APCS

1.引言 治疗性蛋白的免疫原性与超敏反应相关。第1型超敏反应涉及产生IgE亚型的抗药物抗体（ADA）。然而，IgE ADA和高滴度IgG ADA的产生可能对包括输液反应和/或过敏性休克在内的重大不良反应有贡献，尽管这些类型的不良反应并不常见。IgE ADA复合物可以与嗜碱细胞和肥大细胞上的Fcε受体结合并交叉连接它们，导致IgE介导的过敏性休克。此外，IgG ADA可以与治疗性蛋白复合，IgG ADA免疫复合物可以交叉连接中性粒细胞上的Fcγ受体，从而释放类似组胺的血小板活化因子。此外，未能从血液中清除的大型治疗性蛋白-ADA复合物在组织如肾脏、滑膜和脉络丛中沉淀，导致组织损伤和器官衰竭。当ADA与内源性蛋白同源物发生交叉反应时，会发生最严重的不良事件。例如，多年给患者使用重组促红细胞生成素（EPO）后意外地发展为纯红细胞再生障碍（PRCA），这一特征被归因于ADA的发展，而没有发展出任何先前的重大免疫原性问题。ADA导致EPO的配方和给药途径的修改。诺华公司开发的通用EPO的临床试验显示了PRCA的发生；在这种情况下，PRCA的发生被归因于药物产品中大量存在的钨微粒引起的产品聚集。ADA与内源性蛋白发生交叉反应的其他临床情况包括人类生长激素配方中存在的聚集物引起的中和ADA，以及重组治疗产品如因子VII中残留宿主细胞蛋白（HCP）引起的ADA。鉴于这些严重结果是由交叉反应性ADA引起的，已经开发了广泛的体外方法来测量ADA的存在。此外，目前也有用于识别单克隆抗体和HCP免疫反应驱动因素的方法。考虑到这些历史结果，监管机构建议生物治疗药物开发商使用结构化方法来测量免疫原性风险。例如，欧洲药品管理局（EMA）已经发布了关于生物技术衍生治疗蛋白免疫原性评估的指南，其中将影响治疗蛋白免疫原性的因素分类为有益的患者、疾病或产品相关类别。除了EMA指南外，美国食品药品监督管理局（FDA）最近对新药产品和现有产品的通用版本的指南也建议了免疫原性风险评估方法，例如，2014年FDA指南—治疗蛋白产品的免疫原性评估指南。这些指南强调了T细胞表位对免疫原性的贡献，并提到了调节性T细胞的免疫调节作用。此外，“关键质量属性”记录在FDA赞助的质量设计倡议中，侧重于制造“工艺开发”，指的是可能使治疗性蛋白具有免疫原性的因子。最近发布的合成肽药物指南继续遵循监管指南趋势，坚持T细胞反应的重要性。值得注意的是，FDA不将小于40个氨基酸的肽视为蛋白质，但免疫原性测试仍然是这些肽的考虑因素，类似于蛋白质的免疫原性测试。FDA建议免疫原性评估应进一步扩展到合成相关的杂质，并建议肽药物开发商确定与活性药物成分共纯化的杂质中T细胞表位的存在。对于基于肽或蛋白质的药物，主要氨基酸序列本身可能是免疫原潜力的强决定因素。除了主要氨基酸序列之外，机构指南指出可能使特定个体倾向于免疫反应的患者和疾病相关类别。一些例子包括免疫缺陷和伴随的免疫抑制治疗，如甲氨蝶呤，可能会降低免疫原性和自身免疫性，而自身免疫可能会增加由于ADA的风险。相比之下，产品相关因素，即最终药物产品本身固有的有助于免疫原性的因素，可能包括糖基化概况的修改，生物物理和生化属性，肽制造杂质和/或降解产物，或在配方准备期间引入的因素。显然，监管指南和更新的临床前免疫原性风险评估方法正在趋于共识，为这篇综述提供了动力。 2.专注于T细胞依赖性免疫原性评估和缓解 虽然免疫原性测试涉及ADA检测，但根本原因是T细胞依赖（Td）免疫反应，无论是由于聚集物、HCP、杂质、由于目标参与导致的免疫调节，还是药物序列本身。因此，Td免疫原性风险评估侧重于可能来自产品序列（蛋白质或肽）的已知肽段，称为T细胞表位。某些药物衍生的肽/表位可能与人类白细胞抗原（HLA）/主要组织相容性复合体（MHC）II类分子结合，然后肽-MHC在抗原呈递细胞（APC）表面呈递给T细胞。更具体地说，从药物物质处理和衍生的T细胞表位（T辅助细胞表位）对ADA的发展至关重要。T辅助细胞表位由HLA II类分子的一个子集（主要是HLA DR，还有DP或DQ）呈递给CD4+ T细胞，然后释放出B细胞成熟和增加ADA结合亲和力成熟所需的必需细胞因子。这些相互作用发生在淋巴器官的生发中心，树突状细胞和B细胞向T滤泡辅助细胞和T滤泡调节细胞呈递T细胞表位，调节体液免疫反应的成熟。正如识别T辅助表位对免疫原性风险评估至关重要一样，通过去免疫化去除T细胞表位是Td免疫原性风险缓解的关键。去免疫化过程现在完全集成到专注于缓解Td免疫原性风险的临床前计划中。降低免疫原性（调节性T细胞表位）的T细胞表位对于引发含有“人类”成分的蛋白药物的免疫反应同样重要，如人类来源的单克隆抗体、酶替代疗法和其他人类来源的生物治疗药物。循环调节性T细胞（Tregs），也称为自然Tregs（nTregs），有助于调节人类免疫反应，已知是表位特异性的。在IgG中发现调节性T细胞表位（Tregitopes）可以改善单克隆抗体的风险评估。 2.1.定义：生物治疗药物的T细胞依赖性免疫反应 生物治疗药物的免疫反应可以分为两大类。在第一类生物治疗药物中，对“外来”蛋白（对患者来说是外来因子）的免疫反应是典型的，类似于对病原体、疫苗或同种型抗原的反应。血液因子如凝血因子VIII就属于这一类，因为它们在完全没有或部分缺乏内源性对应物的个体中发展。对于像庞贝病的酸性α-葡萄糖苷酶这样的替代酶也是如此。在第二类生物治疗药物中，对自体蛋白（“自身”蛋白）的免疫原性表明B细胞和/或T细胞耐受性的破坏，类似于某些自身免疫疾病中对自体蛋白的反应。自身耐受性由循环调节性T细胞主动调节。这些T细胞对自身蛋白（如免疫球蛋白）中的表位序列做出反应（在HLA结合特征方面可能与非自身蛋白相同），但它们对激活其T细胞受体（TCR）的反应不同。例如，Franco和Sette在川崎病免疫球蛋白治疗患者中发现了分泌IL-10以响应IgG中HLA DR限制性T细胞表位的调节性T细胞。在英夫利昔单抗治疗患者中也记录了对源自英夫利昔单抗的特定T细胞表位的IL-10反应（可能是由于Treg激活）。鉴于许多自身蛋白如单克隆抗体含有调节性T细胞表位，破坏免疫耐受的机制尚不明确，类似于对外来蛋白的免疫反应机制，但可能包括表位模仿、T细胞交叉反应、存在微量先天免疫激活剂如Toll样受体激动剂的存在，和/或聚集蛋白。Toll样受体的遗传变异、共刺激分子的多态性以及细胞因子受体的修饰等可能涉及耐受性的破坏。患有自身免疫疾病的患者可能有这些遗传异常之一，并且可能被认为有更高的发展ADA的风险。 2.2.T细胞独立与T细胞依赖反应 除了T细胞反应的调节外，像ADA产生这样的体液免疫反应可能是胸腺独立（T细胞独立[Ti]）而不是Td起源的。例如，当结构模式如聚合物重复或碳水化合物分子通过B细胞受体（BCR）直接激活B细胞时，B细胞可能以Ti方式激活。Ti激活的B细胞可以从Td激活中区分出来。Ti激活产生的抗体在同型和亲和力方面都是有限的，如果产生了记忆B细胞，那么抗体反应就不是长期的。相比之下，Td激活的B细胞以类别转换（IgM到IgG）为特征，如果产生了记忆B细胞，那么抗体反应具有更高的亲和力，更强大，更持久。生物治疗药物给药后IgG抗体的发展通常表明治疗药物正在推动Td免疫反应。根据定义，Td反应取决于T细胞通过抗原处理和呈现蛋白来识别治疗蛋白衍生的表位。由于人类群体表达不同类型的HLA II类等位基因，抗原表位与HLA之间的相互作用可能在人类群体表达的HLA等位基因谱中表现出不同的结合稳定性。这种HLA遗传多态性及其对特定肽结合（HLA限制）的影响是患者遗传学（HLA单倍型）成为对特定蛋白治疗药物免疫反应的主要决定因素的主要机制。 2.3.先天免疫反应 先天免疫系统控制Td免疫的启动。当被称为APC的先天免疫细胞在外围被激活时，它们会迁移到局部淋巴结，在那里它们可以在适当的共刺激信号存在下将药物衍生的肽抗原呈递给抗原特异性T辅助细胞。与TCR和BCR的特异性不同，先天免疫系统的细胞表达胚系编码的不变受体，称为模式识别受体（PRR），它们识别常见的微生物模式（病原体相关分子模式）。PRR包括几个家族的受体，如Toll样受体、RIG-1螺旋酶和C型凝集素受体。PRR不仅识别微生物模式，还识别一类称为警报素或与危险相关的分子模式（DAMPs）的警报信号，这些信号由受压和死亡的细胞大量释放，以促进局部炎症反应。DAMPs有助于对抗病原体、组织损伤和DAMP介导的炎症期间的压力，这发生在治疗蛋白给药期间，并促进适应性免疫反应。此外，宿主细胞和过程衍生的杂质，称为先天免疫反应修饰杂质（IIRMIs），可以通过与PRR相互作用促进适应性免疫，刺激先天免疫系统。体外和体内研究表明，即使在微量水平，IIRMIs也可以破坏对治疗蛋白的耐受性，并促进不需要的免疫反应。对Td免疫原性的新理解包括疾病状态，例如，针对心血管疾病患者的治疗通常不太可能与增加ADA的产生相关，而自身免疫疾病患者可能表现出一系列可以导致对治疗反应增加倾向的免疫功能障碍。或者，一些患者群体可能有不寻常的HLA分布，这些分布与更大程度地呈现来自药物序列的T效应表位有关，导致更高或更低水平的免疫原性。最后，药物本身的作用机制可能会干扰或促进免疫系统的激活，导致免疫原性风险更高或更低。在100人中看到一两个人（每100人）具有比其他人更高的基线免疫反应并不少见；这些高风险个体也可能对传递载体有夸张的免疫反应。受试者的基线免疫状态（包括B细胞和T细胞库以及HLA单倍型）可以影响他们对生物制剂产生免疫反应的能力。此外，如上所述，生物治疗药物在自身免疫疾病患者中可能更具免疫原性，因为受体患者的免疫系统存在潜在的炎症状态。在过去的几年里，针对自身免疫疾病患者的特定药物包括抗TNF药物，在选定的患者群体中具有显著不同的免疫概况。自身免疫疾病患者中ADA滴度增加的解释各不相同；然而，这些患者可能有缺陷的调节性T细胞或缺乏功能性调节性T细胞细胞因子受体（白细胞介素[IL]-2和IL-10）。调节性T细胞或调节性细胞因子的功能受到干扰，这些细胞因子对Treg功能至关重要，可能会显著降低Treg对含有Tregitopes的药物的反应，包括许多用于治疗自身免疫疾病的单克隆抗体。像甲氨蝶呤和TNF抑制剂这样的药物可以恢复Treg功能，当药物达到治疗水平时，可能会降低ADA滴度。这是RA活跃、加重的患者ADA滴度高的一个潜在解释，这也可能会解释为什么在有效抗炎药物治疗后ADA可能会消失。 2.4.药物功能作为免疫原性的决定因素 针对免疫系统的生物治疗药物的出现已经明确表明，药物本身的作用也可以促进或调节免疫原性，并在抗TNF药物的活性中发挥重要作用，因为TNF对调节性T细胞的作用，如上所述。抗TNF治疗后Treg功能的改善可能会导致在临床过程中对抗TNF药物的ADA滴度降低。同样，IL-2，一种调节性T细胞所需的细胞因子，不仅可以诱导亲调节环境，还可以降低药物产生ADA的可能性。这种机制可能有助于低剂量IL-2治疗在自身免疫疾病中的有效性。相反，IL-2也可以增强效应T细胞反应的功能，并已在治疗病毒和肿瘤疾病中以高剂量使用。 2.5.药物靶标和免疫原性：检查点抑制剂 一些药物如检查点抑制剂（CPIs）增强免疫反应；因此，CPIs在治疗侵袭性癌症方面已证明成功。然而，一些CPIs比预期更具免疫原性，可能导致随着继续治疗而失去疗效。一个假设是，它们的作用降低了可能存在于CPIs序列中的自然Tregitopes的耐受作用和/或增强了效应T细胞对药物序列中外来表位的反应。 2.6.药物靶标和免疫原性：抑制抗炎细胞因子 与CPIs相反，某些抗细胞因子药物比预期的免疫原性要小得多。其中一种药物是托珠单抗，一种抗IL-6生物制剂，目前广泛用于治疗RA和其他自身免疫疾病。值得注意的是，由于IL-6是T细胞激活所必需的，干扰IL-6可能会减少T细胞参与，从而降低ADA滴度。利妥昔单抗是另一种可能直接干扰免疫原性的药物；这种药物靶向发育中的B细胞上的CD20，并减少抗体分泌浆细胞的形成，这可能解释了为什么在利妥昔单抗治疗期间通常检测不到ADA。 2.7.肽类药物 在过去几十年中，肽合成的重要进展促成了治疗性肽药物制造的重大转变，并扩大了进入临床管线的新型肽的数量。对于单克隆抗体、血液因子和重组酶，肽药物中存在的HLA结合序列可能会激活调节性或效应T细胞，因此，这些肽在临床使用中可能表现出免疫原性。从完全重组到合成肽药物的转变引起了监管机构对合成相关杂质可能诱导不需要的免疫反应（包括产生ADA）的担忧。监管机构对选定的通用肽的经验导致了FDA仿制药办公室最近引入的通用肽产品指南草案。肽类药物的免疫原性主要与肽合成方法有关，因为可能会引入可能难以从最终药物制剂中去除的肽杂质。这些杂质可能含有可能有助于T细胞激活（随后，ADA）的新T细胞表位。在某些情况下，杂质的存在与过敏性休克有关。在肽合成过程的每一步可能会无意中产生几类肽杂质，如氨基酸插入和删除、非对映异构氨基酸的合并以及氨基酸R基团的氧化。杂质也可能在储存过程中产生。相对于Td免疫原性，当无意的氨基酸序列修改导致含有新HLA结合配体或改变现有表位的TCR面向轮廓的杂质时，可能会引入新的T细胞表位。 2.8.计算机辅助筛选 当前的免疫原性筛选实践通常从计算机辅助筛选评估开始，然后根据需要进行HLA结合测定、T细胞测定和MHC相关肽组学（MAPPs）。一些团队从MAPPs开始，不使用计算机辅助工具；然而，MAPPs消耗资源且成本高昂。对可用计算机辅助工具的更多经验和熟悉可能会促进这些工具作为未来免疫原性评估的第一步的更大适应。本节简要介绍用于计算机辅助筛选的工具，并强调这些工具的改进。 2.9.T细胞表位预测 ADA介导的反应是由于适应性免疫反应，由T细胞对HLA结合在APC表面展示的线性肽表位的反应支持。对于通过常规途径（外源性的，即静脉内、皮下和局部）输送的生物治疗药物，通过II类途径向CD4+辅助T细胞的呈递最为相关；然而，如上所述，涉及CD8+ T细胞反应的生物治疗药物由病毒载体和细胞治疗输送是一个日益关注的问题。幸运的是，现在可以高度自信地预测T细胞表位。T细胞表位序列的核心残基（由九个氨基酸组成）定义了与HLA DR、DP和DQ等位基因的口袋的结合亲和力和稳定性。在几个公共和学术平台上，有多种方法可以评估完整蛋白的免疫原潜力，有时这些方法与基于假设结合亲和力和T细胞前体频率的数学模型或与MAPPs确定的肽组搭配。用于表位扫描的公共网站可能会出现和消失，并且可能会修改，通常不通知，这导致随时间变化的免疫原性解释的变化。出于这个原因，许多中到大型制药公司导入在线算法并在其防火墙内运行它们，以减少知识产权披露的风险。其他公司或机构使用像安全访问的商业级ISPRI工具包这样的基于网络的工具，或将免疫原性解释外包给商业研究组织。一些工具，如商业ISPRI平台，使用独特的算法和代码来识别单克隆抗体序列中的Treg表位，并对表位内容相对于随机预期进行统计评估，并针对自身性（即耐受潜力）进行调整。使用标准化的“免疫原性量表”，可以直接将新的生物药物产品与其他已知的非免疫原性和免疫原性产品进行排名。该工具包不仅具有寻找“类人”（见下一节）的表位的新算法，因此不太可能参与激活的T细胞，而且还具有直接进行计算机辅助分析的去免疫化和耐受化方法。 2.10.筛选自身性（耐受潜力） T细胞不仅识别肽序列，还识别与HLA分子裂隙中结合的肽复合物。在任何HLA配体中，某些氨基酸与HLA分子本身接触，而其他氨基酸对TCR可接近。如果来自特定表位的TCR面向残基在来自人类蛋白质组的多个HLA结合序列中保守，则该表位可能会激活特定于这些人类蛋白的T细胞。这可能导致由自然Tregs产生的调节性反应，或者由于T细胞在胸腺选择期间的无力或删除而导致的有限或无反应。对于许多HLA等位基因，HLA结合裂隙中的锚定肽位置是已知的，其他残基与TCR相互作用。可以采用诸如JanusMatrix之类的算法，将来自候选治疗药物的预测表位与人类蛋白质组进行筛选，以区分更类似于自身、因此可能被耐受的肽与那些人类交叉保护有限、因此更可能被人类免疫系统识别为“外来”的肽。治疗衍生的“外来”表位很可能是针对治疗性T细胞反应的目标。 2.11.筛选相关肽库 如果确定了T细胞表位，那么也可以确定表位是否已经在体外或体内进行了测试。免疫表位数据库（www.iedb.org），是美国国家过敏和传染病研究所的一个合同项目，现已整理了20,860篇期刊文章和直接提交的内容，编目了近622,105个肽表位。通过将新序列与此数据库筛选，研究人员可以确定开发产品中的表位是否已报告为MHC配体，以及是否已知T细胞反应的表型，这允许将已知序列与具有更大免疫风险的未知序列进行分类。此外，当识别到风险信号时，包含来自APCs的序列的蛋白质组学数据库可以揭示组织和疾病状态之间的重要关系，以通知临床研究期间的仔细监测。7.2.12 按免疫原潜力对生物制剂候选物进行排名 在所有其他因素都相等的情况下，给定蛋白质中包含的T细胞表位的负担越大，该蛋白质诱导免疫反应的可能性就越大。可以通过在ISPRI工具包上执行的操作来实现一种生物制剂与另一种生物制剂的比较，通过对HLA等位基因的表位含量得分进行标准化并根据序列长度进行调整。区域表位密度也可以驱动免疫反应。 3.评估免疫原性风险的体外方法 广泛的验证体外测定可能成本过高；因此，在当前的临床实践中，正在执行使用先进的计算机辅助工具进行的分析。计算机辅助分析后，可以进行HLA结合和T细胞测定，或外包给商业研究组织。这些测定可以应用于（i）药物开发的非常早期阶段，以设计预测免疫原性低的新治疗药物，（ii）在后期阶段，对在人体首次研究中表现出高免疫原性的临床资产进行去免疫化，或者（iii）在项目终止后回顾性地进行，以解释观察到的高临床免疫原性背后的机制和风险因素。显然，对于新的（以及旧的生物药物的通用版本）生物药物要成功，如果在开发阶段的临床前进行免疫原性风险评估，则最具成本效益。 3.1.人类白细胞抗原结合测定 产生T细胞反应的第一步是APC将肽抗原呈递在HLA II类/MHC II类分子上供T细胞识别。一旦通过计算机辅助分析鉴定出潜在表位，可以通过HLA结合测定来首先验证预测，按照Steere等人描述的方法进行，以评估肽与一个或多个HLA超型等位基因结合的能力。超型等位基因指的是共享表位结合基序的HLA-DR等位基因家族。利用这些超型家族，可以在覆盖全球超过95%的人口的同时，对相对较少的等位基因进行结合测定。产生有意义的结合测定数据的一个关键因素是设计要测试的肽序列和测试肽的来源。II类肽的核心结合区域包含九个氨基酸，位于HLA分子的肽结合槽中。这种相互作用由核心结合区域两侧的邻近残基稳定，并延伸到结合槽外面。在设计结合测定的肽时，重要的是要正确地将结合基序置于HLA结合测定中，并具有最佳肽设计。简而言之，感兴趣的肽与特定等位基因的标记追踪肽和可溶性HLA超型单体一起孵育至平衡。第二天，停止结合反应，将混合物转移到预先用pan抗HLA-DR抗体包被的测定板中，并孵育过夜。在此孵育后，进行显色，肽结合通过时间分辨荧光光谱间接测量。使用固定浓度的标记追踪肽和一系列浓度的测试肽，可以生成一个多点剂量范围曲线，从而计算出IC50值，该值不仅提供肽与HLA结合能力的信息（是/否），还提供肽对给定HLA-DR超型的相对亲和力。IC50值可以用来根据它们对给定HLA等位基因的亲和力将肽分类，如高、中等、低和非结合。随着新技术的出现和可访问性，研究结合反应的动力学将提供更多细节。肽纯度也会影响结合测定的结果。某些制造商的肽纯度可能低至60%，这是由于制造过程和原料的纯度。肽内的杂质可能导致假阳性结果，因此导致错误的结论。结合测定的肽应具有最低85%的纯度，并应作为净肽订购。错误的结果也可以归因于错误的合成。例如，非结合肽可能是在同一台机器上合成的，该机器用于早期合成HLA结合肽。这种污染可能会破坏药物开发计划；参考中提供了一个示例。 3.2.外周血单个核细胞测定 从全血中分离的外周血单个核细胞（PBMC）是用于体外细胞基础测定的免疫原性预测中最广泛使用的效应细胞来源。实验中使用的PBMC可以来自健康志愿者或受影响患者的样本中新鲜分离，或从未冷冻保存的库中解冻，可能覆盖适当的疾病相关或常见且有充分文献记录的HLA等位基因的代表性。由于高通量和易于执行，使用全血PBMC或CD8+ T细胞耗尽的PBMC的PBMC测定仍然是最常用的体外细胞基础测定，用于测量免疫原性潜力。 3.3.树突状细胞-T细胞测定 体外单核细胞衍生的树突状细胞（moDCs）和自体CD4+ T细胞的共培养越来越多地用于评估药物候选物和产品关键质量属性（CQAs）的免疫原性潜力。DC-T细胞或DC-PBMC方法将系统简化为细胞介导免疫的基本组成部分：CD4+ T细胞与APCs在相关细胞比例下相互作用，这提高了灵敏度，因为实验系统中潜在反应细胞的总数远大于整个PBMC方法。然而，这种方法耗时且需要分离和分化单核细胞为DCs，然后进行抗原装载/脉冲步骤，这可能依赖于试剂、操作员和材料。单核细胞可以从PBMCs开始，通过塑料粘附或使用磁珠分离方法进行分离。