化作用形成EpFA。EpFA包括环氧二十碳三烯酸、环氧二十碳四烯酸、和环氧二十碳五烯酸。与COX和LOX代谢物主要是促炎不同，EpFAs主要是抗炎和促溶解。 sEH将EpFA水解为二醇，而二醇缺乏环氧化前体的活性，二醇具有高极性，易于偶联，并且快速排出。因此，sEH抑制剂阻止EpFAs的降解，从而延长其抗炎作用。其他EpFA降解途径如β-氧化，链延伸和CYP450氧化已被报道。因此，抑制sEH不会导致EpFA的积累，这将导致脱靶效应的减少。早期的sEH抑制剂(AUDA, 和AEPU)被设计为模拟sEH的天然底物，这些化合物被设计为模拟开放环氧环的假设过渡态。这些化合物具有高度亲脂性，熔点高，生物利用度差，并迅速代谢成无活性的化合物。这些先导化合物导致了新一代化合物的发展，如GSK2256294， TPPU和t-TUCB，它们更稳定，具有类似药物的性质，具有高效力，并且改善了药代动力学谱。基于TPPU结构的一系列新化合物被设计，用来寻找更多的低熔点和高水溶性化合物。其中，EC5026的效价、水溶性、熔点和半衰期得到了改善，目前正在进行治疗神经性疼痛的临床试验。 克服阿片类药物不良反应同时保持其镇痛活性的一种策略，是将低剂量高效阿片类药物与通过非阿片类受体类型发挥镇痛作用的化合物结合。这种联合疗法假定所产生的镇痛将是相加的或协同的，而副作用是降低的。理想情况下，非阿片类药物的副作用与阿片类药物不同，因此这种组合不会增加单个化合物产生的任何给定的副作用。一种非阿片类药物与阿片类药物产生协同镇痛，同时伴有较小程度的不良反应，有时被称为“阿片类药物节约”效应。这样的组合将比单独使用化合物获得更大的治疗指数。以下是一些靶点/化合物与阿片类药物联合产生协同作用：α2-肾上腺素能受体激动剂，AMPA受体，CB2受体激动剂，GABAB，加巴戊二烯类，糖皮质激素，咪唑啉I2, MAGL/FAAH抑制剂，NMDA受体拮抗剂，非甾体抗炎药，孤儿受体GPR119，P2X3和P2X7嘌呤受体拮抗剂，过氧化物酶体增殖激活受体(ppar)，代谢性谷氨酸受体(mGluR)，血清素/去甲肾上腺素再摄取抑制剂，sigma受体，S1P受体1和TRPV1。 α 2肾上腺素能受体激动剂 α2肾上腺素能受体激动剂具有良好的镇痛作用，并广泛应用于围手术期，特别是作为麻醉药和镇痛药的辅助药物。α2肾上腺素能受体有三种类型，分别是在中枢神经系统中发现的α2A和α2C，它们负责镇静、镇痛、和交感神经溶解作用，而在血管平滑肌中发现的α2B负责血管加压作用。MOR和α2肾上腺素能受体激动剂之间的协同作用是由斯波尔丁首次报道的，他观察到吗啡和可卡因定皮下注射可以相互增强。右美托咪定像其他α2肾上腺素能受体激动剂一样，减少麻醉和阿片需求，产生镇静和镇痛，并减少阿片诱导的痛感过敏。开发更具选择性的α2A或α2C肾上腺素能受体激动剂，与阿片类药物产生强大的镇痛协同作用，可进一步提高治疗指标。 大麻素CB2受体激动剂和MAGL/FAAH抑制剂 2-AG和anandamide是内源性亲脂性配体，可激活大麻素CB1和CB2受体。CB1激动剂的临床使用受到限制，因为CB1介导的不良反应(精神活性、戒断、和运动障碍)，而CB2激动剂缺乏这些与大麻素相关的不良反应。CB2激动剂LY2828360与吗啡共给药，在抑制紫杉醇诱导的机械异痛感和阻断吗啡诱导的野生型小鼠奖励中产生协同抗异痛感作用，而不产生奖励或厌恶。2-AG和anandamide分别由脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)和单酰基甘油脂肪酶(MAGL)代谢。因此，抑制这些酶可能会增强大麻素活性。URB937是一种不透脑的FAAH抑制剂，通过激活CB1减少紫杉醇诱导的异位性疼痛，并与吗啡产生协同镇痛作用，但不增强吗啡的不良反应。BIA-10−2474是一种可透脑的FAAH抑制剂，在一项I期临床试验中，出乎意料地在5名健康志愿者中产生了严重的神经系统不良反应，导致1名受试者死亡。因此需要开发不透脑的FAAH 和MAGL抑制剂。GABA受体激动剂 GABA是中枢神经系统中一种抑制性神经递质，参与许多生理过程的调节。巴氯芬(Baclofen)是一种选择性GABAB受体激动剂，临床上用于治疗偏头痛、肌肉骨骼疼痛和三叉神经痛。