然后使用细胞因子或其他因素进行moDCs的分化和成熟，同时添加所需的生物治疗药物、肽片段或聚集体。成熟的、脉冲化的moDCs通常与自体纯化的CD4+ T细胞共培养，以允许抗原呈递和T细胞激活，这取决于免疫原性潜力。反应的测量方法与PBMC测定相同，如上所述。moDC-T细胞系统的高级变体是模块化免疫体外构建（MIMIC R）模型，它能够可靠地产生针对生物制剂如蛋白质、肽、单克隆抗体和包括核酸在内的新型方式的抗原特异性先天和适应性免疫反应，也已用于这些目的。 3.4.流式细胞术分析T细胞表型 流式细胞术已成为免疫原性测试的宝贵工具，允许对免疫反应进行单细胞水平的特征描述。随着使用更多激光和滤光片组合的更复杂仪器以及染色和检测方法的进步，可以从患者的血液样本中获得大量信息。T细胞表位具有免疫原性或耐受性的能力。虽然在细胞培养中测量Tregs的扩增可能具有挑战性，但可以通过在存在免疫原性肽的情况下与效应T细胞共培养来确认Treg表位的存在。在这个旁观者测定中，激活的Tregs抑制抗原特异性T效应细胞对免疫原性肽的反应。标准旁观者测定利用对抗原的免疫记忆，如破伤风毒素，大多数细胞群体通过疫苗接种或自然暴露已经接触过。PBMCs在存在灭活的破伤风类毒素和Tregitope的不同浓度下培养10天。细胞经过染色分析，然后通过流式细胞术计数（Teff细胞定义为CD3+CD4+CD25+FoxP3low，Treg细胞定义为CD3+CD4+CD127lowCD25+FoxP3hi）。然后可以通过CFSE稀释测量细胞增殖。在存在Tregitope和破伤风类毒素的情况下，与单独存在破伤风类毒素相比，T效应细胞的增殖减少。 3.5.主要组织相容性复合体相关肽组学测定 在1990年代初，首先描述了一种称为MAPPs的额外方法。这种测定在识别APCs表面呈递的相关HLA上的处理肽方面证明是有价值的。此外，这种方法提供了健康受试者和疾病患者的抗原处理变异性的详细信息，并且与HLA相关的肽的测序可以确认/验证使用算法识别的序列。液相色谱-质谱灵敏度和蛋白质组学分析的最新进展使得HLA结合映射测定可以在临床前用于映射生物治疗药物中存在的潜在抗原序列。并非所有潜在的HLA结合肽都被APCs处理和呈递，因为HLA结合的部分展开和天冬氨酰蛋白酶修剪的结合。此外，HLA DM和HLA DO的编辑功能进一步提高了要呈递的肽的选择性。在这些测定中，APCs在体外产生并与感兴趣的治疗蛋白孵育24小时，之后它们经历细胞因子/有丝分裂原诱导的成熟步骤以上调HLA表达。细胞溶解后，HLA受体-肽复合物进行免疫沉淀，其中复合物被分离，然后进行酸洗脱步骤，肽从HLA复合物中解离，然后通过液相色谱-质谱测定肽序列。使用蛋白质组学蛋白质数据库算法可以进行内源性肽的减法和肽到治疗的映射。这些测定可能会识别出可以针对去免疫蛋白工程的抗原肽。此外，来自疾病患者的全血分析可以提供呈递改变以及对重组替代治疗的耐受性方面的见解。算法、先天和适应阶段输出以及MAPPs，所有这些都在案例研究中使用，已应用于抗IL-21受体ATR-107。对一级序列的计算机辅助分析预测了重链互补决定区（CDR）2中的两个重叠的CD4+ T细胞表位，以及轻链CDR2中的一个单独表位。MAPPs确认了LC CDR2中的表位作为DCs呈递的主要肽。ATR-107诱导DC激活，这可以通过细胞表面激活标记的上调表达、细胞因子产生增加以及在共培养条件下自体CD4 T细胞的特定增殖来证明。使用MAPPs验证计算机辅助预测结果可以为开发商提供保证。然而，MAPPs测定中肽的洗脱并不确认肽是否推动Td免疫反应。T细胞反应可能因响应序列的T细胞表型而异。当MAPPs在没有额外工具探索响应洗脱肽的T细胞表型的情况下使用时，可能会过高预测免疫原性。个体表位驱动免疫原性的重要性在Cassotta等人最近的一项演示中得到了加强，他们对针对α4整合素的人源化抗体纳他珠单抗的免疫原性进行了MAPPs分析。利用计算机辅助和体外细胞测定的组合，如与患者外周血液中分离的B细胞进行的MAPPs测定，作者确定两名接受纳他珠单抗治疗的多发性硬化症患者发展出中和ADA，对位于轻链V区的CD4+ T细胞表位有T细胞反应。 4.通过去免疫化和耐受化减轻免疫原性 4.1.去免疫化 减轻免疫原性的理想起点是通过工程设计分子，使其在患者中引发不需要的免疫反应的风险较低。这可以通过结合去免疫化和耐受化过程来实现。在单克隆抗体的情况下，去免疫化过程包括两种非互斥方法：超人类化，即将小鼠CDRs移植到人类来源的抗体框架中，以及移除T细胞表位序列，这些序列是使用表位预测对数和体外确认测定的组合来识别的。将小鼠CDRs移植到人类V区域通常会导致亲和力下降或丧失，这可以通过在人类框架中对药物-靶标相互作用至关重要的位置引入小鼠氨基酸（所谓的“回变”）来恢复。这些回变可能会引入额外的T细胞表位；因此，需要应用迭代和及时的去免疫化策略，以在分子序列被优化以实现预期的预测效果时，耗尽去除表位的可能性。在这种情况下，增强的二元替代技术可能是一个有效的组合方法，但需要进一步探索。 4.2.耐受化 与去除有害的CD4+ T细胞表位互补的是引入T调节序列，这个过程被称为耐受化。耐受化在替代疗法中特别有趣，在替代疗法中去除T细胞表位可能会影响药物功能，或者在基因疗法中用来平衡由衣壳抗原决定基引起的细胞毒性反应的激活。事实上，预防性给药腺相关病毒AAV衍生的衣壳蛋白融合到Treg表位可以减少病毒衣壳特异性CD8+ T细胞反应，并伴随着Treg细胞计数的同时增加。迄今为止，预期减少去免疫化和/或耐受化分子的免疫原性的证明依赖于体外和体外测定或临床前模型。高度免疫原性的单克隆抗体的去免疫化形式尚未在临床环境中完全适用，因为生物治疗药物开发商专注于开发具有更长专利寿命和更大操作自由度的新型、免疫原性较低的分子。 4.3.治疗诱导的耐受性 减轻ADA发展风险的努力通常集中在降低治疗蛋白的内在免疫原性上，对于患有血友病A和B的患者，他们对重组凝血因子产生抑制分子，已经建立了免疫耐受诱导协议。针对基于单克隆抗体的药物的ADA反应也可能导致反应丧失和药物更换，即使是完全人源化的分子也是如此。在这种情况下，已经构想并审查了各种诱导对生物治疗药物免疫耐受的方法。对其他救命治疗蛋白的ADA反应，如酶替代疗法，已经损害了治疗效果，有时甚至导致死亡。对于基因疗法，对转基因和病毒载体的ADA发展仍然是成功治疗的主要障碍：对病毒衣壳有预先存在的中和抗体反应的患者没有资格接受治疗，发展出治疗诱导的体液免疫的患者将没有资格重新剂量。“去免疫化”指的是去除推动T辅助介导的免疫反应的T辅助表位可能会减少T辅助免疫反应，而“免疫工程”或“耐受化”指的是通过保留或引入Treg表位（Tregitopes）到蛋白质序列中来识别和增强Treg反应。这种计算机辅助方法使得引入调节性T细胞表位以减少免疫原性的潜力成为可能。或者，可以使用现有的药物制定与免疫耐受诱导相关的方案，这些药物针对与ADA发展相关的免疫瀑布的主要参与者，通过抑制有害的效应T细胞反应或激活耐受途径。前者可以通过干预与T细胞和B细胞激活相关的机制或通过使用免疫抑制剂如环磷酰胺或甲氨蝶呤、抗CD3或抗CD20抗体、蛋白酶体抑制剂或多种耗尽剂的组合来实现。已经应用了几种这样的方法，包括同时使用甲氨蝶呤来减少T细胞介导的免疫原性。在庞贝病和对FVIII疗法抑制剂的耐受性诱导中，目前使用的方案涉及多种药物的组合，如利妥昔单抗（消除抗体分泌B细胞）和静脉注射免疫球蛋白（结合并去除抗体或诱导耐受性）。庞贝病的方案中加入了甲氨蝶呤，这种修改后的方案已经成功地在患有高风险庞贝病的婴儿中建立了对阿糖苷酶α的耐受性。其他正在考虑的方法包括同时给予纳米粒子形式的雷帕霉素方案或与Tregitopes共同给予。在体外条件下，注入扩增的Tregs和Bregs并表达抗原特异性受体可以控制血友病A临床前模型中抑制物的发展。大多数免疫耐受诱导方法仍处于开发初期，这些干预措施的长期效果仍然未知。然而，已经达到临床环境的耐受性方案的价值是激励继续评估免疫耐受诱导作为减轻生物治疗药物不需要的免疫原性的手段。 4.4.抗药物抗体测定标准化 由于缺乏ADA测定的标准化和协调，跨临床研究比较治疗蛋白的免疫原性一直具有挑战性。对于给定的治疗蛋白，关键测定参数（如灵敏度和药物耐受性）的变异性可能导致各个实验室对临床发病率的不同估计。在这种情况下，由Innovative Medicines Initiative（IMI）资助的ABIRISK财团（针对生物制药免疫：预测和分析临床相关性以最小化风险）产生了单克隆抗体，用作ADA测定中的标准。这些通用标准可用于基准测定灵敏度和药物耐受性，常规监测测定性能，并验证生物仿制药ADA测定中的抗原性等效性。此外，基于这些标准的免疫原性评估可以帮助临床医生了解如果观察到效果丧失的剂量策略。针对利妥昔单抗、纳他珠单抗、英夫利昔单抗、阿达木单抗或干扰素β的各种同型和亲和力的单克隆中和抗体是从用相应的治疗蛋白免疫的患者中分离的B细胞产生的，如前述方法所述。生产规模扩大和进一步的表征分析使用ABIRISK验证ADA测定正在进行中。最终，所有抗体将在国家生物标准和控制研究所公开提供。 5.新方式和免疫原性风险评估 如在“新方式”部分所讨论的，新的治疗方式，如细胞和基因疗法，在临床环境中已显示出免疫原性。这些方式可以刺激免疫反应的机制是复杂的，因为高水平的工程、细胞内表达、引入工程基因产品和复杂的输送系统。主要为蛋白质治疗药物开发的修改免疫原性风险评估工具和测定可用于最小化这些新型治疗的免疫原性风险。 5.1.特定细胞系/可溶性T细胞受体 依赖于APCs展示处理肽段在HLA类I/II背景下与T细胞库相互作用的新体外测定方法，被证明对于进一步定义抗原特异性和免疫反应传播非常有用。此外，使用表达类I和类II HLA的工程B细胞系有助于高通量预测细胞内处理和呈现潜在抗原表位。例如，在竞争性方法中，使用可溶性TCRs识别HLA参考肽复合物，用于检测单等位基因APC系呈现潜在免疫原性表位（默克，未发表数据）。 5.2.建模 如上所述，可以在开发的早期阶段部署各种计算机辅助和体外工具，以指导蛋白质工程和设计预测免疫原性低的药物候选物。然而，这些工具可以用来评估与产品相关的风险，特别是基于序列的风险，但它们可能不会揭示与免疫原性相关的因素，如患者和治疗相关因素。免疫原性的总体风险依赖于不同风险因素的加权和整合，其中一些是经验性的或理论性的。免疫原性定量系统药理学（QSP）模拟器可以帮助简化和统一这种整合。它们结合生物治疗药物、生理学基础的药代动力学（PK）和免疫反应的机制模型，以模拟大规模临床试验并预测免疫原性的发生率。可以模拟关键变量如HLA基因型、联合疗法、剂量方案和给药途径对ADA发生率的影响，以及ADA对药物PK的影响。QSP模拟器仍在开发中，它们需要更多的经验输入数据和完善与免疫系统相关的参数，如抗体发展的动力学。验证后，QSP模拟器可以促进个性化管理和减轻免疫原性。 5.3.免疫原性重点组织 由于在准确进行免疫原性风险评估以及测量和确定ADA的临床相关性方面存在挑战，制药公司、生物技术研究所和合同研究组织联合起来，通过解决现有差距在该领域取得进展。创建了科学非营利协会，如欧洲免疫原性平台（www.e-i-p.eu/）。该平台旨在促进免疫原性专家之间的交流，鼓励和领导与监管机构的互动，以及与更广泛的科学界分享知识和免疫原性领域的最新进展，并提供关于免疫原性的实践和监管方面的培训课程。 ABIRISK财团是另一种协作方法，旨在促进免疫原性科学的进步。临床和基础研究学术中心与工业伙伴合作进行了为期6年的研究项目，并解决了与不需要的免疫原性相关的一些主要问题和实际障碍，如现有预测工具的价值、ADA测定、协调和标准化、检测到的ADA的临床相关性、患者风险因素的识别和预测标记。 这种广泛的跨实验室合作在欧洲、美国和以色列产生了一个衍生倡议。BIOPIA（https://ki.se/en/cns/biopia）是一个非营利性努力，由欧洲实验室组成，这些实验室在生物制药PK和许多疾病的免疫原性方面拥有专业知识，这一倡议旨在提高对免疫原性的意识，并倡导整合药物水平和ADA测试以改善患者管理。该网站提供有关ADA和药物水平测试的信息，主要是帮助临床医生实施免疫原性和药物水平的常规临床测试。在美国，也在进行类似的努力，作为AAPS（美国制药科学家协会）的治疗蛋白免疫原性社区的一部分。免疫原性风险评估和缓解工作组进行了一项调查，以表征性能和协调风险评估方法，包括通过成员调查的算法和体外测定。未来的重点是适应当前工具并开发创新测定，以回答有关新方式和下一代疗法的问题。 5.4.监管机构对免疫原性的看法 最近的FDA指南提出了一种基于风险的方法来评估治疗蛋白诱导的免疫反应及其对安全性和效力的影响。还建议在生物仿制药开发早期制定基于风险的策略，最好在人源化之后，并与其他开发能力努力并行。早期评估将使由于结构和序列而产生的负债有更强大的理解。通过药物开发的不同阶段持续评估风险，可以指导临床应用的生物分析策略，这在以下部分描述。风险评估包括由于与蛋白质表达和纯化以及配方/辅料诱导的聚集或降解相关的工艺变化而引起的翻译后修饰的风险。 5.5.将风险评估整合到临床前管线中 简而言之，免疫原性风险评估应考虑潜在的治疗益处，并将其与考虑患者人群类型和适应症以及治疗靶标的以往经验的免疫原性潜在影响进行权衡。 对生物制剂候选物的早期评估允许基于识别风险的最低概率进行排名。还有去免疫化/序列优化的空间，其中去除几个氨基酸以去除表位或插入调节性序列以驱动抑制性T细胞反应。此外，基于风险的策略应包括由于与蛋白质表达和纯化相关的工艺变化引起的翻译后修饰的负债，以及由于配方/辅料引起的聚集或降解。 在开发基于风险的策略期间，还应考虑治疗蛋白的早期药理学知识，包括靶标参与和随后激活免疫途径。临床前毒理学研究为生物仿制药的安全性提供了见解。 可以在不同阶段用于候选物选择以最小化免疫原性风险的工具和测定。例如，在计算机辅助筛选中，可以使用基于计算机的算法评估不仅氨基酸序列对潜在HLA类I和II结合和可能发生化学修饰的残基，还可以评估聚集体的蛋白质结构。可以进行体外测定以评估生物治疗药物在不同供体组中激活T细胞的潜力。这些测定可以与整个蛋白质一起进行，以可能包括靶标参与，或者与重叠肽一起进行，以排除靶标参与。MAPPs和HLA结合测定旨在识别分子内的抗原。当在药物开发过程中出现特定问题时，可以使用包含免疫系统额外部分的体外和体内模型。评估非序列生物物理参数影响的先天免疫系统激活测定可以用来优化工艺开发和配方或工艺变化。临床免疫原性数据和患者特征是验证、评估和改进与靶标和非靶标负债相关的临床工具和测定关联问题的有效性的关键组成部分，特别是当临床前和临床靶标具有同源性时。如果有先前的临床经验，基于风险的策略也可以成为优势，例如，已经处于商业阶段的类似靶标的蛋白质的临床经验。此外，如果对一种疾病适应症的治疗蛋白有足够的临床经验，那么与安全性和效力相关的研究结果也可以总结为正在为新IND开发的新药（IND）的应用。 6.五年展望 由于免疫原性风险评估方法的进步，以及针对产品（主要序列和配方）的去风险工作，以及对可能导致ADA发展的患者因素的理解的提高，大多数生物治疗药物开发商正在将评估整合到药代动力学/药效学（PK/PD）、安全性和临床效力结果中，以更好地了解新产品或生物仿制药的风险。在药物开发过程中（设计新序列、选择领先化合物、去风险识别的负债或比较生物仿制药优先级），应持续考虑使用新兴技术（新的计算机辅助、体外和体内测定）。这些方法还提供了风险估计，包括对临床免疫原性的个体风险（HLA类型）的先验知识。目前不推荐在动物模型中进行体内研究以进行免疫原性测试，因为动物模型中的HLA与人类HLA之间的差异。相反，体外测定更适用于评估细胞介导的免疫反应的风险。在从一种模型物种过渡到另一种模型物种或人类时，可以预期MHC相关免疫反应的变化。在小鼠、非人灵长类和其他模型物种中与MHC结合的T细胞表位通常与与人类MHC结合的表位不同。大多数生物制剂的临床前研究通过在体外条件下测试免疫原性来规避这一问题，其中选择人类PBMC样本以广泛覆盖人类MHC。 在未来5年内，预计大部分风险评估将首先在计算机辅助下进行，然后再转移到（有限的）体外和体内模型。这是因为大多数进行全面临床前开发的制药公司实际上为单一目标生成了数千个潜在候选物。计算机辅助分析是免疫原性的一个很好的初步方法，它允许在需要的地方使用体外方法详细检查某些分子特征。随着更多结果可供公众审查，计算工具的准确性将提高。机器对机器界面，使得可以集成和高通量筛选同一目标的多个候选物，将同时改善临床开发候选物的临床前选择。药物开发商应该熟悉可用的工具，因为预计要筛选的候选物化合物数量将使其无法在没有自动化的计算机辅助分析流程的情况下进行管理。未来，计算机辅助分析（和体外验证）的范围也可能包括HLA类I免疫原性评估和体外测定。这是由于引入了新的治疗方式和病毒载体，它们与MHC类I途径相互作用。 免疫原性风险评估领域已经成熟，并将在新的治疗方式进入临床环境时继续发展。 免疫原性或不良免疫反应被定义为治疗性生物制剂产生针对自身和相关蛋白的免疫反应的倾向，或诱导免疫学相关的非临床效应或不良临床事件。在治疗性生物制剂开发过程中有两种类型的免疫原性： • 期望的免疫原性通常与疫苗接种有关。注射抗原（疫苗）刺激针对病原体（病毒、细菌、癌细胞等）的免疫反应，目的是保护宿主。 • 不期望的治疗性生物制剂的免疫反应也可能中和它们的生物活性并诱导不良事件，不仅通过抑制治疗性生物制剂的效力，还通过与内源性蛋白对应物发生交叉反应，导致其生理功能丧失（例如，中和抗体对治疗性EPO导致PRCA，通过中和内源性蛋白）。这种免疫原性概述是治疗性生物制剂发现和开发中后者的不良免疫反应。 抗原处理由专业的APCs如DCs、巨噬细胞和B细胞执行。这个过程包括两个步骤：首先，抗原捕获，其中抗原被送至细胞抗原处理机制；其次，抗原处理和呈递，其中与MHC分子结合的抗原肽被产生以呈递给适应性免疫细胞。细胞外抗原通过吞噬作用、巨噬细胞吞噬作用和受体介导的内吞作用被APCs捕获。在内质网或溶酶体的酸性环境中，抗原被降解成许多含有T细胞表位的免疫原性肽。摄取抗原后，MHC类II分子首先在内质网中合成，然后通过高尔基体运输，与抗原肽结合形成肽-MHC II复合物，然后这些复合物被呈递到APCs表面。TCRs可以识别肽-MHC-II复合物以激活T细胞以启动免疫反应。抗原呈递的质量取决于肽-MHC复合物的亲和力，肽-MHC复合物稳定性与免疫反应之间存在直接关系。APCs与CD4+ T细胞的结合能力通过DC-T细胞测定来确定。 治疗性生物制剂的免疫反应可以显著影响治疗性生物制剂的效力和患者安全性。第一代治疗性单克隆抗体是小鼠来源的，基于这些抗体的药物在患者中引起高度不良的免疫反应，因为抗体；这些免疫原性反应在人源化单克隆抗体中大部分被抑制，但仍有一定的关注。 不良免疫反应导致ADA的产生，导致许多临床相关效应（表7.1），导致过敏性休克、细胞因子释放综合征和交叉反应中和内源性蛋白，这些蛋白介导关键功能。当ADA的存在得到确认后，除了滴度和分析抗体的中和能力外，进一步的特征化可能是有用的，例如，急性超敏反应的免疫球蛋白类别。也可以对临床重要的ADA进行进一步分型，或确定ADA的“阈值”水平，超过这个水平对药物效力和安全性有显著影响。 从根本上说，鉴于目前许多治疗性生物制剂正在开发中，关于免疫原性的最重要因素是它是PK的协变量；当针对治疗性生物制剂发生免疫原性时，它会增加药物从体内的清除并减少对治疗性药物的暴露。患者相关和产品相关因素可能会影响治疗性生物制剂的免疫原性。这些因素是免疫原性风险评估（表7.2）的关键元素，并需要在免疫原性测试协议中考虑。 7.免疫原性调查 应在目标人群中调查免疫原性，因为动物测试和体外模型并不总能预测人类的免疫反应。在生产变更后证明产品可比性以及在产品获批后生产过程变更的情况下，免疫原性发挥着重要作用。然而，该协议不适用于开发过程中对拟议的生物仿制药产品进行测试。即使是微小的差异也可能影响生物活性、效力或安全性，包括拟议生物仿制药的免疫原性。 评估治疗性生物制剂中的物理化学或配方属性，如杂质、异质性、聚集体形成、氧化和脱酰胺作用，可以指导免疫原性的预测和开发免疫原性较低的治疗剂。此外，预测治疗性生物制剂中潜在的免疫原性表位是提高药物安全性和效力的重要且有效的策略。在治疗性生物制剂开发过程中，有多种临床前免疫原性评估策略可用，如表7.3所示。 7.1.测定 生物仿制药开发商应在临床免疫原性评估中评估以下与抗体相关的参数： 滴度、特异性、相关亚型分布、药物开发的时间进程、持续性、消失、对PK的影响以及与临床后遗症的关联。 产品活性中和：对所有相关功能（例如，摄取和催化活性、酶替代治疗的中和）的中和能力。 开发商应在启动任何临床免疫原性评估之前与监管机构协商测定的充分性。 开发商应开发能够灵敏检测免疫反应的测定方法，即使在循环药物产品（拟议的生物仿制药产品和参考产品）中也是如此。应尽可能使用相同的测定方法和相同的患者血清来评估拟议的生物仿制药产品和参考产品。建议在生物仿制药开发的早期阶段开发和验证免疫原性测定，并应对拟议的生物仿制药产品和参考产品进行验证。 建议采用多层次测试方法，包括开发和验证筛选测定、确认测定、滴定测定和中和测定。筛选测定，也称为结合抗体测定，用于检测与治疗蛋白产品结合的抗体。确认测定建立ADA对治疗蛋白的特异性。滴定测定描述ADA反应的强度。中和测定评估ADA的中和活性。在测定中设定适当的截止点对于最小化假阴性结果的风险至关重要。 应同时开发独立ADA结合测定，包括拟议的生物仿制药产品或参考产品作为捕获配体。每个测定都应经过验证，并已证明能够在药物存在的情况下灵敏检测ADA。应使用两种测定方法测试两种治疗组的样本，以证明ADA对拟议的生物仿制药产品和参考产品的交叉反应性。偏离这种方法应有科学依据。 7.2.灵敏度 建议筛选和确认IgG和IgM ADA测定至少达到100 ng/mL的灵敏度，根据生物仿制药的风险和先前知识，灵敏度限制超过100 ng/mL可能是可接受的。 7.3.特异性 测定特异性的缺乏可能导致假阳性结果；在证明单克隆抗体、Fc融合蛋白和Ig融合蛋白的抗体反应特异性方面存在挑战，并就如何管理这些挑战提供指导。 7.4.选择性 测定结果可能会受到基质或船上治疗蛋白产品的干扰。未能建立测定选择性可能导致非特异性信号，掩盖阳性结果。 7.5.精确度 结果应在测定运行内部和之间可重复；测定精确度对于ADA评估至关重要，因为测定变异性是确定截止点和确保弱阳性样本被检测为阳性的基础。 7.6.可重复性 如果多个实验室在研究中运行一个测定，开发商应建立数据可比性，包括测定灵敏度、药物耐受性和测定精确度。 7.7.稳健性和样本稳定性 生物测定的复杂性使它们容易受到测定条件变化的影响。因此，评估和优化参数（如细胞通道数、孵育时间和培养基成分）至关重要。此外，需要制定短长期稳定性管理计划，以保持抗体反应性。 7.8.格式 开发商应考虑每种类型的测定格式的优缺点，包括通量、灵敏度、选择性、动态范围、检测各种Ig亚型的能力、检测快速解离抗体的能力以及试剂的可用性。应考虑洗涤次数和强度，这可能会影响测定灵敏度和表位暴露。 7.9.试剂 如果阳性对照抗体、阴性对照和系统适用性对照是专门为测定生成的，那么开发商应确保关键试剂的一致性测定性能。 7.10.报告结果 应评估测定方法的适当性，最常见的是定性测定。表7.4展示了常见的筛选测定，表7.5展示了抗体测试的测定方法。 7.11.生命周期管理 在没有观察到临床后遗症的情况下，拟议的生物仿制药产品和参考产品之间的免疫反应差异可能会引起关注。这样的测定可能需要进一步评估（例如，延长随访评估期）。随访评估的持续时间应基于以下因素决定：(1)免疫反应生成的时间进程（如中和抗体、细胞介导的免疫反应的发展）和预期的临床后遗症（由参考产品的经验提供信息），(2)免疫反应消失的时间进程和治疗停止后预期的临床后遗症，以及(3)产品的管理时间。例如，对于长期给药的剂，建议随访期为1年，除非可以根据支持生物相似性的证据总体科学地证明更短的持续期。 然后开发商应获得生命周期管理报告，随着产品经历各个阶段，报告应包括以下部分： 免疫原性风险评估：该评估应针对治疗蛋白，并包括产品质量和主观因素的信息。 分层生物分析策略和测定验证摘要：开发商应总结每个临床开发阶段的评估策略。 临床研究设计和详细的免疫原性采样计划：开发商应包括所有进行评估的临床研究的采样计划。 临床免疫原性数据分析：开发商应包括所有具有免疫原性组成部分的临床研究的免疫原性分析摘要。 结论、风险评估和缓解策略：开发商应讨论免疫原性如何影响患者群体的蛋白质产品的安全性和效力，包括产品如何在上市后阶段进行监测。 7.12.免疫原性测试方法 在没有质量水平相关性以及对临床效力（效力降低或丧失）和安全性没有负面影响的情况下，免疫原性的微小差异可能是可以接受的。评估观察到的免疫原性差异的临床影响可能具有挑战性，因为样本量和随访时间有限。如果观察到的差异的临床影响不确定，例如，由于潜在严重不良反应的罕见性或免疫反应的缓慢发展，则可能需要通过上市后监测或特定风险管理策略更新风险管理计划。 免疫原性研究旨在检测和表征对产品的免疫反应，并调查ADA与PK和PD以及效力和安全性的相关性。因此，应将免疫原性评估包括在关键临床研究的计划中，包括同步采样ADA和相关生物标记物（如果有的话），评估生物仿制药的效力和安全性。 7.12.1.人群 选择适合比较免疫原性的人群很重要。在选择适当人群时，应考虑免疫能力、免疫抑制治疗的先前或同时使用以及参考产品免疫原性的历史数据等因素。由于免疫原性测试通常是作为关键的比较安全性和效力研究的一部分进行的，因此在设计程序的临床部分以证明生物相似性时，必须考虑上述因素。 如果需要，应根据观察到的差异、给药途径、剂量-反应曲线、治疗窗口和潜在的临床影响来证明免疫原性研究的类型。效力、安全性和免疫原性测试的目标人群需要对免疫原性及其后果敏感，并代表产品指示的人群。在高风险情况下，应在批准后的基础上分析样本。 在几种情况下，如果药物治疗（先前或同时）可以抑制免疫反应，则健康人群将是首选；一个很好的例子是，优先在健康人群中评估非格司亭产品。 7.12.2.并行评估 比较免疫原性研究旨在排除拟议的生物仿制药产品和参考产品之间在免疫原性方面的临床意义差异。能够影响生物仿制药安全性和效力的抗体存在是非常令人关注的；例如，通过改变PK、诱发过敏性休克或中和产品及其内源性蛋白对应物，可以克服这个问题。对于每个治疗组，比较研究应描述ADA反应的发生率和强度、ADA发展的进程、ADA持续性以及ADA对生物仿制药安全性、效力和PK的影响。 在拟议的生物仿制药产品开发过程中需要进行并行比较免疫原性研究。如果初始的物理化学和体外测试表明差异，则更有可能检测到免疫原性差异，特别是在分子已知具有高度免疫原性的情况下。 免疫原性测试应与PK、安全性和效力测试相结合。在确认性结合测定中测试阳性的结合ADA患者样本也应测试其中和药物的能力，除非有不这样做的强有力的理由。选择适当的中和抗体测试格式至关重要，应考虑药物的作用机制。根据作用机制，竞争性配体结合测定或基于细胞的测定可能是适当的。 7.12.3.终点 选择与治疗蛋白产品免疫反应相关的临床免疫原性终点或PD措施（例如，抗体形成和细胞因子水平）时，应考虑参考产品报告的免疫原性问题。开发商应预先定义临床免疫反应标准（例如，显着临床事件的定义，如过敏性休克），在可能的情况下使用既定标准，并在研究开始前就这些标准与监管机构达成一致。 7.12.4.采样计划 采样频率以及分析的时机和程度将取决于特定药物的风险评估。采样计划应设计得能够区分暂时阳性的患者和已发展为持续抗体反应的患者。治疗后的采样期应足够长，以便对治疗蛋白触发的免疫反应的持续性得出结论，并发现被治疗蛋白本身抑制的免疫反应。治疗后样本收集的时机由蛋白质的半衰期和ADA测定的药物耐受性决定。在治疗的早期阶段需要更频繁的采样，此时患者通常处于ADA发展的最高风险。长期免疫原性的跟踪采用较少频率的采样，可以提供有关免疫原性的发生率和后果的额外信息。在持续长期治疗的情况下，通常应在授权前期间提供1年治疗的免疫原性数据，但如有适当的科学理由，可以进行较短的跟踪。 应系统地按计划对患者进行免疫原性测试，包括重复采样、症状驱动的方式，并在怀疑发生不希望的免疫反应时收集额外的样本。几种与产品相关的因素将影响对治疗蛋白的免疫反应的发展。因此，检测免疫反应的采样计划应适应并分别适用于每个产品，考虑其PK（例如，消除半衰期）和ADA测定的药物耐受性。始终应收集基线样本。 开发商在描述ADA反应的动力学和潜在免疫介导的不良效应时应使用普遍接受的术语，考虑可比产品的经验以及相关的监管和科学出版物。在治疗期间，应在给药前收集样本，因为样本中活性物质的残留水平可能干扰测定。 如果产品可以通过不同途径给药，则开发商应在上市许可申请中证明其对每种给药途径的免疫原性评估方法的合理性。 7.12.5.依赖于药代动力学 ADA可以影响PK，特别是消除阶段。非中和性“结合”抗体有时可能会调节而不是仅仅减少产品的效力，例如，通过延长半衰期。PK的变化可能是抗体形成的早期迹象。因此，鼓励开发商在所有重复剂量研究中同时进行PK和免疫原性采样。 7.13.安全性和效力关系 应根据免疫原性风险评估考虑间歇治疗相关的免疫原性，例如，来自其他类似产品的经验，潜在免疫原性的风险，增强效应，以及接触生物仿制药后抗体的持续性或出现。 ADA的存在可能或可能没有临床后果。因此，临床开发应基于潜在风险的分析以及检测和减轻这些风险的可能性。免疫介导的不良效应分析计划应基于风险分析，包括产品（类别）的先前经验，蛋白质中可能的免疫原性结构和患者群体类型。预先存在的ADA患者可能表现出不同的效力和安全性概况，应在可行时作为亚组进行分析。分析计划应定义与急性或延迟超敏性、自身免疫和效力丧失相关的症候群。潜在的免疫不良效应应在风险管理计划中得到解决。 7.13.1.免疫原性测试的管理 尽管开发商努力选择免疫原性潜力低的化合物，但对治疗蛋白的有害免疫反应并不总是可以避免的。在这种情况下，开发商应尽可能探索减少临床开发中观察到的免疫原性不良影响的可能性。在某些情况下，免疫抑制或抗炎共用药可能显著预防或减少不良免疫效应。在某些情况下，如凝血因子所观察到的，可能可以通过耐受化方案重新建立免疫耐受，例如，通过给予较大剂量的治疗蛋白。临床研究应记录这样的治疗方案。 7.14.示例研究 附录3提供了一些从EMA和FDA获得生物仿制药批准的研究协议的详细信息。 7.14.1.英夫利昔单抗 虽然主要效力分析表明，在第30周时，拟议的生物仿制药（Flixabi）和参考产品的等效ACR20反应率相同，但在个别测定时间点，拟议的生物仿制药队列中通过高灵敏度测定测量的ADA率大约高出5%-12%（在试验的任何时间点，拟议的生物仿制药队列中近50%的患者ADA阳性）。然而，由于主要终点在预定的可比性范围内，因此未观察到对任何分析的效力参数有任何有意义的影响。 7.14.2.依那西普 虽然产品（Benepali）通过了所有生物相似性测试，但在第24周观察到整体ADA形成有显著差异。ADA差异的临床效应似乎可以忽略不计，并且在治疗8周后差异大部分消失。PK研究通常比临床试验更敏感，能够检测潜在的产品相关差异，这可能解释了为何类似的效力发现不能推翻PK的差异。这可能被视为过于严格。然而，效力试验的结果不仅取决于药物暴露，还取决于生物物质在体内的有效药理作用。因此，这两种类型的研究目标是不同的。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：重组腺相关病毒（AAVs）已经成为有前途的基因传递载体，导致美国食品药品监督管理局（FDA）批准了三种基于AAV的基因疗法，欧洲药品管理局（EMA）也批准了一种。尽管AAV是多项临床试验中治疗性基因转移的领先平台，但宿主对AAV载体和转基因的免疫反应阻碍了它们的广泛应用。多种因素，包括载体设计、剂量和给药途径，共同影响了AAVs的整体免疫原性。对AAV衣壳和转基因的免疫反应涉及最初的先天感知。随后，先天免疫反应触发适应性免疫反应，以引起针对AAV载体的强烈和特定的反应。AAV基因疗法的临床试验和临床前研究提供了有关与AAV相关的免疫介导毒性的重要信息，但研究表明，临床前模型未能准确预测基因传递在人类中的结果。本综述讨论了先天和适应性免疫反应对AAVs的贡献，强调了挑战和潜在策略，以减轻这些反应，从而增强AAV基因疗法的治疗潜力。 1.引言 近年来，使用重组腺相关病毒（AAV）载体的基因治疗取得了令人鼓舞的成果。除了美国食品药品监督管理局（FDA）批准的三种AAV基因治疗产品Luxturna、Zolgensma和HEMGENIX，分别用于治疗Leber先天性黑蒙、脊髓性肌肉萎缩症（SMA）和血友病B型，欧洲药品管理局（EMA）最近还批准了一种AAV5-因子8载体（Roctavian）用于治疗血友病A型患者。目前，正在进行大量的AAV基因治疗临床试验，针对多种疾病，包括血友病、神经退行性疾病和肌营养不良症。然而，阻碍这些试验临床成功的一个因素是AAV的免疫原性，这在该领域仍然是一个未解决的挑战。 已经鉴定并分类了13种不同的AAV野生型血清型和100多种衣壳变体。AAV最初在1965年作为腺病毒（Ad）制剂中的污染物被发现，是自然存在于多种脊椎动物物种中，包括人类和非人灵长类（NHPs）的细小病毒，但从未与任何已知疾病相关联。AAV迅速成为体内基因传递的首选载体，并携带一个由反向末端重复序列（ITRs）包围的转基因表达盒，而不是病毒蛋白编码序列。这些ITRs源自野生型AAV2，是复制和包装所需的唯一顺式作用序列，但它们是非编码区域。AAV作为染色体外DNA存在，能够在非复制细胞中实现稳定转基因表达。尽管AAV的免疫原性较弱，但在AAV基因治疗临床试验中观察到的免疫反应限制了其治疗应用。由于AAV载体不包含任何表达的病毒基因组，因此在基因转移过程中引入的唯一外来抗原来源是病毒衣壳和转基因盒。然而，宿主对AAV载体和传递的转基因的免疫反应影响了有效和稳定的转基因表达。 已经做出了重大的研究努力来评估与AAVs相关的免疫介导毒性。免疫系统的主要作用是识别自身与非自身，以保护免受病原体侵害。包括补体系统在内的先天免疫反应可以被AAV衣壳和AAV基因组以及其他宿主特异性因素触发。随后的激活信号有助于招募抗原呈递细胞（APCs）、T细胞和B细胞，这些细胞负责介导适应性免疫。许多报告已经剖析了适应性免疫反应对AAVs的作用。由于AAV在人类中的广泛传播，许多人群中普遍存在针对AAV衣壳的预先存在的中和抗体（NAbs）。这些抗体可以阻止AAV转导目标细胞。此外，还可能针对传递的转基因产生抗体，这可能中和可溶性转基因产品并干扰成功的基因治疗。此外，针对衣壳的细胞介导的细胞毒性T细胞反应影响转基因表达，并导致转导细胞的清除，阻碍治疗效果。近年来，接受高系统剂量AAV治疗的SMA1、杜氏肌营养不良症（DMD）和X连锁肌管性肌病（XLMTM）患者经历了不同程度的不良反应。这些结果在很大程度上可以归因于对载体的先天和适应性免疫反应。因此，了解免疫系统对AAV的反应对于提高AAV基因治疗的安全性和治疗效果至关重要。 AAV载体激活宿主免疫反应取决于多种因素，包括给药途径和剂量，宿主细胞和体液遇到载体的部位，载体组分以及转基因产品。直接注射到视网膜下空间，如第一个FDA批准的AAV载体的途径，导致较少暴露于血浆蛋白、循环抗体、血细胞和组织驻留的吞噬细胞。注射到其他部位，如中枢神经系统（CNS），可能在一定程度上限制了血清抗体在目标细胞进入之前的暴露。相比之下，AAV的静脉注射使载体广泛暴露于血细胞、血浆蛋白，包括抗体，以及广泛的组织驻留细胞，如肝脏内的Kupfer细胞。最大限度地发挥潜在的载体-抗体相互作用导致降低基因治疗的有效性或安全性。几乎所有衣壳类型和给药途径，广泛生物分布的AAV载体基因组到肝脏，取决于所给剂量。因此，虽然直接注射途径可能在很大程度上绕过了预先形成的抗体，但对载体组分的新的免疫反应可能仍然很强。最后，某些宿主反应仅在非常高剂量的静脉AAV中观察到，这表明这些宿主反应的阈值效应。这表明在评估AAV基因治疗的免疫反应时，需要考虑多种因素，而不仅仅是AAV载体的组成部分。 在这篇综述中，我们提供了针对AAV衣壳和转基因的先天和适应性免疫反应的概述，并讨论了规避这一主要障碍的策略，以发展成功的基于AAV的治疗性基因传递平台。 2.对腺相关病毒（AAVs）的免疫反应 免疫反应可以分为先天和适应性免疫反应。在以下部分中，我们简要概述了AAVs刺激的先天和适应性免疫途径，并讨论了AAV感染响应中激活的机制，这些机制导致转基因表达的抑制（图1）。 图1 AAV基因治疗中的免疫反应。AAV衣壳或引入的转基因可以被先天免疫系统识别，导致细胞因子产生、先天免疫细胞激活、补体激活，并为适应性免疫反应做好准备。在MHC I分子上的衣壳肽段或传递的转基因呈递导致CD8+ T细胞激活和转基因表达的清除。在MHC II上的抗原呈递激活CD4+ T细胞，这导致细胞因子的产生，并进一步诱导体液或细胞介导的免疫反应，并创造免疫记忆。Treg的激活导致细胞和体液免疫反应的抑制以及转基因表达的长期维持。AAV：腺相关病毒，APCs：抗原呈递细胞，FoxP3：叉头框蛋白3，GzmB：颗粒酶B，IFNγ：干扰素γ，MHC：主要组织相容性复合体，NAbs：中和抗体，PFN：穿孔素，rAAV：重组腺相关病毒，TCR：T细胞受体，TLR9：Toll样受体9，TNFα：肿瘤坏死因子α，Tregs：调节性T细胞。 2.1.对AAV的先天免疫反应 暴露于病原体时，先天免疫系统以一种非特异性方式被触发，并随后刺激激活更特异性的适应性免疫反应。在本综述中，我们简要讨论了感知AAV载体元素的关键参与者，这些元素导致先天免疫信号级联的激活。 2.1.1.病原体相关分子模式和模式识别受体 具有独特病原体相关分子模式（PAMPs）的外来病原体被高度表达在先天免疫细胞（如巨噬细胞和树突状细胞）上的模式识别受体（PRRs）识别。PRRs已被分类为不同的家族，即Toll样受体（TLRs）、NOD样受体（NLRs）、C型凝集素受体（CLRs）和DNA传感器。相应的PRRs识别PAMPs主要激活信号通路，如通过适配蛋白如MyD88激活NF-κB。这些信号级联诱导主要组织相容性复合体（MHC）基因表达和促炎细胞因子或Ⅰ型和Ⅲ型干扰素（IFN）的分泌。分泌的IFNs和细胞因子反过来介导表达限制病毒复制的基因，并刺激适应性和记忆免疫反应。适应性抗衣壳体液和细胞毒性免疫反应已被证明在体内受到限制，通过抑制先天免疫激活途径。 TLR介导的信号，触发先天免疫和随后激活适应性免疫反应，是重要的AAV感知机制。TLRs主要表达在免疫细胞上，如DCs和巨噬细胞，以及一些非免疫细胞，如上皮细胞和成纤维细胞。细胞表面TLRs识别病原体的膜成分，如脂蛋白和脂质，细胞内TLRs识别病原体衍生的核酸。研究表明，细胞内TLR9有助于对转基因和衣壳的免疫反应。除了ITRs，插入的转基因、启动子序列和载体表达的RNA可能包含TLRs识别的炎症信号。存在于Kupfer细胞或DCs中的内体TLR9，特别结合双链DNA（dsDNA）载体基因组中的未甲基化CpG二核苷酸。研究表明，密码子优化，一种提高转基因表达的技术，可能增加AAV载体中的CpG基序。TLR9的参与有利于激活AAV特异性细胞毒性CD8+ T细胞反应，由于MHC I上抗原呈递的增加。由IFN诱导的免疫反应导致AAV在小鼠中传递的转基因表达的丧失。此外，TLR9/MyD88途径不仅对激活AAV衣壳的CD8+ T细胞反应至关重要，而且对肝脏和肌肉定向的转基因。研究表明，空AAV衣壳本身也可以触发先天免疫反应，可能通过非实质肝细胞表面的TLR2介导。或者，一些研究报告称，抗AAV衣壳免疫球蛋白（Ig）G2抗体的产生不依赖于任何特定的TLR，而是依赖于B细胞中固有的MyD88信号。此外，其他研究表明，自互补AAV（scAAV）载体与单链AAVs（ssAAVs）相比，表现出对转基因的增加的先天免疫反应，可能由于TLR9/MyD88信号级联的增强激活。 细胞质DNA传感器，如环状GMP-AMP合成酶（cGAS），被AAV基因组激活。AAV转导可能导致细胞将其线粒体DNA释放到细胞质中，从而激活细胞质DNA传感器。另一种可能性是，AAV衣壳的蛋白酶体降解在进入后导致基因组暴露，然后可能被DNA传感器感知。最近的研究指出dsRNA传感器在先天感知AAVs中的作用。ITRs的内在启动子活性可以在细胞质中产生dsRNA中间体，这可能刺激黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）和视黄酸诱导基因（RIG）传感器。在AAV转导人肝细胞后，一些人类受试者观察到MDA5和RIG-1的上调，触发IFN-β的产生。在灵长类视网膜中AAV转导后，也观察到高水平的MDA5和RIG-1。需要进一步的研究来阐明dsRNA形成在AAV转导细胞中启动适应性免疫反应中的作用。 2.1.2.AAV与补体系统 补体系统由多种可溶性和膜结合蛋白组成，是无细胞先天免疫系统的一部分。它可以通过三种不同的途径被激活——经典途径、凝集素途径和替代途径。经典途径与抗体结合到抗原靶标上协同工作，而替代途径是通过外来大分子与循环补体成分的相互作用而被激活，因此不需要预先形成的抗体。这三条途径汇聚在补体成分C3转化酶上，它将C3蛋白裂解为功能性亚基C3a和C3b，最终形成终端膜攻击复合体。 AAV介导的补体激活成为了许多近期研究的焦点。一项研究表明AAV衣壳与C3相互作用，导致巨噬细胞中AAV2的摄取增加，并随后上调了如IL-8、IL-1β和巨噬细胞炎症蛋白等细胞因子。缺乏补体蛋白CR1/2或C3的小鼠对AAV没有表现出强烈的体液免疫反应，这表明补体系统在产生AAV特异性抗体中发挥作用。 