巴氯芬与吗啡共给药产生协同抗疼痛作用，并拮抗吗啡的奖励效应。GABAB受体的阳性变构调节剂ASP8062 可产生镇痛作用，但不良反应少于巴氯芬。因此，应进一步研究GABAB阳性变构调节剂与阿片类药物的联合使用。此外，α1 GABAA受体已被证明与苯二氮卓类药物相关的不良反应有关，而α2、α3和α5 GABAA亚型介导脊髓镇痛。PF-06372865是一种不含α1 GABAA活性的GABAA受体激动剂，可逆转啮齿动物神经性、炎症性和术后疼痛模型的病理性痛觉过敏，目前正在进行临床Ⅱ期试验。 Gabapentinoids Gabapentinoids是电压依赖性钙(Ca2+)通道辅助α2δ (α2δ−1和α2δ−2)亚基的配体，并作为该通道的阻滞剂。尽管加巴喷丁类药物在临床上用于治疗癫痫、神经性疼痛和一些超说明书用途，但关于加巴喷丁类药物急性抗痛觉的研究相对较少。关于加巴喷丁类药物与MOR的相互作用，加巴喷丁的急性抗痛觉性作用似乎是通过阿片受体介导的，因为在小鼠中使用弹尾、夹尾和热板试验，加巴喷丁的抗痛觉性作用被纳洛酮拮抗。此外，通过甩尾实验，加巴喷丁和普瑞巴林增强了吗啡和羟考酮在大鼠中的抗伤害感受作用。在一项随机对照临床试验中证实了普瑞巴林在小鼠中可减少了阿片类药物的消耗。非竞争性NMDA受体拮抗剂 阿片类药物治疗后NMDA受体的激活，可能会降低阿片类药物的镇痛作用，而NMDA拮抗剂治疗可能会增强阿片类药物诱导的抗镇痛作用。也有研究表明，阿片类药物与NMDA受体拮抗剂的联合使用增加了在神经性疼痛状态下对阿片类药物的敏感性。高选择性NMDA拮抗剂(+)-MK-801当与吗啡共给药时，可减少神经性疼痛，可减少耐受性的发展，并逆转阿片类药物耐受性。然而，使用NMDA拮抗剂与阿片类药物的治疗指标非常狭窄，不良效应如严重的拟精神效应是常见的。EU1622-1，偏向的NMDA 正变构调节剂，降低Ca2+的通透性，同时增加激动剂的效力。Sigma-1 受体拮抗剂    sigma-1受体是一种配体调节的伴侣蛋白，它调节与其相互作用的蛋白质(受体、酶)的信号传导。Sigma-1受体拮抗剂单独产生抗痛觉作用，特别是在致敏条件下，如炎症、缺血性和由神经创伤或化学损伤引的神经性疼痛。然而，与阿片类药物不同，sigma-1受体拮抗剂在没有致敏刺激的情况下不会产生抗痛觉，而只在超敏条件下产生，并将伤害性阈值恢复到正常。S1RA，一种选择性sigma-1受体拮抗剂在尾弹试验中没有作用，但增强了抗疼痛感受作用，但没有增强丁丙诺啡、可待因、芬太尼、吗啡、羟考酮和曲马多的不良反应。与S1RA联合给药阻止了吗啡耐受性和奖励效应的发展。CM304是一种sigma-1受体拮抗剂，对sigma-1受体的选择性高于sigma-2受体，比S1RA剂量依赖性地减少了CCI和顺铂神经性疼痛模型中的异位性疼痛。因此，选择性sigma-1受体拮抗剂联合阿片类药物有可能作为神经性疼痛、炎性疼痛和术后疼痛的联合疗法。 5-羟色胺(5-HT) 去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)和5-HT1A激动剂 神经递质去甲肾上腺素和5-羟色胺在抑制脊髓伤害性刺激中起重要作用。milnacipran是一种SNRI，剂量依赖性地减少了大鼠术后疼痛模型中的超敏反应，并与吗啡具有协同相互作用。此外，阈下浓度的DAMGO(阿片激动剂)和5-HT显著降低GABA能微型抑制性突触后电流频率，提示联合治疗的镇痛效果.最近，compound 133，一种强效和选择性5-HT1A激动剂，在福尔马林和热平板试验中产生镇痛作用。因此，应该进一步研究MOR和选择性5-HT1A激动剂的联合治疗，因为这些联合治疗可能会降低MOR激动剂产生的奖励效应，耐受性和呼吸抑制。 靶向参与阿片信号传导的细胞内蛋白 G蛋白信号(RGS)调控因子蛋白与G蛋白的活化G-α亚基结合，增强其GTPase活性，加速其返回至无活性G-α- GDP状态，导致信号终止。有超过30种RGS蛋白，包括RGS9-2和RGS4，已被证明以激动剂依赖的方式调节阿片样物质的作用。此外，下调RGS蛋白RGSz1导致镇痛效果增强，并降低阿片类药物的奖励作用。噻二唑烷酮(TDZDs)通过共价修饰RGS蛋白中半胱氨酸残基来抑制RGS- g -α相互作用，其中CCG-203769和CCG-50014是对RGS4最有效的抑制剂。