在DMD和SMA1的临床试验中，接受静脉AAV剂量>1×10^14病毒基因组(vg)/kg的患者表现出补体激活和血栓性微血管病(TMA)的症状。此外，最近在一份新闻稿中报告，两名接受5×10^13 vg/kg AAV-LK03的甲基丙二酸血症(MMA)患者在最近出现了TMA。这些患者中替代补体途径的激活似乎导致血小板激活并与白细胞和内皮细胞结合，从而触发消耗性血小板减少症、微血管性贫血和播散性血管内凝血，这由D-二聚体和纤维蛋白裂解产物的升高证明。在一些患者中，这些机制可以发展成一系列不同程度的症状，如呕吐、急性肝衰竭和心脏及肾脏损伤（非典型溶血性尿毒症综合征[aHUS]）在AAV给药后（NCT03362502和NCT03368742）。这种综合征通常在输注后5-10天发展。Eculizumab的治疗已在AAV接受者中用于TMA综合征，以中断TMA级联。然而，这些试验的结果尚属初步，需要进一步调查。 2.2.适应性免疫反应 除了启动对AAV的初级免疫反应外，先天免疫还为适应性反应做好准备。适应性免疫反应诱导抗原特异性反应，同时创建免疫记忆。适应性免疫由两个主要机制组成：通过B细胞和抗体的体液免疫，以及通过细胞毒性CD8+ T细胞的细胞免疫。CD4+辅助T细胞在体液和细胞免疫中都是关键的中介，通过激活B细胞和细胞毒性T细胞。 在初次接触AAV后，先天免疫细胞通过PRRs的表达和细胞因子的释放被广泛激活。在长期接触AAV后，如DCs的APCs通过转导或吞噬作用摄取AAV颗粒，并向B或T细胞激活呈现处理过的抗原。B细胞识别可溶性或呈现的抗原并产生抗体。T细胞的激活涉及辅助CD4+细胞，它们进一步诱导炎症反应和激活CD8+细胞毒性T细胞，导致去除AAV感染的细胞。在炎症信号解决后，调节性T细胞抑制免疫反应以恢复稳态。以下部分将强调适应性免疫反应在AAV基因治疗中的作用。 2.2.1.体液免疫反应 体液免疫是通过产生针对特定抗原的抗体来介导的。抗体通过多种机制发挥作用：NAbs阻止病原体进入细胞，覆盖在病原体表面的抗体将它们标记为吞噬作用，或抗体结合导致经典补体途径激活的开始。 体液免疫反应，特别是NAbs的产生，对AAV成功基因传递构成了最有效的障碍之一。AAV转导后，APCs向CD4+辅助T细胞呈现抗原，这导致B细胞成熟、扩增、类别转换，并增加针对AAV衣壳的抗体产生。 在人类中，抗AAV NAbs（以其损害AAV感染或病理学的能力为特征）通过自然接触野生型AAVs形成。根据AAV衣壳变体的不同，2-60%的人类血清含有限制AAV基因治疗应用的抗体。其中，抗AAV2和AAV1 NAbs是AAV衣壳变体中最常见的NAbs。然而，抗AAV NAbs通常在多个衣壳变体之间高度交叉反应，可能由于AAV衣壳变体之间的高度同源性。一些研究表明，在AAV给药后，产生的抗体对其他未给药的AAV衣壳变体也具有交叉反应性。对AAV NAbs的表征显示IgG1是NAbs中的主要亚类，其次是IgG2和IgM。接受AAV基因治疗的患者也会发展出特异性抗体，防止AAV的后续再剂量。在一项研究中，NHP中AAV8的再给药没有导致转基因表达增加，但观察到抗AAV抗体水平增加。然而，目前的治疗方法表明，由于载体稀释或丢失，可能需要在新生儿、儿童和成年退行性疾病患者中重复给药AAV。 结合抗体（BAbs）参与免疫细胞的招募和触发抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。一项研究报告称，在体外存在BAbs的情况下增加了衣壳内化。此外，与接受NAbs免疫的小鼠相比，接受BAbs免疫的小鼠显示出更有效的肝脏转导。BAbs在AAV免疫反应中的作用目前正在进一步调查中，可能会突出BAbs可能的作用以及重新考虑筛选技术的必要性。 大多数系统性（静脉内）AAV基因治疗的临床试验已经排除了针对使用的血清型的显著抗衣壳抗体的患者。例如，BioMarin AAV5-FVIII载体（Roctavian）的关键试验排除了可检测到抗AAV5 NAbs滴度和抗AAV5总结合抗体（TAb）滴度的患者。目前测量抗衣壳抗体的检测包括TAb检测和NAb检测，但NAb检测和TAb检测都难以标准化。NAb检测是基于细胞的或基于小鼠的，因此昂贵、耗时，并有低估TAb滴度的风险。由于TAb检测筛选出针对AAV衣壳的所有抗体，包括中和和非中和的，所得的滴度更为保守和安全。此外，FDA和EMA已经批准了不同的衣壳血清型，每种产品都需要开发不同的抗AAV抗体检测。例如，AAV9的伴随诊断检测不适用于AAV1、AAV2或AAV5。最近的一项研究建立了基于Meso Scale Discovery（MSD）的检测，用于定量BAbs和NAbs，允许快速和定量评估AAV特异性抗体。 除了体液免疫反应外，T细胞介导的反应在限制AAV基因治疗中也起着重要作用，如下一节所强调的。 2.2.2.衣壳特异性T细胞反应 T细胞反应由多种T细胞亚群介导。效应CD4+ T细胞通过细胞因子产生诱导炎症和免疫激活。而细胞毒性CD8+ T细胞通过分泌颗粒酶、穿孔素和炎症细胞因子介导感染细胞的靶向杀伤。此外，Tregs通过与免疫细胞的直接相互作用或产生免疫抑制细胞因子，防止超免疫激活，并将免疫反应恢复到稳态。 在动物研究中，由AAV引起的细胞介导的免疫反应导致转基因表达丧失并不普遍观察到。启动T细胞反应需要通过APCs进行抗原呈递。内源性或细胞内抗原在MHC I上呈递，而外源性或细胞外抗原在MHC II上呈递。在某些APCs中，交叉呈递允许通常在MHC II上展示的外源性抗原在MHC I上呈递。研究表明，浆细胞样DCs、常规DCs和CD4+ T细胞之间的合作导致AAV颗粒在MHC I上的交叉呈递，随后激活CD8+ T细胞。细胞介导的免疫反应首次在血友病临床试验中观察到，其中AAV2表达人类凝血因子9（hFIX）的肝脏传递导致肝脏转氨酶升高和转基因表达丧失。后续研究证实了衣壳特异性CD8+ T细胞的存在。衣壳特异性CD8+ T细胞的扩增可能清除AAV转导的细胞，导致转基因表达丧失和靶器官炎症。此外，APCs在MHC II上呈递衣壳肽段，导致CD4+ T细胞激活。CD4+ T细胞的激活导致细胞因子的产生，进一步激活体液或细胞介导的免疫反应，并创造免疫记忆。在随后的研究中，接受高剂量AAV8-hFIX的人类受试者观察到衣壳特异性T细胞反应，导致肝脏酶升高和hFIX表达下降。类固醇治疗降低了肝脏酶并部分恢复了hFIX表达。此外，中等剂量的AAV给药导致可检测到循环的衣壳特异性T细胞，但没有观察到转氨酶升高和转基因表达丧失。进一步的研究表明，衣壳特异性免疫反应是剂量依赖性的，低剂量的AAV载体给药更有可能引起可由类固醇管理的轻度炎症。额外的表征显示衣壳特异性CD8+ T细胞在体外通过MHC I上的衣壳肽段交叉呈递后消除人类肝细胞。 与其他试验观察到的T细胞免疫反应不同，特别是在肌肉导向的试验中，并没有清除转基因表达。包括在大多数肌肉传递试验中使用非分泌性转基因，以及反应性T细胞的凋亡等因素，使得分析这些结果变得复杂。在α1-抗胰蛋白酶（AAT）缺乏症和Glybera研究中，除了CD8+ T细胞外，还报道了CD4+叉头框P3+（FoxP3）T细胞的浸润。同样，在DMD临床试验中限制或未观察到衣壳特异性T细胞反应。由于Tregs具有抑制免疫反应的能力，因此在局部肌肉导向的AAV基因治疗中诱导免疫耐受和转基因的长期表达归因于Tregs。尽管如此，肢带型肌营养不良的AAV基因治疗导致了衣壳特异性T细胞反应。 需要额外的研究来进一步表征T细胞免疫反应以及Tregs在诱导免疫耐受中的作用，这需要合适的动物模型。一些研究已经集中在模仿在动物中观察到的人类免疫反应。向AAV衣壳引入卵清蛋白免疫优势表位并未能触发特定的杀伤。然而，将扩增和激活的衣壳特异性T细胞转移到小鼠体内，导致转基因表达减少和转导细胞的丧失。此外，用表达VP1衣壳蛋白的AAV或腺病毒免疫小鼠，导致衣壳特异性T细胞的诱导。另一项研究利用嵌合抗原受体（CAR）技术创建衣壳特异性T细胞。AAV-CAR T细胞在体外对多种AAV衣壳变体有反应，并在体内减少了转基因表达。然而，AAV的趋向性和免疫反应在人类和小鼠中并不相同。需要进一步的研究来创建能够准确模拟人类AAV特异性T细胞反应的动物模型。 除了在引入AAV后观察到的细胞介导反应外，免疫记忆在第一次接触AAV后形成，无论是通过AAV基因治疗还是暴露于野生型AAV。这种记忆反应的激活不需要先天免疫反应。与体液免疫类似，衣壳特异性T细胞反应在年幼儿童中较少见，可能在婴儿期在感染野生型AAV后产生。研究表明，在二次AAV暴露后，衣壳特异性记忆T细胞会产生细胞因子并获得细胞毒性表型。一些研究对健康人类受试者的T细胞反应进行了表征，并报告了10-100%的人类受试者具有针对多种AAV血清型的功能性循环衣壳特异性T细胞。进一步分析证实，大多数AAV特异性CD8+和/或CD4+ T细胞属于中央记忆亚群。尽管AAV特异性免疫反应对基因治疗和再剂量研究至关重要，但传递的转基因可以引起免疫反应。下一节将讨论针对转基因的免疫反应。 3.针对转基因的免疫反应 传递的转基因产品通常包含外来抗原，因此它们可能诱导体液或细胞免疫反应，中和分泌性转基因并清除转导细胞。在暴露于AAV传递的转基因后，APCs通过转导或吞噬作用获得蛋白质产物，并在MHC I或MHC II分子上呈现处理过的抗原，分别导致细胞或体液免疫反应。针对转基因的免疫反应持续到转导细胞被清除，或由Tregs或T细胞耗竭抑制免疫反应。然而，与腺病毒和慢病毒载体相比，由于AAV对APCs的转导效率较低，AAVs诱导针对转基因的免疫反应的风险较低。在这篇综述中，我们总结并讨论了转基因免疫反应的复杂性。 迄今为止，AAV基因治疗中针对转基因的免疫反应主要在肌肉导向的临床试验中报告。在一项研究中，AAV的肌肉传递在一些患者中导致了针对转基因的抗体形成，这在NHP研究中已被预测。此外，研究表明，在没有残留蛋白表达或大片段缺失的基因转移的人类受试者中，针对转基因的免疫反应风险更高，而在具有错义突变的受试者中，基因传递更易被耐受。一些临床试验通过简单地不招募有更高风险发展反应的患者来控制针对转基因的免疫反应。在大多数肝脏导向的临床试验中，排除了有蛋白替代疗法免疫反应史或空突变的人类受试者。然而，在庞贝病临床试验中，AAV被肌肉注射，观察到缺乏功能性酶表达或非常低水平的患者出现免疫反应，类似于蛋白替代疗法中观察到的情况。在一项肌肉传递AAV的AAT临床试验中，只有在一个具有常见非病理性多态性和较不常见的HLA-单倍型的人类受试者中观察到转基因免疫反应。此外，当在肌肉传递hFIX中包括具有错义突变的患者时，未观察到转基因免疫反应。最近的一篇摘要表明，包括在转基因蛋白中存在的N-末端表位的基因组缺失的DMD患者，对转基因免疫反应的风险更高。这些观察表明，残留蛋白表达水平和患者基因型在影响针对转基因的免疫反应方面发挥了更关键的作用。此外，在临床环境中，眼部和鞘内AAV基因传递显示出有限的与转基因相关的免疫反应，可能是由于它们的分隔和减少的抗原呈递。AAV衣壳变体是另一个促进针对传递转基因的免疫反应的因素。在APCs中转导效率较低的衣壳可能具有较低的风险诱导针对转基因的免疫反应。 总结来说，针对转基因的免疫反应主要在没有残留蛋白表达的患者中观察到；因此，临床研究更倾向于选择具有错义突变的受试者或在蛋白替代疗法中没有反应的受试者。然而，这种方法排除了需求最迫切的目标人群。为了满足这一未满足的需求，已经采用了几种策略，将在第5.3节中描述。 4.监管批准后的AAV载体免疫反应 临床试验在标准化条件下进行，涉及的小规模、同质人群与批准后的患者选择和治疗条件不同。因此，可能会观察到安全性概况和反应的差异。迄今为止，已有三种基于AAV的药物（Luxturna、Zolgensma和HEMGENIX）获得FDA批准，为许可后研究提供了更大的数据集。在这一部分，我们简要讨论与Luxturna和Zolgensma相关的整体安全性概况和免疫反应。 4.1.Luxturna Luxturna（voretigene neparvovec）是FDA批准的第一种用于治疗双等位基因视网膜色素上皮特异性65千道尔顿（RPE65）突变相关视网膜营养不良的眼部AAV基因治疗。通过单次AAV基因传递，将RPE65基因的功能性拷贝直接传递到视网膜细胞，恢复患者的视力。无论是对AAV2衣壳还是转基因，都没有观察到有害的免疫反应。报道了Luxturna的轻微免疫反应，并通过Luxturna的视网膜下传递前后的系统性皮质类固醇治疗得到了控制。同样，在用AAV2-ND4（玻璃体内注射）治疗的Leber遗传性视神经病变（LHON）患者中，体液和细胞免疫反应有限。Luxturna和LHON患者观察到的轻微免疫反应可以归因于局部注射到含有高浓度免疫调节神经肽和细胞因子的分隔环境中。 4.2.Zolgensma Zolgensma（onasemnogene abeparvovec）是FDA批准的第一种基于AAV的基因替代疗法，用于治疗SMA。Zolgensma由一个自互补的、复制缺陷的AAV9组成，编码功能性SMN蛋白，通过单次静脉注射以1.1×10^14 vg/kg体重的剂量给药。 Zolgensma能够实现临床相关的治疗结果，并在减少SMA患者的过早死亡方面取得了有希望的结果。来自临床试验和市场后监测的数据显示，存在诸如肝毒性、血小板减少、TMA、心脏事件和神经节病等安全风险。在SMA许可后，报告了肝转氨酶的暂时升高，这些通过强的松治疗得到了解决。所有SMA患者都接受了预防剂量的强的松，但激素治疗的剂量和持续时间是可变的。当转氨酶水平低于正常上限的两倍时，才开始逐渐减少剂量。表现出急性肝衰竭的患者接受了暂时的高皮质类固醇剂量。对于接受长期激素治疗的患者，建议咨询内分泌学家以评估肾上腺功能不足。 肝毒性可能归因于衣壳特异性的细胞介导免疫反应。在急性疾病的情况下，即使经过长期皮质类固醇治疗，也可能考虑使用氢化可的松进行应激剂量。迄今为止，强的松已被证明在SMA临床试验和许可后经验中有效地恢复了肝转氨酶水平。然而，尽管接受了类固醇治疗，仍有SMA患者出现急性肝毒性的证据。诺华最近报告了两名儿童SMA患者因急性肝衰竭死亡。这些患者的肝功能严重受损，并迅速发展为肝性脑病和多器官衰竭。死亡发生在Zolgensma治疗后6-7周，开始逐渐减少强的松后。 除了肝毒性，其他不良反应包括短暂的血小板减少症。在一个患者中，观察到血小板减少症和多器官衰竭的晚期发作，但机制仍然不明。在接受Zolgensma治疗的1400多名患者中，FDA报告了9例TMA病例。EMA报告了在接受Zolgensma治疗的800名患者中有5例TMA病例。在基因治疗后第12天被诊断为TMA的一名患者，由于多种因素，面临致命结果。有趣的是，报告了该患者补体激活的生物标志物可溶性C5b9复合物（sC5b9）的水平增加。患者逐渐恶化，症状符合非典型溶血性尿毒症（aHUS）。根据儿童aHUS的治疗建议，患者接受了依库珠单抗治疗，这是一种单克隆抗体，已知可抑制补体因子C5的裂解。依库珠单抗注射导致EsC5b9 C3水平恢复正常，C3减少，C4正常，血小板计数轻微增加，表明1个月后TMA恢复。然而，在第40天，由于表皮葡萄球菌感染的发生，TMA复发，患者不幸心脏骤停。另一项研究报告称，在Zolgensma治疗1周后，也有三名患者发展为TMA，这表明了免疫介导的病因。其他因素，如并发细菌感染和最近的疫苗暴露，也促成了TMA。在两个病例中报告了通过替代途径激活补体系统，接受依库珠单抗治疗的一名患者没有显示出显著的临床改善。需要进一步调查，以评估依库珠单抗在由AAV基因治疗引起的TMA中的有效性。值得注意的是，其他基于AAV9的基因治疗在DMD和Danon病中也报告了伴有补体激活的TMA。未来的研究需要阐明补介导因素在SMA患者TMA中的作用。 最近的一项研究报告了一名接受Zolgensma治疗的SMA患者出现血嗜性淋巴组织细胞增多症（HLH）。连续3天使用高剂量的甲泼尼龙，随后几天逐渐减量，导致临床改善。因此，需要仔细监测炎症标志物，以避免因HLH导致的致命性。 5.少AAV基因治疗中免疫反应的策略 在这一部分，我们讨论可能的策略，以规避针对AAV衣壳和转基因的有害免疫反应，从而实现成功的转基因传递和表达（表1）。 表1 AAV基因治疗中的免疫反应及可能的调节策略 5.1.减少针对AAV的先天免疫反应的策略 正在积极开发免疫调节技术，以减少AAV载体的免疫原性，并允许安全和重复的干预。尽管在大多数试验中施用的皮质类固醇有助于调节免疫介导的毒性并实现长期转基因表达，但有些病例需要更复杂的类固醇方案和额外的方法，以潜在地减少载体和转基因的免疫原性。 5.1.1.克服Toll样受体激活和DNA感应 TLR激活在触发针对AAV载体的先天免疫反应中起着关键作用。规避TLR激活的策略旨在减轻这些反应。TLR9缺陷的小鼠显示出高水平的转基因表达，这一观察促使几个小组修改转基因序列，以干扰TLR9介导的识别。通过耗尽AAV基因组中的CpG二核苷酸来阻止TLR9信号，已被证明可以增强AAV介导的基因表达。耗尽CpG二核苷酸在免疫原性AAVrh32.33.33载体中显示出稳定的转基因表达，并减少了效应T细胞（Tef）的浸润。此外，CpG缺失在血友病B小鼠的肌肉注射中导致显著减少的CD8+ T细胞浸润，但没有影响抗体水平。ITR区域也含有高CpG含量，因此一项研究产生了功能性无CpG ITR。然而，由于ITR在包装中的关键作用，载体产量减少了约三倍。在另一项研究中，已报告在AAV基因组中加入TLR9抑制（TLR9i）DNA序列可以减少小鼠和猪的免疫反应。TLR9i由多个TTAGGG副本组成，也可以阻断DNA传感器，如cGAS。此外，抗疟药羟氯喹（HCQ）可能作为TLR9抑制剂。在小鼠和人体组织中，HCQ在AAV传递前1小时给药增强了转导效率。其他修改包括工程化表达盒，以便从3′ ITR阻断转录。因此，不会生成dsRNA，并且可以避免源自与细胞质dsDNA和dsRNA结合的先天免疫反应。在AAV表达盒中引入设计用于dsRNA传感器或其下游信号通路的短发夹RNA，可能用于规避dsRNA介导的先天免疫反应。采取多学科方法阻断TLR9激活和DNA感应，以规避先天免疫反应，可能会改善临床反应。 5.1.2.逃避补体系统激活 限制补体激活可能防止炎症反应和随后的组织损伤。Apellis Pharmaceuticals提出了使用一种名为APL-9的聚乙二醇化合成环状肽，它抑制补体激活的所有三条途径，以防止对AAV的补体激活。在I期测试中，静脉注射单剂量的APL-9能够限制补体激活，持续时间长达12小时。没有报告严重的不良事件，APL-9治疗能够完全抑制AH50溶血活性。在最近的一项研究中，APL-9减少了APCs上的CD86水平，AAV摄取和细胞因子/趋化因子分泌，以响应体外的AAV。由于在IgG耗尽的血清中确认了经典途径的参与，减少AAVs与抗体之间相互作用的治疗可能在防止补体激活方面有效。正在测试大量的补体抑制剂，从小分子抑制剂、siRNAs、适体、反义寡核苷酸、抑制肽、药理学药物到阻断抗体等，以抑制补体激活。依库珠单抗是一种针对补体超激活的单克隆抗体，通过抑制C5和MAC形成发挥作用。依库珠单抗已成功用于限制SMA和DMD AAV基因治疗中的补体激活(NCT03362502, NCT03368742, NCT03381729, NCT02122952)。未来需要进行进一步的研究，以抑制AAVs通过补体系统激活。 5.1.3.减少抗原呈递细胞中的转基因表达 正在开发限制免疫细胞激活的策略。例如，TLR9抑制性寡核苷酸恢复了由scAAV给药触发的增加的巨噬细胞浸润。限制泛素化并逃避蛋白酶体介导降解的蛋白酶体抑制剂可以减少MHC I分子上衣壳肽片段的呈递。通过阻断其他细胞的不需要表达，实现目标组织和细胞特异性表达的microRNA(miRNA)介导的去靶向是另一种策略。这种方法可以减少先天免疫细胞的抗原呈递，并随后阻断对AAV传递的转基因的适应性免疫反应。下面讨论了限制对AAV衣壳和转基因的适应性免疫反应的其他方法。 5.2.减轻对AAV衣壳的适应性免疫反应 AAV基因传递后的适应性免疫反应限制了转基因表达，并产生了抑制AAV重复剂量的免疫记忆。因此，正在采用几种策略来限制适应性衣壳特异性免疫反应。在以下部分中，讨论了克服针对AAV衣壳的体液和T细胞介导的免疫反应的策略。 5.2.1.克服体液免疫反应的策略 AAV基因治疗受到NAbs形成的阻碍，因此采用了多种策略来克服体液免疫反应。需要系统给药AAV的患者尤其处于NAbs的更大劣势。一种方法是剂量受试者缺乏对AAV的预先存在的免疫力，这在年轻患者中更为常见，但在青少年和成人中则相当少。 由于NAbs的高流行率，已经采用了几种策略来抑制或消融基因治疗受试者的体液免疫反应。抑制体液免疫的主要方法是使用免疫抑制药物（IS）。一种广泛适用的策略是使用B细胞耗竭单克隆抗体。研究表明，使用利妥昔单抗，一种抗CD20抗体，进行B细胞耗竭后，NAb滴度降低的有希望的结果。利妥昔单抗与雷帕霉素，mTOR抑制剂，或与雷帕霉素和皮质类固醇的组合，在临床试验中成功诱导耐受并防止抗体形成。贝利木单抗，一种抗B细胞激活因子(BAFF)的抗体，是另一种B细胞耗竭抗体，在控制自身免疫疾病方面显示出有希望的结果。此外，使用ibrutinib，一种B细胞抑制剂，在小鼠模型中减少了针对AAV的初级抗体反应。然而，全身性IS可能增加感染风险，并且对于完全缓解高滴度NAbs无效。除了传统的IS，AAV载体和合成疫苗封装雷帕霉素(SV[rapa])的联合给药，ImmTOR，是另一种有希望的方法。ImmTOR治疗导致抑制AAV特异性抗体形成，并减少了B和T细胞的激活。最近的一篇摘要显示，ImmTOR与贝利木单抗联合给药减少了抗AAV IgM抗体，提供了更持久的抗AAV IgG抗体抑制，并允许在小鼠中多次重新给药AAV8载体。当ImmTOR与ibrutinib组合时，观察到减少的效果。然而，将ImmTOR与空AAV8联合给药给健康人体受试者只延迟了NAbs的形成。 多种方法专注于直接逃避NAbs。一种方法利用细菌衍生的抗体降解酶。另一种方法是血浆置换，它用于减少循环抗体，但可能无法完全根除NAbs或需要多个周期。此外，血浆置换去除总抗体含量，因此增加了传染病的风险。为了克服这个障碍，一项研究使用AAV特定的血浆置换柱从NHP的血浆中耗尽抗AAV NAbs，而不影响总IgG水平。另一项研究表明，AAV9颗粒结合到Sepharose珠子上在大鼠中选择性地耗尽抗AAV抗体。这种方法的治疗窗口有限，因为血浆置换不去除产生抗体的细胞。在另一项研究中，使用盐水冲洗或带气囊导管隔离目标组织与系统循环。这种策略相对侵入性，并且可能不适用于所有目标组织和AAV的系统给药。此外，在这项研究中，使用了NAbs低的NHP，这种方法在NAbs高的动物中的有效性需要进一步评估。建议使用最小暴露于NAbs的途径。在一项血友病临床试验中，与系统给药途径相比，AAV的肌肉传递对预先存在的NAbs不太敏感。此外，在动物模型中，直接将AAV传递到CNS被良好耐受。然而，改变给药途径可能会潜在地减弱转导效率并改变AAV载体的生物分布。 其他方法专注于AAV衣壳以调节体液免疫反应。一种方法是使用诱饵空衣壳吸收循环NAbs。空衣壳的添加通常不是有效的，可能会加剧AAV的免疫毒性并降低转导效率。此外，除了携带转基因的衣壳外，还生产大量空衣壳，这给过程增加了额外的复杂性和相关成本。 衣壳工程是另一种方法，用于生成具有所需趋向性和降低免疫原性的重组AAV。在NAb识别位点的修改可以提高转导效率。或者，通过定向进化产生的衣壳可以逃避NAb感应。与自然变体相比，由AAV2、AAV8和AAV9变体的残基组成的工程化AAV-DJ变体已被证明在存在人类静脉注射IgG的情况下转导肝细胞。此外，从人源化小鼠模型中分离的AAV3b对NAb识别不敏感，并且在人类肝细胞中具有更高的转导效率。尽管如此，与使用当前可用且研究充分的衣壳相比，工程化AAV衣壳是耗时的、劳动密集的，并且需要识别NAb识别位点。为了避免工程化AAV衣壳的复杂性，建议对AAV衣壳进行化学修饰，包括聚乙二醇化和聚合物封装。然而，这些化学修饰可能会潜在地降低转导效率，降低产量，改变AAV载体的生物分布，并导致抗聚合物抗体的形成。除了化学修饰的衣壳外，多项研究表明，外泌体封装的AAV可以在预先存在的免疫存在下转导目标细胞，诱导耐受性，并赋予AAV改变的趋向性。然而，用外泌体封装AAV可能进一步复杂化生产过程并引入核酸或蛋白质污染。 通常，AAV基因治疗的单一治疗可能不够。除了AAV基因治疗后的免疫反应外，暴露于野生型AAV导致预先存在的免疫力，阻碍了AAV再剂量。多项研究表明，CD28/B7和CD40/CD40L阻断导致炎症反应的缓解并允许载体再给药。在这个策略中，CTLA4融合蛋白与B7的相互作用比CD28具有更高的亲和力，导致免疫反应的下调。这种方法与一种抗CD40配体抗体结合使用，阻断了B细胞的刺激信号。尽管结果有希望，但CD28/B7和CD40/CD40L阻断广泛抑制NAbs并需要进一步调查。此外，血浆置换、衣壳诱饵和更换衣壳变体的缓解策略不是有效的。此外，免疫抑制和使用抗体降解酶不针对AAV特异性免疫反应。需要进一步研究开发更具体和有效的方法。更换衣壳变体是另一种允许AAV再剂量的选择，但受到AAV衣壳的不同趋向性、NAbs的交叉反应性和开发不同产品的复杂性的限制。逃避允许基因治疗的体液免疫反应仍然难以捉摸。包括给药途径、所需剂量和目标组织在内的几个变量在选择适当策略中起着关键作用。此外，使用除B细胞耗竭之外的其他策略，如针对IL-1β和IL-6的抗体、etanercept（TNFα抑制剂）或anakinra（IL-1R阻断剂）可能有助于调节AAV基因治疗中的体液免疫反应。使用一种或多种策略可能允许在否则不符合条件患者中进行AAV基因治疗。 5.2.2 克服细胞介导免疫反应的策略 与可以预测的患者体液免疫反应不同，患者对AAV的细胞介导反应在临床试验中差异很大。自从在血友病临床试验中首次观察到以来，通过免疫抑制方案广泛抑制了衣壳特异性T细胞反应。在AAV临床试验中使用的IS治疗包括类固醇、单克隆抗体和蛋白酶体抑制剂。类固醇通常用于临床试验，以通过影响T细胞受体信号减少T细胞激活和细胞因子产生。此外，它们增加抗炎细胞因子的产生和Treg增殖。类固醇通过抑制血管生成、白细胞迁移到炎症部位以及改变免疫细胞死亡和迁移来抑制炎症反应。如前所述，糖皮质激素被用于所有人类受试者中，以抑制Zolgensma试验中的衣壳特异性T细胞反应，然而在类固醇逐渐减少期间，两名患者死于急性肝衰竭。多项临床研究表明，使用类固醇未能防止转基因逐渐丧失。因此，一些研究专注于使用免疫抑制剂药物组合和优化治疗时机。环孢素和他克莫司下调IL-2转录，从而抑制T细胞增殖和激活。他克莫司的日常给药允许NHP中AAV传递的转基因持续表达。麦考酚酸莫非特（MMF）优先耗尽T和B淋巴细胞中的鸟苷核苷酸，并抑制它们的增殖。环孢素和MMF的组合在Glybera临床试验中使用，但未能抑制所有人类受试者的免疫反应。后续研究表明，在AAV剂量之前开始免疫抑制和额外的皮质类固醇治疗是有益的。体外研究表明他克莫司和环孢素抑制Treg增殖。一项研究表明，他克莫司治疗损害了肾脏和肝脏移植患者的Treg功能，而雷帕霉素对Treg有有益的效应。因此，雷帕霉素与利妥昔单抗或强的松的组合已在AAV临床试验中频繁用于诱导耐受。此外，环孢素和非耗尽性CD4受体抗体诱导Tregs并允许在小鼠中重新剂量。建议使用蛋白酶体抑制剂如硼替佐米。体外和临床前动物研究表明，硼替佐米的给药可以防止内化的AAV降解，减少衣壳呈递，并增加通过增强AAV的核转移来提高转导效率。尽管应用广泛，系统性免疫抑制可能会导致Treg抑制和多种不良效应，包括肠道并发症、肌肉疼痛和头痛，这使得其他策略受到关注。 在AAV运输过程中，AAV衣壳表面的酪氨酸残基可以被磷酸化并随后泛素化，这导致衣壳降解并呈现在转导细胞表面。因此，建议突变表面酪氨酸，这导致AAV衣壳的呈递减少，T细胞毒性降低，并需要治疗剂量。多项研究减少了AAV的治疗剂量，并使用了转基因的超活性变体。并非每个转基因都有超活性版本，并且可能并不总是导致减少的T细胞反应。 除了前面讨论的策略外，降低给药剂量和去除空衣壳已被提出。这种方法试图减少AAV衣壳对抗原呈递的可用性。然而，降低AAV剂量可能会降低转导效率，并导致NAbs中和AAV。 Tregs的浸润和肌肉导向AAV基因治疗试验中转基因的长期表达强调了Treg在诱导免疫耐受中的作用。因此，Treg诱导表位，Tregitope，被纳入AAV衣壳结构，成功扩大了Treg并抑制了CD8 T细胞。除了工程化AAV衣壳，ImmTOR颗粒在衣壳特异性T细胞和体液免疫反应方面显示出有希望的结果。然而，这些新策略需要进一步的功效和安全性调查，因为它们是非抗原特异性治疗。 为了诱导局部和特异性耐受，另一项研究结合了Tregs抑制免疫反应的能力以及CAR的抗原特异性。在这项研究中，使用了AAV特异性CAR Tregs和多克隆Tregs，尽管存在衣壳特异性T细胞反应，但允许转基因表达。 在临床上，衣壳特异性T细胞反应主要通过使用类固醇来控制。免疫抑制增加了感染风险，并且在需要高剂量AAV时效果较差。因此，开发一种新的抗原特异性策略似乎是不可避免的。 5.3.减轻转基因免疫反应 为了避免针对传递转基因的免疫反应，已提出几种方法，包括限制目标人群、免疫抑制、使用组织特异性启动子、miR技术以及免疫细胞疗法。 短期使用环磷酰胺治疗，这是一种烷基化剂，可减少促炎细胞因子的产生，在小鼠和犬模型中成功实现了基因表达。此外，在犬研究中，使用环孢素、抗胸腺细胞球蛋白和MMF的短暂免疫抑制预防了免疫反应并实现了转基因表达。除了系统性免疫抑制外，临床前研究指出了组织特异性启动子在减少针对传递转基因的免疫反应中的作用。当转基因由普遍性启动子驱动时，与肌肉特异性启动子相比，观察到较低水平的转基因表达和强烈的体液和细胞免疫反应。此外，使用肌肉特异性启动子在犬模型中实现了转基因的稳定表达，而没有免疫反应。此外，NHP的一项研究报告称，肝脏导向的表达可能有助于限制抗转基因抗体，诱导耐受，并允许重新使用不同衣壳变体的再剂量。 其他研究利用Tregs来抑制与转基因相关的免疫反应。一项研究使用多克隆Tregs来抑制蛋白替代疗法中因子8和9的免疫反应。然而，Tregs的低频率和潜在的非特异性免疫抑制限制了多克隆Tregs的应用。因此，多项研究产生了转基因特异性CAR Tregs，在抑制转基因诱导的免疫反应方面显示出有希望的结果。TRuC Tregs是通过将抗人凝血因子VIII (hFVIII) 的单链可变片段与T细胞受体融合而开发的。这项研究表明，与FVIII-CAR Treg相比，F8-TRuC Treg具有更优越的抑制功能。B细胞抗体受体（BAR）是通过将因子8抗原和T细胞刺激信号域结合而产生的。BAR T细胞在体外和体内成功消除了FVIII反应性B细胞。随后，通过将Tregs与BAR构建物共转导而创建的BAR Tregs，在抑制转基因特异性B细胞方面显示出有希望的结果。尽管免疫细胞疗法在抑制转基因免疫反应方面取得了有希望的结果，但其临床安全性和有效性需要进一步调查。 目前，临床研究中招募了可能具有较低转基因免疫反应风险的受试者。利用新开发的方法使我们能够包括更多的代表性研究对象。 6.结论 关于患者对AAV基因治疗的免疫反应仍有许多未知之处。然而，基于正在进行的临床试验和治疗数千而非少数患者的许可后数据，不断积累的证据。为了进一步了解AAV基因治疗的免疫反应的发展，需要对入选受试者进行进一步的免疫监测，包括监测血清因子的策略、外周血免疫细胞的表征以及组织分析。然而，缺乏免疫测定的标准协议以及无法收集相关样本导致研究间的变异性，并进一步复杂化了研究结果的解释。开发标准协议以监测AAV临床试验中的受试者将有利于该领域的更好比较。然而，当前试验中存在的剂量、给药途径和使用多种衣壳血清型的变异性可能进一步使比较和解释AAV基因治疗的免疫反应更加复杂。 在大多数试验中，系统性免疫抑制被广泛施用以调节AAV基因治疗临床试验中的免疫反应，尽管有一些显著的不良效应。然而，免疫抑制方案、剂量和时机也都非常多变，并且该领域没有共识。适当的动物模型来测试当前或新药物并不容易获得，这使得标准化协议变得困难。应用新开发的战略可能比广泛、非特异性的免疫调节更有针对性，可能有助于改善结果并减少并发症。 自1995年第一次AAV临床试验以来，已经观察到有关AAV安全性和免疫反应的显著临床数据，然而免疫反应仍然是成功AAV基因治疗的障碍。克服免疫反应的新兴策略将使AAV基因治疗的全部潜力对数千人的生活产生积极影响。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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摘要:佐剂性和递送性是mRNA疫苗设计的两个关键方面。在现代mRNA疫苗中，佐剂功能被整合到mRNA疫苗纳米颗粒中，允许抗原mRNA和佐剂以统一的、一体化的形式共递送。在这种配方中，许多mRNA疫苗利用mRNA的免疫刺激性特性以及疫苗载体组分（包括脂质和聚合物）作为佐剂。然而，需要谨慎设计，因为过度的佐剂性和不当的先天免疫信号激活反而会阻碍疫苗效果并引发不良反应。mRNA疫苗还需要递送系统来实现在淋巴器官内的抗原呈递细胞（APCs）中的抗原表达。一些疫苗直接针对淋巴器官中的APCs，而另一些则依赖于APCs在摄取mRNA疫苗后迁移到引流淋巴结。本综述探讨了这些过程的当前机制理解以及基于这种理解正在进行的提高疫苗安全性和有效性的尝试。 1.引言 mRNA为疫苗提供了一个强大的工具。在传染病的情况下，一旦建立了mRNA递送平台，只需改变mRNA序列，疫苗就可以针对各种病原体。这一特性使得两种mRNA疫苗BNT162b2和mRNA-1273在由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的2019冠状病毒病（COVID-19）爆发后的一年内迅速获得紧急批准。这些疫苗在各种疫苗形式中展示了高效果，对控制大流行起到了关键作用。mRNA疫苗有效诱导中和抗体，有助于其在预防SARS-CoV-2感染方面的高效性。此外，mRNA疫苗还激发细胞免疫反应，这些反应比体液免疫反应更持久，更能抵抗病毒突变。细胞免疫可能在预防COVID-19的严重疾病和死亡中发挥关键作用。mRNA疫苗的广泛免疫原性，包括细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的诱导，也使其成为癌症疫苗的一个有吸引力的候选者。mRNA癌症疫苗通过针对共享的肿瘤相关抗原和来自每个患者基因突变的新抗原，在临床试验中显示出有希望的结果。新抗原疫苗的准备需要在识别癌症基因突变并预测合适的表位后迅速适应。在这方面，mRNA疫苗允许通过改变mRNA序列，简单地对应于每个患者中的突变蛋白，快速且方便地准备。从安全角度来看，mRNA在注射后一周内迅速降解，在体内持续存在的风险最小。最近的一项研究在人体样本中解决了这个问题，显示mRNA在接种后一个月内通过定量PCR（qPCR）检测不到。每年数十亿剂的可扩展性是另一个关键属性，特别是在大流行中。 早在1990年代中期就有关于针对传染病和癌症的mRNA疫苗的记录。然而，它们需要多年的研究和技术突破才能达到目前的临床成功，特别是在mRNA合成和递送系统领域。在前者中，mRNA的假尿苷修饰减轻了对mRNA的先天免疫反应，并提高了蛋白质翻译效率。其他关键技术包括添加5'帽和聚A尾，编码和非翻译区域的序列优化，以及去除体外转录mRNA的杂质。这些mRNA合成技术通过避免不良的炎症反应来提高mRNA疫苗的安全性，并通过增加抗原产生效率来增强疫苗效果。mRNA疫苗还需要递送系统来保护mRNA免受酶降解，将mRNA递送到APCs和淋巴组织，并促进mRNA在细胞内的运输到细胞质中的翻译位点。此外，最近的研究表明递送纳米颗粒作为免疫刺激性佐剂的作用。值得注意的是，在2010年代中期之前，大多数mRNA疫苗临床试验采用了体外mRNA递送后的APC移植。然而，体外策略需要在移植前进行临床级别的细胞培养的繁琐程序，限制了mRNA在癌症免疫疗法中的应用。最近的技术进步使得有效的体内mRNA递送成为可能，扩大了mRNA在传染病疫苗中的应用，并避免了癌症疫苗中繁琐的体外程序。在上述描述的mRNA疫苗的各种设计属性中，本综述关注两个问题：疫苗佐剂性和针对APCs和淋巴器官的递送系统，这在疫苗开发中尤为重要。同时，我们将读者重定向到其他综述中，以获得mRNA递送系统的一般描述，特定于COVID-19疫苗的主题，以及mRNA疫苗的临床概况。 2.佐剂性 2.1.佐剂性概述 免疫刺激性佐剂通过引发先天免疫反应，将抗原表达与适应性免疫诱导联系起来，从而提高疫苗效果的效率和持久性。在由重组蛋白或编码蛋白的核酸衍生的现代疫苗中，佐剂的作用变得越来越重要。值得注意的是，这些疫苗缺乏传统活减毒和灭活疫苗中存在的许多病原体相关分子模式（PAMPs），这些模式充当佐剂。在两种批准的mRNA COVID-19疫苗中，佐剂功能被整合到离子化脂质基脂质纳米颗粒（iLNPs）配方中，作为内置佐剂，而不是作为额外的佐剂补充。事实上，小鼠和人类对mRNA iLNPs的强烈先天免疫反应在疫苗功能中发挥着关键作用。iLNPs的脂质组分和mRNA分子都有助于mRNA疫苗中的佐剂性。内置佐剂方法允许mRNA疫苗的简单一体化配方，有助于平稳的临床转化。此外，一体化配方使得抗原mRNA和佐剂能够共递送到相同的APCs中，有效激活表达从递送的mRNA中得到的抗原蛋白的APCs。在这方面，重组蛋白疫苗的广泛研究表明共递送抗原和佐剂的好处。在一项开创性研究中，共包埋CpG DNA和卵清蛋白（OVA）的聚（D,L-乳酸-羟基乙酸共聚物）（PLGA）微球在诱导小鼠抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性方面优于分别包埋这两种组分的微球混合物。尽管佐剂在疫苗接种中起着关键作用，但佐剂性应该精确控制，以在最佳强度下激活适当的信号通路，因为过度和意外的佐剂性会带来安全问题，并对疫苗效果产生负面影响。本节提供了关于mRNA疫苗中佐剂性的机制理解和开发的观点。 2.2.当前mRNA疫苗的先天免疫反应 mRNA通过几种先天免疫受体触发先天免疫反应，包括内体内的Toll样受体（TLRs）和细胞质中的视黄酸诱导基因I（RIG-I）和黑素瘤分化相关蛋白5（MDA5）（图1(a)）。每个受体的首选配体分别是TLR3的>45碱基对（bp）双链RNA（dsRNA），TLR7,8的>20核苷酸（nt）单链RNA（ssRNA），MDA-5的几千bp dsRNA，以及RIG-I的>20 nt dsRNA，其在5'端有一个三磷酸基团。这些受体的主要适配分子分别是TLR3的Toll/白介素-1（IL-1）受体结构域包含的适配分子诱导干扰素-β（IFN-β）（TRIF），TLR7,8的髓样分化初级反应88（MyD88），以及MDA-5和RIG-I的线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）。这些分子最终触发I型IFN和其他促炎细胞因子的产生。此外，mRNA的5'帽结构对于区分自身和非自身mRNA至关重要。5'帽结构基于第一和第二核糖体的2'O-甲基化状态进行分类。在Cap0中，第一和第二核糖体中都没有2'O-甲基化，在Cap1中，只有第一核糖体有2'O-甲基化，而在Cap2中，第一和第二核糖体都有2'O-甲基化。在高等真核生物中，mRNA具有Cap1或Cap2结构，留下Cap0 mRNA主要被RIG-I识别为非自身。最近的一项研究表明，与Cap1结构相比，Cap2结构进一步降低了mRNA对RIG-I的亲和力。 图1. mRNA疫苗诱导的先天免疫。(a) 外源性RNA的受体及其信号通路。ppp-dsRNA：在5'端具有三磷酸基团的双链RNA。(b) 对iLNPs脂质成分的先天免疫反应的潜在机制。 体外转录mRNA中的杂质，包括未加帽和长dsRNA，引发强烈的先天免疫反应。体外转录制备的未加帽RNA在5'末端有一个三磷酸基团，刺激RIG-I。尽管包括CleanCap在内的最新技术已经提高了加帽效率，但在CleanCap mRNA制备过程中产生的少量未加帽RNA仍然显著激活先天免疫反应。事实上，CleanCap mRNA溶液的南极磷酸酶处理，去除未加帽mRNA杂质的5'三磷酸基团，显著降低了培养巨噬细胞中的细胞因子反应。这一结果突出了CleanCap mRNA中未加帽mRNA污染物的显著免疫刺激。长dsRNA是先天免疫的强烈诱导剂，是从体外转录过程中的RNA模板转录RNA制备的。在这个过程中，从DNA模板制备的预期mRNA链作为模板合成互补的非预期RNA链，导致长dsRNA的形成。如后文讨论的，这些杂质对先天免疫反应可能会极大地影响mRNA疫苗接种的结果，需要仔细讨论在免疫刺激杂质的背景下的疫苗接种效果。 尽管mRNA疫苗需要先天免疫反应作为佐剂，但过度的反应会带来安全问题，并负面影响疫苗效果，如后文所述。此外，对体外转录mRNA的细胞反应通过诱导全局mRNA降解和损害翻译启动，对mRNA的蛋白表达效率产生负面影响（图1(a)）。2'-5'-联腺苷酸合成酶（OAS）的mRNA识别和随后的RNase L激活导致大量细胞内ssRNA降解。此外，外源RNA通过激活RNA依赖性蛋白激酶（PKR）和磷酸化翻译启动因子2-α（eIF-2α）损害蛋白翻译的启动过程。因此，mRNA疫苗的开发需要控制细胞对体外转录mRNA的感知。