RGS同工异构体的瞬时半胱氨酸暴露机制不同，这可能对下一代RGS抑制剂的合理设计有潜在的帮助。因此，开发RGS蛋白的小分子抑制剂可能是发现减少阿片类药物不良作用的新疗法的可行途径。热休克蛋白90(Hsp90)是多种蛋白质的激活和稳定所必需的伴侣蛋白，抑制热休克蛋白90已被证明可以减少阿片类药物依赖和戒断的躯体体征。应进一步研究Hsp90调节剂用于阿片类药物协同治疗，以减少阿片类药物的不良反应。此外，信号激酶如ERK1/2、JNK MAPKs和p38 MAPK的激活可能在阿片类药物诱导的耐受、依赖、痛觉过敏/异常性疼痛和便秘以及KOR相关的厌恶和烦躁不安的不良反应中发挥作用。MOR或KOR激动剂与RK、JNK或p38抑制剂联合治疗可提高阿片类药物的治疗指数。然而，由于这些信号激酶广泛表达并参与许多生物过程，它们的抑制可能会增加非阿片类药物不良反应的风险。专注于阿片样物质细胞内信号蛋白调节剂的药物发现工作应该考虑筛选化合物的毒性。 双作用或多功能阿片配体 利用联合治疗的一种有效方法是设计对MOR和其他非阿片类疼痛靶点具有双重或多功能活性的化合物。Tapentadol是美国FDA批准的第一种同时具有MOR激动剂和SNRI活性的中枢作用镇痛药,由于具有双重作用模式，它被用于治疗中度至重度急性和慢性非癌性疼痛和神经性疼痛。Cebranopadol和compound 138是痛感肽/孤儿蛋白FQ肽(NOP)和MOR受体激动剂，在啮齿动物急性和神经性疼痛模型中显示出治疗急性和慢性疼痛的疗效。另一种化合物EST73502是一种MOR激动剂和sigma-1受体拮抗剂，在急性和慢性疼痛动物模型中具有与羟可酮同等的镇痛活性。与羟考酮相比，化合物139产生更少的阿片类戒断症状和肠道转运抑制化合物140，一种TRPV1拮抗剂和MOR激动剂双配体在小鼠福尔马林实验中产生抗伤害感受作用。Mitragynine，已被证明与阿片肾上腺素能和血清素能受体结合,通过甩尾试验在小鼠中产生抗疼痛感觉。因此，除了已知介导疼痛信号的受体靶点外，靶向MOR的双重或多功能配体仍然是开发新型镇痛药的可行途径。 阿片类药物是用于治疗疼痛的主要药物类别，过度使用阿片类药物治疗疼痛已导致阿片类药物过量危机。因此，需要新的镇痛药或治疗策略来遏制持续的阿片类药物流行。疼痛药物发现的一个主要挑战是缺乏适当的人类疾病的临床前替代模型。例如，像甩尾试验这样的急性抗触感试验测量的是啮齿类动物的反射行为，而不一定是抗疼痛感。此外，神经性疼痛模型的损伤后时间(约14天)不能恰当地反映人类的神经性疼痛。如果没有合适的疼痛模型，药物研发工作将受到阻碍，因为大多数候选药物通常在临床前阶段表现出良好的镇痛效果，副作用较少，但在临床试验中产生的效果与安慰剂相似。因此，非常需要适当的临床前疼痛模型。 目前正在进行临床疼痛试验的非阿片类候选药物包括：χ-conopeptide，一种选择性变抗NET抑制剂;CGX-1160，一种神经紧张素a类似物;BI44370 TA, CGRP受体拮抗剂;EC5026，一种sEH抑制剂。许多化合物和联合疗法仍处于临床前阶段。以非阿片类药物为目标将有助于克服与阿片类药物相关的滥用倾向、耐受性和呼吸抑制。与MOR激动剂相比，作用于非阿片类靶点的化合物的主要挑战是获得的镇痛效果较差。因此，针对导致特定疼痛的多种机制类型可能有助于提高镇痛效果。 综上所述，镇痛药物开发的重点是开发具有低滥用潜力的化合物。为了克服这一挑战，必须努力开发更安全的阿片类药物，减少滥用风险，或采用联合疗法等治疗策略，允许使用较低剂量阿片类药物，从而减少阿片类药物的相关不良反应。最后，努力已经并将继续关注开发具有与阿片类药物相似或更有效的非阿片类药物作用机制的新型镇痛药，这将在急性和慢性疼痛的治疗中是无价的。参考文献：Novel Approaches, Drug Candidates, and Targets in Pain Drug Discovery END 免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。 OTC2024类器官前沿应用与3D细胞培养论坛圆满落幕，点击图片可查看会后报告，咨询OTC2025类器官论坛请联系：王晨 180 1628 8769