为此，许多mRNA疫苗使用假尿苷（Ψ）或N1-甲基-假尿苷（1 mΨ）的核苷修饰，这减轻了对mRNA的先天免疫反应。此外，使用高效液相色谱（HPLC）消除长dsRNA，并通过南极磷酸酶去除未加帽mRNA的5'三磷酸也减少了mRNA杂质的免疫刺激。mRNA纯化的更近期技术包括具有光敏疏水标签的帽类似物，用于从未加帽mRNA中纯化加帽mRNA，以及为最小化dsRNA产生的工程化RNA聚合酶。这些方法可以通过增加抗原蛋白翻译和减轻促炎反应来提高mRNA疫苗的安全性和有效性。 在当前mRNA疫苗广泛使用的iLNP配方中，其脂质组分是先天免疫反应的主要诱导剂。事实上，不含mRNA封装的空iLNPs在小鼠局部注射后诱导了强烈的促炎反应。值得注意的是，在去除离子化脂质组分后，促炎反应几乎消失，表明离子化脂质在免疫刺激中的关键作用。离子化脂质在细胞外pH下呈中性电荷，在内/溶酶体pH下变为阳离子。因此，离子化脂质被认为比无pH响应的传统阳离子脂质的炎症性小，因为使用离子化脂质而不是阳离子脂质可能减少LNP与细胞膜的相互作用及其随后的膜损伤。相反，将iLNP中的离子化脂质替换为阳离子脂质减少了对纳米颗粒的先天免疫反应。几份报告提供了iLNP先天免疫激活的机制见解（图1(b)）。如后文所述，几种离子化脂质特别激活先天免疫受体，包括TLRs和细胞内干扰素基因刺激剂（STING）。此外，mRNA iLNPs和其他纳米颗粒的研究表明，溶酶体破裂，mRNA递送的一个重要细胞内过程，通过炎症体激活引发先天免疫反应。在注射部位受损细胞释放的损伤相关分子模式（DAMPs），包括DNA、RNA和蛋白质，也可能在iLNP递送后刺激先天免疫受体。事实上，最近的一项动物研究表明，在肌肉注射（i.m.）批准的COVID-19 mRNA疫苗BNT162b2后，包括双链DNA、高迁移率族蛋白盒（HMGB）1和尿酸在内的DAMPs血清水平急剧增加。在人类中，批准的COVID-19 mRNA疫苗诱导了强烈的局部反应，可能造成DAMPs的释放。 2.3.桥接佐剂性到疫苗效果 本节讨论先天免疫反应如何影响疫苗效果，重点关注iLNPs。最近的一项全面研究通过为各种受体准备基因敲除小鼠，调查了各种先天免疫受体在接种批准的COVID-19 mRNA疫苗BNT162b2后诱导体液和细胞免疫的参与情况。目标受体包括RNA感知途径中的TLR3、TLR7、RIG-I和MDA-5，炎症体中的NLR家族PYD结构域含有蛋白（NLRP）3和凋亡相关斑点蛋白含有C末端胱天蛋白酶募集结构域（ASC），以及TLR2、TLR4、TLR5、环状GMP-AMP合成酶（cGAS）和STING，其中一些是离子化脂质介导的免疫刺激的潜在靶分子。在这些基因中，只有MDA-5基因敲除显著降低了疫苗接种后刺突抗原特异性CD8+T细胞的频率。更准确地说，MDA-5基因敲除减少了IFN-α的分泌，这是MDA-5信号传导的下游分子，并阻止了树突细胞的激活。此外，IFN-α/β受体（IFNAR）1基因敲除也损害了刺突特异性CD8+T细胞的诱导。这些结果揭示了MDA-5和IFN-α在诱导CD8+T细胞反应中的关键作用。MDA-5可能识别mRNA疫苗配方中的dsRNA或作为DAMPs释放的受损细胞中的dsRNA。 然而，体液免疫诱导的途径更为复杂。上述任何先天免疫受体的基因敲除都没有降低刺突特异性抗体的效率。此外，只有在IFNAR1基因敲除后检测到刺突特异性抗体的最小减少。这一结果与人类研究的结果一致。该人类研究评估了COVID-19 mRNA疫苗在由于TLR7、IFNAR1或干扰素调节转录因子（IRF）7的固有缺陷或对I型IFNs的自身抗体而患有先天性和获得性I型干扰素信号传导缺陷的患者中的有效性。mRNA疫苗在这些患者中有效地诱导了中和抗体和记忆B细胞，水平与健康对照组相当。同时，几项动物研究提供了对体液免疫诱导至关重要的途径的见解。MyD88基因敲除，该基因编码许多TLRs的适配蛋白，显著抑制了使用mRNA iLNP疫苗接种后抗原特异性滤泡辅助T（Tfh）和生发中心（GC）B细胞的诱导。此外，编码Tfh细胞分化中关键细胞因子的白介素（IL）-6基因敲除也消除了疫苗效果。相比之下，RIG-I和MDA-5的适配蛋白MAVS基因敲除后，疫苗效果得以维持。另一项关于自扩增RNA（saRNA）的研究也证明了IL-6在小鼠疫苗接种中的作用，表明IL-6基因敲除损害了抗体反应和Tfh细胞及GC B细胞的诱导。与此同时，IL-6基因敲除后，saRNA疫苗对致命性流感病毒挑战的保护效果得以保留。这些研究表明，在诱导体液免疫反应的先天免疫信号传导途径中存在冗余，而TLRs和IL-6发挥主要作用。 在人类疫苗接种中，第二剂COVID-19 mRNA疫苗大幅增强了体液和细胞免疫，并同时引起了比第一剂更严重的全身反应原性。这一观察结果意味着，第二剂后负责反应原性的促炎分子可能也有助于增强适应性免疫。先前的一项研究评估了人类BNT162b2疫苗接种者血浆中67种细胞因子的概况。其中，IFN-γ显示出一个独特的概况，特别是在第二剂后急剧增加。小鼠模型也在第二次接种BNT162b2后复制了IFN-γ水平的急剧增加，伴随着巨噬细胞、单核细胞和树突细胞的激活。进一步分析揭示了CD4+和CD8+ T细胞在第二次接种后产生IFN-γ的显著贡献。有趣的是，IFN-γ受体中和抗体的给药减弱了巨噬细胞、单核细胞和树突细胞的激活，证明了IFN-γ在第二剂后的佐剂功能。然而，IFN-γ受体中和抗体对抗原特异性抗体产生和CD4+及CD8+ T细胞诱导的效率影响很小。因此，需要进一步的研究来解读COVID-19 mRNA疫苗的佐剂性机制。 2.4.脂质和mRNA的佐剂性 iLNP佐剂性的另一个关键问题是，脂质和mRNA组分中哪一个主要促进免疫刺激，以及每个组分激活的信号通路是什么。一项全面的机制研究通过比较空iLNP与封装修饰mRNA的iLNP来解决这个问题。有趣的是，两种配方在小鼠皮内（i.d.）注射后4和24小时引流淋巴结中产生的细胞因子和趋化因子水平相似，表明脂质组分在对iLNP的先天免疫反应中占主导地位。因此，两种iLNP都作为佐剂，并提高了重组蛋白疫苗的效率，使其比AddaVax（模仿临床上批准的MF59佐剂的角鲨烯佐剂）更有效地产生抗原特异性抗体。有趣的是，空iLNP的佐剂效应在MyD88和MAVS基因敲除后大多得以维持，但在IL-6基因敲除后减少。因此，空iLNP可能通过IL-6分泌发挥其佐剂性。然而，同一研究的详细分析揭示了mRNA对mRNA iLNPs的先天免疫反应的贡献，即使mRNA在化学上被修饰以最小化免疫刺激。当比较空iLNP和装载mRNA的iLNP对其作为佐剂以提高重组蛋白疫苗的效率时，MyD88基因敲除减少了装载mRNA的iLNP的体液免疫诱导，而不是空iLNP。这一结果表明，mRNA而不是脂质组分激活了MyD88。在另一项研究中，非人类灵长类动物（NHPs）肌肉注射和皮内注射后，只有装载修饰mRNA的iLNP，而不是空iLNP，在引流淋巴结中的树突细胞中诱导了I型IFN表达和树突细胞的成熟，揭示了mRNA在iLNP佐剂性中的关键作用。 随着未修饰mRNA的使用和较少免疫刺激性的mRNA递送载体，mRNA的佐剂性变得更加明显。在这方面，用于癌症疫苗临床试验的阴离子脂质体比iLNPs的免疫刺激性小。有趣的是，当装载未修饰的mRNA时，阴离子脂质体提供了强大的CTL活性，但相反，当装载1 mΨ mRNA时，诱导了抗原特异性免疫耐受。这些研究强调了未修饰mRNA的佐剂性，将免疫耐受疫苗转化为抗癌疫苗。在装载未修饰mRNA的阴离子脂质体中，TLR7和IFNAR1基因敲除，而不是TLR3、4和9，减少了疫苗接种后树突细胞、NK细胞、T细胞和B细胞的激活。这一结果表明，mRNA通过TLR7识别和随后激活I型IFN在未修饰mRNA的佐剂性中的贡献。 2.5.设计递送系统以改善佐剂性 迄今为止回顾的机制理解意味着改善mRNA疫苗的佐剂性的好处，促进了这一领域的积极研究（表1）。事实上，在某些情况下，佐剂性，而不是抗原表达效率，可能决定疫苗接种的效果，其中提供增强免疫刺激和较低抗原表达的疫苗比提供效率较低的免疫刺激和增强抗原表达的疫苗表现更好。在设计mRNA疫苗佐剂时，首选包含抗原mRNA和佐剂的一体化疫苗配方，允许抗原和佐剂的共递送。如上所述，重组蛋白疫苗的研究已经显示了共递送抗原和佐剂对强大疫苗接种的好处。此外，这种简单的疫苗配方在临床转化中是有利的。 一种策略是将佐剂和mRNA共封装到相同的纳米颗粒中。基于脂质的系统有两个选择：将水溶性佐剂封装在水相中，或将疏水性佐剂封装在脂质相中（图2(a)）。前者的方法是iLNP封装锰，这是STING途径的激活剂，在针对SARS-CoV-2的疫苗接种中显示出有希望的结果。在后一种方法中，R848，一个小分子TLR7/8激动剂，被结合到棕榈酸中以并入阳离子mRNA脂质复合物。该脂质复合物显示出强大的CTL诱导和抗癌效果。另一个例子是Pam2Cys，一个由半胱氨酸、硫甘油和两个棕榈酸链组成的TLR2/6佐剂，被并入iLNP，从而增强了细胞和体液免疫反应。其他系统使用了α-半乳糖神经酰胺，它在APCs上呈现后激活不变自然杀伤T（NKT）细胞，证明了它们在针对癌症和疟疾的疫苗中的效用。针对疟疾的疫苗靶向感染的肝细胞。 除了使用额外的佐剂外，将佐剂性纳入可离子化或阳离子脂质是脂质基疫苗的一个选项（图2(a)）。无需额外的佐剂，这种方法通过最小化成分来简化疫苗配方，可能有利于临床转化。佐剂脂质具有激活先天免疫反应和促进mRNA递送的双重功能。例如，具有环胺头基的可离子化脂质比具有线性胺头基的脂质更有效地诱导先天免疫反应和针对癌症的抗原特异性CTL活性。有趣的是，STING基因敲除消除了由环胺iLNP诱导的先天和适应性免疫反应，表明可离子化脂质中的环胺激活了STING。最近的一项研究在环胺和烷基链之间引入了可生物降解的酯类连接物，以促进佐剂环胺的清除，提高安全性。另一项研究开发了一种类似阳离子脂质的材料，激活TLR4。由此产生的基于脂质的疫苗在野生型小鼠中提高了细胞免疫，但在TLR4基因敲除小鼠中没有提高，证明了TLR4信号在疫苗中的参与。将现有的佐剂或其组分结合到可离子化脂质上是更直接的方法。最近的一项研究设计了一种与TLR7/8佐剂结合的佐剂可离子化脂质体，提高了细胞和体液免疫的诱导效率。另一项研究将维生素E（临床上批准的AS03佐剂的组分）引入可离子化脂质的疏水尾部。含有维生素E的可离子化脂质展现出增强的佐剂性，比含有肉豆蔻酸或油酸尾部的对照可离子化脂质更有效地诱导CTL反应。 在脂质基配方中使用无机系统是另一个具有递送和佐剂功能的双功能系统的例子。先前的一项研究设计了由mRNA负载的钙磷酸核心和脂质层涂层组成的纳米颗粒（图2(b)）。钙磷酸核心在细胞外环境中稳定纳米颗粒，但在细胞内释放Ca2+。由此产生的细胞内Ca2+浓度增加触发树突细胞成熟的信号。此外，钙磷酸核心可以与抗原mRNA共同封装PD-L1 siRNA，用于免疫检查点阻断，进一步增强癌症疫苗的效果。 聚合物基系统，作为一大类mRNA递送系统，与脂质基系统相比，在mRNA疫苗配方中的关注度较小。先前的一项研究比较了聚聚体和iLNP中saRNA的疫苗效果。有趣的是，装载saRNA的iLNP在肌肉注射后远远优于装载saRNA的聚聚体，在细胞和体液免疫诱导方面，尽管聚聚体比iLNP提供了更有效的抗原表达。一致地，iLNP在诱导IL-6（mRNA疫苗佐剂性的关键分子）的表达方面比聚聚体更强。因此，作者将其低疫苗效率归因于其低佐剂性，尽管其他因素，包括递送到淋巴组织的效率，也可能影响疫苗效果。 与此同时，一些聚聚体系统在疫苗接种中提供了有希望的结果（图2(c)）。在几项临床试验中使用的精蛋白/mRNA聚聚体利用未修饰mRNA的佐剂性刺激TLR7（图2(d)）。在这个系统中，与精蛋白的mRNA复合增加了先天免疫反应，但与裸mRNA相比，在小鼠皮内注射后降低了抗原表达效率。因此，控制mRNA和精蛋白的混合比例，以在注射溶液中包含游离mRNA和精蛋白/mRNA聚聚体，以同时获得抗原表达和佐剂性。在一项机制研究中，TLR7基因敲除几乎完全抑制了聚聚体给药后的IL-12分泌。此外，聚聚体通过TLR7基因敲除减少了其CTL诱导潜力，而不是TLR9基因敲除，突出了TLR7佐剂性在这种疫苗配方中的作用。在另一个例子中，硅纳米颗粒被聚(乙二醇)（PEI）涂层，随后PEI交联，mRNA装载和甘露糖涂层。然后，移除硅核心，提供中空核心糖胶囊（图2(e)）。甘露糖的功能是靶向树突细胞并激活树突细胞作为佐剂。结果，这个系统为癌症疫苗提供了强大的CD4+和CD8+免疫。最近的研究还展示了mRNA疫苗中佐剂性多阳离子的潜力（图2(c)）。例如，用于mRNA复合的200-kDa阳离子壳聚糖也作为佐剂，通过激活STING和炎症体，增强抗原特异性细胞和体液免疫。在另一项研究中，具有C18侧链的多阳离子由于其佐剂性激活树突细胞和有效的淋巴结迁移，展现了有效的癌症疫苗效果。一项关于亚单位疫苗的研究也揭示了多阳离子佐剂性。在这项研究中，PEI通过释放宿主细胞的DNA作为DAMPs，激活IFN调节因子-3信号，发挥其佐剂性。这些研究表明了聚合物基系统在疫苗接种中的潜力，这尚未被充分探索。如前所述，iLNP也产生DAMPs，这可能作为佐剂。同时，过量的DAMPs可能引发自身免疫性疾病。例如，通过自身DNA过度激活cGAS-STING途径可能会引起艾卡迪-古特雷斯综合症和共济失调毛细血管扩张症。疫苗开发需要考虑这些风险。 图2. 提高mRNA疫苗佐剂效应的策略。(a) iLNPs或其他脂质系统。(b) 含有磷酸钙核心的脂质载体。(c) 聚复合物。(d) 普罗胺/mRNA聚复合物。(e) 用甘露糖涂层的空心糖胶囊。(f) 设计用于提高佐剂效应的mRNA。用于增强佐剂效应的策略和组分用粗体标出。 2.6.设计mRNA以提高佐剂性 调节mRNA佐剂性提供了另一种改善疫苗效果的选项。这种mRNA佐剂方法包括添加编码免疫刺激性蛋白的mRNA，并利用RNA分子的内在免疫刺激性特性（图2(f)）。这些策略允许使用单一纳米颗粒配方共递送抗原mRNA和佐剂RNA。此外，佐剂RNA在注射后几天内经历酶促降解，避免长时间的免疫刺激。关于编码免疫刺激性蛋白的mRNA，一项开创性的研究将抗原mRNA与三种类型的免疫刺激性mRNA混合，编码CD40配体、TLR4的组成性活性形式和CD70。这种设计显著提高了与单独注射裸mRNA相比的抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞诱导和抗癌效果，在淋巴结内注射后。最近的研究证明了免疫刺激性mRNA在iLNP配方中的好处。例如，先前的一项研究通过筛选编码参与先天免疫信号传导的各种蛋白的mRNA物种，确定组成性活性STING mRNA是最有效的mRNA，能在小鼠中诱导CTL活性。另一项研究使用了编码C3d的mRNA，C3d是哺乳动物补体成分，能激活滤泡树突细胞和B细胞。C3d mRNA封装到iLNP中提高了抗原特异性细胞和体液免疫。 RNA分子，特别是dsRNA的内在免疫刺激性特性可以作为佐剂使用。在这方面，dsRNA的免疫刺激性特性可能对saRNA疫苗的疫苗效果产生积极或消极的影响。saRNA具有单链RNA病毒的复制机制，可以在宿主细胞内自我放大，提供抗原蛋白的持续表达。此外，细胞内增殖过程中的dsRNA中间体也可能增强细胞dsRNA受体的激活，以诱导先天免疫反应。这些特性使得使用低剂量的saRNA在动物和人类中进行有效的疫苗接种。然而，dsRNA中间体的持久性可能导致长时间的免疫刺激和PKR激活，可能在某些情况下对疫苗效果产生负面影响。事实上，IFNAR1或MAVS基因敲除提高了saRNA疫苗接种后体液或细胞免疫诱导的效率。此外，saRNA通过共表达MERS-CoV-2 ORF4a提高了其疫苗效率，该蛋白通过结合dsRNA抑制MDA-5和RIG-I的激活[86]，或天花病毒免疫逃逸蛋白阻断PKR和IFN-β的活性。 相反，使用dsRNA对先天免疫反应进行短暂刺激有助于改善mRNA疫苗以提高CTL活性。在这个策略中，dsRNA结构是通过将互补RNA与mRNA杂交到非复制mRNA中准备的（图3）。以前的研究评估了互补RNA与mRNA杂交在蛋白翻译效率和先天免疫反应方面的影响。当互补RNA靶向蛋白编码区域时，在与17 nt互补RNA杂交后翻译效率保持稳定（图3(a)），但在与23 nt或更长的RNA杂交后下降（图3(b)）。与mRNA杂交的短RNA在细胞内环境中特别被从mRNA上脱落，可能是通过翻译过程中蛋白质翻译机制的内源性解旋酶活性。这个过程可能允许从与17 nt互补RNA链杂交的mRNA中有效表达蛋白。关于佐剂性，23 nt或更长的互补RNA杂交，而不是17 nt互补RNA，增加了mRNA的免疫刺激性特性。同时，当靶向mRNA的非编码区域时，RNA杂交的影响是不同的。在先前的研究中，通过体外转录准备的120 nt poly U RNA与mRNA的120 nt poly A杂交。有趣的是，poly U杂交极大地增强了mRNA诱导先天免疫反应的能力，对翻译效率的影响最小（图3(c)），提供了具有佐剂性的mRNA的优秀配方。机制分析揭示了RIG-I在先天免疫激活中的主要作用。事实上，120 nt poly U RNA在体外转录时没有5'帽类似物，在5'端有一个三磷酸基团，是RIG-I的配体。在小鼠疫苗接种中，这种配方在淋巴结内裸mRNA的形式下增强了模型抗原mRNA的疫苗效果。然而，这个系统中的免疫刺激强度是不可控的。因此，后来的研究重新设计了这个系统，以实现对免疫刺激强度的微调。为此，通过17 nt互补RNA与mRNA杂交，准备了梳状结构的mRNA，精确设计了dsRNA牙齿以诱导RIG-I刺激。更重要的是，通过改变免疫刺激性牙齿的数量，这个策略使佐剂性的微调成为可能，以最大限度地提高疫苗效率，同时最小化不良反应。最终，这个系统提高了三种不同mRNA配方的CTL活性：阴离子脂质体、iLNP和聚乙二醇化聚聚体。 图3. mRNA与dsRNA佐剂杂交。展示了RNA杂交后的翻译效率和免疫刺激性。(a-c) 互补RNA与mRNA的编码区(a, b)和聚A区(c)杂交。(d) 梳状结构的mRNA与设计用于靶向mRNA编码区RIG-I的dsRNA杂交。 2.7.杰基尔和海德的佐剂特性 上述描述集中在mRNA疫苗中先天免疫反应的积极方面。然而，许多研究揭示了佐剂特性更为复杂的方面。例如，mRNA修饰在疫苗接种中提供了复杂的结果。像Ψ和1 mΨ这样的mRNA修饰减轻了对mRNA的先天免疫反应，即佐剂效应。未修饰的mRNA的佐剂效应对CTL诱导和抗体产生产生相反的效果。几项iLNP研究表明，未修饰的mRNA在诱导抗原特异性CD8+ T细胞反应方面优于修饰的mRNA。根据最近的一项研究，不含核苷修饰的抗原mRNA包裹在iLNP中，比包裹1 mΨ修饰的抗原mRNA更有效地诱导抗原特异性CD8+ T细胞，包括那些对颗粒酶B呈阳性的细胞，并更有效地激活肿瘤浸润性树突状细胞。结果，未修饰的mRNA在小鼠模型的癌症疫苗中优于修饰的mRNA，显示出有效的肿瘤体积抑制和延长小鼠存活时间（图4（a））。引人注目的是，在一项使用编码荧光蛋白的mRNA的报告试验中，未修饰的mRNA在淋巴结和脾脏的树突状细胞和巨噬细胞中提供的报告蛋白表达效率远低于1 mΨ修饰的mRNA（图4（b））。这些结果证明了未修饰的mRNA在诱导CTL反应方面的潜力，即使以牺牲抗原表达效率为代价。在机制分析中，未修饰的mRNA比修饰的mRNA更有效地激活脾脏树突状细胞，并且使用抗IFNAR1抗体的给药减少了未修饰的mRNA在疫苗接种中的好处。因此，未修饰的mRNA可能通过I型IFN途径发挥其佐剂效应。 图4. 1 mΨ修饰对癌症疫苗接种的影响。(a) 装载卵清蛋白（OVA）mRNA的iLNP被肌肉内注射到皮下携带表达OVA的B16F0肿瘤的小鼠中。评估了肿瘤大小。(b) 使用iLNPs肌肉内注射0、40、70和100% 1 mΨ修饰的mCherry mRNA。量化了淋巴结和脾脏中常规类型1和2树突状细胞（cDC1和cDC2）中mCherry表达的效率。版权所有© 2022 sittplangkoon, Alameh, Weissman, Lin, Tam, Prompetchara和Palaga。 相反，与iLNP一起传递的1 mΨ mRNA在产生抗原特异性抗体方面比未修饰的mRNA更有效，这表明未修饰的mRNA中佐剂效应的负面影响。一项全面研究调查了1 mΨ修饰对基于iLNP的流感病毒疫苗在小鼠中结果的影响。在i.d.疫苗接种后，1 mΨ mRNA在诱导抗原特异性CD4+ T细胞和抗体方面优于未修饰的mRNA（图5（a）），伴随着脾脏中Tfh和GC B细胞的增强产生。这些结果可能反映了未修饰的mRNA佐剂效应的负面影响。同时，1 mΨ mRNA比未修饰的mRNA产生了更有效和持久的报告蛋白表达（图5（b））。值得注意的是，1 mΨ修饰对蛋白表达效率的好处在器官和细胞类型之间有所不同，在脾脏免疫细胞中尤为明显，包括单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。因此，1 mΨ修饰的mRNA在免疫细胞中提供增强的抗原表达的能力也可能有助于其高疫苗潜力。最近的一项研究通过调查使用三种不同的iLNPs在小鼠和NHPs中1 mΨ修饰的效果，提供了关于先天免疫反应和抗体产生效率之间关系的机制见解。在研究中，1 mΨ修饰增加了抗体产生效率，并伴随着系统性趋化因子和细胞因子分泌的减少。更具体地说，在三种iLNPs中，两种在没有1 mΨ修饰的情况下诱导了大量I型IFN分泌的iLNPs，在1 mΨ修饰后获得了比其他iLNPs更大的疫苗效率好处，后者在没有修饰的情况下显示出最小的I型IFN反应。因此，I型干扰素反应可能是抑制疫苗结果的罪魁祸首。 图5. 1 mΨ修饰对传染病疫苗的影响。(a) 小鼠通过皮内注射使用iLNPs装载的未修饰或1 mΨ修饰的表达流感病毒血凝素（HA）的mRNA进行疫苗接种。评估了HA抑制滴度。(b) 在使用装载未修饰和1 mΨ修饰mRNA的iLNP皮内注射后评估荧光素酶表达效率。版权所有© 2018 Pardi等人。 mRNA杂质的免疫刺激也可能产生负面影响。在最近的一项iLNP mRNA疫苗研究中，C57BL6小鼠比BALB/c小鼠表现出更弱的体液免疫诱导。在这两种小鼠之间比较，C57BL6小鼠的树突状细胞产生的I型IFN比BALB/c小鼠多10倍以上。在使用HPLC从mRNA中去除dsRNA污染物后，C57BL6中的IFN产生被抑制，C57BL6小鼠中的抗体产生增加到与BALB/c小鼠观察到的水平相当。这些数据也表明了I型IFN对体液免疫诱导的抑制效应。在人类中，如上所述，I型IFN信号通路的缺陷并没有损害SARS-CoV-2 mRNA疫苗中的抗体产生。因此，人类的抗体产生可能不需要强烈的佐剂效应和I型IFN激活。从安全角度来看，1 mΨ修饰减轻了使用iLNP在NHPs中mRNA疫苗接种后系统性细胞因子和趋化因子的释放。因此，诱导最小I型IFN反应的mRNA疫苗配方可能在专注于体液免疫的疫苗中更实用。同时，也应注意到化学修饰的必要性仍然是有争议的。事实上，装载未修饰的mRNA的iLNP在NHPs中诱导了有效的体液免疫，其水平与临床批准的COVID-19疫苗装载1 mΨ mRNA的水平相当。 除了核苷修饰，I型IFN信号在CTL诱导中的作用提供了另一个复杂机制的例子，这些机制是佐剂效应的基础。值得注意的是，I型IFN信号根据疫苗接种途径对CTL诱导产生相反的效果。IFNAR1基因敲除或IFNAR1阻断抗体改善了局部给药后mRNA脂质复合物的CTL诱导效率，包括皮内(i.d.)、皮下(s.c.)和淋巴结内给药，显示出I型IFN信号对疫苗接种的负面影响。重要的是，即使没有从mRNA中大幅度提高蛋白表达效率，IFNAR1阻断也改善了疫苗接种效果。因此，除了抗原表达效率之外的机制，大概是I型IFN信号的过度佐剂效应，可能会损害疫苗接种效果。相反，IFNAR1基因敲除降低了系统性注射后CTL诱导的效率，显示出I型IFN佐剂效应的积极影响。根据对疫苗接种中I型IFN信号的后期机制研究，局部给药后的负面影响和系统性给药后的积极影响在条件性IFNAR1基因敲除的CD4+ T细胞中被消除，但在树突状细胞中没有。因此，I型IFN对CD4+ T细胞的作用可能解释了其在疫苗接种中相互矛盾的效果。 对于CD4+ T细胞的激活，I型IFN信号和抗原呈递的动力学在CD4+ T细胞的命运中起着关键作用。在抗原呈递给T细胞受体之前，I型IFN信号对T细胞具有抗增殖和促凋亡作用。另一方面，同时或延迟的I型IFN信号对T细胞具有增殖和抗凋亡作用。这种动力学上的差异可能解释了系统性给药和局部给药之间I型IFN的相互矛盾效果。系统性注射可能将mRNA直接送入脾脏树突状细胞，允许与I型IFN暴露相对快速和同时的抗原呈递，从而激活T细胞。另一方面，局部注射需要时间让组织残留的APCs迁移到淋巴器官。这可能会延迟抗原呈递，从而对T细胞功能产生负面影响。 最近的一项研究揭示了iLNP对先天和适应性免疫反应的长期影响，持续数周。有趣的是，预先注射装载非抗原mRNA的iLNP或空iLNP减少了2周后注射的后续iLNP疫苗产生抗体和GC B细胞的效果（图6(a,b)）。当预注射到疫苗接种的时间间隔从2周增加到8周时，抑制效果仍然存在，但程度较小。预注射降低了后续疫苗接种中mRNA iLNP的抗原表达效率，这可能有助于抑制效果。进一步的机制实验通过评估iLNP预注射对预防传染病的保护效果，调查了先天免疫在这种抑制效果中的作用。在这个实验中，接受装载非抗原mRNA的iLNP的小鼠在2周后被流感病毒和白色念珠菌挑战，其中先天免疫决定了对感染的易感性（图6(c)）。有趣的是，预注射对流感病毒（图6(d)）提供了保护效果，但加剧了白色念珠菌的感染（图6(e)）。iLNP预注射后血液中中性粒细胞水平的降低可能解释了白色念珠菌的结果，而涉及流感病毒挑战实验的机制尚不清楚。重要的是，两个结果都表明iLNP注射对先天免疫反应的长期影响对抗随后的传染病。通过显示iLNP对后续疫苗接种的抑制效果，这项研究可能具有临床意义。通过延长初次和加强剂量之间的时间间隔，提高了COVID-19疫苗在人类中的效力。初次剂量对加强剂量的抑制效果可能解释了这一临床结果。 图6. iLNP预注射对后续先天和适应性免疫反应的影响。(A-B) 装载非抗原mRNA (eGFP)、空iLNP (eLNP) 或PBS被皮内注射。两周后，注射装载血凝素（HA）的iLNP，随后在疫苗接种后两周评估疫苗效果。(a) 实验方案。(b) HA特异性抗体产生。(c-e) 注射装载非抗原mRNA的iLNP两周后，小鼠被流感病毒或白色念珠菌挑战。(c) 实验方案。(d, e) 流感病毒挑战后的病毒载量(d)和白色念珠菌挑战后的病毒载量(e)。版权所有© 2021 Qin等人。 总的来说，这一节提供了过度佐剂效应阻碍疫苗效果的例子，而佐剂效应是mRNA疫苗的重要组成部分，如前几节所描述的。免疫刺激的强度、信号通路和动力学可能部分解释了佐剂效应的杰基尔和海德特性，尽管需要进一步的机制研究来理解和控制佐剂效应的结果。 3.传递 3.1.传递概述 有效的疫苗接种需要在淋巴器官中表达抗原的APCs（抗原呈递细胞），包括淋巴结和脾脏，与T细胞和B细胞合作以诱导适应性免疫。mRNA疫苗在淋巴器官中的APCs实现抗原表达主要有两条途径（图7）。在一条途径中，mRNA疫苗在非淋巴组织给药后，残留的APCs在注射部位摄取抗原mRNA，然后通过淋巴管迁移到淋巴组织。这些过程需要数小时到数天。在APCs较少的组织中，这一途径需要mRNA疫苗引发的先天免疫反应触发免疫细胞向注射部位的浸润。将mRNA疫苗传递到富含APCs的组织，如皮肤组织，是利用这一途径的另一种策略。在另一条途径中，疫苗纳米颗粒通过淋巴管传递，直接将mRNA传递到淋巴组织中的APCs，这一过程需要数分钟到数小时。值得注意的是，淋巴管有对流以促进这一过程。这一途径需要具有适合淋巴运输的尺寸和表面特性的纳米颗粒。此外，靶向配体可以帮助疫苗在淋巴组织中的积聚和保留，并将疫苗传递给特定类型的免疫细胞。从安全角度来看，疫苗在淋巴器官中的保留对于避免疫苗分布到非淋巴器官、异位抗原表达和先天免疫激活至关重要。以下各节将从传递的角度讨论mRNA疫苗接种，重点关注传递途径和纳米颗粒设计（表2）。每个部分首先一般性地描述每种疫苗传递途径，然后专注于mRNA疫苗接种。 图7. iLNP mRNA疫苗肌肉内注射后的可能机制。在一条途径中，iLNPs迁移到淋巴结以在淋巴结中的APCs中提供抗原蛋白表达。在另一条途径中，免疫细胞浸润到注射部位并在摄取抗原后迁移到淋巴结。 3.2.非淋巴组织的传递 大多数临床可用的疫苗都是注射到肌肉或皮下组织，尽管这些组织中APCs很少。因此，需要浸润注射部位的APCs摄取疫苗并迁移到近端引流淋巴结，以促进适应性免疫反应的协调激活。或者，疫苗可能直接通过淋巴管传递到这些淋巴结。与皮下途径相比，肌肉内注射通常在注射部位的不良事件风险较低，并诱导更强的免疫反应。肌肉组织通常血管和淋巴循环更丰富，允许疫苗有效运输到淋巴结。这可能解释了肌肉内注射途径相对于皮下途径在疫苗接种中的优势。相比之下，皮下给药的疫苗倾向于在注射部位停留较长时间，大概是因为皮下脂肪组织的血管化有限和物质交换能力低。因此，皮下途径在疫苗接种中依赖于APC迁移到淋巴结，而不是疫苗迁移。 在mRNA疫苗引起广泛关注之前，其他领域的广泛研究已经讨论了疫苗纳米颗粒的物理化学特性如何决定它们在细胞间质给药后的命运。特别是，它们的尺寸和表面特性，如电荷和亲水性，是它们淋巴结转移的决定因素。尺寸在10到100纳米之间，更具体地说是20-50纳米的纳米颗粒，适合穿越细胞间质并进入和通过淋巴管。然而，尺寸在100-200纳米的纳米颗粒表现出较差的淋巴结迁移能力，因为大约100纳米大小的水通道限制了它们通过细胞间质的扩散和对流。尺寸超过200纳米的纳米颗粒停留在注射部位，并完全依赖于APCs的摄取和APC迁移到淋巴结以提供疫苗效果。相反，小于10纳米的纳米颗粒更倾向于进入血管而不是淋巴管，因为尺寸允许穿透血毛细血管壁。此外，血毛细血管中的流动大约是淋巴流动的100-500倍，有助于清除纳米颗粒。 关于纳米颗粒的表面特性，带正电荷的纳米颗粒被注射部位的负电荷细胞膜和细胞外基质所困。相比之下，带负电荷或未带电荷的纳米颗粒缺乏这种局部相互作用，可以穿过淋巴管传递到淋巴结，显示出在疫苗接种中的适宜特性。用包括聚乙二醇（PEG）在内的亲水性隐形材料涂层纳米颗粒表面，可以进一步提高纳米颗粒向淋巴结的迁移效率，因为这种表面与细胞间质的相互作用最小。有趣的是，纳米颗粒的PEG化使超过100纳米尺寸的纳米颗粒转移成为可能，如120纳米尺寸的阴离子脂质体和250纳米尺寸的阳离子脂质体，大概是因为PEG化可能改善了纳米颗粒的胶体稳定性，并减少了它们在注射部位细胞间环境中的非特异性吸附。同时，纳米颗粒表面的PEG密度需要优化。例如，含有1摩尔% DSPE-PEG2000的阳离子脂质体在淋巴结中的保留时间延长，并且比含有5摩尔% DSPE-PEG2000的APCs摄取增强，而两种脂质体都有效地迁移到淋巴结。另一项研究也揭示了PEG密度优化对最大化疫苗效力的重要性。针对APCs的配体，如甘露糖衍生物和针对DC40、CD11c和DEC-205的抗体，也可以提高传递效率到APCs。然而，这些方法增加了制造的成本和复杂性。考虑到APCs的高吞噬活性以及它们在淋巴结中的丰富性，一旦纳米颗粒到达淋巴结中的APCs，调整纳米颗粒的物理化学特性可能就足够了。 这些关于纳米颗粒疫苗的研究为mRNA疫苗的开发提供了基础。根据之前的一项mRNA研究，直接将裸mRNA疫苗注射到淋巴结中可以产生强大的CTL反应，而裸mRNA疫苗在其他传递途径中，包括皮内、皮下和近淋巴结注射，未能诱导出可检测的疫苗效果。淋巴结内裸mRNA注射在针对新抗原的癌症疫苗的临床试验中也显示出有希望的结果。这些研究强调了在淋巴结中获得抗原表达的重要性。然而，淋巴结内注射需要在超声成像的指导下进行繁琐的操作，阻碍了广泛的临床应用。相比之下，在普通医疗护理中进行的局部注射，如皮下和肌肉内注射，针对的是非淋巴组织。因此，mRNA疫苗应该具有在传递到非淋巴组织后在淋巴组织中的APCs诱导抗原表达的功能。促进mRNA疫苗和APCs向淋巴结迁移是实现这一目的的两条主要途径（图7），而这两个途径通常无法区分。 有趣的是，mRNA iLNP在肌肉内注射后在引流淋巴结中有效地产生表达抗原的APCs，这可能有助于批准的COVID-19 mRNA疫苗的高效性。之前的一项研究通过正电子发射断层扫描-计算机断层摄影术跟踪了NHPs中放射性标记的iLNP。肌肉内注射后4小时内，iLNP在距离注射部位远达9.2厘米的淋巴结中提供了强烈的信号。其他研究通过观察小和大动物肌肉内注射iLNP后mRNA分布和报告蛋白表达，进一步深入了解了局部传递后mRNA iLNP在细胞水平上的过程。iLNP诱导免疫细胞浸润到注射部位，并在浸润的免疫细胞以及残留的成纤维细胞和脂肪细胞中提供报告蛋白表达。报告蛋白表达在注射后8小时在引流淋巴结中有效观察到，但在非引流淋巴结中未观察到。表达水平逐渐下降，但在注射后7天仍高于检测限。在淋巴结中的各种细胞类型中，位于被膜下和髓质窦的巨噬细胞表现出强大的报告表达，而树突状细胞和单核细胞的表达效率较低，T细胞和B细胞中几乎检测不到。巨噬细胞可能作为APCs通过与T细胞和B细胞的相互作用来触发强大的适应性免疫。值得注意的是，人类引流淋巴结在肌肉内疫苗接种后也显示出疫苗mRNA和抗原蛋白表达的有效积累。尽管上述研究没有精确区分在淋巴结中获得抗原表达的两条途径，即iLNP和APCs的迁移（图7），但iLNP在远处淋巴结的快速积累意味着iLNP迁移的贡献。此外，iLNP在全身器官中诱导了强大的蛋白表达，包括肝脏和脾脏，大概是通过iLNP迁移而不是APC迁移，突出了iLNP在注射部位以外传播的潜力。 几项研究试图进一步区分这两条途径的贡献。为了这个目的，最近的一项研究准备了一个在注射部位具有高效抗原蛋白表达效率而在引流淋巴结中效率低的系统。mRNA和空iLNP的混合物在肌肉内注射后在注射部位提供了可比较的蛋白表达水平，但与装载mRNA的iLNP相比，在引流淋巴结中的水平要低得多。值得注意的是，与装载mRNA的iLNP相比，mRNA和空iLNP的混合物在诱导体液和细胞免疫方面的效率要低得多。这些结果表明，淋巴结中抗原表达在疫苗接种中的重要贡献。尽管这项研究无法精确区分iLNPs和APCs的迁移，但可以合理假设装载mRNA的iLNP可能比mRNA和空iLNP的混合物更有效地将抗原mRNA传递到淋巴结。因此，结果表明iLNP迁移到引流淋巴结在疫苗接种中的重要角色。考虑到纳米颗粒的大小对其淋巴结迁移效率的影响，mRNA iLNPs的大小也可能影响其疫苗结果。在这种情况下，之前的一项研究使用小鼠中的135批iLNP进行回顾性研究，显示了抗体产生效率和iLNP大小之间的明确相关性。这一结果支持iLNP迁移到淋巴结在疫苗接种中的参与。同时，这种相关性在NHPs中变得不那么明显，这可能反映了小鼠和NHPs之间淋巴系统解剖学的差异。 另一项研究比较了iLNP、阳离子纳米乳和阳离子脂质体的疫苗效果，揭示了每种配方的目标细胞类型影响体液和细胞免疫的诱导效率（图8(a)）。肌肉内注射后，与其他配方相比，iLNP产生了更高水平的抗体产生，但细胞免疫水平较低（图8(b)）。在报告试验中，阳离子脂质体在小鼠的引流淋巴结中诱导蛋白表达的效率比其他配方更高。在培养细胞实验中，iLNP在蛋白表达方面对肌细胞的偏好超过了树突状细胞。相反，阳离子纳米乳和脂质体在树突状细胞中显示出高效的蛋白表达。基于这些结果，作者假设阳离子脂质体在淋巴结中的有效积累和有效的mRNA传递到树突状细胞有助于细胞免疫的强烈诱导。相比之下，iLNP可能主要在肌细胞中提供蛋白表达，然后APCs摄取肌细胞释放的抗原。这一过程可能更倾向于诱导体液免疫。重要的是，非APCs中的抗原蛋白表达以几种模式对疫苗结果做出贡献。当mRNA编码分泌性抗原时，APCs可以摄取非APCs分泌的抗原。在质粒DNA（pDNA）疫苗的研究中，编码分泌性OVA的pDNA在肌肉内和皮内裸注射后产生的抗OVA抗体水平比编码膜结合或细胞质OVA的更高，显示了抗原分泌的好处。同时，在mRNA iLNP疫苗中，编码细胞相关和分泌性血凝素（HA）的mRNA显示出可比的抗HA抗体产生，表明在这种情况下抗原分泌的作用边缘化。在另一种模式中，非APCs的细胞碎片也可以在疫苗接种后表达抗原的非APCs受损时向APCs提供抗原。 图8. 不同mRNA疫苗配方的接种效果。(a) mRNA疫苗配方。(b) 针对SARS-CoV-2尖峰蛋白的受体结合域（RBD）的每种疫苗配方诱导的体液和细胞免疫。版权所有© 2022 Shi等人。 一些研究表明mRNA疫苗不需要迁移到淋巴组织就能有效地进行疫苗接种。最近的一项研究对裸saRNA进行了皮内注射，该saRNA优选在皮肤温度范围（30-35°C）内复制，但在体温或超过37°C时变得失活。裸RNA分布在注射部位以外的其他器官是不可能的，因为在迁移到其他器官的过程中裸mRNA可能会被降解。此外，其他组织中非最佳温度限制了saRNA仅在皮肤中复制。即使仅在皮肤中表达抗原，这种疫苗配方也能诱导强大的细胞免疫。另一项研究表明，即使阳离子纳米乳基saRNA疫苗的分布最小化到淋巴结或其他器官，也能通过强烈的体液免疫诱导。在saRNA疫苗中，saRNA附着在纳米颗粒的表面，与脂质层内装载mRNA的iLNP相反。该研究比较了阳离子纳米乳和iLNP之间的生物分布和疫苗效果。在小鼠肌肉内注射后，纳米乳主要将蛋白表达限制在注射的肌肉中，而iLNP在引流淋巴结和肝脏中提供了强烈的蛋白表达。然而，纳米乳比iLNP诱导了更强烈的体液免疫反应，表明迁移到淋巴结在疫苗接种中并非不可或缺。值得注意的是，纳米乳的这种局部分布有助于避免全身炎症反应，而iLNP诱导了全身细胞因子释放和体重减轻。 值得注意的是，最近的一项研究揭示了NHPs中mRNA iLNP的大量系统分布，在肌肉内注射后在脾脏、肝脏和血浆中检测到注射的mRNA。这种系统分布可能在人类中引起安全问题，包括罕见的自身免疫性肝炎和心肌炎病例。自身免疫性肝炎的人类研究揭示了针对肝脏中尖峰蛋白的CD8+ T细胞的存在。这一结果表明，T细胞可能在mRNA疫苗接种后攻击表达尖峰蛋白的肝细胞。关于心肌炎，对mRNA疫苗接种后死亡的患者进行的mRNA分布调查揭示了在几位患者的心肌中存在疫苗衍生的mRNA。有趣的是，这些患者的心脏部分可视化显示心脏损伤的证据，有巨噬细胞浸润，而这种变化在心脏中未检测到疫苗mRNA的患者中要少得多。这些结果暗示了心肌炎和iLNP分布到心脏之间的因果关系。 尽管这些研究强调了mRNA疫苗系统分布的潜在安全风险，但mRNA疫苗更倾向于超越注射部位到淋巴器官。因此，研究人员试图开发能够迁移到引流淋巴结而不发生系统泄漏的mRNA疫苗配方。例如，之前的一项研究筛选了基于引流淋巴结中蛋白表达水平的iLNP配方，使用了一组可电离脂质和具有不同混合比例的四种脂质成分的iLNP。与BNT162b中使用的iLNP相比，最佳iLNP在淋巴结中提供了增强的蛋白表达，并最小化了肝脏或其他系统器官中的表达。另一项研究通过使用大约100 nm（小）、180 nm（中）和330 nm（大）大小的iLNP来调查iLNP大小的影响，从而提供了机制上的见解。肌肉内注射后，小型和中型iLNP从注射部位泄漏出来，在肝脏中积累并提供了强烈的蛋白表达，而大型iLNP显示出从注射部位的最小泄漏。 使用iLNP以外的传递系统也可能减少mRNA疫苗的系统泄漏，因为iLNP在肝脏积累中具有积极机制。血液中的载脂蛋白E（ApoE）与iLNP结合，通过肝脏中的低密度脂蛋白受体促进其被肝细胞吸收。没有这种积极机制，一些脂多聚复合物和多聚复合物避免了在肝脏中的积累，但允许有效地传递到淋巴器官，实现安全有效的疫苗接种。脂多聚复合物的研究比较了其分布与肌肉内注射后iLNP的分布（图9(a)）。脂多聚复合物在淋巴器官中，包括淋巴结和脾脏中，提供了有效的荧光素酶表达，而在肝脏中的表达最小，而肝脏是iLNP注射后表达荧光素酶的主要器官（图9(b)）。在脂多聚复合物注射后的定量PCR评估中，83%的mRNA停留在注射的肌肉中，其余的mRNA主要分布在血液中，只有0.06%分布在肝脏中（图9(c)）。这些结果表明了脂多聚复合物有利的分布概况。这种脂多聚复合物在小鼠和NHPs中诱导了针对SARS-CoV-2的强大疫苗接种，显示出对感染的保护效果。疫苗显示出可接受的安全性概况，全身细胞因子释放和白细胞的短暂增加。 图9. 脂多聚复合物的生物分布。(a) 脂多聚复合物的制备。(b) 脂多聚复合物和装载荧光素酶mRNA的iLNP肌肉注射后的荧光素酶表达分布。(c) 通过qPCR评估脂多聚复合物注射后的mRNA分布。饼图显示了每个器官中累积的mRNA拷贝数。版权所有© 2021 Yang等人。 3.3.皮内传递 与肌肉和皮下组织相比，皮肤是一个高度免疫原性的组织，为疫苗接种提供了一个有吸引力的场所。表皮中的免疫相关细胞包括角质形成细胞、APCs（如朗格汉斯细胞）、真皮树突状细胞和巨噬细胞，以及特定的T细胞亚群，它们共同作用于触发先天和适应性免疫。角质形成细胞占表皮细胞的80%，它们表达一系列模式识别受体，并通过分泌促炎细胞因子（IL-1α、IL-1β、IFN-α、IFN-β和G-CSF）以及促进朗格汉斯细胞迁移和分化的细胞因子（IL-6、IL-10、IL-18和TNF-α），为发展免疫原性环境做出贡献。朗格汉斯细胞和真皮树突状细胞擅长捕获抗原并迁移到引流淋巴结进行抗原呈递，从而激活适应性免疫反应。真皮环境富含血管和淋巴管，吸引免疫细胞并促进它们在对促炎刺激的反应中进入淋巴流动，允许疫苗有效地传递到淋巴结。 真皮组织作为免疫器官的这些有利特征促使多年来开发皮内mRNA疫苗。早期的动物研究已经证明了皮内普罗胺/mRNA疫苗针对传染病和癌症的潜力。皮内普罗胺/mRNA疫苗还在癌症疫苗的人类临床试验中提供了可检测的抗原特异性T细胞反应。此外，针对狂犬病病毒糖蛋白的皮内喷射普罗胺/mRNA疫苗在人类中诱导了强大的中和抗体和CD4+ T细胞反应，没有严重的安全问题。皮内给药途径即使在裸mRNA疫苗中也显示出其临床潜力。在一项临床试验中，使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）作为佐剂的裸mRNA疫苗针对几种肿瘤相关抗原，通过诱导对抗原有反应的CD4+和CD8+ T细胞，减缓了一些患者的肾癌进展。最近，BNT162b2和mRNA-1273，这两种基于iLNP的COVID-19疫苗在临床上被批准用于肌肉内给药，它们在临床试验中被测试了皮内注射的潜力。皮内注射10μg或20μg的mRNA-1273产生了几乎与肌肉内注射100μg mRNA相当的尖峰特异性抗体，表明皮内给药在剂量节省方面的潜力。BNT162b2的临床研究评估了作为灭活疫苗接种者的增强剂量的疫苗接种结果。在这些研究中，皮内注射五分之一剂量和肌肉内注射全剂量诱导了几乎相当的针对尖峰蛋白的体液和细胞免疫反应。值得注意的是，与全剂量注射BNT162b2相比，五分之一剂量的皮内疫苗接种减轻了系统性反应原性。 一项机制研究使用NHPs对皮内和肌肉内mRNA疫苗接种进行了详细比较。在针对流感病毒的基于iLNP的mRNA疫苗中，皮内途径在产生抗原特异性抗体和CD4+记忆T细胞方面优于肌肉内途径。皮内和肌肉内iLNP给药都导致循环中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞浸润到注射部位。值得注意的是，皮内给药刺激了CD209+残留真皮APCs的增殖。有趣的是，在皮内传递荧光标记的装载报告蛋白mRNA的iLNP后，CD1a+和CD209+真皮APCs有效地摄取了iLNP，提供了长达9天的报告蛋白表达，激活表达CD80，并迁移到引流淋巴结。这些真皮APCs可能增强了皮内传递后的疫苗效果。最近的一项研究评估了使用敲除这些细胞类型的小鼠在接种装载saRNA的iLNP后朗格汉斯细胞和常规类型1树突状细胞（cDC1）的贡献。缺乏这两种细胞类型的小鼠表现出血清中疫苗特异性抗体诱导和引流淋巴结中Tfh和GC B细胞反应受损（图10(a)）。有趣的是，那些只缺乏一种细胞类型的小鼠没有表现出疫苗效果受损，表明朗格汉斯细胞和cDC1s在mRNA疫苗接种中的冗余作用。同一研究还通过评估有无中性粒细胞耗竭的疫苗效果，探索了中性粒细胞在疫苗接种中的作用。中性粒细胞耗竭并没有显著减少Tfh和GC B细胞反应和抗体产生（图10(b)），表明在皮内mRNA疫苗接种中浸润中性粒细胞的较小贡献。如图7所示，mRNA疫苗有两种机制来获得APCs在淋巴结中的抗原表达：组织残留APCs迁移到淋巴结和mRNA疫苗纳米颗粒的迁移。在这种情况下，本节中的皮内疫苗接种研究表明，通过展示真皮组织残留APCs的关键作用，前一种机制做出了巨大贡献。同时，并非所有mRNA疫苗都受益于皮内给药途径。例如，以前的saRNA疫苗报告显示，皮内途径提供了与肌肉内途径相当或效率较低的疫苗效果。其他因素，包括抗原蛋白表达的效率、saRNA生物分布和佐剂效应，可能是这些设置中疫苗接种结果的决定因素。 图10. 朗格汉斯细胞（LCs）和常规树突状细胞1（cDC1）在皮内mRNA疫苗接种中的作用。使用iLNPs皮内注射表达HA的mRNA。(A) 在野生型（WT）小鼠或缺乏一个或两个LCs和cDC1的敲除小鼠中的抑制滴度。(B) 在疫苗接种前用中性粒细胞耗竭抗体（1A8）注射的WT小鼠中的抗体水平。版权所有© 2022 Ndeupen等人。 皮内疫苗接种途径在临床设置中面临技术困难和注射不准确的问题。这一问题促使了新的注射方法和设备的开发。其中，喷射注射器在狂犬病毒的临床试验中被使用。有趣的是，普罗胺/mRNA多聚体的喷射注射，而不是多聚体的针头注射，在人类中诱导了可检测的抗体产生。这一结果揭示了喷射注射改善疫苗效果的额外好处，大概是通过提高多聚体的传递效率。 微针提供了另一个有希望的皮内疫苗接种选择。例如，裸mRNA和脂质mRNA载体在用空心微针注射后在猪皮中提供了有效的报告蛋白表达，这种微针允许从每个针尖的孔中注入液体。最近的一项研究开发了由可溶解聚合物基质组成的微针，其中包含mRNA iLNP。微针在插入皮肤后30分钟内溶解以释放iLNP。这一系统在水平上显示出与相同iLNP的肌肉内注射相当的强大疫苗效果对抗SARS-CoV-2。此外，该系统可以在室温下耐受6个月的储存，储存后蛋白表达效率没有显著下降。 3.4.系统性传递 通过静脉注射进行的系统性给药提供了一条有效的途径，可以达到全身的器官或组织。与其它注射途径相比，其低侵入性、技术简单性和普遍适用性也具有吸引力。值得注意的是，通过系统性给药的重组蛋白癌症疫苗在治疗黑素瘤和结直肠癌方面显示出高疗效。在目标器官中，脾脏和淋巴结作为富含免疫细胞（包括T细胞、B细胞和树突状细胞）的二级淋巴器官，在疫苗接种中发挥关键作用。特别是，疫苗的主要靶器官是静脉注射的脾脏和局部给药的淋巴结。 多年来，除了mRNA疫苗领域外的研究已经解决了控制系统给药纳米颗粒生物分布的一个艰巨挑战。纳米颗粒的物理化学属性决定了它们在系统给药后的生物分布。例如，纳米颗粒应具有直径大于6纳米或分子量大于50 kDa，以避免通过肾脏肾小球滤过快速清除。尺寸在10到200纳米之间的纳米颗粒优先在肝脏中积累，肝脏是一个主要的清除器官。这一尺寸范围与肝脏窦状内皮细胞中的孔径（50-200纳米）和Kupfer细胞的大小依赖性吞噬活性一致。此外，肝脏窦状内的慢血流促进了纳米颗粒对窦状壁的捕获，肝脏的重量也是一个导致纳米颗粒在肝脏中积累的原因。疫苗纳米颗粒应避免这些清除和清除机制，以改善脾脏靶向。用生物相容性亲水性聚合物，如PEG或两性离子聚合物，涂层纳米颗粒表面，可以有效地减少纳米颗粒的肝脏摄取。PEG化肝脏窦状内皮壁，而不是纳米颗粒，也可以抑制纳米颗粒在肝脏中的积累。脾脏通过脾脏窦隙的内皮缝隙物理捕获大于200纳米的纳米颗粒，这些缝隙过滤血液成分，而微米级聚集体则受到肺微血管的捕获。此外，将纳米颗粒的表面电荷从正变为负或用亲水性聚合物修饰它们可以显著改善它们对脾脏的选择性。总的来说，略大于200纳米的大小、阴离子表面和亲水性隐形涂层可能是适合脾脏靶向的属性，而脾脏APCs的靶向配体可以进一步增强纳米颗粒在脾脏中的积累。 在mRNA疫苗领域，一项开创性研究已经证明了系统性mRNA疫苗在动物实验和人类临床试验中对抗癌症的效用。在该研究中，具有不同表面电荷的脂质体，通过改变mRNA和阳离子脂质体的混合比例制备，基于它们在系统注射到小鼠后在脾脏中的mRNA传递效率进行筛选。在报告试验中，用mRNA对阳离子脂质体的过量电荷比制备的阴离子脂质体，有效地将mRNA传递到脾脏、淋巴结和骨髓中的CD11c+树突状细胞，提供蛋白表达。这一系统在几种小鼠癌症模型中展示了有效的治疗效果，并在人类中诱导了可检测的抗原特异性T细胞。随后的临床试验通过靶向肿瘤相关抗原和新抗原展示了这一系统的强大的抗肿瘤效果。人类中的荧光-2-脱氧-2-D-葡萄糖正电子发射断层扫描（FDG-PET）显示，在这一阴离子脂质体传递后，脾脏中葡萄糖摄取选择性增加（图11），表明这一系统在人类中也成功地靶向脾脏。 图11. 通过系统给药使用脂质体靶向人类脾脏。在使用阴离子脂质体进行静脉疫苗接种后的人体中进行18F-2-脱氧-2-D-葡萄糖正电子发射断层扫描。脾脏被圈出。版权所有© 2018 Pektor等人。 这一临床成功正在促进针对脾脏的mRNA传递系统的开发。例如，向mRNA iLNP中添加阴离子脂质将iLNP从肝脏重新定向到脾脏，而iLNP具有肝脏的内在亲和性。随后的机制研究表明，添加阴离子脂质改变了血液循环中附着在iLNP上的蛋白质冠的组成，这可能决定了iLNPs的组织亲和性。同样，来自报告mRNA和聚阳离子的聚复合物在小鼠静脉注射后选择性地在脾脏和淋巴结中提供报告蛋白表达（图12(a)）。聚阳离子具有两性离子结构，向阳离子侧链添加了带负电荷的磷酸基团。在淋巴结中，CD4+ T细胞和巨噬细胞有效地表达了报告蛋白（图12(b)）。尽管阴离子纳米颗粒经常用于mRNA疫苗中靶向脾脏，但一种称为两亲性碳点的阳离子纳米颗粒也展示了选择性mRNA传递到脾脏。 图12. 使用聚复合物在小鼠中靶向淋巴组织。系统性注射编码荧光素酶（a）和tdTomato（b）的报告mRNA。（a）荧光素酶表达的分布。（b）淋巴结中表达tdTomato的细胞类型。版权所有© 2021美国化学会。 碳点是通过将疏水烷基链结合到基于多胺的纳米颗粒上制备的。通过体外筛选选出的两种碳点配方在系统注射后评估了其体内功能。其中一种实现了对脾脏的选择性mRNA传递，在癌症疫苗中诱导了有效的抗肿瘤活性。总的来说，这些系统利用纳米颗粒的物理化学属性进行脾脏靶向。然而，在大多数系统中，靶向的确切机制仍然不清楚，阐明这些机制将有助于未来合理设计脾脏靶向系统。 除了依赖于物理化学属性的策略外，配体基础系统也被追求作为一种实现细胞水平精确靶向的策略。一项开创性的研究将甘露糖配体附着在脂多聚复合物上，这增加了mRNA传递到脾脏树突状细胞的效率4倍。在应用于靶向肿瘤相关抗原的癌症疫苗时，脂多聚复合物显示出有效的抗肿瘤效果。然而，脂多聚复合物在脾脏以外的器官中诱导了蛋白表达，包括肝脏。为了提高对脾脏树突状细胞的选择性，随后的研究使用三甘露糖而不是单甘露糖作为配体。结果，三甘露糖脂多聚复合物将mRNA专门传递到脾脏，并在其他器官中最小化了传递mRNA的蛋白表达。此外，在小鼠中耗尽CD11c+ APCs后脾脏中的蛋白表达显著减少，显示出该系统在脾脏APCs中的高特异性。有趣的是，该系统诱导的CTL反应独立于I型IFN，因此即使带有1 mΨ修饰也保留了CTL活性。因此，装载1 mΨ修饰的mRNA的脂多聚复合物提供了有效的癌症疫苗，并最小化了系统性细胞因子释放的诱导。另一组使用唾液酸作为配体，靶向树突状细胞表面表达的唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-1 (Siglec-1) 作为iLNP的配体。有趣的是，将唾液酸引入iLNP显著增加了内体逃逸效率。结果，iLNP在系统给药后允许有效的mRNA传递到脾脏树突状细胞，从而增强了抗癌症疫苗。 3.5.粘膜传递 粘膜疫苗接种可以避免侵入性注射程序，并在粘膜相关淋巴组织（MALT）中触发强大的局部和系统免疫反应。特别是，包括肺在内的上呼吸道和下呼吸道的粘膜，是针对传染病的疫苗的一个有吸引力的场所。针对COVID-19的鼻内（i.n.）给药或吸入活减毒和腺病毒载体粘膜疫苗在临床试验中显示出有希望的结果。在粘膜免疫中，分泌到粘液中的IgA在中和和消除最初进入点的外来病原体中发挥重要作用，有效预防感染。此外，鼻内疫苗接种有效地诱导交叉反应性抗体，赋予广泛的交叉保护性免疫。这一特性对于预防具有高突变率的病毒（如RNA病毒）的感染是吸引人的。有效地诱导IgA分泌需要将抗原传递到位于粘液覆盖的上皮屏障下的淋巴组织中的APCs。粘膜上皮中的M细胞介导抗原从粘膜表面到固有层的采样。因此，以前的鼻内疫苗接种研究已经尝试促进疫苗穿透粘液以被M细胞吸收，证明了这一策略的可行性。在这种给药途径中，靶向APCs也是至关重要的，其中被APCs激活的B细胞在激活的CD4+ T细胞的协助下大量分泌IgA。值得注意的是，不同部位的粘膜具有交叉对话。因此，在粘膜部位的疫苗接种可以在远处的粘膜部位诱导抗原特异性免疫，促进整个粘膜系统对病原体感染的加强。除了粘膜IgA分泌外，激活的B细胞还为全身免疫提供系统性IgG分泌。此外，粘膜疫苗接种可以诱导细胞毒性CD8+ T细胞直接杀死感染细胞或表达抗原的细胞，激励其应用于癌症疫苗。 尽管粘膜疫苗接种具有这些优点，但mRNA疫苗的应用仍然具有挑战性，很少有报告涉及这一主题。在一项针对流感病毒和SARS-CoV-2的疫苗研究中，saRNA iLNP的鼻内（i.n.）给药产生的抗体滴度比其肌肉内（i.m.）注射低10倍以上，并且细胞免疫效率较低。机制分析显示肌肉内注射后的血清细胞因子水平高于鼻内给药。因此，作者通过鼻内途径的低佐剂效应来解释i.n.路线的疫苗效率降低。随后的一项研究在i.n.、i.m.和皮内（i.d.）saRNA疫苗接种中进行了更全面的比较，使用了4种不同的疫苗配方：固体LNP、聚合物纳米颗粒、阳离子LNP和iLNP。在每种配方中，i.n.疫苗接种一致地产生了比其他疫苗途径效率低的体液和细胞免疫，即使i.n.疫苗接种使用的mRNA剂量比其他两条途径高10倍。荧光素酶mRNA报告试验显示，荧光素酶表达在i.n.给药后仅持续几天，而肌肉内和皮内注射提供了超过10天的表达。因此，通过i.n.给药引入的saRNA细胞的快速清除可能解释了i.n. saRNA疫苗接种的低免疫原性。 与此同时，几份报告在利用基于脂质和聚合物系统的i.n. mRNA疫苗接种中展示了有希望的结果。在脂质系统方面，一项开创性的研究使用了一种商业脂质试剂进行i.n. mRNA疫苗接种，在小鼠模型中预防性和治疗性给药后诱导了抗癌症活性。在另一项研究中，mRNA被装载到使用普罗胺缩合的聚乙二醇化阳离子脂质体中。这一系统在培养细胞中展示了有效的抗原表达和免疫刺激，以及在小鼠中伴随CD4+和CD8+ T细胞有效诱导的抗肿瘤活性。在最近的一项研究中，通过用阳离子脂质替代两性离子辅助脂质来增强mRNA传递效率到粘膜组织，iLNP被用于i.n.疫苗接种。结果iLNP实现了有效的mRNA传递到粘膜APCs。最终，iLNP展示了与相同系统在装载编码SARS-CoV-2尖峰蛋白的受体结合域和补体C3蛋白的融合蛋白的mRNA后肌肉内疫苗接种观察到的水平相当的强系统IgG诱导。 在聚合物系统的领域，一系列研究试图克服阻碍mRNA疫苗到达APCs的鼻上皮屏障。虽然多聚阳离子通过打开上皮细胞之间的紧密连接有效地破坏屏障，但它们可能引起组织损伤。因此，这些研究通过将聚乙烯亚胺与环糊精结合来减轻细胞毒性，从而减少电荷密度。在i.n.疫苗接种后，得到的聚复合物成功地在鼻腔和阴道腔中产生了IgA，以及IgG和抗原特异性CD8+和CD4+ T细胞。根据随后的机制研究，聚复合物在浅表颈、深颈和腋窝淋巴结中有效地提供了蛋白表达，并激活了淋巴结中的树突状细胞，从而增强了疫苗效率。在安全分析中，聚复合物没有引起血液中毒性标记物或细胞因子的增加，并且在鼻上皮和肝脏的组织切片中没有观察到异常。在最近的一项研究中，通过聚乙二醇化mRNA聚复合物传递到肺部尝试了粘膜疫苗接种。对于聚复合物的肺部传递，需要优化表面PEG密度。PEG减轻了由阳离子聚复合物引起的组织损伤，并促进了它们对粘膜的穿透，尽管它们表面密集的PEG层阻碍了进入目标细胞。疫苗研究首先通过基于传递效率到肺部的筛选优化了PEG密度和多阳离子结构。最优聚复合物在肺部APCs和上皮细胞中有效地提供了蛋白表达。在SARS-CoV-2疫苗方面，聚复合物在引流淋巴结中诱导了抗原特异性T细胞和B细胞，包括表达IgA的B细胞。此外，观察到抗原特异性组织驻留CD8+ T细胞和强粘膜IgG分泌，证明了成功诱导粘膜免疫。最终，该系统有效地保护了小鼠免受病毒挑战。然而，该系统未能诱导可检测的IgA分泌，需要进一步改进疫苗设计。 4.未来展望 mRNA疫苗需要多种功能，包括保护mRNA免受RNase攻击、以最小化非靶向分布为目标APCs和淋巴组织，以及时空控制先天免疫激活。虽然先天免疫的刺激对于有效的疫苗接种至关重要，但过度的佐剂效应可能导致不良反应并阻碍疫苗结果。在mRNA传递系统方面，mRNA纳米颗粒迁移到淋巴器官有利于疫苗效果。然而，它们广泛分布到非靶向组织，如肝脏和心脏，可能导致罕见但严重的不良反应。在mRNA疫苗中微调这些各种因素仍然具有挑战性，需要大规模筛选以确定最优的mRNA疫苗设计。例如，SM-102是一种用于批准的COVID-19疫苗mRNA-1273的可电离脂质，它是基于小鼠和NHPs中抗原产生能力从30种LNPs配方中筛选出来的。值得注意的是，可电离脂质结构的微小变化可能导致体液免疫诱导的显著差异，而pKa在6.6和6.9之间的可电离脂质往往表现出有效的疫苗效果。有趣的是，虽然五种领先的LNPs在小鼠中展示了可比的抗体产生效率，但它们在NHPs中导致了抗体诱导的大差异，强调了疫苗效力的物种特异性变化。更详细地解密结构-功能关系可能有利于未来疫苗开发，为此，正如本评论所讨论的，正在进行有力的机制分析。 前述的物种差异是纳米医学领域的一个重要问题。例如，临床前动物模型和人类之间在纳米药物生物分布上存在显著差异。吸附到纳米药物上的蛋白质冠在不同物种中的特异性变化可以通过影响克服多种生物学屏障的过程（如有限的组织扩散和不良的清除机制）来影响它们在各个物种中的分布。此外，对mRNA疫苗构成额外障碍的炎症反应在不同物种之间也有所不同。例如，小鼠对阴离子mRNA脂质体的耐受性比人类高，系统给药时炎症反应最小。小鼠在对炎症刺激的反应中更有效地产生抗炎IL-1ra，与人类相比，减轻了mRNA疫苗的系统反应原性。解决物种差异对未来疫苗开发至关重要。 尽管mRNA疫苗在对抗COVID-19方面取得了成功，但当前的mRNA疫苗仍需改进，特别是在减少反应原性方面。虽然在大流行期间，反应原性可能被认为是可以接受的，但人们需要反应原性更温和的mRNA疫苗配方，以用于反复增强针对COVID-19的免疫力，以及更广泛地应用于其他传染病。此外，强烈的反应原性也是疫苗犹豫的原因之一。关于反应原性和免疫原性（疫苗效果）是否可以分离的辩论仍在继续。在人类中，疫苗的系统反应原性在第二次剂量后比第一次剂量更常见，这表明适应性免疫在反应原性中的参与。此外，增强的反应原性与第二次剂量后系统IFN-γ分泌水平的升高相吻合，这在人类和小鼠中都有观察到。在小鼠研究中，CD4+和CD8+ T细胞是第二次剂量中IFN-γ的主要产生者，给予IFN-γ受体中和抗体减弱了巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞的激活。这些发现表明反应原性和免疫原性之间存在密切关系。然而，IFN-γ受体中和抗体对小鼠体液和细胞免疫诱导的效率影响很小。此外，系统反应原性的强度与人类体液和细胞免疫诱导的效果之间的相关性有限。这些结果表明反应原性和免疫原性有潜力被分离。关于佐剂效应，阐明负责反应原性和免疫原性的先天免疫信号通路可能有助于开发具有降低反应原性的高效疫苗。在淋巴结中有效积累且系统泄漏最小的mRNA传递系统可能在减轻系统不良反应的同时保持效果。 虽然这篇综述主要关注佐剂效应和mRNA传递系统，但与其他策略的结合对未来mRNA疫苗的设计至关重要。旨在延长抗原表达持续时间的RNA设计，包括saRNA和环状RNA，也可以增强mRNA疫苗的效力。saRNA疫苗ARCT-154在3期临床试验中作为加强疫苗接种，比BNT162b2或mRNA-1273的两剂接种后显示出更强的免疫原性。编码SARS-CoV-2尖峰蛋白受体结合域的环状RNA在小鼠和NHPs中诱导了强大的免疫反应，尽管环状RNA和线性mRNA之间的疫苗效果几乎相当。在重组蛋白疫苗的研究中，抗原和佐剂的暴露动力学对疫苗接种结果有很大影响，持续暴露导致增强的抗体产生。因此，在mRNA疫苗中调节动力学可以提高其效力。为了实现这一点，一些报告尝试通过水凝胶控制mRNA纳米颗粒的释放。例如，与基于脂质的商业试剂复合的mRNA被装载到基于聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)(pHEMA)的多孔支架上。在皮下注射后，这种支架保留mRNA超过3天，并提高了与mRNA注射相比的蛋白表达效率。最近的研究开发了一种由氧化石墨烯(GO)和线性聚乙烯亚胺(LPEI)组成的水凝胶，装载抗原mRNA和TLR7激动剂。这种水凝胶在小鼠注射后逐渐释放装载mRNA和激动剂的GO-LPEI纳米颗粒，超过一个月，同时在此期间保护mRNA免受降解。结果，水凝胶注射比纳米颗粒的注射提高了抗肿瘤效果。由mRNA编码的蛋白质的工程也大大影响疫苗接种效果。有趣的是，在mRNA疫苗中将SARS-CoV-2的尖峰蛋白工程化形成类病毒颗粒，提高了中和滴度10倍以上。在癌症疫苗中，准确的表位预测和与其他免疫疗法的结合是关键。优化佐剂效应和传递系统，结合上述其他策略，将大幅扩展mRNA疫苗在未来的潜力。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。